一種具有免疫抑制活性的桂皮多酚提取物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有免疫抑制活性的桂皮多酚提取物及其制備方法和應(yīng)用。所述提取物是來源于天竺桂、柴桂、油桂中的至少一種樹皮的提取物，所述提取物中的總多酚含量達(dá)50wt%以上。本發(fā)明所述的桂皮多酚提取物的半數(shù)細(xì)胞致死濃度＞50μg/mL，且對絲裂原ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞的增殖及參與免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)的重要細(xì)胞因子IL-6、IFN-γ的分泌均具有濃度依賴性的抑制作用，可望作為活性成分之一或唯一的活性成分用于制備治療免疫性疾病的藥物制劑，尤其可望作為活性成分之一或唯一的活性成分用于制備治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物制劑，具有藥用價(jià)值。
【專利說明】一種具有免疫抑制活性的桂皮多酚提取物及其制備方法和 應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種桂皮多酚提取物及其制備方法和應(yīng)用，具體說，是涉及一種具有 免疫抑制活性的桂皮多酚提取物及其制備方法和應(yīng)用，屬于中藥【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA)是當(dāng)前危害人類健康的最重要疾病之一，被稱為"不死的癌 癥"。RA是一種以多關(guān)節(jié)受累、滑膜炎癥、骨與軟骨破壞等為主要特征的慢性全身性自身免 疫炎性疾病，其發(fā)病機(jī)理至今尚未完全闡明，普遍認(rèn)為與遺傳、感染和免疫調(diào)節(jié)等因素紊亂 密切相關(guān)。我國RA的患病率約0. 3%?0. 4%，約有400萬患者，病程5-10年致殘率為60%， 晚期90%患者喪失社會勞動力和生活自理能力，是成人勞動力喪失的主要原因之一，因此 造成了很多家庭問題以及巨大的社會負(fù)擔(dān)?，F(xiàn)行治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法主要有手術(shù)治 療、化學(xué)藥物治療和細(xì)胞因子類生物制劑的治療。一般認(rèn)為外科手術(shù)只適用于晚期畸形病 例，且費(fèi)用昂貴，對機(jī)體創(chuàng)傷較大；化學(xué)藥物如非留體抗炎藥、抗風(fēng)濕藥和糖皮質(zhì)激素等的 長期應(yīng)用會引起胃腸道不適、骨髓抑制、肝損傷、高血壓等嚴(yán)重的不良反應(yīng)；生物制劑在干 預(yù)病變細(xì)胞的同時(shí)，對正常細(xì)胞也同樣會產(chǎn)生一定的作用，干擾機(jī)體的固有免疫和適應(yīng)性 免疫，從而產(chǎn)生較大的毒性和破壞機(jī)體防御作用的風(fēng)險(xiǎn)。因此，尋求高效低毒的防治RA的 藥物仍是世界醫(yī)學(xué)界面臨的一項(xiàng)艱巨任務(wù)和難題。
[0003] 桂皮為樟科樟屬植物肉桂、柴桂、天竺桂、錫蘭桂、油桂等樹皮的通稱，為常用中 藥，又為食品香料或烹飪調(diào)料。商品桂皮的原植物比較復(fù)雜，約有十余種。研究表明（上海 中醫(yī)藥雜志，2011年第45卷第5期第82?86頁):不同種類桂皮的化學(xué)成分存在一定的差 異性，例如：肉桂中的總多酚含量為1. 31%，而柴桂中的總多酚含量為1. 92%。雖然李堯華等 報(bào)道（四川中醫(yī)雜志，1989, 2 :28):用肉桂25g+綠豆200g+陳石灰適量治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 40例，顯效34例，有效6例；但是對其作用機(jī)制還不明確，其發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)也尚未弄 清。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種具有免疫抑制活性的桂 皮多酚提取物及其制備方法和應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明所述的具有免疫抑制活性的桂皮多酚提取物，是來源于天竺桂、柴桂、油桂 中的至少一種樹皮的提取物，所述提取物中的總多酚含量達(dá)50wt%以上。
[0006] 進(jìn)一步說，所述提取物中的總多酚含量達(dá)70wt%?90wt%。
[0007] 本發(fā)明所述提取物的制備方法，包括如下步驟：
[0008] a)用乙醇水溶液或丙酮水溶液對天竺桂、柴桂、油桂中的至少一種樹皮藥材進(jìn)行 提取；
[0009] b)減壓蒸餾除去提取液中的乙醇或丙酮，然后加適量水稀釋濃縮液，得粗提液；
[0010] c)用乙酸乙酯萃取粗提液2?6次，合并萃取得到的乙酸乙酯層，減壓蒸餾除去其 中的乙酸乙酯，得到乙酸乙酯部位；
[0011] d)將乙酸乙酯部位用少量甲醇或者乙醇溶解后加水稀釋并上樣于DM130大孔樹 脂柱，依次用3?5柱體積水、3?5柱體積lOvol%乙醇水溶液、3?5柱體積35vol%乙醇 水溶液和3?5柱體積70vol%乙醇水溶液洗脫，收集35vol%的乙醇流分，減壓濃縮，干燥， 即得所述的提取物。
[0012] 步驟a)中所述的提取可以是冷浸提取、溫浸提取或回流提取。
[0013] 步驟a)中所述的提取可以為1?3次；每次提取時(shí)，1克樹皮藥材使用5?50毫 升的乙醇水溶液或丙酮水溶液。
[0014] 上述的乙醇水溶液和丙酮水溶液的體積百分比濃度均優(yōu)選為20%?70%。
[0015] 步驟c)中的萃取，每次用于萃取的乙酸乙酯的體積推薦為被萃取的粗提液體積 的0. 5?1. 5倍。
[0016] 步驟d)中所述的干燥優(yōu)選為真空干燥或冷凍干燥。
[0017] 研究表明：本發(fā)明所述的桂皮多酚提取物的半數(shù)細(xì)胞致死濃度（CC50) >50 μ g/ mL，且對絲裂原ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞的增殖及參與免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)的重要細(xì)胞因子 IL-6、IFN- γ的分泌均具有濃度依賴性的抑制作用,可望作為活性成分之一或唯一的活性 成分用于制備治療免疫性疾病的藥物制劑，尤其可望作為活性成分之一或唯一的活性成分 用于制備治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物制劑。
[0018] 本發(fā)明中所述的藥物制劑形式是任何可藥用的口服劑型或注射劑，包括：片劑、糖 衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖 齊IJ、丸劑、散劑、注射液、粉針劑等。

【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)、完整地說明，但并不因此限制本發(fā)明；本 領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)下述內(nèi)容所作的一些非本質(zhì)的改進(jìn)或替換均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0020] 實(shí)施例中所用的天竺桂樹皮藥材產(chǎn)自江西上饒，實(shí)施例中所用的柴桂和油桂樹皮 藥材均產(chǎn)自云南。實(shí)施例中關(guān)于提取物中的總多酚含量的測定是參照文獻(xiàn)"上海中醫(yī)藥雜 志，2011年第45卷第5期第83頁"中所述方法。
[0021] 實(shí)施例1
[0022] a)在40°C用體積濃度為50%的丙酮水溶液對天竺桂樹皮藥材進(jìn)行溫浸提取1次， 其中：1克天竺桂樹皮藥材用50毫升丙酮水溶液；
[0023] b)減壓蒸餾除去提取液中的丙酮，然后加適量水稀釋濃縮液，得粗提液；
[0024] c)用乙酸乙酯萃取粗提液，每次萃取所用的乙酸乙酯的體積為被萃取的粗提液體 積的1倍，共萃取3次；合并萃取得到的乙酸乙酯層，減壓蒸餾除去其中的乙酸乙酯，得到乙 酸乙酯部位；
[0025] d)將得到的乙酸乙酯部位用少量乙醇溶解后加水稀釋并上樣于DM130大孔樹脂 柱，依次用4柱體積水、4柱體積lOvol%乙醇水溶液、4柱體積35vol%乙醇水溶液和4柱體 積70vol%乙醇水溶液洗脫，收集35vol%的乙醇流分，減壓濃縮，冷凍干燥，即得本發(fā)明所述 的提取物。
[0026] 經(jīng)測定分析，本實(shí)施例制得的提取物中，總多酚的含量為76wt%。
[0027] 實(shí)施例2
[0028] a)在室溫下，用體積濃度為50%的丙酮水溶液對天竺桂樹皮藥材進(jìn)行攪拌提取2 次，其中：1克天竺桂樹皮藥材用25毫升丙酮水溶液；
[0029] b)減壓蒸餾除去提取液中的丙酮，然后加適量水稀釋濃縮液，得粗提液；
[0030] c)用乙酸乙酯萃取粗提液，每次萃取所用的乙酸乙酯的體積為被萃取的粗提液體 積的1倍，共萃取5次；合并萃取得到的乙酸乙酯層，減壓蒸餾除去其中的乙酸乙酯，得到乙 酸乙酯部位；
[0031] d)將得到的乙酸乙酯部位用少量乙醇溶解后加水稀釋并上樣于DM130大孔樹脂 柱，依次用4柱體積水、4柱體積lOvol%乙醇水溶液、4柱體積35vol%乙醇水溶液和4柱體 積70vol%乙醇水溶液洗脫，收集35vol%的乙醇流分，減壓濃縮，冷凍干燥，即得本發(fā)明所述 的提取物。
[0032] 經(jīng)測定分析，本實(shí)施例制得的提取物中，總多酚的含量為72wt%。
[0033] 實(shí)施例3
[0034] a)在40°C用體積濃度為20%的丙酮水溶液對柴桂樹皮藥材進(jìn)行溫浸提取2次，其 中：1克柴桂樹皮藥材用25毫升丙酮水溶液；
[0035] b)減壓蒸餾除去提取液中的丙酮，然后加適量水稀釋濃縮液，得粗提液；
[0036] c)用乙酸乙酯萃取粗提液，每次萃取所用的乙酸乙酯的體積為被萃取的粗提液體 積的1.5倍，共萃取2次；合并萃取得到的乙酸乙酯層，減壓蒸餾除去其中的乙酸乙酯，得到 乙酸乙酯部位；
[0037] d)將得到的乙酸乙酯部位用少量乙醇溶解后加水稀釋并上樣于DM130大孔樹脂 柱，依次用4柱體積水、4柱體積lOvol%乙醇水溶液、4柱體積35vol%乙醇水溶液和4柱體 積70vol%乙醇水溶液洗脫，收集35vol%的乙醇流分，減壓濃縮，冷凍干燥，即得本發(fā)明所述 的提取物。
[0038] 經(jīng)測定分析，本實(shí)施例制得的提取物中，總多酚的含量為70wt%。
[0039] 實(shí)施例4
[0040] a)用體積濃度為20%的丙酮水溶液對柴桂樹皮藥材進(jìn)行回流提取1次，其中：1克 柴桂樹皮藥材用50毫升丙酮水溶液；
[0041] b)減壓蒸餾除去提取液中的丙酮，然后加適量水稀釋濃縮液，得粗提液；
[0042] c)用乙酸乙酯萃取粗提液，每次萃取所用的乙酸乙酯的體積為被萃取的粗提液體 積的1倍，共萃取3次；合并萃取得到的乙酸乙酯層，減壓蒸餾除去其中的乙酸乙酯，得到乙 酸乙酯部位；
[0043] d)將得到的乙酸乙酯部位用少量乙醇溶解后加水稀釋并上樣于DM130大孔樹脂 柱，依次用5柱體積水、5柱體積lOvol%乙醇水溶液、5柱體積35vol%乙醇水溶液和5柱體 積70vol%乙醇水溶液洗脫，收集35vol%的乙醇流分，減壓濃縮，冷凍干燥，即得本發(fā)明所述 的提取物。
[0044] 經(jīng)測定分析，本實(shí)施例制得的提取物中，總多酚的含量為70wt%。
[0045] 實(shí)施例5
[0046] a)在室溫下，用體積濃度為70%的乙醇水溶液對柴桂樹皮藥材進(jìn)行攪拌提取1次， 其中：1克柴桂樹皮藥材用50毫升乙醇水溶液；
[0047] b)減壓蒸餾除去提取液中的乙醇，然后加適量水稀釋濃縮液，得粗提液；
[0048] c)用乙酸乙酯萃取粗提液，每次萃取所用的乙酸乙酯的體積為被萃取的粗提液體 積的1倍，共萃取3次；合并萃取得到的乙酸乙酯層，減壓蒸餾除去其中的乙酸乙酯，得到乙 酸乙酯部位；
[0049] d)將得到的乙酸乙酯部位用少量乙醇溶解后加水稀釋并上樣于DM130大孔樹脂 柱，依次用5柱體積水、5柱體積lOvol%乙醇水溶液、5柱體積35vol%乙醇水溶液和5柱體 積70vol%乙醇水溶液洗脫，收集35vol%的乙醇流分，減壓濃縮，冷凍干燥，即得本發(fā)明所述 的提取物。
[0050] 經(jīng)測定分析，本實(shí)施例制得的提取物中，總多酚的含量為78wt%。
[0051] 實(shí)施例6
[0052] a)在室溫下，用體積濃度為50%的乙醇水溶液對油桂樹皮藥材進(jìn)行攪拌提取2次， 其中：1克油桂樹皮藥材用25毫升乙醇水溶液；
[0053] b)減壓蒸餾除去提取液中的乙醇，然后加適量水稀釋濃縮液，得粗提液；
[0054] c)用乙酸乙酯萃取粗提液，每次萃取所用的乙酸乙酯的體積為被萃取的粗提液體 積的1倍，共萃取5次；合并萃取得到的乙酸乙酯層，減壓蒸餾除去其中的乙酸乙酯，得到乙 酸乙酯部位；
[0055] d)將得到的乙酸乙酯部位用少量乙醇溶解后加水稀釋并上樣于DM130大孔樹脂 柱，依次用3柱體積水、3柱體積lOvol%乙醇水溶液、3柱體積35vol%乙醇水溶液和3柱體 積70vol%乙醇水溶液洗脫，收集35vol%的乙醇流分，減壓濃縮，冷凍干燥，即得本發(fā)明所述 的提取物。
[0056] 經(jīng)測定分析，本實(shí)施例制得的提取物中，總多酚的含量為81wt%。
[0057] 實(shí)施例7
[0058] a)用體積濃度為20%的乙醇水溶液對油桂樹皮藥材進(jìn)行回流提取3次，其中：1克 油桂樹皮藥材用10毫升乙醇水溶液；
[0059] b)減壓蒸餾除去提取液中的乙醇，然后加適量水稀釋濃縮液，得粗提液；
[0060] c)用乙酸乙酯萃取粗提液，每次萃取所用的乙酸乙酯的體積為被萃取的粗提液體 積的〇. 5倍，共萃取6次；合并萃取得到的乙酸乙酯層，減壓蒸餾除去其中的乙酸乙酯，得到 乙酸乙酯部位；
[0061] d)將得到的乙酸乙酯部位用少量乙醇溶解后加水稀釋并上樣于DM130大孔樹脂 柱，依次用3柱體積水、3柱體積lOvol%乙醇水溶液、3柱體積35vol%乙醇水溶液和3柱體 積70vol%乙醇水溶液洗脫，收集35vol%的乙醇流分，減壓濃縮，冷凍干燥，即得本發(fā)明所述 的提取物。
[0062] 經(jīng)測定分析，本實(shí)施例制得的提取物中，總多酚的含量為71wt%。
[0063] 實(shí)施例8
[0064] a)在40°C下，用體積濃度為70%的乙醇水溶液對油桂樹皮藥材進(jìn)行溫浸提取2 次，其中：1克油桂樹皮藥材用25毫升乙醇水溶液；
[0065] b)減壓蒸餾除去提取液中的乙醇，然后加適量水稀釋濃縮液，得粗提液；
[0066] c)用乙酸乙酯萃取粗提液，每次萃取所用的乙酸乙酯的體積為被萃取的粗提液體 積的1倍，共萃取4次；合并萃取得到的乙酸乙酯層，減壓蒸餾除去其中的乙酸乙酯，得到乙 酸乙酯部位；
[0067] d)將得到的乙酸乙酯部位用少量乙醇溶解后加水稀釋并上樣于DM130大孔樹脂 柱，依次用3柱體積水、3柱體積lOvol%乙醇水溶液、3柱體積35vol%乙醇水溶液和3柱體 積70vol%乙醇水溶液洗脫，收集35vol%的乙醇流分，減壓濃縮，冷凍干燥，即得本發(fā)明所述 的提取物。
[0068] 經(jīng)測定分析，本實(shí)施例制得的提取物中，總多酚的含量為76wt%。
[0069] 實(shí)施例9
[0070] a)用體積濃度為70%的乙醇水溶液對油桂樹皮藥材進(jìn)行回流提取1次，其中：1克 油桂樹皮藥材用50毫升乙醇水溶液；
[0071] b)減壓蒸餾除去提取液中的乙醇，然后加適量水稀釋濃縮液，得粗提液；
[0072] c)用乙酸乙酯萃取粗提液，每次萃取所用的乙酸乙酯的體積為被萃取的粗提液體 積的1倍，共萃取6次；合并萃取得到的乙酸乙酯層，減壓蒸餾除去其中的乙酸乙酯，得到乙 酸乙酯部位；
[0073] d)將得到的乙酸乙酯部位用少量乙醇溶解后加水稀釋并上樣于DM130大孔樹脂 柱，依次用3柱體積水、3柱體積lOvol%乙醇水溶液、4柱體積35vol%乙醇水溶液和4柱體 積70vol%乙醇水溶液洗脫，收集35vol%的乙醇流分，減壓濃縮，冷凍干燥，即得本發(fā)明所述 的提取物。
[0074] 經(jīng)測定分析，本實(shí)施例制得的提取物中，總多酚的含量為78wt%。
[0075] 實(shí)施例10
[0076] a)在40°C下，用體積濃度為50%的丙酮水溶液對油桂樹皮藥材進(jìn)行溫浸提取2 次，其中：1克油桂樹皮藥材用30毫升丙酮水溶液；
[0077] b)減壓蒸餾除去提取液中的丙酮，然后加適量水稀釋濃縮液，得粗提液；
[0078] c)用乙酸乙酯萃取粗提液，每次萃取所用的乙酸乙酯的體積為被萃取的粗提液體 積的1倍，共萃取4次；合并萃取得到的乙酸乙酯層，減壓蒸餾除去其中的乙酸乙酯，得到乙 酸乙酯部位；
[0079] d)將得到的乙酸乙酯部位用少量乙醇溶解后加水稀釋并上樣于DM130大孔樹脂 柱，依次用3柱體積水、3柱體積lOvol%乙醇水溶液、3柱體積35vol%乙醇水溶液和3柱體 積70vol%乙醇水溶液洗脫，收集35vol%的乙醇流分，減壓濃縮，冷凍干燥，即得本發(fā)明所述 的提取物。
[0080] 經(jīng)測定分析，本實(shí)施例制得的提取物中，總多酚的含量為73wt%。
[0081] 實(shí)施例11
[0082] 用MTT法檢測本發(fā)明所述的桂皮多酚提取物的細(xì)胞毒性：
[0083] 樣品組：用RPMI-1640培養(yǎng)液對實(shí)施例2、5、6、10所制備的提取物分別配制成濃度 為 12. 5 μ g/mL、25 μ g/mL 及 50 μ g/mL 的溶液；
[0084] 對照組：RPMI-1640培養(yǎng)液；
[0085] 將BALB/c小鼠脾淋巴細(xì)胞（4X IO5個(gè)/孔)與各實(shí)驗(yàn)組樣品分別共培養(yǎng)48h，在培 養(yǎng)結(jié)束前4h加入MTT溶液（5mg/mL)。培養(yǎng)結(jié)束后，吸去培養(yǎng)上清150 μ 1，再加150 μ I DMSO 溶解甲臜顆粒，低速搖床l〇min，用酶標(biāo)儀于570nm處讀取OD值。
[0086] 檢測各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞活性值（0D值)，詳細(xì)檢測結(jié)果見表1所示。
[0087] 表1各實(shí)驗(yàn)組在作用48h后所測的細(xì)胞OD值（Xrhi, ;2=5)
[0088]

【權(quán)利要求】
1. 一種具有免疫抑制活性的桂皮多酚提取物，其特征在于：是來源于天竺桂、柴桂、油 桂中的至少一種樹皮的提取物，所述提取物中的總多酚含量達(dá)50wt%以上。
2. 如權(quán)利要求1所述的桂皮多酚提取物，其特征在于：所述提取物中的總多酚含量達(dá) 70wt% ?90wt%。
3. -種權(quán)利要求1所述的桂皮多酚提取物的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： a) 用乙醇水溶液或丙酮水溶液對天竺桂、柴桂、油桂中的至少一種樹皮藥材進(jìn)行提 ??； b) 減壓蒸餾除去提取液中的乙醇或丙酮，然后加適量水稀釋濃縮液，得粗提液； c) 用乙酸乙酯萃取粗提液2?6次，合并萃取得到的乙酸乙酯層，減壓蒸餾除去其中的 乙酸乙酯，得到乙酸乙酯部位； d) 將乙酸乙酯部位用少量甲醇或者乙醇溶解后加水稀釋并上樣于DM130大孔樹脂柱， 依次用3?5柱體積水、3?5柱體積lOvol%乙醇水溶液、3?5柱體積35vol%乙醇水溶 液和3?5柱體積70vol%乙醇水溶液洗脫，收集35vol%的乙醇流分，減壓濃縮，干燥，即得 所述的提取物。
4. 如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于：步驟a)中所述的提取為冷浸提取、溫 浸提取或回流提取。
5. 如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于：步驟a)中所述的提取為1?3次；每 次提取時(shí)，1克樹皮藥材使用5?50毫升的乙醇水溶液或丙酮水溶液。
6. 如權(quán)利要求3或5所述的制備方法，其特征在于：所述的乙醇水溶液和丙酮水溶液 的體積百分比濃度均為20%?70%。
7. 如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于：步驟c)中的萃取，每次用于萃取的乙 酸乙酯的體積為被萃取的粗提液體積的0. 5?1. 5倍。
8. 如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于：步驟d)中所述的干燥為真空干燥或冷 凍干燥。
9. 一種權(quán)利要求1或2所述的桂皮多酚提取物的應(yīng)用，其特征在于：以所述提取物作 為活性成分之一或唯一的活性成分用于制備治療免疫性疾病的藥物制劑。
10. 如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于：以所述提取物作為活性成分之一或唯一的 活性成分用于制備治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物制劑。
【文檔編號】A61P19/02GK104274528SQ201310273225
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2013年7月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月2日
【發(fā)明者】李醫(yī)明, 楊以阜, 賈琦, 陳亮, 楊揚(yáng) 申請人:上海中醫(yī)藥大學(xué)