一種重組融合蛋白及其用途
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及重組融合蛋白及其用途，具體涉及攜帶被插入到乙肝核心抗原蛋白顆?；蛘呓囟唐蝺?nèi)的乙肝病毒治療性抗原表位的重組融合蛋白及其用途。該重組融合蛋白包含乙肝病毒HBV多種表位抗原及其他免疫刺激表位抗原和乙肝核心抗原病毒樣顆?；蚱浣囟唐沃苽涑汕逗峡乖?，所述的多種抗原表位可以單表位或者多表位組合的形式插入到乙肝病毒核心抗原HBc或其截短片段中相同或者不同的位點，同時結(jié)合不同的佐劑，加強HBV病毒特異性的體液免疫和細胞免疫功能。
【專利說明】一種重組融合蛋白及其用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及重組融合蛋白及其用途，具體涉及攜帶被插入到乙肝核心抗原蛋白顆?；蛘呓囟唐蝺?nèi)的乙肝病毒治療性抗原表位的重組融合蛋白及其用途。

【背景技術(shù)】
[0002]據(jù)統(tǒng)計，截止2010年全國的乙肝表面抗原流行率為是7.18%，較以前的11%，下降趨勢明顯，表明目前采用的有關(guān)防控手段有效。由于人口基數(shù)龐大，中國仍約有9300萬例乙肝病毒攜帶者，其中慢性乙肝患者約2000-3000萬。有研究表明，乙肝病毒感染引起的慢性肝炎與肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝癌密切相關(guān)，例如，肝癌患者中90%以上是由乙肝病毒感染引起的。研究表明，乙肝病毒對肝臟損害先表現(xiàn)為肝細胞炎癥壞死，爾后發(fā)展成肝纖維化、肝硬化和肝細胞癌。每年近30萬人死于與乙肝相關(guān)的肝硬化和肝癌等，是我國目前最為突出的一個公共衛(wèi)生問題。因此乙型肝炎病毒感染防治仍是目前中國乃至全世界的科研人員研究的熱點。
[0003]目前主流的乙肝治療方法療效較好，但各存有缺點，根據(jù)最新2010版的《慢性乙型肝炎防治指南》描述，慢性乙型肝炎治療主要包括抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗炎和抗氧化、抗纖維化和對癥治療，其中治療慢性乙肝的關(guān)鍵是抗病毒治療。目前抗病毒治療主要采用干擾素和核苷(酸)類似物。干擾素包括普通干擾素和長效干擾素，如派羅欣和佩樂能等；核苷(酸)類似物如拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋和替比夫定(素比伏)。所述的干擾素療程相對固定，HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率較高，療效相對持久，不發(fā)生耐藥；但不良反應(yīng)較多，不適用于高血清轉(zhuǎn)氨酶水平(如高于10倍以上正常值上限)的患者，以及失代償期肝硬化患者[1-7];核苷(酸)類似物口服給藥，抑制病毒作用強，不良反應(yīng)少而輕微，可用于失代償期肝硬化患者治療，但療程相對不固定，HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率低，須長期用藥，停藥后易復(fù)發(fā)且可能發(fā)生病情惡化，甚至出現(xiàn)危及生命的肝功能失代償，易發(fā)生病毒耐藥性變異。綜上，目前關(guān)鍵的乙肝治療藥物尚無法清除感染者體內(nèi)的HBV CCC-DNA。
[0004]乙肝治療性疫苗是近年發(fā)展起來的免疫治療新概念旨在打破機體的免疫耐受，提高機體特異性免疫應(yīng)答，清除病原體或異常細胞，使疾病得以治愈。治療性乙肝疫苗的應(yīng)用針對慢性乙肝患者或HBV攜帶者，可由高純度和高含量的抗原和免疫佐劑組成增強其免疫原性，并通過不同途徑呈遞乙肝抗原，打破機體的免疫耐受，有效誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，達到清除乙肝病毒的目的。乙肝治療性疫苗的安全性、有效性已經(jīng)獲得初步驗證，目前全球范圍內(nèi)已經(jīng)有多個乙肝治療性疫苗正處于臨床試驗階段，我國的某乙肝治療性蛋白疫苗和DNA疫苗已被SFDA批準，如復(fù)旦大學(xué)聞玉梅院士和北京生物制品研究所趙鎧院士等合作研發(fā)的抗原抗體復(fù)合物治療性乙型肝炎疫苗(乙克，簡稱YIC或YK)，已經(jīng)進入臨床3期，有望成為全球第一個上市的乙肝治療性疫苗；第三軍醫(yī)大學(xué)吳玉章教授領(lǐng)銜的乙肝病毒多肽乙肝治療性疫苗也已經(jīng)進入2期臨床。這表明乙肝治療性疫苗的安全性、有效性已經(jīng)獲得初步臨床驗證，雖然還需要后期長期和大樣本人群的檢驗。
[0005]本申請的發(fā)明人在目前乙肝治療性疫苗的構(gòu)成及相關(guān)研究的基礎(chǔ)上，擬提供一種攜帶乙肝病毒治療性抗原表位的重組融合蛋白；進一步提供多樣表位/HBc組成重組嵌合疫苗。
[0006]與本發(fā)明相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)有:
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目地是基于目前乙肝治療性疫苗相關(guān)研究的背景，提供一種重組融合蛋白及其用途，具體涉及一種攜帶乙肝病毒治療性抗原表位的重組融合蛋白及其用，尤其涉及攜帶被插入到乙肝核心抗原蛋白顆粒或者截短片段內(nèi)的乙肝病毒治療性抗原表位的重組融合蛋白及其用途。
[0008]本發(fā)明采用乙肝病毒核心顆粒HBc或其截短片段作為HBsAg、HBcAg中多種B細胞刺激表位，CTL表位，及Th細胞刺激表位的疫苗載體，利用其強大的佐劑樣作用，有效遞呈多種表位，激活高效的針對HBV病毒的機體免疫反應(yīng)，以期打破病毒慢性感染所產(chǎn)生的免疫耐受狀態(tài)，達到主要針對乙肝病毒感染免疫治療的效果及有效的預(yù)防長期HBV感染誘發(fā)的多種疾病如肝癌等。
[0009]本發(fā)明的重組融合蛋白，包含乙肝病毒HBV多種表位抗原及其他免疫刺激表位抗原和乙肝核心抗原病毒樣顆?；蚱浣囟唐沃苽涑汕逗峡乖撍龅亩喾N抗原表位可以單表位或者多表位組合的形式插入到乙肝病毒核心抗原HBc或其截短片段中相同或者不同的位點，同時結(jié)合不同的佐劑，能加強HBV病毒特異性的體液免疫和細胞免疫功能。
[0010]具體的，本發(fā)明的一種重組融合蛋白，由乙肝核心抗原蛋白HBcAg或其合理的截短片段和HBV刺激性表位多肽融合構(gòu)成，其包括乙肝核心抗原HBcAg或其截短片段，以及由下列的一個或者多個連接而成的肽段:n個B細胞，Th細胞刺激表位和CTL細胞表位(n ^ I) ；i個柔性氨基酸組成的連接短肽序列(i彡O)。
[0011]本發(fā)明中，所述的表位可以是以下的一種或幾種:B細胞表位是HBV Pre-S2來源的第14-24氨基酸序列(DPRVRGLYFPA)及其變異序列或HBs抗原上的a決定簇(CTKPTDGNCT)及其變異序列；Th細胞刺激表位是破傷風類毒素來源的第830-843氨基酸序列(QYIKANSKFIGITE)及其變異序列或通用Th細胞表位PADRE及其變異序列；CTL細胞表位是乙肝肝炎病毒來源的CTL表位序列，HBV核心抗原上的第18-27氨基酸序列(PLGFFPDH)及其變異序列。
[0012]本發(fā)明中，所述的柔性氨基酸組成的連接短肽序列是以下的一種或者幾種:AAA，SSS，GGG，GGGS，GGGGSGGGG, GS⑶EGG。
[0013]本發(fā)明中，所述的乙肝核心抗原蛋白或其片段是乙肝核心抗原全長蛋白(HBcAg，183AA)，或者氨基端144個氨基酸(HBcAg_N144)及氨基端149個氨基酸(HBcAg_N149);該蛋白片段所需的編碼DNA可由化學(xué)合成，重疊延伸PCR等眾所周知的方式獲得。
[0014]本發(fā)明中，所述的重組融合蛋白，其表位插入乙肝核心抗原片段或其截短片段的相同或者不同的許可位點，其插入方式分別為:單表位插入，單表位重復(fù)插入，單表位經(jīng)柔性短肽間隔后重復(fù)插入，不同單表位組合串聯(lián)插入，不同單表位組合串聯(lián)重復(fù)插入，不同單表位經(jīng)柔性短肽間隔后串聯(lián)插入，或不同單表位經(jīng)柔性短肽間隔后組合串聯(lián)重復(fù)插入。
[0015]本發(fā)明中，所述的乙肝核心抗原或其片段的相同或不同的許可位點，在HBcAg，HBcAg-N144或HBcAg_N149的78-79位氨基酸之間，或替換HBcAg76_81位氨基酸之間的任意η個氨基酸(1<η<6);
所述的重組后的融合蛋白可由眾所周知的人工氨基酸合成或者基因表達系統(tǒng)表達獲得。
[0016]本發(fā)明還是提供了一種以本發(fā)明所設(shè)計的重組融合蛋白作為主要有效成分的疫苗制品，尤其是乙肝治療性疫苗制品；本發(fā)明還包括醫(yī)學(xué)上可接受的藥用佐劑，如鋁鹽佐劑或者細胞因子如GM-CSF作為免疫佐劑。
[0017]本發(fā)明提供編碼上述重組融合蛋白氨基酸序列的DNA序列，由于基因的簡并性，編碼相同肽段的DNA序列不是唯一的，但均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0018]本發(fā)明的又一目的是提供制備乙肝核心抗原HBc或其截短片段-多肽表位重組融合蛋白的方法。
[0019]制備該重組融合蛋白的方法包括以下幾個部分:首先通過化學(xué)合成或重疊延伸PCR的方法可獲得乙肝核心抗原全長蛋白(HBcAg，183AA)，氨基端144個氨基酸(HBcAg-N144)及氨基端149個氨基酸(HBcAg_N149)所對應(yīng)的基因序列，再通過同樣的方法將HBsAg，HBcAg中的B細胞表位，CTL細胞表位，和Th刺激表位或其變異序列，分別以如下的方式:單表位插入，單表位重復(fù)插入，單表位經(jīng)柔性連接短肽間隔后重復(fù)插入，不同單表位組合串聯(lián)插入，不同單表位組合串聯(lián)重復(fù)插入，不同單表位經(jīng)柔性連接短肽間隔后組合串聯(lián)插入，不同單表位經(jīng)柔性連接短肽間隔后組合串聯(lián)重復(fù)插入HBcAg的78-79位氨基酸之間，或替換HBcAg76-81位氨基酸之間的任意η個氨基酸(I ^ n ^ 6);或插入截短的HBcAg-N144，HBcAg-N149片段的78-79位氨基酸之間，或替換HBcAg76_81位氨基酸之間的任意η個氨基酸(I n ^ 6),成為一個人工融合基因，并將該基因在表達載體系統(tǒng)中表達純化，得到乙肝核心抗原蛋白HBc或截短片段-治療性多肽表位重組融合蛋白。該重組融合抗原純化后與其他佐劑如GM-CSF等制備成完整的疫苗，可制備成溶液，懸液，氣溶膠，乳液，固體或脫水物形式，例如作為凍干粉在無菌管形瓶中保存。
[0020]本發(fā)明在HBV病毒B細胞刺激表位，CTL表位及通過Th細胞刺激表位或破傷風類毒素刺激表位的單個表位或組合在一起的多個表位插入到乙肝核心抗原蛋白或其片段的不同位點，制成了能夠?qū)BV病毒特異性細胞免疫的重組融合蛋白，建立了抗原表達方法，并初步評價免疫原性和保護性，為現(xiàn)有乙肝疫苗的適用和發(fā)展表位疫苗等新型疫苗提供依據(jù)。
[0021]下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1是HBC-N149片段蛋白發(fā)酵及純化產(chǎn)物的SDS-PAGE和dot_blot分析，
其中，Lanel-2 細胞破碎液；lane3 蛋白 marker (7, 14, 28, 40, 65, 90Kd)；
Lane4:純化的融合蛋白。
[0023]圖2顯示重組融合蛋白的顆粒直徑(30nm)。
[0024]圖3是抗preS2_B表位及HBc抗體滴度檢測，其中顯示融合蛋白疫苗免疫2次后一周，用ELISA方法檢測抗preS2-B表位及HBc抗體滴度，結(jié)果表明，與生理鹽水對照組相t匕，疫苗組能激發(fā)高強度的體液免疫效果。
[0025]圖4 IL4和IFNy的檢測，
其中顯示融合蛋白疫苗免疫3次后一周，采集脾臟，用流式細胞儀檢測IL4和IFNy陽性的細胞豐度，結(jié)果表明，經(jīng)HBcAg-N149蛋白及重組融合蛋白HBcAg-N149/preS2免疫3次后，與生理鹽水組相比，細胞免疫被明顯激活。

【具體實施方式】
[0026]實施例1以HBcAg_N149片段為例制備乙肝核心抗原蛋白載體或其截短片段編碼乙肝核心抗原HBcAg-N149基因片段可從乙肝病毒顆粒(HBV)經(jīng)PCR方法獲得，截取1-149個氨基酸殘基，5’和3’端分別加上和PWI的酶切位點。該HBcAg_N149基因片段通過和RsiI的酶切，連接導(dǎo)入大腸桿菌表達質(zhì)粒Pcold IV，重組大腸桿菌表達質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌表達宿主菌JM109。將鑒定陽性的重組菌落接入5 mL LB培養(yǎng)液中，37°〇振蕩培養(yǎng)至培養(yǎng)液的4_達0.4-0.6。各取2 mL培養(yǎng)菌液加入200 mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)3 h，然后加入IPTG至終濃度為I mmol/L，低溫培養(yǎng)16 h,誘導(dǎo)蛋白表達。收集細菌用裂解緩沖液和超聲細胞粉碎機裂解細菌，分別收集上清和沉淀。將沉淀(包涵體)充分溶解于8 mol/L尿素中，室溫16 h,收集上清，在含復(fù)性液的透析袋中透析48 h,收集上清即為復(fù)性后的表達蛋白，經(jīng)離子交換柱和分子量，純化后經(jīng)SDS-PAGE鑒定為17kD左右，用dot-blot方法，使用HBc抗體檢測，表達和純化的蛋白呈陽性反應(yīng)結(jié)果如圖1所示。
[0027]實施例2 將B細胞表位插入HBcAg_N149合理位點組成融合蛋白為例制備攜帶HBV治療性多肽表位的HBcAg或截短片段重組融合蛋白
將編碼HBV Pre-S2來源的第14-24氨基酸序列(DPRVRGLYFPA)的基因序列用重疊PCR的方式插入HBcAg-N149片段的78-79位氨基酸之間，5’和3’端分別加上和PWI的酶切位點。該HBcAg-N149基因片段通過^amHl和PWI的酶切，連接導(dǎo)入大腸桿菌表達質(zhì)粒Pcold IV，重組大腸桿菌表達質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌表達宿主菌JM109。將鑒定陽性的重組菌落接入5 mL LB培養(yǎng)液中，37°C振蕩培養(yǎng)至培養(yǎng)液的A_達0.4-0.6。各取2 mL培養(yǎng)菌液加入200 mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)3 h,然后加入IPTG至終濃度為I mmol/L,低溫培養(yǎng)16 h,誘導(dǎo)蛋白表達。收集細菌用裂解緩沖液和超聲細胞粉碎機裂解細菌，分別收集上清和沉淀。將沉淀(包涵體)充分溶解于8 mol/L尿素中，室溫16 h,收集上清，在含復(fù)性液的透析袋中透析48 h,收集上清即為復(fù)性后的表達蛋白。將純化后的重組融合蛋白經(jīng)電子顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)其顆粒與天然的HBcAg顆粒大小類似，為30nm左右(如圖2所示)。
[0028]實施例3
以重組HBcAg-N149片段與重組融合蛋白HBcAg-N149/preS2為例說明疫苗誘導(dǎo)HBV特異性免疫應(yīng)答實驗
設(shè)立3個實驗組，分別為生理鹽水組，HBcAg-N149組，重組融合蛋白HBcAg_N149/preS2組；在6個雌性的BALB/c小鼠中試驗(每組)，每小鼠在0，21，42天皮下注射0.1-1OOPg融合蛋白和1Mg招鹽佐劑。
[0029]在第二次免疫后一周，檢測抗preS2_B表位的抗體，結(jié)果如圖3所示，有超過15的抗preS2-B表位的抗體滴度，及超過13滴度的針對HBc的抗體滴度，結(jié)果顯示有劑量依賴關(guān)系；HBcAg-N149不能誘導(dǎo)抗preS2-B表位的抗體；在第三次免疫后一周，檢測脾臟中細胞免疫反應(yīng)(IL4和IFNy )，結(jié)果如圖4所示，3次免疫以后，結(jié)果顯示，HBcAg-N149/preS2融合蛋白疫苗能誘導(dǎo)大量的IL4及IFNy細胞因子分泌，引發(fā)有效的細胞免疫效應(yīng)。
【權(quán)利要求】
1.一種重組融合蛋白，其特征在于，所述的重組融合蛋白包括乙肝核心抗原HBcAg或其截短片段，以及由下列的一個或者多個連接而成的肽段:n個B細胞，Th細胞刺激表位和CTL細胞表位(n ^ I) ；i個柔性氨基酸組成的連接短肽序列(i彡O)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組融合蛋白，其特征在于:所述的B細胞表位是HBVPre-S2來源的第14-24氨基酸序列DPRVRGLYFPA及其變異序列或HBs抗原上的a決定簇CTKPTDGNCT及其變異序列；Th細胞刺激表位是破傷風類毒素來源的第830-843氨基酸序列QYIKANSKFIGITE及其變異序列或通用Th細胞表位PADRE及其變異序列；CTL細胞表位是HBV核心抗原(HBcAg)上的第18-27氨基酸序列PLGFFPDH及其變異序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組融合蛋白，其特征在于:所述的柔性連接短肽序列是AAA, SSS, GGG, GGGS, GGGGSGGGG, GS⑶EGG 中的一種或者幾種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組融合蛋白，其特征在于:所述的乙肝核心抗原蛋白或其片段是乙肝核心抗原全長蛋白(HBcAg，183AA)，或者氨基端144個氨基酸(HBcAg_N144)及氨基端149個氨基酸(HBcAg-N149)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組融合蛋白，其特征在于:其表位插入乙肝核心抗原片段或其截短片段的相同或者不同的許可位點，其插入方式為:單表位插入，單表位重復(fù)插入，單表位經(jīng)柔性短肽間隔后重復(fù)插入，不同單表位組合串聯(lián)插入，不同單表位組合串聯(lián)重復(fù)插入，不同單表位經(jīng)柔性短肽間隔后串聯(lián)插入，或不同單表位經(jīng)柔性短肽間隔后組合串聯(lián)重復(fù)插入。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組融合蛋白，其特征在于:所述的乙肝核心抗原或其片段的相同或不同的許可位點在HBcAg，HBcAg-Nl44或HBcAg_N149的78-79位氨基酸之間，或替換HBcAg76-81位氨基酸之間的任意η個氨基酸(I < η < 6)。
7.—種乙肝治療性疫苗制品，其特征在于，以權(quán)利要求1所述的重組融合蛋白作為有效成分。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的乙肝治療性疫苗制品，其特征在于:所述疫苗中還包括醫(yī)學(xué)上可接受的藥用佐劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的乙肝治療性疫苗制品，其特征在于:其給藥途徑是:皮下注射給藥或粘膜給藥方式，其制劑是注射液或氣霧劑。
【文檔編號】A61K39/29GK104341506SQ201310324703
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年7月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月30日
【發(fā)明者】史訓(xùn)龍, 周珮, 鞠佃文, 周偉, 黃海, 馮美卿, 朱海燕, 葉麗 申請人:復(fù)旦大學(xué)