一種雙特異性抗體cd20×cd3的構(gòu)建及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫學(xué)的技術(shù)領(lǐng)域。具體地說，涉及雙特異性抗體的構(gòu)建和制備方法， 以及雙抗體功能和性質(zhì)檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 雙特異性抗體（bispecificantibody，BiAb)是含有兩種特異性抗原結(jié)合位點的 人工抗體，能在靶細(xì)胞和功能分子（細(xì)胞）之間架起橋梁，產(chǎn)生導(dǎo)向性的效應(yīng)功能。BiAb在 生物醫(yī)學(xué)中，特別是在腫瘤的免疫治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。通過BiAb介導(dǎo)細(xì)胞毒作用 殺死腫瘤細(xì)胞是當(dāng)前免疫治療應(yīng)用研宄的熱點，其主要特點是BiAb能同時結(jié)合腫瘤相關(guān) 抗原和免疫應(yīng)細(xì)胞上的靶分子，直接觸發(fā)免疫效應(yīng)細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷。以下是 針對所研宄的免疫細(xì)胞抗原和腫瘤細(xì)胞抗原，以及相關(guān)技術(shù)發(fā)展的一些【背景技術(shù)】介紹。
[0003] I. CD3
[0004] CD3分子由4個亞基組成：S、e、Y、e，其分子質(zhì)量分別為18. 9k Da、23. Ik Da、 20. 5k Da、18. 7k Da，其長度分別有171、207、182、164個氨基酸殘基。它們一起組成6條 肽鏈，常與T細(xì)胞受體（T cell rec印tor，TCR)緊密結(jié)合形成含有8條肽鏈的TCR-CD3 復(fù)合體，結(jié)構(gòu)示意圖見圖1。此復(fù)合體具有T細(xì)胞活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，穩(wěn)定TCR結(jié)構(gòu)的功能。 ⑶3胞質(zhì)段含免疫受體酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)，TCR識別并結(jié)合由MHC(major histo-compatibility complex)分子提呈的抗 原肽，導(dǎo)致CD3的ITAM的保守序列的酪氨酸殘基被T細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸蛋白激酶p561ck磷 酸化，然后可募集其他含有SH2(Scr homology 2)結(jié)構(gòu)域的酪氨酸蛋白激酶（如ZAP-70)。 ITAM的磷酸化和與ZAP-70的結(jié)合是T細(xì)胞活化信號傳導(dǎo)過程早期階段的重要生化反應(yīng)之 一。因此，CD3分子的功能是轉(zhuǎn)導(dǎo)TCR識別抗原所產(chǎn)生的活化信號。
[0005] 2. CD20
[0006] ⑶20是B淋巴細(xì)胞表面的特異性的標(biāo)志性分子，表達(dá)于95%以上的正?；驉盒訠 淋巴細(xì)胞表面，在造血干細(xì)胞、祖細(xì)胞和其他正常組織中無⑶20抗原的表達(dá)。它由297個 氨基酸組成，分子量為33kD，34?36kD屬于非糖基化磷蛋白，其抗原表位為第三、四跨膜區(qū) 間的由43個氨基酸組成的環(huán)區(qū)。⑶20與相應(yīng)抗體結(jié)合后不發(fā)生明顯的內(nèi)化現(xiàn)象，也不發(fā)生 明顯的細(xì)胞表面脫落現(xiàn)象，是治療B淋巴細(xì)胞相關(guān)疾病的理想靶點。研宄表明，CD20具有 鈣離子通道的功能，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度，影響細(xì)胞周期，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與分化， 甚至導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。目前有兩種針對CD20靶點的單克隆抗體藥物美羅華和奧法木， 其作用機(jī)制主要有補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性反應(yīng)、抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用以及提高細(xì) 胞對細(xì)胞毒作用的敏感性，此外免疫接種作用等也均導(dǎo)致B細(xì)胞的凋亡。由于原始的正常B 細(xì)胞不受抗CD20單抗的作用，即使在抗CD20單抗殺傷了所有表達(dá)CD20分子的淋巴瘤細(xì)胞 及正常B細(xì)胞后，仍能夠重建B細(xì)胞群，因此抗⑶20單克隆抗體也越來越多被應(yīng)用到B細(xì) 胞相關(guān)疾病的治療中。
[0007] 3.雙特異性抗體技術(shù)發(fā)展
[0008] 雙特異性抗體，一個抗體分子中的兩個抗原結(jié)合部位可分別結(jié)合兩種不同的抗原 表位的抗體。
[0009] 抗體藥物是以細(xì)胞工程技術(shù)和基因工程技術(shù)為主體的抗體工程技術(shù)制備的生物 大分子藥物，具有特異性高、性質(zhì)均一、可針對特定靶點定向制備等優(yōu)點。單克隆抗體在臨 床上主要應(yīng)用于以下三個方面：腫瘤治療、免疫性疾病治療以及抗感染治療。其中腫瘤的治 療是目前單抗應(yīng)用最為廣泛的領(lǐng)域，目前已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗和上市的單抗產(chǎn)品中，用于腫 瘤治療的產(chǎn)品數(shù)量占比大概為50%。單克隆抗體治療腫瘤是一種針對病變細(xì)胞特異靶點刺 激免疫系統(tǒng)來殺傷靶細(xì)胞的免疫療法，為了增強(qiáng)抗體的效應(yīng)功能，特別是殺傷腫瘤細(xì)胞的 效果，人們嘗試多種方法改造抗體分子，雙特異性抗體是改善抗體治療效果的發(fā)展方向之 一，現(xiàn)已成為抗體工程研宄領(lǐng)域的熱點。
[0010] 用于免疫治療的雙特異性抗體是含有2種特異性抗原結(jié)合位點的人工抗體，能在 靶細(xì)胞和功能分子（細(xì)胞）之間架起橋梁，激發(fā)具有導(dǎo)向性的免疫反應(yīng)，在腫瘤的免疫治療 中具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0011] 4.雙特異性抗體制備
[0012] 雙特異性抗體可通過多種途徑獲得，其制備方法主要有：化學(xué)偶聯(lián)法、雜交一雜交 瘤法和基因工程抗體制備法?；瘜W(xué)偶聯(lián)法是將2個不同的單克隆抗體用化學(xué)偶聯(lián)的方式連 接在一起，制備出了雙特異性單克隆抗體，這是最早的雙特異性單克隆抗體概念。雜交一雜 交瘤法是通過細(xì)胞雜交法或者三元雜交瘤的方式產(chǎn)生雙特異性單克隆抗體，這些細(xì)胞雜交 瘤或者三元雜交瘤是通過建成的雜交瘤融合，或者建立的雜交瘤和從小鼠得到的淋巴細(xì)胞 融合而得到的，只能生產(chǎn)出鼠源的雙特異性抗體，它的應(yīng)用受到了極大的限制。而隨著分子 生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，出現(xiàn)了基因工程人源化雙特異性抗體的多種構(gòu)建模式，并主要分 為雙特異性微抗體，雙鏈抗體，單鏈雙價抗體，多價雙特異性抗體四類。目前，國際上已有數(shù) 種基因工程雙特異性抗體藥物進(jìn)入臨床試驗階段，并顯示有較好的應(yīng)用前景。
[0013] 5.腫瘤的過繼免疫治療
[0014] 腫瘤的過繼免疫治療是將自體或異體的免疫活性細(xì)胞經(jīng)過體外擴(kuò)增后輸入患者 體內(nèi)，直接殺傷腫瘤細(xì)胞，調(diào)節(jié)和增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，主要包括LAK細(xì)胞、TIL細(xì)胞、激活 的T淋巴細(xì)胞和CIK細(xì)胞的免疫治療。而免疫療法只能清除少量的、零散的腫瘤細(xì)胞，對于 晚期的實體腫瘤療效有限。故常將其作為一種輔助療法與手術(shù)、化療、放療等常規(guī)方法聯(lián)合 應(yīng)用。先用常規(guī)方法清掃大量的腫瘤細(xì)胞后，再用免疫療法清除殘存的腫瘤細(xì)胞，可提高腫 瘤綜合治療的效果。其中，過繼免疫治療作為腫瘤綜合治療中的一個新方法，已經(jīng)與常規(guī)手 術(shù)治療、放療、化療及其他細(xì)胞和分子治療得到廣泛配合，在多種腫瘤的治療中展示了廣泛 的應(yīng)用前景。然而，一種更理想的方式應(yīng)該是，雙特異性抗體一端可以結(jié)合培養(yǎng)好的免疫細(xì) 胞的表面抗原CD3,并隨之一起輸入體內(nèi)，而雙特異性抗體的另一端能很好地結(jié)合腫瘤細(xì) 胞的表面抗原；這樣，雙特異性抗體就能在體內(nèi)架起腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間的橋梁，使免 疫細(xì)胞集中在腫瘤細(xì)胞周圍，進(jìn)而對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷。通過這種方法可有效解決腫瘤細(xì) 胞的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散，克服了手術(shù)、放化療三大傳統(tǒng)治療方式后的"不徹底、易轉(zhuǎn)移、副作用大" 等弊端。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 術(shù)語和縮略語
[0016] BiAb:雙特異性抗體（bispecific antibody)
[0017] TA:腫瘤抗原（tumor antigen)
[0018] VH:重鏈可變區(qū)（heavy chain variable region)。
[0019] VL:輕鏈可變區(qū)（light chain variable region) 〇
[0020] CL :輕鏈恒定區(qū)（constant region of light chain) 〇
[0021] CDR :是英文 Complementarity determining regions (CDRs)的縮寫，是指抗體的 抗原互補(bǔ)決定區(qū)。
[0022] ScFv :單鏈可變區(qū)抗體片段（single-chain variable fragment)，又稱為單鏈抗 體。
[0023] CLD:細(xì)胞系開發(fā)（cell line development)
[0024] FACS :焚光激活細(xì)胞分選（Fluorescence-activated cell sorting)，也稱為流式 細(xì)胞分選術(shù)。
[0025] 本發(fā)明針對常規(guī)單克隆抗體的不足之處，通過基因工程和抗體工程的方法進(jìn)行的 新分子-雙特異性抗體的創(chuàng)制，在傳統(tǒng)單克隆抗體主要通過CDC，ADCC和凋亡能力來殺傷腫 瘤細(xì)胞的基礎(chǔ)上，增加了介導(dǎo)T細(xì)胞的免疫療法，大大提高了免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤細(xì)胞的功 效。
[0026] 具體地，本發(fā)明提供了以下的技術(shù)方案：
[0027] 在一種實施方式中，提供一種雙特異性抗體，其特征在于，所述抗體包含：(a)單 價單元，為輕鏈-重鏈對，該輕鏈-重鏈對針對腫瘤細(xì)胞表面抗原具有特異性結(jié)合能力，優(yōu) 選地該腫瘤細(xì)胞表面抗原是CD20、EPCAM和CD30,更優(yōu)選地該腫瘤細(xì)胞表面抗原是CD20 ; 和（b)單鏈單元，為融合肽，該融合肽包含單鏈可變片段ScFv和具有鉸鏈區(qū)、CH2結(jié)構(gòu)域和 CH3結(jié)構(gòu)域的Fc片段，其中該融合肽針對的免疫細(xì)胞選自T細(xì)胞、NKT細(xì)胞或CIK細(xì)胞；優(yōu) 選地，該融合肽對免疫細(xì)胞表面抗原CD3具有特異性結(jié)合能力。
[0028] 在一種實施方式中，所述雙特異性抗體的單鏈單元的CH2結(jié)構(gòu)域位于ScFv片段和 CH3結(jié)構(gòu)域之間；所述單鏈單元不包含CHl結(jié)構(gòu)域。
[0029] 在一種實施方式中，雙特異性抗體的單鏈可變片段由輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)結(jié) 構(gòu)域組成，它們都靶向于抗原表位CD3。
[0030] 在一種實施方式中，在單價單元中，所述輕鏈的輕鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域和輕鏈可變區(qū) 結(jié)構(gòu)域都靶向于腫瘤抗原表位CD20 ;所述重鏈的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域CHl和重鏈可變結(jié)構(gòu)域也 靶向于腫瘤抗原表位CD20 ;輕鏈通過二硫鍵與重鏈結(jié)合；重鏈通過一個或多個二硫鍵與所 述融合肽結(jié)合。
[0031] 在一種實施方式中，單鏈單元包括針對CD3的抗體抗-CD3,單價單元包括針對 ⑶20的抗體抗-⑶20。
[0032] 在一種實施方式中，抗體抗-CD20的重鏈的氨基酸序列為序列號1所示的氨基酸 序列，抗體抗-CD20的輕鏈的氨基酸序列為序列號3所示的氨基酸序列，以及所述抗-C