e-咔啉-3-羧酸與寡肽的綴合物，其制備，納米結(jié)構(gòu)和作為抗腫瘤劑的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】e-咔啉-3-羧酸與寡肽的綴合物，其制備，納米結(jié)構(gòu)和作為抗腫瘤劑的應(yīng)用。本發(fā)明公開(kāi)P-咔啉-3-羧酸與6種寡肽的綴合物(8a-f)，6種寡勝選自Leu-Pro-Asn-lie-Ser-Lys-Pro(LPNISKP)，Arg-Gly-Asp-Ser(RGDS)，Arg-Gly-Asp-Phe(RGDF)，Arg-Gly-Asp-Val(RGDV)，Leu-Asp-Ser(LDV)和Lys-Glu(KE)?公開(kāi)了它們的制備方法，公開(kāi)了它們的納米結(jié)構(gòu)，公開(kāi)了它們對(duì)HL60、HCT-8、HeLa、BEL-7402、HepG2五株腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，進(jìn)一步公開(kāi)了它們對(duì)荷S180小鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。結(jié)果表明本發(fā)明的e-咔啉-3-羧酸與6種寡肽的綴合物具有優(yōu)秀的抗腫瘤作用。因而本發(fā)明的P-咔啉-3-羧酸與6種寡肽的綴合物作為抗腫瘤藥物具有臨床應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】β -咔啉-3-羧酸與寡肽的綴合物，其制備，納米結(jié)構(gòu)和作 為抗腫瘤劑的應(yīng)用 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及圖1結(jié)構(gòu)的β -咔啉-3-羧酸與6種寡肽的綴合物（8a-f)， 6 種寡膚選自 Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro (LPNISKP) ,Arg-Gly-Asp-Ser (RGDS)， Arg-Gly-Asp-Phe(RGDF),Arg-Gly-Asp-Val(RGDV)，Leu-Asp-Val (LDV)和 Lys-Glu(KE)。涉 及它們的制備方法。涉及它們的納米結(jié)構(gòu)。涉及它們對(duì)HL60，HCT-8，HeLa、BEL-7402、!fepG2 五株腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，進(jìn)一步涉及它們對(duì)荷S180小鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。結(jié)果 表明本發(fā)明的β-咔啉-3-羧酸與6種寡肽的綴合物具有優(yōu)秀的抗腫瘤作用。因而本發(fā)明 的β-咔啉-3-羧酸與6種寡肽的綴合物作為抗腫瘤藥物具有臨床應(yīng)用前景。本發(fā)明屬于 生物醫(yī)藥領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的主要疾病之一，攻克癌癥一直是世界矚目的研究 課題。世界衛(wèi)生組織調(diào)查表明癌癥患者正在逐年增加，我國(guó)癌癥年發(fā)病人數(shù)在120萬(wàn)左右， 每年死于癌癥的人數(shù)高達(dá)90萬(wàn)人以上，已成為僅次于心血管病的第二大疾病。腫瘤的治療 方法有手術(shù)治療，放射治療和藥物治療（化療）。目前，化療仍然是臨床治療腫瘤的主要手 段。由于臨床化療藥物的療效不理想和毒副作用大，所以尋找療效好和毒副作用小的抗腫 瘤新藥具有明確的價(jià)值。
[0003] 隨著腫瘤研究深化，最近幾年抗腫瘤藥物不斷從傳統(tǒng)的細(xì)胞毒藥物向發(fā)展非細(xì)胞 毒藥物過(guò)渡。β-咔啉是天然來(lái)源的代表性細(xì)胞毒性抗腫瘤化合物。發(fā)明人認(rèn)識(shí)到，β-咔 啉抗腫瘤的本質(zhì)是細(xì)胞毒性，來(lái)自它與腫瘤細(xì)胞DNA之間的共價(jià)扦插。這種形式的扦插除 導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖受制外，還可造成嚴(yán)重毒性反應(yīng)。發(fā)明人曾經(jīng)發(fā)現(xiàn)，β-咔啉與腫瘤細(xì)胞 DNA之間的扦插包括π-π堆積和共價(jià)扦插兩個(gè)步驟。在進(jìn)一步的研究中，發(fā)明人認(rèn)識(shí)到， β-咔啉的抗腫瘤活性來(lái)自堆積，而嚴(yán)重毒性則來(lái)自共價(jià)扦插。發(fā)明人還認(rèn)識(shí)到，在 β-咔啉的3位引入羧甲基及衍生基生成β-咔啉-3-羧酸可增強(qiáng)β-咔啉與腫瘤細(xì)胞DNA 之間的π-π堆積，降低共價(jià)扦插。發(fā)明人進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到，以Ne-NO2-Arg為連接臂將β-咔 啉-3-羧酸與LPNISKP，RGDS，RGDF，RGDV，LDV和KE六種寡肽綴合，除可進(jìn)一步增強(qiáng)β -咔 啉與腫瘤細(xì)胞DNA之間的Ji-JI堆積，避免共價(jià)扦插外，還可形成納米結(jié)構(gòu)，促使它在轉(zhuǎn)運(yùn) 中不被巨噬細(xì)胞吞噬。這些種特色使得本發(fā)明具有突出的創(chuàng)造性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的第一個(gè)內(nèi)容是提供圖1的以Ne-NO2-Arg為連接臂的β -咔啉-3-羧酸與 LPNISKP，RGDS，RGDF，RGDV，LDV 和 KE 的綴合物（8a-f)。
[0005] 本發(fā)明的第二個(gè)內(nèi)容是提供以Ne-NO2-Arg為連接臂的β-咔啉-3-羧酸與 LPNISKP，RGDS，RGDF，RGDV，LDV和KE的綴合物的制備方法。該方法包括以下步驟：
[0006] I) L-色氨酸在稀硫酸催化下與甲醒進(jìn)行Pictet-Spengler縮合生成3S-1，2, 3, 4-四氫-β-咔啉-3-羧酸（I);
[0007] 2)3S-1，2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧酸（1)轉(zhuǎn)化為 3S-1，2,3,4-四氫-β-咔 啉-3-羧酸甲酯（2);
[0008] 3)用尚猛酸鐘將3S-1，2, 3,4_四氧- β-咔琳_3_駿酸甲醋⑵氧化為β -咔 啉-3-羧酸甲酯（3);
[0009] 4) β -咔啉-3-羧酸甲酯（3)水解為β -咔啉-3-羧酸（4);
[0010] 5) β -咔啉-3-羧酸⑷與硝基精氨酸芐酯偶聯(lián)為β -咔啉-3-酰 基-Nci-NO2-Arg-OBzl (5);
[0011] 6) β -咔啉-3-?；?Ne-NO2-Arg-〇Bz 1(5)水解為 β -咔啉-3-酰 基-Ne-NO2-Arg (6);
[0012] 7)按照多肽合成的標(biāo)準(zhǔn)方法制備LPNISKP，KE，RGDS，RGDF，RGDV和LDV的中間 體 Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys (Fmoc)-Pro-OBzl(9a)，Lys(Fmoc)-Glu(OBzl)-OBzl(9b)， Arg-Gly-Asp (OBzl)-Ser-OBzl(9c)，Arg-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl(9d)， Arg-Gly-Asp (OBzl)-Val-OBzl(9e)和 Leu-Asp (OBzl)-Val-OBzl(9f);
[0013] 8)將 Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys (Fmoc) - Pro-OBzl, Arg-Gly-Asp (OBzl) -Ser-OBzl，Arg-Gly-Asp (OBzl) - Phe-OBzl， Arg-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzI， Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl 和 Lys(Fmoc)-Glu(OBzl)-OBzl 分別與β -咔啉-3-?；?Ν°-Ν02-Αι^(6)偶聯(lián)，制備β -咔啉-3-?；?#-勵(lì)2-八1^-1^11-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys (Fmoc) -Pro-OBzl (7a)，β -咔琳 _3_ 酉先基-NG-N02-Arg-Lys (Fmoc) -G Iu(OBzI)-OBzI (7b)，β -咔啉 _3_ 酉先基-Nci-NO2-Arg-Arg-Gly-Asp (OBzl)-Ser-OBzl (7c)， β -咔琳 _3_ 酉先基-Nci-NO2-Arg-Arg-Gly-Asp (OBzl) -Phe-OBzl (7d)，β -咔琳 _3_ 酉先基-N G-N02_Arg-Arg-Gly-Asp (OBzl) -Val-OBzl (7e)和 β -咔琳 _3_ 酸基-Nci-NO2-Arg-Leu-Asp (0Bzl)-Val-0Bzl(7f) ;9)將 β-咔啉-3-?；?NG-N02-Arg-Leu-Pr〇-Asn_lle-Ser-Lys( Fmoc) -Pro-OBzl (7a)，β -咔琳 _3_ 酉先基-NG-N02-Arg-Lys (Fmoc) -Glu (OBzl) -OBzl (7b)， β -咔琳-3-酸基-Nci-NO2-Arg-Arg-Gly-Asp (OBzl) -Ser-OBzl (7c)，β -咔琳-3-酸基-N G-N02_Arg-Arg-Gly-Asp (OBzl) -Phe-OBzl (7d)，β -咔琳 _3_ 酉先基-Nci-NO2-Arg-Leu-Asp (0 Bzl)-Val-OBzl (7e)和 β-咔啉-3-?；?NG-N02-Arg-Leu-Asp (OBzl)-Val-OBzl (7f)脫 保護(hù)基，制備本發(fā)明化合物β _咔啉_3_酸基-Ng-NO2-Arg-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pr o (8a)，β -咔琳-3-酸基-Nci-NO2-Arg-Lys-Glu (8b)，β -咔琳-3-酸基-Ne-NO2-Arg-Arg-Gly-Asp-Ser (8c)，β -咔琳 _3_ 酉先基-Nci-NO2-Arg-Arg-Gly-Asp-Phe (8d)，β -咔琳 _3_ 酉先 基-Ng-NO2-Arg-Arg-Gly-Asp-Val (8e)和 β -咔琳 _3_ 酸基-Ng-NO2-Arg-Leu-Asp-Val (8f)。
[0014] Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys (Fmoc) - Pro-OBzl (9a)和 Lys (Fmoc)-Glu (OBzl)-OBzl (9b)的制備可用圖 1 概括。
[0015] Arg-Gly-Asp (OBzl)-Ser-OBzl (9c), Arg-Gly-Asp (OBzl)-Phe-OBzl (9d), Arg-Gly-Asp (OBzl) -Val-OBzl (9e)和 Leu-Asp (OBzl) -Val-OBzl (9f)的制備可用圖 2 概括。
[0016] 8a_f的制備可用圖3概括。
[0017] 本發(fā)明的第二個(gè)內(nèi)容是評(píng)價(jià)8a_f的抗腫瘤細(xì)胞增殖活性。即采用MTT法評(píng)價(jià)8a_f 抑制HL60、HCT-8、HeLa、BEL-7402和!tepG2五株腫瘤細(xì)胞增殖活性，計(jì)算8a-f抑制這五種 腫瘤細(xì)胞增殖的IC 5。值。
[0018] 本發(fā)明的第三個(gè)內(nèi)容是評(píng)價(jià)8a-f對(duì)荷S180小鼠腫瘤增長(zhǎng)的抑制作用。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1 β -咔啉-3-羧酸與6種寡肽的綴合物結(jié)構(gòu)圖。
[0020] 圖29a和9b的合成路線.i)DCC，H0Bt，NMM ;ii)氯化氫對(duì)乙酸乙酯溶液（4Μ) ;iii) NaOH水溶液（2M)，甲醇。
[0021] 圖39c_f的合成路線.9c中AA = Ser殘基，9d中AA = Phe殘基，9e中AA = Val 殘基；i)DCC，HOBt，NMM ;ii)氯化氫對(duì)乙酸乙酯溶液（4M) ;iii)NaOH水溶液，甲醇。
[0022] 圖48a_f的合成路線.i)甲醛，濃H2SO4，室溫6小時(shí)；ii)甲醇，SOCl 2 ;iii)KMn04， 丙酮，室溫反應(yīng) l〇h ;iv)NaOH 水溶液（2M)，甲醇；v)DCC，HOBt，NMM，THF ;vi)NaOH 水溶液 (2M)，甲醇；￥^)00：，!108扒畫(huà)，01^，寡肽片段9&-91￥1^)恥0!1水溶液（2厘)，甲醇.7(3-76， 8c-8e中AA分別代表Ser，Phe和Val殘基。
[0023] 圖58a_f在25°C下7天的粒徑。
[0024] 圖68a_f在I X l(T8mg/mL濃度下的透射電鏡照片。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列實(shí)施例。這些實(shí)施例完全是例證性的，它 們僅用來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0026] 實(shí)施例1制備3S-1，2,3,4_四氫-β-咔啉3-羧酸（1)
[0027] 室溫?cái)嚢柘峦?00mL蒸餾水中緩慢滴入0. ImL濃硫酸。往得到的稀硫酸溶液中加 入2. 520g(12. 4mmol)L-色氨酸并超聲振蕩至L-色氨酸完全溶解。往得到的溶液中加入5mL 濃度為37%的甲醛溶液。得到的無(wú)色溶液室溫?cái)嚢?小時(shí)，薄層層析監(jiān)測(cè)（二氯甲烷：甲 醇，3 : 1)到L-色氨酸消失，終止反應(yīng)。往反應(yīng)溶液中緩慢滴加濃氨水，調(diào)至pH6,靜置半 小時(shí)。布氏漏斗減壓濾出生成的沉淀，沉淀用水及丙酮反復(fù)淋洗3次，將濾出的無(wú)色固體平 鋪于培養(yǎng)皿，置于通風(fēng)櫥中吹干后得到2. 640g (99% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色粉末。ESI-MS (m/ e) :215[Μ-ΗΓ。
[0028] 實(shí)施例2制備3S-1，2, 3,4_四氧-β -咔琳_3_竣酸甲醋（2)
[0029] 冰浴和攪拌下往25mL甲醇中緩慢滴入2. 6mL二氯亞砜，活化30分鐘后，往里加 2. 16g(10mm〇l)3S-l，2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧酸（1)，得到的無(wú)色溶液室溫?cái)嚢?8小 時(shí)，薄層層析監(jiān)測(cè)（二氯甲烷：甲醇，2 : 1)至原料點(diǎn)消失，終止反應(yīng)。將反應(yīng)混合物減壓 濃縮至干，殘留物加30mL甲醇溶解，得到的溶液減壓濃縮至干。該操作再重復(fù)1次。殘留 物加30mL乙醚溶解，得到的溶液減壓濃縮至干。該操作再重復(fù)1次。殘留物柱層析純化 (二氯甲烷：甲醇，80 : 1)，得到1.95g(89%)標(biāo)題化合物，為無(wú)色粉末。ESI-MS(m/e): 232[M+H]+。
[0030] 實(shí)施例3制備β -咔啉-3-羧酸甲酯（3)
[0031] 冰浴和攪拌下往IOOmL丙酮中加入2.0g(9. 26mmo I) 3S-1，2,3,4-四氫-β-咔 啉-3-羧酸甲酯，緩慢加入3. lg(13. 89mmol)高錳酸鉀粉末。反應(yīng)混合物室溫?cái)嚢?2h，薄 層層析監(jiān)測(cè)（二氯甲烷：甲醇，10 : 1)至3S-1，2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧酸甲酯消失， 終止反應(yīng)。加入IOOmL乙醇，攪拌30分鐘，猝滅未反應(yīng)的高錳酸鉀，減壓過(guò)濾除去二氧化錳， 濾液減壓濃縮至干，得到淡黃色油狀物。柱層析分離（二氯甲烷：甲醇，25 : 1)得到的混 合物，得到1.05g(54% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色粉末。ESI-MS(m/e) :228[M+H] +。
[0032] 實(shí)施例4制備β -咔啉-3-羧酸（4)
[0033] 冰浴和攪拌下往30mL甲醇中加入4. lg(17. 98mmol) β -咔啉-3-羧酸甲酯，8mL NaOH水溶液（2M)，反應(yīng)8小時(shí)，用飽和KHSO4水溶液將反應(yīng)液調(diào)至pH7,減壓濃縮至干，向殘 余物中加入30mL蒸餾水，用飽和KHSO 4水溶液將其調(diào)至pH2,用乙酸乙酯萃?。?0mLX 3)。 將乙酸乙酯層合并，用飽和NaCl洗（50mLX 3)，用無(wú)水Na2SO4干燥。過(guò)濾，減壓濃縮至干， 得到 3. 890g(98. 9% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色粉末。ESI-MS(m/e) :213. 2[M+H] +。
[0034] 實(shí)施例 5 制備 β -咔啉-3-?；?Ne-NO2-Arg- (NO2) -OBzl (5)
[0035] 冰浴和攪拌下往IOOmL無(wú)水N，N-二甲基甲酰胺（DMF)中加入2. 344g (7. IOmmol) β -咔啉-3-羧酸，4. 900g(12. 4mmol)TosH · Nc-NO2-Arg-OBzl, I. 402g(10. 4mmol)H0Bt，攪 拌溶解。將2. 589g (12. 6mmol) DCC溶于IOmL無(wú)水DMF中，緩慢滴加至反應(yīng)瓶中，充分?jǐn)嚢?5分鐘。N-甲基嗎啉（NMM)調(diào)反應(yīng)液至pH8,反應(yīng)混合物室溫?cái)嚢?小時(shí)后，吹干DMF。得 到的殘余物用150mL乙酸乙酯溶解,依次用飽和碳酸氫鈉水溶液洗（30mLX3),飽和氯化鈉 水溶液洗（30mLX3)，5%硫酸氫鉀水溶液洗（30mLX3)，飽和氯化鈉水溶液洗（30mLX3)， 飽和碳酸氫鈉水溶液洗（30mLX3)，飽和氯化鈉水溶液洗（30mLX3)。合并的乙酸乙酯層 用無(wú)水硫酸鈉干燥2小時(shí)，過(guò)濾，濾液減壓濃縮至干得到淡黃色油狀物。經(jīng)過(guò)柱層析分離 (二氯甲烷：甲醇，30 : 1)，得到3. 565g (97 % )標(biāo)題化合物，為無(wú)色粉末。ESI-MS (m/e): 503. 2[M+H]+。
[0036] 實(shí)施例6制備β -咔啉-3-?；?Ne-NO2-Arg (6)
[0037] 冰浴和攪拌下往15mL甲醇中加入200mg(0. 285mmol) β -咔啉-3-酰 基-NG-N02-Arg-0bzl，加入ImL NaOH水溶液（2Μ)，冰浴攪拌3小時(shí)，TLC顯示（二氯甲烷： 甲醇，10 : 1)原料點(diǎn)消失，用飽和KHSO4水溶液將反應(yīng)液調(diào)至pH7,減壓濃縮至干，向殘余 物中加入IOmL蒸餾水，用飽和KHSO 4水溶液調(diào)至pH2,用乙酸乙酯萃取（50mLX 3)，將乙酸 乙酯層合并，用飽和NaCl洗（50mLX 3)，用無(wú)水Na2SO4干燥。過(guò)濾，濾液減壓濃縮至干，得 123mg(97% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色粉末。ESI-MS(m/e) :413. 3[M-H]_。
[0038] 實(shí)施例7制備Pro-OBzl
[0039] 冰浴和攪拌下往50mL苯甲醇中，滴加20mL二氯亞砜（S0C12)。攪拌30分鐘后， 往反應(yīng)混合物中加入5. 00g(43. 48mmol)L-Pro,室溫?cái)嚢?8小時(shí)，反應(yīng)液減壓濃縮，殘留 物用8mL甲醇溶解，再減壓濃縮至干。該操作重復(fù)2次。殘留物加無(wú)水乙醚，減壓濃縮至 干。該操作重復(fù)2次。得到的脯氨酸芐酯鹽酸鹽的淡黃色固體用甲醇-無(wú)水乙醚重結(jié)晶， 得 5.35g(56% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/e) :206[M+H]+。
[0040] 實(shí)施例8制備Boc-Ser
[0041] 冰浴和攪拌下往ImL蒸饋水中加入5g(46mmol)L-Ser，并緩慢滴加25mL NaOH水 溶液（2M)，得到溶液（I)。將13.08g(60mmol) (Boc)2O溶解于25mL二氧六環(huán)中，得到溶液 (II)。將溶液（II)滴加至冰浴攪拌下的溶液（I)中，再緩慢滴加 NaOH水溶液（2M)調(diào)節(jié) PH9,混合物冰浴下攪拌。30分鐘后，檢測(cè)反應(yīng)混合物的pH值，并用NaOH水溶液（2M)調(diào)節(jié) pH值使之保持為9,并用水泵抽出反應(yīng)生成的氣體，TLC(二氯甲烷：甲醇，20 : 1)監(jiān)測(cè)反 應(yīng)進(jìn)程。約48小時(shí)反應(yīng)完全，減壓濃縮除去二氧六環(huán)，殘留物用5mL水溶解，以飽和硫酸氫 鉀水溶液調(diào)節(jié)PH2,加50mL乙酸乙酯萃取三次，合并有機(jī)相，加5% KHSO4洗滌3次，并以飽 和NaCl水溶液洗滌至中性，分出乙酸乙酯層，加入無(wú)水硫酸鈉干燥。過(guò)濾，濾液減壓濃縮， 殘留物用乙酸乙酯-石油醚重結(jié)晶，得8. 18g(95%)標(biāo)題化合物，為無(wú)色晶體。ESI-MS(m/ e) :204[Μ-ΗΓ。
[0042] 實(shí)施例 9 制備 Boc-Lys (Fmoc) -Pro-OBz I
[0043] 冰浴和攪拌下往無(wú)水四氫呋喃（THF)中加4. 68g(10. 00mmol)Boc_Lys (Fmoc), I. 63g(12. 00mmol)H0Bt，并使完全溶解。然后加2. 47g(12. 00mmol)DCC，反應(yīng)混合物冰浴攪 拌10分鐘，得溶液（I)。
[0044] 將 2. 26g(ll. 00mmol)Pr〇-0Bzl 用無(wú)水 THF溶解，NMM調(diào) pH9,得到反應(yīng)液（II)。冰 浴下把反應(yīng)液（II)加入反應(yīng)液（I)中，得到的反應(yīng)混合物室溫?cái)嚢?4h。TLC(二氯甲烷： 甲醇，30 : 1)顯示原料點(diǎn)消失。濾除二環(huán)己基脲（D⑶)，反應(yīng)混合物減壓濃縮至干，殘留物 用乙酸乙酯溶解，濾除不溶物。得到的溶液依次用5% NaHCO3水溶液洗，飽和NaCl水溶液 洗，5% KHSO4水溶液洗和飽和NaCl水溶液洗。乙酸乙酯層用無(wú)水Na2SO4干燥，過(guò)濾，濾液 減壓濃縮至干，得到5. 61g(85. 6%)淡黃色油狀物。柱層析（二氯甲烷：甲醇，50 : 1)純 化，得4.9g(75% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/e) :655·8[Μ+Η]+。
[0045] 實(shí)施例 10 制備 Lys (Fmoc)-Pro-OBzl
[0046] 冰浴和攪拌下，往48mL氯化氫對(duì)乙酸乙酯溶液（4M)中加3. 50g (5. 33mmol) Boc-Lys(Fmoc)-Pr〇-0Bzl，攪拌2小時(shí)后TLC(二氯甲烷：甲醇，30 : 1)顯示原料點(diǎn)消失， 減壓濃縮，殘留物反復(fù)用少量乙醚進(jìn)行減壓濃縮以除去氯化氫，最后得到2. 73g(92% )標(biāo) 題化合物，為無(wú)色固體，直接用于下一步反應(yīng)。ESI-MS(m/e) :556[M+H] +。
[0047] 實(shí)施例 11 制備 Boc-Ser-Lys (Fmoc)-Pro-OBz I
[0048] 按照實(shí)施例 10 的操作，由 2. 15g (3. 87mmol) Lys (Fmoc)-Pro-OBzl 和 0· 87g(4. 26mmol)Boc-Ser 得 I. 21g(46 % )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/e): 758[M+H]+。
[0049] 實(shí)施例12制備Boc-Leu
[0050] 按照實(shí)施例 8 的操作，由 5g (37mmol) L-Leu 和 13. 50g (62. 5mmol) (Boc) 20 得 7.88g(92%)標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/e) :231[Μ-ΗΓ。
[0051] 實(shí)施例13制備Boc-Asn
[0052] 按照實(shí)施例 8 的操作，由 2. 72g (20. Bmmol) T-Asn 與 5. 84g (26. 78mmol) (Boc) 20 得 4.21g(88%)標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/e) :231[Μ-ΗΓ。
[0053] 實(shí)施例 14 制備 TosH · Ile-OBzl
[0054] 室溫?cái)嚢柘峦?0mL苯甲醇和30mL環(huán)己燒中加10g(76. 22mmol)L_Ile和 15. 7g (91. 46mmol)對(duì)甲苯磺酸。反應(yīng)液加熱到90°C，安裝上分水器和冷凝管，反應(yīng)24小時(shí) 后，TLC(二氯甲烷：甲醇，15 : 1)顯示原料點(diǎn)消失。降溫到60°C左右，加入大量乙醚，充 分?jǐn)嚢?小時(shí)，過(guò)濾，濾出的固體用乙醚泡洗兩次，以便除去苯甲醇，得25. 46g(85% )標(biāo)題 化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/e) :222[M+H] +。
[0055] 實(shí)施例 15 制備 Boc-Asn-Ile-OBzl
[0056] 按照實(shí)施例 9 的操作，由 I. OOg (4. 31mmol) Boc-Asn 和 I. 86g (4. 74mmol) TosH · Ile-OBzl 得到 I. 62g(87% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/e) :436[M+H] +。
[0057] 實(shí)施例 16 制備 Asn-Ile-OBzl
[0058] 按照實(shí)施例 8 的操作，由 I. 53g(3. 50mmol)Boc-Asn-Ile-0Bzl 得到 I. 19g(95% ) 標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體，直接用于下一步反應(yīng)。ESI-MS(m/e) :334[M-H]_。
[0059] 實(shí)施例 17 制備 Boc-Leu-Pro-OBzl
[0060] 按照實(shí)施例 9 的操作，由 I. 14g(5. 33mmol)Boc-Leu 和 0· 97g(4. 85mmol)Pro-OBzl 得到1.75g(84% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/e) :418[M+H]+。
[0061] 實(shí)施例 18 制備 Boc-Leu-Pro
[0062] 按照實(shí)施例6的操作，由I. OOg (2. 39mmol) Boc-Leu-Pro-OBzl脫除節(jié)酯得到 0.713g(91%)標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/e) :328[Μ-ΗΓ。
[0063] 實(shí)施例 19 制備 Boc-Leu-Pro-Asn-Ile-OBzl
[0064] 按照實(shí)施例 9 的操作，由 I. 27g (3. 88mmol) Boc-Leu-Pro 和 I. 46g (4. 27mmol) Asn-Ile-OBzl 得 2.34g(89%)標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/e) :645[M+H] +。
[0065] 實(shí)施例 2〇 制備 Ser-Lys (Fmoc) -Pro-OBz I
[0066] 按照實(shí)施例 8 的操作，由 I. 20g (I. 83mmol) Boc-Ser-Lys (Fmoc)-Pro-OBzl 得到 1.06g(98%)標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/e) :658[Μ-ΗΓ。
[0067] 實(shí)施例 21 制備 Boc-Leu-Pro-Asn-Ile
[0068] 按照實(shí)施例 6 的操作，由 I. IOg(I. 62mmol)Boc-Leu-Pro-Asn-Ile-OBzl 脫除節(jié)酯 得到0. 90g(89% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/e) :555[Μ-ΗΓ。
[0069] 實(shí)施例 22 制備 Boc-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys (Fmoc) -Pro-OBzl
[0070] 按照實(shí)施例 9 的操作，由 0· 85g (I. 44mmol) Boc-Leu-Pro-Asn-Ile 和 0. 77g (I. 31mmol) Ser-Lys (Fmoc) -Pro-OBzl 得 650mg (44 % )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。 ESI-MS(m/e) :1179[M+H]+。
[0071] 實(shí)施例 23 制備 HCl · Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys (Fmoc)-Pro-OBz I (9a)
[0072] 按照實(shí)施例 8 的操作，由 I. OOg (0· 85mmol) Boc-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys (Fmoc) -Pro-OBzl，得到 0.871g(95% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/e) :1079[Μ-ΗΓ。
[0073] 實(shí)施例 24 制備（TosH)2 · Glu (OBzl)-OBzl
[0074] 按照實(shí)施例 14 的操作，由 10. 00g(68. 02mmol)L-Glu，23. 60g(150. (Mmmol)對(duì) 甲苯磺酸和160mL苯甲醇得到38. 34g(84% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/e): 327[M+H]+。
[0075] 實(shí)施例 25 制備 Boc-Lys (Fmoc) -Glu (OBzl) -OBzl
[0076] 按照實(shí)施例 9 的操作，由 4. 68g(10. 00mmol)Boc_Lys (Fmoc)和 7. 45g(ll. I mmol) (TosH)2 · Glu(OBzl)-OBzl 得 7. IOg(91 % )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/e): 777. 5[M+H]+。
[0077] 實(shí)施例 26 制備 HCl · Lys (Fmoc) -Glu (OBzl) -OBzl (9b)
[0078] 按照實(shí)施例 8 的操作，由 4. 67g (6. Ommol) Boc-Lys (Fmoc)-Glu (OBzl)-OBzl 得 3.71g(91%)標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/e) :677·5[Μ+Η] +。
[0079] 實(shí)施例 27 制備 Asp (OBzl)
[0080] 室溫?cái)嚢柘峦?0mL無(wú)水乙醚中滴加4mL&H2S04，攪拌均勻，再加40mL苯甲醇， 攪拌約5分鐘。減壓蒸饋除去乙醚，攪拌下加5. 40g(40mmol)L-Asp。反應(yīng)24小時(shí)后加 入88mL95 %乙醇，反應(yīng)液滴加吡啶調(diào)至pH6,攪拌均勻，放入4°C冰箱析晶保存過(guò)夜。過(guò) 濾，得到的無(wú)色固體用熱水在l〇〇°C攪拌溶解，再放入4°C冰箱過(guò)夜緩慢析晶，過(guò)濾得到 7.2g(81%)標(biāo)題化合物，為無(wú)色片狀晶體。ESI-MS(m/e) :224·2[Μ+Η] +。
[0081] 實(shí)施例 28 制備 Boc-Asp (OBzl)
[0082] 按照實(shí)施例 8 的操作，由 4. 22g(19. 29mmol)Asp (OBzl)和 5. 12g(23. I mmol) (Boc)2O 得到 I. 3g(21% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/e) :324. I [M+H] +。
[0083] 實(shí)施例 29 制備 Boc-Asp (OBzl) -Ser-OBzl
[0084] 按照實(shí)施例 9 的操作，由 808mg (2. 5mmol) Boc-Asp (OBzl)和 740mg (2. 3mmol) TosH .Ile-OBzl 得到 I. 07g(93%)標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/e) :500. 7[M+H]+。
[0085] 實(shí)施例 30 制備 TosH · Gly-OBzl
[0086] 按照實(shí)施例 14 的操作，由 10. 00g(133. 33mmol)L-Gly，15. 73g(91. 46mmol)對(duì)甲苯 磺酸和8〇1^苯甲醇得到38.198(84%)標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體』51-1^(111/6) :165[1+!1]+。
[0087] 實(shí)施例 31Boc-NG-N02-Arg-Gly_0Bzl
[0088] 按照實(shí)施例 9 的操作，由 Boc-Ng-NO2-Arg (9. 9g，31. Ommol)和 TosH .Gly-OBziaLSgdt Immol)得 11. 689g(81 % )標(biāo)題化合物.ESI-MS(m/e): 467. 6[M+H]+。
[0089] 實(shí)施例 32 制備 Boc-Arg-Gly
[0090] 室溫?cái)埾橄峦?10mT,乙醇中加 IOOmg (0· 21mmol) Boc-Ng-NO2-Arg-Gly-OBzl 和 IOmg (0. (Mmmol)鈀碳，通氫氣，室溫反應(yīng)。TLC (二氯甲烷：甲醇，20 : 1)監(jiān)測(cè)反應(yīng)結(jié)束，過(guò) 濾，濾液減壓濃縮得到59. 33mg(85% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/e) :332[M+H]+。
[0091] 實(shí)施例 33 制備 HCl · Asp (OBzl)-Ser-OBzl
[0092] 按照實(shí)施例 8 的操作，由 I. OOg (2. OOmmol) Boc-Asp (OBzl)-Ser-OBzl 得到 0.744g(93%)標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/e) :399[Μ-ΗΓ。
[0093] 實(shí)施例 34 制備 Boc-Arg-Gly-Asp (OBzl) -Ser-OBzl
[0094] 按照實(shí)施例 9 的操作，由 5g (15. IOmmol) Boc-Arg-Gly 和 6. Og (15. 10mmol) Asp(OBzl)-Ser-OBzl 得到 14. 56g(84 % )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS (m/e): 1140[M+H]+。
[0095] 實(shí)施例 35 制備 HCl · Arg-Gly-Asp (OBzl) -Ser-OBzl (9c)
[0096] 按照實(shí)施例 8 的操作，由 I. OOg (I. 75mmol) Boc-Arg-Gly-Asp (OBzl)-Ser-OBzl 得 到 1.67g(93% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/e) :1040[Μ-ΗΓ。
[0097] 實(shí)施例 36 制備 TosH · Phe-OBzl
[0098] 按照實(shí)施例 14 的操作，由 10. OOg(60. 6mmol) L_Phe，15. 73g(91. 46mmol)對(duì)甲苯橫 酸和80mL苯甲醇得到23.96g(93% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/e) :255[M+H] +。
[0099] 實(shí)施例 37 制備 Boc-Asp (OBzl)-Phe-OBzl
[0100] 按照實(shí)施例 9 的操作，由 4. 0g(12. 4mmol)Boc_Asp (OBzl)和 4. 782g(ll. 2mmol) TosH · Phe-OBzl 得到 5. 79g(92% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/e) :560[M+H] +。
[0101] 實(shí)施例 38 制備 HCl · Asp(OBzl)-Phe-OBzl
[0102] 按照實(shí)施例 8 的操作，由 Boc-Asp (OBzl)-Phe_0Bzl5· 6g (10. Ommol)得 4.41g(96%)標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/e) :460[M+H] +。
[0103] 實(shí)施例 39 制備 Boc-Arg-Gly-Asp (OBzl)-Phe-OBzI
[0104] 按照實(shí)施例 9 的操作，由 5g (15. lOmmol) Boc-Arg-Gly 和 7. 08g (15. lmmol) HCl · Asp (OBzl)-Phe-OBzl 得 10. 52g(90 % )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS (m/e): 773. 5[M+H]+。
[0105] 實(shí)施例 40 制備 HCl · Arg-Gly-Asp (OBzl)-Phe-OBzl (9d)
[0106] 按照實(shí)施例 8 的操作，由 Boc-Arg-Gly-Asp (OBzl)-Phe-OBzl (4. 64g，6. Ommol)得 2. 99g(96%)標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/e) :673. 5[M+H] +。
[0107] 實(shí)施例 41 制備 TosH · Val-OBzl
[0108] 按照實(shí)施例 14 的操作，由 10. 00g(85. 5mmol)L_Val，15. 73g(91. 46mmol)對(duì)甲苯橫 酸和80mL苯甲醇得到30.36g(94% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體.ESI-MS(m/e) :207[M+H] +。
[0109] 實(shí)施例 42 制備 Boc-Asp (OBzl)-Val-OBzl
[0110] 按照實(shí)施例 9 的操作，由 4. Og(12. 4mmol)Boc-Asp (OBzl)和 4. 167g(11. 2mmol) TosH · Val-OBzl 得 5. 2g(90% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/e) :513. 5[M+H] +。
[0111] 實(shí)施例 43 制備 HCl · Asp(OBzl)-Val-OBzl
[0112] 按照實(shí)施例 8 的操作，由 5. 2g (10. lmmol) Boc-Asp (OBzl)-Val-OBzl 得 4. 5g(99%)標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/e) :413. 1[M+H] +。
[0113] 實(shí)施例 44 制備 Boc-Arg-Gly-Asp (OBzl)-Val-OBzl
[0114] 按照實(shí)施例 9 的操作，由 5g (15. lOmmol) Boc-Arg-Gly 和 10. 6g (15. lmmol) HCl · Asp(OBzl)-Val-OBzl 得 8. 32g(76 % )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/e): 725[M+H]+。
[0115] 實(shí)施例 45 制備 HCl · Arg-Gly-Asp (OBzl)-Val-OBzl (9e)
[0116] 按照實(shí)施例 8 的操作，由 4. 5g (5. 3mmol) Boc-Arg-Gly-Asp (OBzl)-Val-OBzl 得 4. lg(99%)標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/e) :671.4[M+H] +。
[0117] 實(shí)施例 46 制備 Boc-Leu-Asp (OBzl)-Val-OBzl
[0118] 按照實(shí)施例 9 的操作，由 3. 49g (15. lOmmol) Boc-Leu 和 10. 6g (15. lmmol) HCl · Asp(OBzl)-Val-OBzl 得 8. 43g(89 % )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/e): 625. 3[M+H]+。
[0119] 實(shí)施例 47 制備 HCl · Leu-Asp (OBzl)-Val-OBzl (9f)
[0120] 按照實(shí)施例 8 的操作，由 3. 75g (6. Ommol) Boc-Leu-Asp (OBzl)-Val-OBzl 得 2.92g(93%)標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/e) :525.3[M+H] +。
[0121] 實(shí)施例 48 制備 β -咔啉-3-酸基-Ng-NO2-Arg-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys (Fmoc) -Pro-OBzl (7a)
[0122] 按照實(shí)施例5的操作，由700mg(l. 7mmol) β -咔啉-3-?；?Ng-NO2-Ai^ 180mg(I. 3mmol)HOBt,272mg (I. 5mmol)DCC 785mg(I. 4mmol)Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys ( Fmoc)-Pro-OBzl 得 680mg (55% )標(biāo)題化合物，為淡黃色固體。ESI-MS (m/e) :1474. 3 [M+H]+。
[0123] 實(shí)施例 49 制備 β -咔啉-3-酸基-Ng-NO2-Arg-Lys (Fmoc) -Glu (OBzl) -OBzl (7b)
[0124] 按照實(shí)施例5的操作，由0.413g(l. OOmmol) β -咔啉-3-酰基-Ne-NO2-Arg和 (0· 745g，I. lmmol) Lys (Fmoc)-Glu (OBzl)-OBzl 得 0· 797g (74% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。 ESI-MS(m/e) :1072[M+H].〇
[0125] 實(shí)施例 50 制備 β -咔啉-3-?；?NG-N02_Arg-Arg-Gly-Asp (OBzl)-Ser-OBzl (7c)
[0126] 按照實(shí)施例5的操作，由0. 413g (I. OOmmol) β -咔啉-3-?；?Ne-NO2-Arg和 (I. 14g，l. lmmol)Arg-Gly-Asp(OBzl)-Ser-〇Bzl 得 0· 57g(57%)標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。 ESI-MS(m/e) :1008[M+H]+。
[0127] 實(shí)施例 51 制備 β -咔琳 _3_ 醜基-Ng-NO2-Arg-Arg-Gly-Asp (OBzl)-Phe-OBzl (7d)
[0128] 按照實(shí)施例5的操作，由0. 413g (I. OOmmol) β -咔啉-3-?；?Ne-NO2-Arg和 (0· 741g，I. lmmol) Arg-Gly-Asp (OBzl)-Phe-OBzl 得 0· 336g (63 % )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固 體。ESI-MS (m/e) :1068 [M+H] +。
[0129] 實(shí)施例 52 制備 β -咔琳 _3_ 醜基-Ng-NO2-Arg-Arg-Gly-Asp (OBzl)-Val-OBzl (7e)
[0130] 按照實(shí)施例5的操作，由0. 413g (I. OOmmol) β -咔啉-3-酰基-Ne-NO2-Arg和 (0· 739g，I. lmmol) Arg-Gly-Asp (OBzl)-Val-OBzl 得 0· 513g (50 % )標(biāo)題化合物，為淡黃色 固體。ESI-MS(m/e) :1020[M+H] +。
[0131] 實(shí)施例 53 制備 β -咔啉-3-?；?NG-N02-Arg-Leu-Asp (OBzl) -Val-OBzl (7f)
[0132] 按照實(shí)施例5的操作，由0. 413g (I. OOmmol) β -咔啉-3-?；?Ne-NO2-Arg和 (0· 578g，I. lmmol) Leu-Asp (OBzl)-Val-OBzl 得 0· 500g (54 % )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。 ESI-MS(m/e) :920[M+H] +。
[0133] 實(shí)施例 54 制備 β -咔琳 _3_ 醜基-NG-N02-Arg-Leu-Pr〇-Asn_lle-Ser-Lys-Pro (8 a)
[0134] 按照實(shí)施例 6 的操作，由 740mg (0· 502mmol) β -咔啉-3-醜基-NG-N02_Arg-Le U-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys(Fmoc)-Pro-OBzl 得到 52511^(90% )標(biāo)題化合物，為淡黃色固 體。ESI-MS(m/e):1163·3[M+H]+·Mp :231·7-233·9。C;[α]D25 = -23 (c = 0·08，CH30H)· IR(KBr) ：3745. 76,3298. 28,3064. 89,2958. 80,2372. 44, 1641. 42, 1633. 71,1529. 55, 1452. 40, 1340. 53, 1257. 59, 1188. 15,1107. 14, 729. 09,619. 15cm_1. 1H NMR(800MHz, MeOD ： D2O = 5 ： I) ： δ/ppm = 8. 94 (s, 1H), 8. 81 (s, 1H), 8. 29 (d, J = 3. OHzlH), 7. 69-7. 66 (m, 2H), 7. 38-7. 37 (m, 1H), 4. 78-4. 68 (m, 4H), 4. 45-4. 40 (m, 3H), 4. 25 (d, J = 3. OHzlH)，3· 84-3. 75 (m, 4H)，2· 99-2. 98 (m, 2H)，2· 88-2. 76 (m, 2H)，2· 28-2. 27 (m, 2H)， 2· 06-1. 95 (m，6Η)，L 90-1. 89 (m，1Η)，1· 88-1. 86 (m，1Η)，1· 79-1. 69 (m，6Η)，1· 63-1. 61 (m， 1Η)，I. 47-1. 46 (m，3Η)，I. 26-1. 18 (m，2Η)，0· 98-0. 85 (m，12Η) · HPLC 純度：99. 4 % 流動(dòng)相： CH3OH : H2O = 85 : 15,保留時(shí)間：7. 63min。
[0135] 實(shí)施例 55 制備 β -咔啉-3-?；?NG-N02-Arg-Lys-Glu (8b)
[0136] 按照實(shí)施例 6 的操作，由 0. 536g (0. 50mmol) β -咔啉-3-醜基-Ne-NO2-Arg-Lys (Fm oc)-Glu(OBzI)-OBzI 得 0.316g(94% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/e)670[M+H]+· Mp222-223 °C ;[a]D25 = -20 (c = 0.08, CH3OH) .IR(KBr) :3834. 49, 3739. 97, 3643. 53， 2929. 87,2862. 36,2360. 87,2322. 29, 1849. 73, 1637. 56, 1512. 19,1450.46,1163.08, 1112. 93,864. 11,743. 86,605. 65cm_1. 1HNMR(800MHz, MeOD ： D2O = 5 ： I) ： δ /ppm = 8. 93 (s, 1H) ,8. 83 (s, 1H) ,8. 29 (d, J = 3. 0Hz, 1H), 7. 69-7. 59(m,2H) ,7. 41-7. 34 (m, 1H), 4. 72-4. 70 (m, 1H), 4. 45-4. 42 (m, 2H), 3. 64 (s, 1H), 2. 99 (t, J = 4. 8Hz2H), 2. 47-2. 45 (m, 2H)，2. 24-2. 22 (m, 1H)，2. 07-1. 97 (m, 1H)，I. 95-1. 90 (m, 1H)，I. 83-1. 81 (m, 2H)， 1.76-1.72〇11，2!1)，1.55-1.50(111，2!1).冊(cè)^：純度：98.5%，流動(dòng)相 ：0130!1:!120 = 85:15， 保留時(shí)間：6. 13min。
[0137] 實(shí)施例 56 制備 β -咔琳-3-醜基-Ng-NO2-Arg-Arg-Gly-Asp-Ser (8c)
[0138] 按照實(shí)施例 6 的操作，由 0. 50g (0. 50mmol) β -咔啉-3-醜基-Ng-NO2-Arg-Arg-Gly -Asp(OBzl)-Ser-OBzl 得 0· 377g(91% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體<^51-]\^(111/6)828[]\1+!1]+· Mp204-206 °C · [a]D25 = -32 (c = 0.04, CH3OH) .IR (KBr) :3292. 49, 3196. 05, 3066. 82， 2939.52,2376.30,1654.92,1637.56,1583. 90,1454. 33,1363. 67,1265. 30,1109. 07， 860. 25,756. 10,621. 08cm_1. 1HNMR(800MHz, MeOD ： D2O = 5 ： I) ： δ/ppm = 8. 97 (s, 1H), 8. 43 (s, 1H) , 7. 80-7. 67 (s, 1H), 7. 44-7. 09 (m, 3H), 4. 74-4. 71 (m, 2H) , 4. 62 (s, 1H), 4· 51-4. 32 (m，1H)，3· 98-3. 92 (m，2H)，3· 24-3. 13 (m，2H)，2· 98-2. 80 (m，2H)，2· 10-2. 04 (m， 4H)，I. 96-1. 95 (m，2H)，I. 84-1. 69 (m，6H) · HPLC 純度：95. 8 %，流動(dòng)相：CH30H : H2O = 85 : 15 保留時(shí)間：8. 26min。
[0139] 實(shí)施例 57 制備 β -咔琳-3-醜基-Ng-NO2-Arg-Arg-Gly-Asp-Phe (8d)
[0140] 按照實(shí)施例 6 的操作，由 0. 534g (0. 50mmol) β -咔啉-3-醜基-Ne-NO2-Arg-Arg-Gl y-Asp (OBzl) -Phe-OBzl 得 0· 40Ig (90% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體<^51-]\^(111/6)888[]\1+!1]+· Mpl95. 9-197. 5°C ；[a ]D25 = -16 (c = 0. 04, CH3OH). IR(KBr) :3824. 84,3741. 90,3290. 56, 3232. 70,3076. 46,2931. 80,2615. 47,2316. 51,1653. 00, 1525. 69, 1454. 33, 1261. 45, 1103. 28,744. 52,617. 22cm_1. 1HNMR(800MHz,MeOD ： D2O = 5 ： I) ： δ/ppm = 8. 94(s, 1H), 8. 90 (s, 1H), 8. 30 (d, J = 3. OHzlH), 7. 70-7. 65 (m, 2H), 7. 50-7. 36 (m, 1H), 7. 26-7. 09 (m, 5H)，4. 73-4. 68 (m，2H)，4. 62-4. 60 (m，1H)，4. 12-4. 09 (m，1H)，3. 96-3. 92 (m，2H)， 3. 25-3. 22 (m，2H)，3. 00-2. 96 (m，2H)，2. 82-2. 77 (m，2H)，2. 08-2. 04 (m，2H)，2. 01-1. 95 (m， 2H)，I. 84-1. 71 (m，6H) · HPLC 純度：95. 9 %，流動(dòng)相：CH30H : H2O = 85 : 15,保留時(shí)間： 6.672min〇
[0141] 實(shí)施例 58 制備 β -咔琳-3-醜基-Ng-NO2-Arg-Arg-Gly-Asp-Val (8e)
[0142] 按照實(shí)施例 6 的操作，由 0. 51g (0. 50mmol) β -咔啉-3-?；?Ne-NO2-Arg-Ar g-Gly-Asp (OBzl)-Val-OBzl 得 0.387g(92 % )標(biāo)題化合物，為淡黃色固體。ESI-MS (m/ e)840[M+H]+. Mp210. 1-212. 2 〇C；[a]D25 = -21(c = 0. 04, CH3OH). IR(KBr) :3747.69, 3294. 42,3219. 19,3066. 82,2935. 66,2374. 37, 1651. 07, 1521. 84, 1460. 11,1259. 52, 1192. 01,1111. 00,621. 08cm_1. 1HNMR(800MHz,MeOD ： D2O = 5 ： I) ： δ/ppm = 8. 93 (s, 1H), 8. 83 (s, 1H)，8. 29 (d, J = 3. OHzlH)，7. 68-7. 63 (m, 2H)，7. 38-7. 36 (m, 1H)，7. 26-7. 09 (m, 5H)，4. 64-4. 62(m，2H)，4. 47-4. 40(m，1H)，4. 22(d，J = 3. OHzlH)，3. 99-3. 91 (m，2H)， 3. 37-3. 24 (m，2H)，2. 88-2. 85 (m，2H)，2. 11-2. 06 (m，4H)，2. OO-L 71 (m，6H)，0· 94-0. 88 (m， 6H). HPLC 純度：95. 1%，流動(dòng)相：CH30H : H2O = 85 : 15,保留時(shí)間：7. 32min。
[0143] 實(shí)施例 59 制備 β -咔啉-3-?；?NG-N02-Arg-Leu-Asp-Val (8f)
[0144] 按照實(shí)施例 6 的操作，由 0· 460g (0· 50mmo 1) β -咔琳 _3_ 醜基-NG-N02-Arg-Leu_A sp (OBzl)-Val-OBzl 得 0.356g (96 % )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/e)740[M+H]+· Mpl83. 0-185. 2°C ；[α ]D25 = -36 (c = 0. 15, CH3OH). IR(KBr) :3302. 13,3086. 11,2960. 73, 2933. 73,2872. 01,1643. 35, 1637. 56, 1537. 27, 1517. 98, 1460. 11,1346. 31,1263. 37, 1149.57,1109.07,862.18,754.17,729.09,621.0801^.^^^(80011^,1^00 : D2O = 5 ： I) ： δ /ppm = 8. 89 (s, 2H), 8. 28 (s, 1H) , 7. 64 (s, 1H), 7. 35 (s, 1H), 4. 82-4. 53 (m, 3H)，4· 33-4. 31 (m，1H)，2· 93-2. 85 (m，2H)，2· 17-2. 16 (m，1H)，2· 10-2. 05 (m，1H)， I. 95-1. 91 (m，2Η)，I. 87-1. 84 (m，1Η)，I. 78-1. 72 (m，2Η)，I. 69-1. 62 (m，2Η)，I. 34-1. 28 (m， 2H)，I. 00-0· 90 (m，12H) · HPLC 純度：99. I %，流動(dòng)相：CH3OH : H2O = 85 : 15,保留時(shí)間： 8. 702min〇
[0145] 實(shí)驗(yàn)例I評(píng)價(jià)8a_f抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性
[0146] 化合物8a_f用含0. 4% DMSO的1640培養(yǎng)基配制成所需濃度。分別將生長(zhǎng)狀態(tài) 良好、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL60細(xì)胞按照4X IO4個(gè)/mL的密度接種于96孔板，每孔100 μ L。 在37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)，按預(yù)設(shè)的濃度梯度100μΜ、50μΜ、25μΜ、12. 5μΜ 和6. 25 μ M加入經(jīng)滅菌處理的化合物8a-f的溶液，對(duì)照組加入等體積溶解樣品的含0. 4% DMSO的1640培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，每孔加25 μ L濃度為5mg/mL的MTT溶液，置于 37°C孵育4小時(shí)，小心除去上清液后每孔加入IOOyl DMS0,振蕩約15min溶解沉淀。立即 于酶標(biāo)儀上570nm波長(zhǎng)下測(cè)定0· D.(吸光度）值。按抑制率=(含0· 4% DMSO的1640培 養(yǎng)基組的OD平均值-化合物8a-f組的OD平均值）八含0.4%01^0的1640培養(yǎng)基組的 OD平均值）X 100%計(jì)算抑瘤率及IC5tl。實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次，以抑制率對(duì)化合物8a-f的濃 度作圖，計(jì)算本發(fā)明化合物的IC 5tl(半數(shù)有效抑制濃度）值。
[0147] 化合物8a_f用含0. 4% DMSO的DMEM培養(yǎng)基配制成所需濃度。分別將生長(zhǎng)狀態(tài)良 好、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT-8，HeLa，BEL-7402，H印G2細(xì)胞按照4X10 4個(gè)/mL的密度接種于 96孔板，每孔100 μ L。在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)，按預(yù)設(shè)的濃度梯度100 μ M、 50 μ Μ、25 μ Μ、12. 5 μ M和6. 25 μ M加入經(jīng)滅菌處理的化合物8a-f的溶液，對(duì)照組加入等體 積溶解樣品的DMEM培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，每孔加25 μ L濃度為5mg/mL的MTT溶 液，置于37°C孵育4小時(shí)，小心除去上清液后每孔加入100 μ I DMS0,振蕩約15min溶解沉 淀。立即于酶標(biāo)儀上570nm波長(zhǎng)下測(cè)定O.D.(吸光度）值。按抑制率=(含0.4% DMSO的 DMEM培養(yǎng)基組的OD平均值-化合物8a-f組的OD平均值）八含0.4%01^0的01^11培養(yǎng) 基組的OD平均值）X 100 %計(jì)算抑瘤率及IC5tl。實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次，以抑制率對(duì)化合物8a-f 的濃度作圖，計(jì)算本發(fā)明化合物的IC50(半數(shù)有效抑制濃度）值。
[0148] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。數(shù)據(jù)表明，8a_f基本沒(méi)有細(xì)胞毒樣抗腫瘤細(xì)胞增殖作用。
[0149] 表18a_f抗腫瘤增殖活性（IC5tl，無(wú) ± SD μ M)
[0150]

【權(quán)利要求】
1. 一種β -咔啉-3-羧酸與6種寡肽的綴合物（8a-f)，6種寡肽選自 Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro, Arg-Gly-Asp-Ser, Arg-Gly-Asp-Phe, Arg-Gly-Asp-Val, Leu-Asp-Ser 和 Lys-Glu0
2. 制備權(quán)力要求1的β -咔啉-3-羧酸與6種寡肽的綴合物（8a-f)的方法，該方法包 括以下步驟： 1. L-色氨酸在稀硫酸催化下與甲醒進(jìn)行Pictet-Spengler縮合生成3S-1，2, 3,4-四 氫-β-咔啉-3-羧酸（1); 2) 3S-1，2,3,4-四氧-β -昨琳竣酸（1)轉(zhuǎn)化為3S-1，2,3,4-四氧-β -昨琳竣 酸甲酯（2); 3) 用商猛酸鐘將3S_1，2, 3,4_四氧-β -咔琳_3_竣酸甲醋⑵氧化為β -咔琳_3_竣 酸甲酯（3); 4) β -咔啉-3-羧酸甲酯（3)水解為β -咔啉-3-羧酸（4); 5) β -咔啉-3-羧酸（4)與硝基精氨酸芐酯偶聯(lián)為β -咔啉-3-酰 基，<:，02-八邙-(^1(5); 6) β -咔啉-3-?；?Ne-NO2-Arg-OBzl (5)水解為 β -咔啉-3-?；?Ne-NO2-Arg (6); 7) 按照多肽合成的標(biāo)準(zhǔn)方法制備LPNISKP，KE，RGDS，RGDF，RGDV和LDV的中間 體 Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys(Fmoc)-Pro-OBzl(9a), Lys (Fmoc)-Glu(OBzl)-OBzl(9b), Arg-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl(9c) , Arg-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl(9d)， Arg-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl(9e)和 Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl(9f); 8) 將 Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys(Fmoc)-Pro-OBzl, Arg-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl, Arg-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl, Arg-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl, Leu-Asp (OBzl)-Val-OBzl 和 Lys (Fmoc) -Glu (OBzl) -OBzl 分別與 β -咔啉-3-酰基-Ne-NO2-Arg (6)偶聯(lián)，制備 β -咔 啉-3_ 醜基-Ng-NO2-Arg-Leu-Pro-Asn-I le-Ser-Lys (Fmoc) -Pro-OBzl (7a), β -咔啉 _3_ 醜 基-Ne-NO2-Arg-Lys (Fmoc) -Glu (OBzl) -OBzl (7b), β -咔琳 _3_ 醜基-Ne-NO2-Arg-Arg-Gly -Asp(OBzl)-Ser-OBzl (7c), β -咔琳_3_醜基-Ng-NO2-Arg-Arg-Gly-Asp (OBzl)-Phe-OBzl ( 7d)，β -咔啉-3-?；?Ne-NO2-Arg-Arg-Gly-Asp (OBzl) -Val-OBzl (7e)和 β -咔啉-3-酰 基-NG-N02-Arg-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl(7f); 9) 將 β -咔啉-3_ 醜基-Ng-NO2-Arg-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys (Fmoc)-Pro-OBzl ( 7a)，β -咔啉-3-?；?Nc-NO2-Arg-Lys (Fmoc) -Glu (OBzl) -OBzl (7b)，β -咔啉-3-酰 基-Ng-NO2-Arg-Arg-Gly-Asp (OBzl)-Ser-OBzl (7c), β -咔琳 _3_ 醜基-Ne-NO2-Arg-Arg -Gly-Asp (OBzl) -Phe-OBzl (7d)，β -咔啉-3-?；?NG-N02-Arg-Leu-Asp (OBzl) -Val-OB zl (7e)和 β -咔啉-3-酰基-NG-N02-Arg-Leu-Asp (OBzl) -Val-OBzl (7f)脫保護(hù)基，制 備本發(fā)明化合物 β _ 咔啉 _3_ 醜基-Ng-NO2-Arg-Leu-Pro-Asn-I le-Ser-Lys-Pro (8a)， β -咔琳-3-醜基-Ne-NO2-Arg-Lys-Glu (8b), β -咔琳 _3_ 醜基-Ne-NO2-Arg-Arg-Gly -Asp-Ser (8c), β -咔琳 _3_ 醜基-Ng-NO2-Arg-Arg-Gly-Asp-Phe (8d), β -咔琳 _3_ 醜 基-Nc-NO2-Arg-Arg-Gly-Asp-Val (8e)和 β -咔琳 _3_ 醜基-Nc-NO2-Arg-Leu-Asp-Val (8f)。
3. 權(quán)利要求1的β -咔啉-3-羧酸與6種寡肽的綴合物（8a-f)的納米結(jié)構(gòu)。
4. 權(quán)利要求1的β -咔啉-3-羧酸與6種寡肽的綴合物（8a-f)抑制腫瘤細(xì)胞增殖的 作用。
5. 權(quán)利要求1的權(quán)利要求1的β -咔啉-3-羧酸與6種寡肽的綴合物（8a-f)抑制荷 S180小鼠腫瘤生長(zhǎng)的作用。
6. 權(quán)利要求1的權(quán)利要求1的β -咔啉-3-羧酸與6種寡肽的綴合物（8a-f)在制備 抗腫瘤藥物中的用途。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK104211768SQ201310225709
【公開(kāi)日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2013年6月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月5日
【發(fā)明者】趙明, 彭師奇, 王玉記, 吳建輝, 楊帥 申請(qǐng)人:首都醫(yī)科大學(xué)