雙特異性抗體的制作方法
【專利摘要】本申請(qǐng)?zhí)峁╇p特異性抗體，其由單鏈單元和單價(jià)單元組成，其中該單鏈單元針對(duì)免疫細(xì)胞具有特異性，該單價(jià)單元針對(duì)腫瘤細(xì)胞或微生物具有特異性。該單鏈單元包含與Fc片段融合的單鏈可變片段(scFv)且該單價(jià)單元包含輕鏈和重鏈對(duì)。本申請(qǐng)還提供雙特異性抗體的制備方法，這些抗體的藥學(xué)用途和診斷用途。
【專利說(shuō)明】雙特異性抗體

【背景技術(shù)】
[0001] 雙特異性抗體（BsAb)為具有兩種不同結(jié)合特異性的抗體或抗體類分子。BsAb廣 泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)，尤其是針對(duì)腫瘤的免疫治療中。目前，對(duì)于免疫治療研究的一個(gè)關(guān)注焦 點(diǎn)為如何利用BsAb的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性來(lái)殺死腫瘤細(xì)胞。BsAb可設(shè)計(jì)為同時(shí)靶向作用 于腫瘤細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞，同時(shí)激發(fā)效應(yīng)細(xì)胞使其殺滅腫瘤細(xì)胞。
[0002] BsAb可通過(guò)例如化學(xué)工程、細(xì)胞工程以及基因工程的方法制備。基因工程的優(yōu)勢(shì) 在于能夠容易地改造抗體，使得能夠設(shè)計(jì)和生產(chǎn)許多不同形式的雙特異性抗體片段，包括 雙體，串聯(lián)的（tanderm)ScFv和單鏈雙體及其衍生物（參見(jiàn)Jin和Zhu,于"the design and engineering of IgG-Like bispecific antibodies，', RE Kontermann (編），Bispecific antibodies)。由于這些BsAb不具有IgG Fe結(jié)構(gòu)域，因此它們的小的尺寸使得它們滲透進(jìn) 入腫瘤的能力增強(qiáng)，但它們?cè)隗w內(nèi)具有相當(dāng)短的半衰期并且缺乏ADCC作用，該作用與抗體 的恒定區(qū)相關(guān)聯(lián)。
[0003] 為了增強(qiáng)穩(wěn)定性和治療能力，對(duì)重鏈進(jìn)行重組基因改造以促進(jìn)它們的異二聚化并 獲得較高的含F(xiàn)c的IgG類雙特異性抗體的產(chǎn)量。已經(jīng)有幾種合理的設(shè)計(jì)方案用于改造抗體 CH3鏈用于異二聚化，即，二硫鍵、鹽橋、件-臼（knobs-into-holes)。在并置的位置處產(chǎn)生 件（knob)和臼（hole)的基礎(chǔ)在于該件和臼相互作用將有助于形成異二聚體，然而件-件 和臼-臼相互作用因有利的相互作用缺失而不利于形成同二聚體。盡管該杵-臼方案解 決了重鏈同二聚化問(wèn)題，但這沒(méi)有解決來(lái)自兩種不同抗體的輕鏈和重鏈之間的錯(cuò)配問(wèn)題。 雖然有可能對(duì)于兩種不同抗體識(shí)別相同的輕鏈，但使用具有相同輕鏈的兩種抗體序列構(gòu)建 BsAb的可能性非常小。
[0004] 因此需要提供更好的易于制備的BsAb，并且該BsAb具有較好的臨床穩(wěn)定性和效 力和/或減弱的系統(tǒng)毒性。


【發(fā)明內(nèi)容】
摶術(shù)問(wèn)是頁(yè)
[0005] 本申請(qǐng)的一個(gè)實(shí)施例提供了一種抗體，該抗體包含：(a)輕鏈-重鏈對(duì)，該輕鏈-重 鏈對(duì)針對(duì)腫瘤細(xì)胞或微生物具有特異性；和（b)融合肽，該融合肽包含單鏈可變片段（scFv) 和具有CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域的Fc片段，其中該融合肽針對(duì)免疫細(xì)胞具有特異性。 摶術(shù)解決方案
[0006] 在某些方面，該輕鏈-重鏈對(duì)針對(duì)腫瘤抗原具有特異性。一方面，該腫瘤抗原選 自：EGFR、Her2、EpCAM、CD20、CD30、CD33、CD47、CD52、CD133、CEA、gpA33、粘蛋白、TAG-72、 CIX、PSMA、葉酸鹽結(jié)合蛋白、⑶2、⑶3、GM2、VEGF、VEGFR、整合素（Integrin)、ανβ3、 α 5 β 1、ERBB2、ERBB3、MET、IGF1R、ΕΡΗΑ3、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP 和肌膜蛋白 (Tenascin)。一方面，該輕鏈-重鏈對(duì)針對(duì)較對(duì)應(yīng)的非腫瘤細(xì)胞而言在腫瘤細(xì)胞上過(guò)表達(dá) 的蛋白具有特異性。
[0007] 在某些方面，該輕鏈-重鏈對(duì)針對(duì)病毒或細(xì)菌具有特異性。一方面，該輕鏈-重鏈 對(duì)針對(duì)內(nèi)毒素具有特異性。
[0008] 在某些方面，該免疫細(xì)胞選自T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、 樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞和肥大細(xì)胞。
[0009] 在某些方面，該融合肽針對(duì)以下抗原具有特異性，該抗原選自⑶3、⑶16、⑶19、 CD28 和 CD64。
[0010] 在某些方面，該輕鏈通過(guò)二硫鍵與該重鏈結(jié)合。在某些方面，該重鏈通過(guò)一個(gè)或多 個(gè)二硫鍵與該融合肽結(jié)合。一方面，該重鏈包含人或者人源化的（humanized)Fc片段。一 方面，該重鏈的Fc片段包含人IgG Fc片段。一方面，該融合肽的Fc片段包含人或者人源 化的Fc片段。一方面，該融合肽的Fc片段包含人IgG Fc片段。
[0011] 在某些方面，與野生型抗體片段相比，該重鏈和/或該融合肽的Fc片段包含一處 或多處替換，該替換在該重鏈和Fc片段之間形成離子鍵。一方面，這些替換選自表1。
[0012] 在某些方面，與野生型抗體片段相比，該重鏈和/或該融合肽的Fc片段包含一處 或多處替換，該替換在該重鏈和Fc片段之間形成杵-白結(jié)構(gòu)配對(duì)。一方面，這些替換選自 表2。
[0013] 在某些方面，該CH2結(jié)構(gòu)域位于該SCFv片段和CH3結(jié)構(gòu)域之間。一方面，該融合 肽不包含CHl結(jié)構(gòu)域。
[0014] 在一個(gè)實(shí)施例中，本申請(qǐng)還提供一種包含上述任一實(shí)施例中的抗體的組合物。一 方面，載體為藥物載體。
[0015] 另一實(shí)施例提供了一種復(fù)合體，該復(fù)合體包含與一個(gè)或多個(gè)抗原結(jié)合的上述任一 實(shí)施例中的抗體。
[0016] 本申請(qǐng)進(jìn)一步提供了一種抗體的制備方法，該方法包括：將（a)輕鏈-重鏈對(duì)和 (b)融合肽混合，該輕鏈-重鏈對(duì)針對(duì)免疫細(xì)胞具有特異性，且該融合肽包含單鏈可變片段 (scFv)和具有CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域的Fc片段，其中該融合肽對(duì)于腫瘤細(xì)胞具有特異 性。一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N可通過(guò)該方法獲得的抗體。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1顯示了本申請(qǐng)的雙特異性抗體的一個(gè)實(shí)施例的結(jié)構(gòu)；
[0018] 圖2顯示了圖1雙特異性抗體的每條鏈的表達(dá)載體的構(gòu)造；
[0019] 圖3為1 %瓊脂糖凝膠電泳圖：泳道M :DL2000指示物（marker);泳道1 :赫賽汀 (Here印tin) VH ;泳道2 :赫賽汀VL ;泳道3 :人IgGlCH區(qū)域（CH1+鉸鏈+Fe);泳道4 :人 IgCL ；
[0020] 圖4為1 %瓊脂糖凝膠電泳圖：泳道M :DL1000DNA指示物；泳道1 :人源化的 0KT3 (H0KT3) VH-接頭；泳道 2 :接頭-H0KT3VL ;
[0021] 圖5為1 %瓊脂糖凝膠電泳圖：泳道M :DL10000DNA指示物；泳道I :H0KT3單鏈；
[0022] 圖6-8為用于定點(diǎn)誘變的質(zhì)粒的限制圖譜；
[0023] 圖9顯示了 6%凝膠SDS-PAGE圖和蛋白質(zhì)印記（Western blot)圖。樣品為293F 細(xì)胞上清液。泳道M :蛋白指示物；泳道1 :赫賽汀mAb ;泳道2 :T366W修飾的H0KT3單鏈 +Y407A修飾的赫賽汀重鏈+赫賽汀輕鏈；泳道3 :T366W K392D和K409D修飾（TKK)的H0KT3 單鏈+D356K D399K Y407A修飾（DDY)的赫賽汀重鏈+赫賽汀輕鏈；泳道4:K392D和K409D 修飾（KK)的H0KT3單鏈+D356K D399K修飾（DD)的赫賽汀重鏈+赫賽汀輕鏈；泳道5 :T366W K392D和K409D修飾（TKK)的H0KT3單鏈+L368R D399K Y407A修飾（LDY)的赫賽汀重鏈 +赫賽汀輕鏈；泳道6 :T366W K392D和K409D修飾（TKK)的H0KT3單鏈+D399KY407A修飾 (DY)的赫賽汀重鏈+赫賽汀輕鏈；
[0024] 圖10顯示了 6% SDS-PAGE凝膠電泳，并用考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果，該圖顯示：泳道 M :蛋白標(biāo)記物；泳道1 :純化的MSBODY ;泳道2 :赫賽汀；泳道3 :H0KT3單鏈；
[0025] 圖11顯示了抗Her2X抗⑶3MSB0DY結(jié)合至BT474細(xì)胞（A)和外周血單核細(xì)胞 (PBMC) (B)的細(xì)胞表面結(jié)合的流式細(xì)胞分析，其中，灰線：PBS對(duì)照；黑實(shí)線=MSBODY ;黑虛 線：赫賽汀；
[0026] 圖12包括四張顯示細(xì)胞聚集的顯微鏡圖片；
[0027] 圖13顯示抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性；
[0028] 圖15A-E顯示了實(shí)施例4中檢測(cè)的某些抗體的結(jié)構(gòu)。A :MSB0DY ;B :SMB0DY ;C : SSBODY ;D :赫賽汀單鏈抗體；E :H0KT3單鏈抗體；
[0029] 圖 16A-B 顯示 了將抗 Her2x 抗 CD3MSB0DY 和 SMBODY 結(jié)合至 BT474 細(xì)胞（A)和 PBMC 細(xì)胞（B)的結(jié)合情況；
[0030] 圖17顯示了 MSBODY比SMBODY對(duì)BT474細(xì)胞具有更高的結(jié)合活性；
[0031] 圖18顯示了熱挑戰(zhàn)分析的結(jié)果；
[0032] 圖19顯示了抗體介導(dǎo)的對(duì)BT474、MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的細(xì)胞毒性的結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0033] 定義
[0034] 應(yīng)注意非明確數(shù)量的實(shí)體限定應(yīng)指一或多個(gè)（種）該實(shí)體；例如，"雙特異性抗體" 應(yīng)理解為表示一或多個(gè)（種）雙特異性抗體。同樣地，非明確數(shù)量限定的、術(shù)語(yǔ)"一個(gè)或多 個(gè)"和"至少一個(gè)"本文中可互換使用。
[0035] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"多肽"用于包括單數(shù)的"多肽"以及復(fù)數(shù)的"多肽"，并且也指通 過(guò)酰胺鍵（也稱為肽鍵）線性連接的單體（氨基酸）組成的分子。術(shù)語(yǔ)"多肽"是指兩個(gè) 或多個(gè)氨基酸的任一條或多條鏈，而不是指特定長(zhǎng)度的該產(chǎn)物。因此、肽、二肽、三肽、寡肽、 "蛋白"、"氨基酸鏈"、或任何指兩個(gè)或多個(gè)氨基酸組成的一條或多條鏈的其他術(shù)語(yǔ)都包括 在"多肽"的定義中，且術(shù)語(yǔ)"多肽"可代替這些術(shù)語(yǔ)的任何一個(gè)或與它們互換使用。術(shù)語(yǔ) "多肽"也用于指多肽的表達(dá)后修飾的產(chǎn)物，包括但不限于糖基化、乙?；⒘姿峄?、酰胺化、 通過(guò)已知的保護(hù)基/阻斷基衍生化、蛋白水解裂解或通過(guò)非自然產(chǎn)生的氨基酸的修飾。多 肽可衍生自天然的生物源或通過(guò)重組技術(shù)生產(chǎn)，但不一定由指定核酸序列翻譯而成。其可 以任何方式產(chǎn)生，包括通過(guò)化學(xué)合成方式。
[0036] 本文使用的關(guān)于細(xì)胞、核酸（如DNA或RNA)的術(shù)語(yǔ)"分離的"，是指分別從其他的 以天然來(lái)源的大分子存在的DNA或RNA分離的分子。本文使用的術(shù)語(yǔ)"分離的"也指通過(guò) 重組DNA技術(shù)生產(chǎn)時(shí)基本不含細(xì)胞材料，病毒材料或培養(yǎng)基的核酸或肽，或經(jīng)化學(xué)合成制 備時(shí)基本不含化學(xué)前體或其他化學(xué)品。此外，"分離的核酸"是指包括非自然產(chǎn)生為片段的 核酸片段，且這些片段自然狀態(tài)下不存在。本文中術(shù)語(yǔ)"分離的"也用于指從其他細(xì)胞蛋白 或組織分離的細(xì)胞或多肽。分離的多肽是指包括純化的和重組的多肽。
[0037] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"重組"，在涉及多肽或多核苷酸時(shí)指自然狀態(tài)下不存在的多肽或 多核苷酸的形式，其中一個(gè)非限制性的例子，可以通過(guò)將通常不會(huì)一起出現(xiàn)的多核苷酸或 多肽組合在一起來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0038] "同源性"或"同一性"或"相似性"是指兩個(gè)肽鏈分子之間或兩個(gè)核酸分子之間的 序列相似程度。同源性可通過(guò)比較每個(gè)序列中的位置來(lái)測(cè)定，可通過(guò)比對(duì)來(lái)進(jìn)行比較。當(dāng) 在被比較的序列中的位置上有相同的堿基或氨基酸時(shí)，在該位置上的分子為同源的。多個(gè) 序列之間的同源度為這些序列共有的配對(duì)或同源位點(diǎn)數(shù)量的函數(shù)。"無(wú)關(guān)的"或"非同源的" 序列與本申請(qǐng)的序列之一之間具有少于40%的同源性，但優(yōu)選小于25%的同源性。
[0039] 多核苷酸或多核苷酸區(qū)域（或多肽或多肽區(qū)域）與另一序列具有一定的百分比 (例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%)的"序列同一性"是指， 在比對(duì)時(shí)，在這兩個(gè)序列比較時(shí)該百分比的堿基（或氨基酸）是相同的。此種比對(duì)和百分 比同源性或序列同一性，可使用本領(lǐng)域中已知的軟件程序測(cè)定，例如，通過(guò)Ausubel等人編 的（2007) Current Protocols in Molecular Biology描述的那些軟件。優(yōu)選地，使用默認(rèn) 參數(shù)用于比對(duì)。BLAST是一種比對(duì)程序，使用默認(rèn)參數(shù)。具體地，程序?yàn)锽LASTN和BLASTP， 使用如下I犬認(rèn)參數(shù)：Genetic code = standard ;fiIter = none ;strand = both ;cutoff = 60 ;expect = 10 ;Matrix = BL0SUM62 !Descriptions = 50sequences ;sort by = HIGH SCORE ；Databases = non-redundant, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translation s+SwissProtein+SPupdate+PIR。這些程序的詳細(xì)信息，可于以下互聯(lián)網(wǎng)地址獲得：http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/Blast. cgi，2008 年 5 月 21 日最后一次訪問(wèn)。生物學(xué)等效的 多核苷酸是具有上面提到的特定百分比的同源性，并編碼具有相同或相似的生物活性多肽 的多核苷酸。
[0040] 術(shù)語(yǔ)"等效核酸或多核苷酸"是指與該核酸的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列具有一定 程度的同源性，或序列同一性的核苷酸序列的核酸。雙鏈核酸的同源物是指包含特定核苷 酸序列的核酸，該特定核苷酸序列具有與另一核酸或其互補(bǔ)序列具有一定程度的同源性。 一方面，某核酸的同系物（homologs)能夠與該核酸或其互補(bǔ)序列雜交。同樣地，"等效的多 肽"是指與參考多肽的氨基酸序列具有一定程度的同源性，或序列同一性的多肽。在一些方 面，該序列同一性至少為約70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%。在某些方面， 該等效序列保留了參考序列的活性（例如，抗原表位結(jié)合）或結(jié)構(gòu)（例如，鹽橋）。
[0041] 雜交反應(yīng)可以在不同的"嚴(yán)格"條件下進(jìn)行。通常，低嚴(yán)格雜交反應(yīng)于約40°C在約 10XSSC或同等離子強(qiáng)度/溫度的溶液中進(jìn)行。中等嚴(yán)格雜交通常在約50°C于約6X SSC 中進(jìn)行，高度嚴(yán)格雜交反應(yīng)通常在約60°C于約I X SSC中進(jìn)行。雜交反應(yīng)也可在本【技術(shù)領(lǐng)域】 的技術(shù)人員熟知的"生理?xiàng)l件"下進(jìn)行。生理?xiàng)l件的一個(gè)非限制性例子是細(xì)胞中通常存在 的溫度，離子強(qiáng)度，pH值和Mg 2+濃度。
[0042] 多核苷酸由4個(gè)核苷酸堿基組成的特定序列組成：腺嘌呤（A)，胞嘧啶（C)，鳥嘌呤 (G)，胸腺嘧啶（T)，在該多核苷酸為RNA時(shí)尿嘧啶（U)替換胸腺嘧啶。因此，術(shù)語(yǔ)"多核苷 酸序列"是多核苷酸分子按字母順序排列的表示。該字母順序表示可以被輸入到計(jì)算機(jī)的 數(shù)據(jù)庫(kù)中，該計(jì)算機(jī)中有中央處理單元，并且用于生物信息學(xué)應(yīng)用，如功能基因組學(xué)和同源 性檢索。術(shù)語(yǔ)"多態(tài)性"是指共存有多于一種形式的基因或其一部分?；虻囊徊糠志哂?至少兩種不同的形式，g卩，兩種不同的核苷酸序列時(shí)，該基因的該部分被稱為"基因的多態(tài) 區(qū)域"。多態(tài)區(qū)域可以是單核苷酸，其同一性在不同的等位基因中不同。
[0043] 術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"和"寡核苷酸"可以互換使用，并涉及任何長(zhǎng)度的核苷酸的聚合物 形式，無(wú)論是脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物。多核苷酸可以有任何三維結(jié)構(gòu)，并 且可以具有任何已知或未知的功能。以下為多核苷酸的非限制性實(shí)施例：基因或基因片段 (例如，探針，引物，EST或SAGE標(biāo)簽），外顯子，內(nèi)含子，信使RNA (mRNA)，轉(zhuǎn)移RNA，核糖體 RNA，核酶，cDNA，dsRNA，siRNA，miRNA，重組多核苷酸，分支多核苷酸，質(zhì)粒，載體，單獨(dú)的任 意序列的DNA，單獨(dú)的任意序列的RNA，核酸探針和引物。多核苷酸可以包括修飾的核苷酸， 如甲基化的核苷酸和核苷酸類似物。如果存在，則在多核苷酸的裝配之前或之后對(duì)堿基結(jié) 構(gòu)進(jìn)行修飾。該核苷酸序列可以被非核苷酸成分中斷。多核苷酸可在聚合后進(jìn)一步修飾， 如用標(biāo)記成分結(jié)合。該術(shù)語(yǔ)也指雙鏈和單鏈分子。除非另外指出或要求，否則本申請(qǐng)的多 核苷酸的任一實(shí)施例既包括雙鏈形式也包括已知的兩條互補(bǔ)單鏈形式或預(yù)計(jì)成為雙鏈形 式的情況。
[0044] 術(shù)語(yǔ)"編碼"在其應(yīng)用于多核苷酸時(shí)指被認(rèn)為"編碼"某一多肽的多核苷酸，以其 天然的狀態(tài)或由本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法操作時(shí)，它可以被轉(zhuǎn)錄和/或翻譯以產(chǎn)生該多 肽的mRNA和/或其片段。反義鏈?zhǔn)谴朔N核酸的互補(bǔ)物，該編碼序列可以由其推導(dǎo)出。
[0045] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"可檢測(cè)的標(biāo)簽"指可直接或間接檢測(cè)的化合物或組合物，該化合 物或組合物直接或間接地結(jié)合至待檢測(cè)的組合物（例如，多核苷酸或蛋白質(zhì)，該蛋白如抗體） 以獲得"有標(biāo)簽的"組合物。該術(shù)語(yǔ)還包括，結(jié)合至該多核苷酸的序列，其通過(guò)插入序列的表 達(dá)提供信號(hào)，如綠色熒光蛋白（GFP)等。該標(biāo)簽自身可被檢測(cè)（例如放射性同位素標(biāo)簽或熒 光標(biāo)簽）或者，在酶標(biāo)簽情況下，可催化底物化合物或組合物的化學(xué)改變，該改變可被檢測(cè)。 該標(biāo)簽可用于小規(guī)模檢測(cè)或更適于高通量篩選。同樣地，合適的標(biāo)簽包括但不限于放射性同 位素、熒光染料、化學(xué)發(fā)光化合物、染料、和蛋白（包括酶）。該標(biāo)簽可僅被檢測(cè)，也可被定量。 僅被檢測(cè)的反應(yīng)通常包括僅能證實(shí)其存在的反應(yīng)，其中可被定量的反應(yīng)通常包括具有可定量 的（例如可通過(guò)數(shù)字報(bào)告的）值例如強(qiáng)度、極化和/或其他性質(zhì)的反應(yīng)。在發(fā)光或熒光分析 中，可檢測(cè)的反應(yīng)可直接使用與分析成分相關(guān)的實(shí)際上涉及結(jié)合的發(fā)光體或熒光基團(tuán)，或間 接使用與另一（例如報(bào)告分子或指示劑）成分連接的發(fā)光體或熒光基團(tuán)。
[0046] 本文使用的，"抗體"或者"抗原結(jié)合多肽"指特定識(shí)別并結(jié)合抗原的多肽或多肽復(fù) 合體。抗體可為整個(gè)抗體也可為任何抗原結(jié)合片段或者其單鏈。因此術(shù)語(yǔ)"抗體"包括含 有特定分子的任何蛋白或肽，該特定分子含有至少一部分的免疫球蛋白分子，該免疫球蛋 白分子具有結(jié)合至抗原的生物活性。此種情況的實(shí)例包括但不限于，重鏈或輕鏈或其配體 結(jié)合部分的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)，重鏈或輕鏈可變區(qū)，重鏈或輕鏈恒定區(qū)，框架（FR)區(qū)或其任 何部分，或結(jié)合蛋白的至少一部分。
[0047] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"抗體片段"或"抗原結(jié)合片段"為抗體的一部分，該抗體例如 F(ab'）2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv等。不管結(jié)構(gòu)如何，與相同的抗原結(jié)合的抗體片段 被認(rèn)為是完整抗體。術(shù)語(yǔ)"抗體片段"包括適配體、適配體對(duì)映體（spiegelmers)和雙體 (diabodies)。術(shù)語(yǔ)"抗體片段"也包括任何合成的或基因改造的蛋白，它們與抗體一樣可 結(jié)合至特定的抗原以形成復(fù)合體。
[0048] "單鏈可變片段"或"scFv"指免疫球蛋白的重鏈（Vh)和輕鏈（VJ的可變區(qū)域的融 合蛋白。在某些方面，這些區(qū)域用10至約25個(gè)氨基酸的短接頭肽連接。該接頭可富含甘 氨酸以具有柔性，也含有絲氨酸或蘇氨酸以具有可溶性，且能將Vh的N-末端連接至 '的C 末端，反過(guò)來(lái)也一樣。該蛋白質(zhì)保留了原始的免疫球蛋白的特性，只是去除了恒定區(qū)并引入 了接頭。ScFv分子為本領(lǐng)域已知的，且描述于美國(guó)專利5, 892, 019中。
[0049] 術(shù)語(yǔ)抗體包括多種寬泛類別的多肽，這些多肽可被生化識(shí)別。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng) 理解重鏈分為8&1111]^、1]111、3]^1^、(16]^、及6口8；[1011(，，，，）并具有一些亞類（例如，1-4)。該鏈的性質(zhì)決定了抗體的"類"，如IgG，IgM，IgA，IgG，或者IgE。免疫球蛋白亞類（同 型）例如IgG^ IgG2、IgG3、IgG4、IgG5等被很好表征并在功能上具有特異性。本領(lǐng)域技術(shù)人員 參考本申請(qǐng)可容易識(shí)別這些類和同型的每一種修飾形式，因此，這些形式在本申請(qǐng)范圍內(nèi)。 所有免疫球蛋白類明確地在本申請(qǐng)的范圍內(nèi)，下列討論通常將針對(duì)免疫球蛋白分子的IgG 類。關(guān)于IgG，標(biāo)準(zhǔn)免疫球蛋白分子包含兩個(gè)相同的輕鏈多肽（它們的分子量約為23, 000 道爾頓）和兩個(gè)相同的重鏈多肽（它們的分子量為53, 000-70, 000)。這四條鏈通常經(jīng)二硫 鍵以"Y"型連接在一起，其中輕鏈在"Y"結(jié)構(gòu)的口部開(kāi)始支撐重鏈，并延伸穿過(guò)可變區(qū)。
[0050] 本申請(qǐng)的抗體、抗原結(jié)合多肽、它們的變體或衍生物包括但不限于，多克隆抗體、 單克隆抗體、多特異性抗體、人抗體、人源化的抗體、靈長(zhǎng)類化的（primatized)抗體、或嵌 合抗體、單鏈抗體、抗原表位結(jié)合片段，例如，F(xiàn)ab、Fab'和F(ab'） 2、Fd、Fvs、單鏈Fvs (scFv)、 單鏈抗體、二硫鍵連接的Fvs (sdFv)、包含VL結(jié)構(gòu)域或VH結(jié)構(gòu)域的片段、由Fab表達(dá)庫(kù)產(chǎn) 生的片段、和抗獨(dú)特型（idiotypic)(抗-Id)抗體（包括,例如，本文公開(kāi)的抗Id抗體至 LIGHT抗體）。本申請(qǐng)的免疫球蛋白分子或抗體分子可為任何類型的（例如IgG、IgE、IgM、 IgD、IgA和IgY)、免疫球蛋白分子的任何類（例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2) 或亞類。
[0051] 輕鏈分為kappa或lambda (，）。每類重鏈均可結(jié)合kappa或lambda輕鏈。通常， 輕鏈和重鏈共價(jià)地結(jié)合在一起，且當(dāng)這些免疫球蛋白由雜交瘤、B細(xì)胞或基因改造的宿主細(xì) 胞產(chǎn)生時(shí)，兩條重鏈的"尾部"部分通過(guò)共價(jià)二硫鍵或非共價(jià)連接結(jié)合在一起。在該重鏈中， 氨基酸序列從Y型結(jié)構(gòu)的叉端的N末端向每條鏈的底部C末端延伸。
[0052] 輕鏈和重鏈兩者都分成結(jié)構(gòu)區(qū)和功能同源區(qū)。術(shù)語(yǔ)"恒定"和"可變的"為功能上 的使用。在此，應(yīng)認(rèn)識(shí)到輕鏈可變結(jié)構(gòu)域（VL)和重鏈可變結(jié)構(gòu)域（VH)同時(shí)決定了抗原識(shí) 別和特異性。相反地，輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域（CK)和重鏈恒定結(jié)構(gòu)域（CH1，CH2或CH3)提供了重 要的生物學(xué)性質(zhì)，例如分泌、經(jīng)胎盤的流動(dòng)性、Fc受體結(jié)合，補(bǔ)體結(jié)合等。通常恒定區(qū)結(jié)構(gòu) 域的數(shù)量隨著遠(yuǎn)離抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)或氨基端的末端位置而增加。N末端部分為可變區(qū)， 而在C末端部分為恒定區(qū)；CH3和CK結(jié)構(gòu)域?qū)嶋H上分別包含重鏈和輕鏈的羧基末端。
[0053] 如上所述，該可變區(qū)域使得抗體能選擇性識(shí)別并特異性結(jié)合抗原上的抗原表位。 艮P，抗體的VK結(jié)構(gòu)域和VH結(jié)構(gòu)域，或互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)的亞類組合形成定義三維抗原結(jié) 合位點(diǎn)的可變區(qū)域。這種四價(jià)抗體結(jié)構(gòu)形成了抗原結(jié)合位點(diǎn)，該抗原結(jié)合位點(diǎn)存在于Y構(gòu) 型的每個(gè)臂的末端。更具體地，該抗原結(jié)合位點(diǎn)被每個(gè)VH和VK鏈（S卩，CDR-H1，CDR-H2， ⑶R-H3，⑶R-Ll，⑶R-L2和⑶R-L3)上的三個(gè)⑶R定義。在一些實(shí)例中，例如，某些衍生自駱 駝種或基于駱駝免疫球蛋白改造的免疫球蛋白，完整的免疫球蛋白分子可僅由重鏈組成， 而沒(méi)有輕鏈。參見(jiàn)，例如，Hamers-Casterman 等，Nature363:446-448 (1993)。
[0054] 自然產(chǎn)生的抗體中，存在于每個(gè)抗原結(jié)合域中的六個(gè)"互補(bǔ)決定區(qū)"或"⑶R"是 短的，非連續(xù)的氨基酸序列，它們具有特定的定位以形成抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，對(duì)于抗體假定其 三維構(gòu)型處于水環(huán)境中。該抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的其余氨基酸，稱為"框架"區(qū)，具有更少的分 子內(nèi)可變性。該框架區(qū)主要采用β-折疊片構(gòu)型，且⑶R形成環(huán)，該環(huán)連接該β-折疊片 結(jié)構(gòu)，有時(shí)形成該β-折疊片結(jié)構(gòu)的一部分。因此，框架區(qū)用于形成支架，該支架使CDR通 過(guò)鏈內(nèi)的、非共價(jià)作用在正確方向上定位。由該定位的CDR形成的抗原結(jié)合域定義了互補(bǔ) 于免疫活性抗原表位的表面。該互補(bǔ)表面促進(jìn)了抗體與其同源表位的非共價(jià)結(jié)合。本領(lǐng) 域技術(shù)人員可對(duì)分別包括CDR和框架區(qū)的氨基酸針對(duì)任何給定的重鏈或輕鏈可變區(qū)容易 地識(shí)別，因?yàn)樗鼈円呀?jīng)被明確定義（參見(jiàn)，"Sequences of Proteins of Immunological Interest,，Kabat，E·，等，美國(guó)衛(wèi)生和公共服務(wù)部（U.S. Department of Health and Human Services, )，（1983) ;Chothia 和 Lesk，J. Mol. Biol.，196:901-917 (1987)，其在此通過(guò)引用 以全文形式結(jié)合至本文）。
[0055] 在本【技術(shù)領(lǐng)域】?jī)?nèi)使用和/或可接受的情況下，一個(gè)術(shù)語(yǔ)有兩個(gè)或兩個(gè)以上定義 時(shí)，本文使用的術(shù)語(yǔ)的定義用于包括所有的含義，除非明確說(shuō)明與此相反。一個(gè)具體的例子 為，使用術(shù)語(yǔ)"互補(bǔ)決定區(qū)"（"CDR"）來(lái)描述在重鏈和輕鏈多肽的可變區(qū)中都存在的非連 續(xù)的抗原結(jié)合位點(diǎn)。這種具體區(qū)域由Kabat等描述于美國(guó)衛(wèi)生和公共服務(wù)部，"Sequences of Proteins of Immunological Interest"（1983)和由 Chothia 等描述與 J. MoI. Biol. 196:901-917(1987)中，其通過(guò)全文引用結(jié)合至本文。根據(jù)Kabat和Chothia的定義， CDR包括相互比較時(shí)重疊的氨基酸殘基，或氨基酸亞結(jié)構(gòu)。然而，每種關(guān)于抗體或其變體的 CDR的定義的應(yīng)用都將在本文定義和使用的術(shù)語(yǔ)的范圍內(nèi)。包含如以上引用的每一篇參考 文獻(xiàn)定義的CDR的合適的氨基酸殘基列于下表中作為比較。包含特定CDR的精確殘基數(shù)將 隨該CDR的序列和大小變化。如果給定該抗體的可變區(qū)氨基酸序列，則本領(lǐng)域技術(shù)人員通 ?？纱_定哪些殘基包含特定⑶R。
[0056] [表 1]

【權(quán)利要求】
1. 一種抗體，包含： (a) 針對(duì)腫瘤細(xì)胞或微生物有特異性的輕鏈-重鏈對(duì)；和 (b) 融合肽，所述融合肽包含單鏈可變片段（scFv)和具有CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域的 Fc片段，其中所述融合肽針對(duì)免疫細(xì)胞具有特異性。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，所述輕鏈-重鏈對(duì)針對(duì)腫瘤抗原具有特異 性。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗體，其特征在于，所述腫瘤抗原選自：EGFR、Her2、EpCAM、 CD20、CD30、CD33、CD47、CD52、CD 133、CEA、gpA33、粘蛋白、TAG-72、CIX、PSMA、葉酸鹽結(jié)合蛋 白、⑶2、⑶3、GM2、VEGF、VEGFR、整合素、αVβ3、α5βl、ERBB2、ERBB3、MET、IGFlR、EPHA3、 TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP 和肌腱蛋白。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，所述輕鏈-重鏈對(duì)針對(duì)在腫瘤細(xì)胞上相對(duì) 于對(duì)應(yīng)的非腫瘤細(xì)胞過(guò)表達(dá)的蛋白具有特異性。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，所述輕鏈-重鏈對(duì)針對(duì)病毒或者細(xì)菌具有 特異性。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗體，其特征在于，所述輕鏈-重鏈對(duì)針對(duì)內(nèi)毒素具有特異 性。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的抗體，其特征在于，所述免疫細(xì)胞選自T細(xì)胞、B 細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、樹突細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì) 胞、嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的抗體，其特征在于，所述融合肽針對(duì)選自CD3、 ⑶16、⑶19、⑶28和⑶64的抗原具有特異性。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的抗體，其特征在于，所述輕鏈通過(guò)二硫鍵與所述 重鏈結(jié)合。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的抗體，其特征在于，所述重鏈通過(guò)一個(gè)或多個(gè)二 硫鍵與所述融合肽結(jié)合。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的抗體，其特征在于，所述重鏈包含人或者人源 化的Fc片段。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的抗體，其特征在于，所述重鏈的Fc片段包含人IgG Fc片 段。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的抗體，其特征在于，所述融合肽的Fc片段包括 人或者人源化的Fc片段。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的抗體，其特征在于，所述融合肽的Fc片段包括人IgG Fc片 段。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的抗體，其特征在于，與野生型抗體片段相比，所 述重鏈和/或所述融合肽的Fc片段包含一處或多處氨基酸替換，所述替換在所述重鏈和Fc 片段之間形成離子鍵。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的抗體，其特征在于，所述替換選自表1。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的抗體，其特征在于，與野生型抗體片段相比，所 述重鏈和/或所述融合肽的Fc片段包含一處或多處替換，所述替換在所述重鏈和Fc片段 之間形成杵-臼結(jié)構(gòu)配對(duì)。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的抗體，其特征在于，所述替換選自表2。
19. 根據(jù)權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)所述的抗體，其特征在于，所述抗體還包含可檢測(cè)的 標(biāo)簽。
20. 根據(jù)權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)所述的抗體，其特征在于，所述CH2結(jié)構(gòu)域位于所述 scFv片段和CH3結(jié)構(gòu)域之間。
21. 根據(jù)權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)所述的抗體，其特征在于，所述融合肽不包含CH1結(jié)構(gòu) 域。
22. -種組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)所述的抗體和載體。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的組合物，其特征在于，所述載體為藥物載體。
24. -種復(fù)合體，所述復(fù)合體包含根據(jù)權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)所述的抗體，所述抗體 與一個(gè)或多個(gè)抗原結(jié)合。
25. -種抗體的制備方法，所述方法包括：將（a)輕鏈-重鏈對(duì)和（b)融合肽混合，其 中所述輕鏈-重鏈對(duì)針對(duì)免疫細(xì)胞具特異性，所述融合肽包含單鏈可變片段（scFv)和具有 CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域的Fc片段，其中所述融合肽針對(duì)腫瘤細(xì)胞具有特異性。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法制得的抗體。
【文檔編號(hào)】A61K39/44GK104271602SQ201280065551
【公開(kāi)日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2012年11月21日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月21日
【發(fā)明者】周鵬飛, 張敬, 嚴(yán)永祥 申請(qǐng)人:武漢友芝友生物制藥有限公司