專利名稱：一種冰致微結(jié)構(gòu)軟體組織的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
:本發(fā)明涉及一種用于體內(nèi)器官替換的人工器官軟體組織的制備方法，該方法是一種組織工程三維軟體組織的制備方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
:世界上每年患有組織缺損或器官衰竭的病人數(shù)逾千萬(wàn)，僅美國(guó)每年以外科手術(shù)治療此類病人約800萬(wàn)。然而，解決這一問題最有效的方法是對(duì)缺損器官進(jìn)行人工替代。而人工替代生物主要途徑有以下兩個(gè):一是采用自體或異體器官移植，然而，供體的匱乏和排斥反應(yīng)一直制約著組織器官移植；二是采用人工器官。傳統(tǒng)的人工器官常用金屬、陶瓷或高分子材料制作。由于這種人造器官的內(nèi)部結(jié)構(gòu)、生物活性和可降解性方面的不完備性，替代效果不甚理想，不能防止患者的病情進(jìn)一步惡化。為了克服這些局限，組織工程為體外培養(yǎng)活體組織器官提供了可能，它有望恢復(fù)人體器官組織更多的生化功能，基于此目的，提出了一種冰致微結(jié)構(gòu)軟體支架的制備方法。由于不同的器官都具有特定的內(nèi)部微結(jié)構(gòu)，故根據(jù)個(gè)體差異制備不同特定組織結(jié)構(gòu)器官軟體支架是對(duì)現(xiàn)有人工器官制備的創(chuàng)新和探索。發(fā)明專利CN102525688A公開了一種同時(shí)具有內(nèi)部微結(jié)構(gòu)和個(gè)性化外形的組織工程支架的制造方法，該方法首先用三維立體蠟型打印機(jī)打印多孔結(jié)構(gòu)的負(fù)型；然后將具有自凝或熱凝特性的生物材料用溶液或生理鹽水均勻成漿狀，灌入多孔結(jié)構(gòu)支架負(fù)型的孔中，冷卻凝固，并將支架表面多余的生物材料刮去；最后將灌注后的支架負(fù)型置入加熱爐中加熱至高于支架蠟型的熔點(diǎn)溫度，持續(xù)加熱至石蠟熔化消失，并用生理鹽水對(duì)其進(jìn)行沖洗，從而得到同時(shí)具有內(nèi)部微結(jié)構(gòu)和個(gè)性化外形的組織工程支架。該方法的優(yōu)點(diǎn)是:具有較廣的生物材料適應(yīng)性、內(nèi)部微結(jié)構(gòu)可控，可實(shí)現(xiàn)同時(shí)具有內(nèi)部微結(jié)構(gòu)和個(gè)性化外形的組織工程支架的制備。但是該方法仍然存在如下問題及不足:首先，需要設(shè)計(jì)及制造支架結(jié)構(gòu)負(fù)型，延長(zhǎng)了支架的制作時(shí)間，提高了成本；其次，支架需要經(jīng)過(guò)高溫處理，這無(wú)形就增加了生物支架的污染幾率；最后，該方法不能用于制備人工器官的軟體支架。公開號(hào)為CN101219240A的發(fā)明專利公開了一種帶通道的活體組織的制備方法，該方法首先將彈性高分子材料溶于有機(jī)溶劑，將細(xì)胞基質(zhì)材料加入細(xì)胞凍存液；把選定的細(xì)胞與含凍存液的細(xì)胞基質(zhì)材料溶液混合均勻；用計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)帶管道的活體組織模型，根據(jù)離散堆積-原理，利用快速成型設(shè)備按照計(jì)算機(jī)模型結(jié)構(gòu)所規(guī)劃的路徑，將上述彈性高分子材料溶液、細(xì)胞-基質(zhì)材料溶液的混合物通過(guò)不同的噴頭積壓貨噴射出來(lái)，形成帶管道的彈性高分子材料、細(xì)胞基質(zhì)材料的雜合體。然后在低溫下冷藏活在液氮中長(zhǎng)期凍存，復(fù)蘇后可直接由于組織或 器官的修復(fù)。該方法的優(yōu)點(diǎn)是:有效避免了細(xì)胞在組裝后若不及時(shí)使用就會(huì)出現(xiàn)壞死的現(xiàn)象，同時(shí)該方法也克服了所組裝的細(xì)胞-材料三維結(jié)構(gòu)力學(xué)性能較差的缺陷。但是該方法仍然存在如下問題及不足:該方法所制備的活體組織，其內(nèi)部的三維通道結(jié)構(gòu)并不能得到完全的滿足，因?yàn)樵趦?nèi)部通道結(jié)構(gòu)還沒有定型之前其還不能承受負(fù)載作用，故實(shí)際制備過(guò)程中的通道結(jié)構(gòu)與預(yù)先設(shè)計(jì)好的三維通道結(jié)構(gòu)還存在很大的差異；此外通道直接成型還存在一定的難度，軟體支架內(nèi)部通道對(duì)通道尺寸有一定的要求
發(fā)明內(nèi)容
:為了克服現(xiàn)有技術(shù)不能制備具有特定內(nèi)部微結(jié)構(gòu)的器官軟體組織的要求，本發(fā)明提出了一種冰致微結(jié)構(gòu)軟體組織支架的制備方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種冰致微結(jié)構(gòu)軟體組織的制備方法，首先運(yùn)用計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)好具有軟體組 織通道網(wǎng)狀微結(jié)構(gòu)的模型，然后利用增材制造技術(shù)制備具有通道微結(jié)構(gòu)的樹脂模具，并往樹脂模具中灌注純水冷凍后剝離，從而得到具有通道微結(jié)構(gòu)的冰致模具；最后在低溫下往此冰致模具體系中灌注預(yù)先配置好的具有組織活體細(xì)胞、生長(zhǎng)因子等的PVA水凝膠，待其穩(wěn)定成型后，將其放置于5 10C°的環(huán)境下，直至冰致通道慢慢溶化完全，最終所獲得的軟體支架就是具有微通道結(jié)構(gòu)的軟體組織支架。該方法具體包括以下步驟:步驟1、運(yùn)用計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)好具有軟體組織通道網(wǎng)狀微結(jié)構(gòu)的模型； 步驟2、將步驟I所構(gòu)建的模型數(shù)據(jù)輸入到快速成型機(jī)，并利用快速成型技術(shù)制造具有通道微結(jié)構(gòu)的樹脂模具；步驟3、往步驟2所得的樹脂模具中灌注滿純水，并在_5'10C°低溫環(huán)境下進(jìn)行冷凍后，將樹脂模具剝離，從而得到通道微結(jié)構(gòu)的冰致模具；步驟4、取用病患個(gè)體的器官組織細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)液為高糖DMEM培養(yǎng)液，其中每IOOml培養(yǎng)液中添加有IOml胎牛血清、29.2mg谷氨酰胺和IOmg青霉素/鏈霉素，經(jīng)過(guò)多次傳代達(dá)到需求數(shù)量，使用前用胰酶消化，并加入DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液從而制備出具有特定細(xì)胞密度的細(xì)胞懸浮液；步驟5、根據(jù)臨床需求取具有特定PVA濃度的PVA水溶液，并將該溶液與步驟4所得到的組織細(xì)胞懸浮液按一定體積比均勻混合，溫度控制在oc° ;步驟6、將步驟5所得到的混合液與適量5%濃度的三磷酸鈉水溶液混合均勻，以使水凝膠發(fā)生交聯(lián)，并在_5C°的低溫條件下，立即將混合溶液灌注到步驟3所得到的具有通道微結(jié)構(gòu)的冰致模具中，待含有組織細(xì)胞的PVA水凝膠穩(wěn)定成型后將其取出，并置于5C°的環(huán)境下，直至冰致通道慢慢溶化完全，水從通道結(jié)構(gòu)排出軟體組織；制備出最終軟體組織支架。本發(fā)明的有益效果是:I)本發(fā)明的軟體組織的制備過(guò)程中采用了冰來(lái)制備軟體組織通道微結(jié)構(gòu)，不但保證了通道結(jié)構(gòu)在成型之前不會(huì)因外界作用發(fā)生結(jié)構(gòu)變形，同時(shí)結(jié)構(gòu)負(fù)型的去除也不必做任何特殊處理，只需要在5C°環(huán)境下帶冰致通道溶化即可，這無(wú)形中就避免了因高溫處理給原體組織帶來(lái)污染；2)本發(fā)明的通道微結(jié)構(gòu)可以根據(jù)實(shí)際需求來(lái)設(shè)計(jì)，從而實(shí)現(xiàn)組織通道微結(jié)構(gòu)的人為控制，這為實(shí)踐制備帶來(lái)了極大的便利；此方法不但滿足了組織對(duì)通道微結(jié)構(gòu)的需求，而且其制備過(guò)程較為簡(jiǎn)便，容易操作，制備成本也很低廉，具有廣泛的適用性；3)本發(fā)明采用的器官自身組織細(xì)胞和PVA水凝膠來(lái)制備的軟體組織，故該軟體組織是一種活體組織，可以減少器官組織替換過(guò)程中的排斥免疫反應(yīng)和給病人帶來(lái)的痛苦。


圖1是實(shí)施例中冰致模具所制備的類肝軟組織支架。
具體實(shí)施實(shí)例本實(shí)施例中以肝軟組織為的制備例，來(lái)描述一種冰致微結(jié)構(gòu)軟體組織的制備方法，具體包括以下步驟:步驟1、運(yùn)用CAD軟件設(shè)計(jì)需要制備的，具有肝軟體組織通道網(wǎng)狀微結(jié)構(gòu)的組織模型；步驟2、將步驟I所構(gòu)建的模型數(shù)據(jù)輸入到快速成型機(jī)，并利用快速成型技術(shù)制造具有通道微結(jié)構(gòu)的樹脂模具；步驟3、往步驟2所得的樹脂模具中灌注滿純水，并在_5C°冷凍后將樹脂模具剝離，從而得到通道微結(jié)構(gòu)的冰致模具；

步驟4、取用1.0X IO6個(gè)病患個(gè)體肝組織細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)液為高糖DMEM培養(yǎng)液，每IOOml培養(yǎng)液中添加有IOml胎牛血清、29.2mg谷氨酰胺和IOmg青霉素/鏈霉素，經(jīng)過(guò)多次傳代已達(dá)到需求數(shù)量,使用前用胰酶消化,并加入DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液從而制備出細(xì)胞密度為7.0X IO8細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸浮液；步驟5、本實(shí)施例根據(jù)臨床需求，取PVA百分含量為25%的水凝膠材料，并將其與步驟2所得到的組織細(xì)胞懸浮液按2:3的體積比均勻混合；步驟6、將步驟5所得到的混合液與5%濃度的三磷酸鈉水溶液混合均勻，體積比為49:1，以使水凝膠發(fā)生交聯(lián)，并在_5C°的低溫環(huán)境條件下，立即將混合溶液灌注到步驟3所得到的具有通道微結(jié)構(gòu)的冰致模具中直至灌滿，待含有組織細(xì)胞的PVA水凝膠穩(wěn)定成型后將其取出，并置于5C°的環(huán)境下，直至冰致通道慢慢完全溶化，水從通道結(jié)構(gòu)排出軟體組織；獲得最終軟體組織支架。
權(quán)利要求
1.一種冰致微結(jié)構(gòu)軟體組織的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟1、設(shè)計(jì)好具有軟體組織通道網(wǎng)狀微結(jié)構(gòu)的模型； 步驟2、將步驟I所構(gòu)建的模型數(shù)據(jù)輸入到快速成型機(jī)，并利用快速成型技術(shù)制造具有通道微結(jié)構(gòu)的樹脂模具； 步驟3、往步驟2所得的樹脂模具中灌注滿純水，并在-5 -10C°低溫環(huán)境下進(jìn)行冷凍后，將樹脂模具剝離，從而得到通道微結(jié)構(gòu)的冰致模具； 步驟4、取用病患個(gè)體的器官組織細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)液為高糖DMEM培養(yǎng)液，其中每IOOml培養(yǎng)液中添加有IOml胎牛血清、29.2mg谷氨酰胺和IOmg青霉素/鏈霉素，經(jīng)過(guò)多次傳代達(dá)到需求數(shù)量，使用前用胰酶消化，并加入DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液從而制備出具有特定細(xì)胞密度的細(xì)胞懸浮液； 步驟5、根據(jù)臨床需求，取具有特定PVA濃度的PVA水溶液，并將該溶液與步驟4所得到的組織細(xì)胞懸浮液按一定體積比均勻混合，溫度控制在0C° ; 步驟6、將步驟5所得到的混合液與適量5%濃度的三磷酸鈉水溶液混合均勻，以使水凝膠發(fā)生交聯(lián)，并在_5C°的低溫條件下，立即將混合溶液灌注到步驟3所得到的具有通道微結(jié)構(gòu)的冰致模具中，待含有組織細(xì)胞的PVA水凝膠穩(wěn)定成型后將其取出，并置于5C°的環(huán)境下，直至冰致通道慢慢溶化完全，水從通 道結(jié)構(gòu)排出軟體組織；制備出最終軟體組織支架。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種冰致微結(jié)構(gòu)軟體組織的制備方法，屬于生物組織工程領(lǐng)域。該方法首先設(shè)計(jì)好具有軟體組織通道網(wǎng)狀微結(jié)構(gòu)的模型，然后利用增材制造技術(shù)制備具有通道微結(jié)構(gòu)的樹脂模具，并往樹脂模具中灌注純水冷凍后剝離，從而得到具有通道微結(jié)構(gòu)的冰致模具；最后在低溫下往此冰致模具體系中灌注預(yù)先配置好的具有組織活體細(xì)胞、生長(zhǎng)因子等的PVA水凝膠，待其穩(wěn)定成型后，將其放置于5~10C°的環(huán)境下，直至冰致通道慢慢溶化完全，最后所獲得的就是具有通道微結(jié)構(gòu)的軟體組織。本方法保證了通道結(jié)構(gòu)在成型之前不會(huì)因外界作用發(fā)生結(jié)構(gòu)變形，避免了因高溫處理給原體組織帶來(lái)污染；制備過(guò)程較為簡(jiǎn)便，容易操作，制備成本也很低廉，具有廣泛的適用性。
文檔編號(hào)A61L27/16GK103120807SQ20131001617
公開日2013年5月29日 申請(qǐng)日期2013年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月16日
發(fā)明者汪焰恩, 魏慶華, 潘飛龍, 葉東東, 龍水軍, 毛海龍, 郭葉, 李欣培, 李川川, 張磊, 楊明明, 魏生民 申請(qǐng)人:西北工業(yè)大學(xué)