一種用于制備Aβ表位疫苗的融合蛋白及其制備方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及一種用于制備Αβ多價(jià)表位疫苗的重組融合蛋白 及其制備方法。更具體地說，本發(fā)明提供了一種利用基因工程技術(shù)提高Αβ功能Β細(xì)胞表 位免疫原性、優(yōu)化Αβ疫苗免疫特性的技術(shù)方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 阿爾茨海默?。ˋlzheimer'sdisease,AD)是一種致死性神經(jīng)退行性疾病，是老年 期癡呆的主要類型。其臨床特點(diǎn)是隱襲起病，逐漸出現(xiàn)記憶力衰退、認(rèn)知功能障礙、行為異 常和社交障礙。隨病情的進(jìn)行性加重，患者逐漸喪失獨(dú)立生活能力，在發(fā)病10~20年后因 并發(fā)癥而死亡。罹患AD不但嚴(yán)重影響患者自身的生活質(zhì)量，而且還給家庭和社會(huì)帶來沉重 負(fù)擔(dān)。隨著社會(huì)老齡化的加速，AD患病率增加的可能性將達(dá)到近流行病的程度，已成為當(dāng) 今公認(rèn)的醫(yī)學(xué)和社會(huì)難題。
[0003] 由于AD病因復(fù)雜、仍未闡明，迄今為止仍然沒有成功預(yù)防和治愈AD的策略。目前 臨床應(yīng)用的藥物主要有：膽堿酯酶抑制劑（多奈呱齊、卡巴拉汀、加蘭他敏等）、改善腦血流 循環(huán)和腦細(xì)胞代謝的藥物（如尼角麥林、吡拉西坦等）、神經(jīng)保護(hù)劑（鹽酸美金剛）、非甾體 抗炎藥、自由基清除劑和抗氧化劑（維生素E、維生素C、司來吉蘭、褪黑素、姜黃素、輔酶Q) 等。這些藥物療效不高，僅能在一定程度上緩解和改善AD患者的認(rèn)知、精神行為和功能方 面的癥狀。研究和開發(fā)AD防治藥物已迫在眉睫。
[0004] 近年來，β-淀粉樣蛋白（AmyloidP-peptide,Αβ)沉積學(xué)說被公認(rèn)為AD的主 要致病機(jī)制。Αβ是由39-43個(gè)氨基酸殘基組成的內(nèi)源性多肽，由淀粉樣跨膜前體蛋白 (Amyloidprescursorprotein,ΑΡΡ)依次經(jīng)蛋白水解酶β和γ裂解得到。Αβ整體疏水， 不同分子之間容易以β-折疊的構(gòu)象相互聚集，形成不溶性纖維，并以此為核心沉積形成 致病老年斑（Senileplaques,SP)。在大小不同的Αβ中，C-端包含有多個(gè)疏水性氨基酸 殘基的42肽Αβ(即Αβ42)最易沉積，并通過多種途徑損傷神經(jīng)細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。減 少Αβ42產(chǎn)生、抑制Αβ42聚集、清除腦內(nèi)Αβ42沉積已成為當(dāng)前AD防治藥物研發(fā)的重要策略 和發(fā)展方向。
[0005] 1999年Schenk用人工合成的人Α042作為免疫原接種轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠，在體 內(nèi)成功誘導(dǎo)了針對(duì)六042的特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)，并緩解和改善了模型小鼠的病理狀況，開 創(chuàng)了AD免疫防治的先河。此后，Elan公司用人Αβ42混合QS21佐劑開發(fā)了第一個(gè)AD疫苗 (ΑΝ-1792)。該疫苗的I期臨床研究證實(shí)：作為自身抗原，人Αβ42亦能誘導(dǎo)人體產(chǎn)生特異的 抗Αβ42體液免疫應(yīng)答，能有效減輕患者腦內(nèi)的淀粉樣沉積，并在一定程度上促進(jìn)認(rèn)知的改 善和記憶的恢復(fù)。然而，其Ila期臨床試驗(yàn)的失敗則揭示：Αβ42誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)能在 部分患者腦內(nèi)產(chǎn)生具有中樞神經(jīng)毒性的致敏Τ細(xì)胞。鑒于此，以Αβ為靶標(biāo)的免疫策略被 廣泛認(rèn)為是有效預(yù)防和治療AD的手段；去除Αβ42的Τ細(xì)胞表位，以Αβ42的Β細(xì)胞表位為 基礎(chǔ)研究和開發(fā)Αβ表位疫苗是AD防治藥物發(fā)展的重要趨勢。
[0006] 免疫學(xué)研究表明，N-端1-15氨基酸殘基組成的多肽片段（Αβi15)是Αβ42的功能 Β細(xì)胞表位，能與具有AD防治功能的抗Αβ42抗體發(fā)生特異性結(jié)合。然而，由于Αβi15是缺 乏輔助性T細(xì)胞（HelperTcell，Th)表位的小分子內(nèi)源肽，因此強(qiáng)化其免疫原性并誘導(dǎo)免 疫反應(yīng)向利于體液免疫的Th2方向發(fā)展已成為當(dāng)前Αβ表位疫苗制備和開發(fā)的關(guān)鍵技術(shù)問 題，也是決定Αβ疫苗防治AD有效性和安全性的基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 有鑒于此，為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種用于制備Αβ表位疫苗 的融合蛋白，基于此融合蛋白制備構(gòu)建的Αβ多價(jià)表位疫苗可以誘導(dǎo)很強(qiáng)的針對(duì)Αβ的體 液免疫應(yīng)答反應(yīng)和細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)，并且能誘導(dǎo)免疫反應(yīng)向Th2方向偏移，體現(xiàn)出比傳 統(tǒng)抗原蛋白更好的有效性和安全性，為基于Αβ的阿爾茨海默病預(yù)防與治療奠定基礎(chǔ)。
[0008] 本發(fā)明具體技術(shù)方案如下： 一種用于制備Αβ多價(jià)表位疫苗的融合蛋白，所述融合蛋白具有三個(gè)功能片段：Ν-端 的功能片段選自天門冬酰胺酶II(EcA)片段，中部的功能片段以及C-端的功能片段分別選 自輔助性T細(xì)胞表位（ThE)多肽片段和人Αβ的B細(xì)胞表位片段中的一種，且中部的功能 片段和C-端的功能片段不相同，即該融合蛋白可以是Ν-端為天門冬酰胺酶II(EcA)片段， 中部為輔助性T細(xì)胞表位（ThE)多肽片段，C-端的為人Αβ的B細(xì)胞表位片段的蛋白，也 可以是Ν-端為天門冬酰胺酶II(EcA)片段，中部為人Αβ的Β細(xì)胞表位片段，C-端為輔助 性Τ細(xì)胞表位（ThE)多肽片段的蛋白。
[0009] 所述天門冬酰胺酶II片段包括但不限于大腸桿菌來源的天門冬酰胺酶II(EcA); 所述輔助性T細(xì)胞表位（ThE)為人工設(shè)計(jì)的通用型HLA-DR結(jié)合（PanHLA-DRbinding epitope，PADRE)多肽，該表位多肽包含但不限于PADRE多肽；所述人Αβ的B細(xì)胞表位片 段為來源于淀粉樣蛋白肽（Αβ)Ν-端1-15氨基酸殘基組成的多肽片段（Αβ115)。
[0010] 優(yōu)選的，所述天門冬酰胺酶II片段的氨基酸序列如SEQIDNO: 1所示，輔助性Τ 細(xì)胞表位多肽片段的氨基酸序列如SEQIDN0:2所示，所述人Αβ的B細(xì)胞表位片段的氨 基酸序列如SEQIDΝ0:3所示。
[0011] 本發(fā)明所述融合蛋白的N-端的功能片段、中部的功能片段以及C-端的功能片段 可以直接相連或者通過連接肽相連。優(yōu)選的，N-端的功能片段與中部的功能片段通過限制 性內(nèi)切酶直接相連，中部的功能片段與C-端的功能片段通過連接肽相連，優(yōu)選連接肽的氨 基酸序列如SEQIDN0:7所示。
[0012] 本發(fā)明提供的一種優(yōu)選的融合蛋白氨基酸序列如SEQIDNO: 10所示。
[0013] 本發(fā)明還進(jìn)一步公開了編碼本發(fā)明所述融合蛋白的基因，具有編碼三個(gè)功能片段 的基因：編碼融合蛋白N-端的功能片段的基因選自天門冬酰胺酶II片段的基因，編碼中 部的功能片段以及C-端的功能片段的基因分別選自編碼輔助性T細(xì)胞表位多肽片段的基 因和編碼人Αβ的B細(xì)胞表位片段的基因中的一種，且編碼中部的功能片段和C-端的功能 片段的基因不相同，編碼融合蛋白Ν-端的功能片段的基因、編碼中部的功能片段基因以及 C-端點(diǎn)功能片段的基因可以直接相連，也可以通過連接肽基因相連。
[0014] 優(yōu)選的，所述編碼天門冬酰胺酶II片段的基因序列如SEQIDΝ0:4所示，編碼輔 助性Τ細(xì)胞表位多肽片段的基因序列如SEQIDΝ0:5所示，編碼人Αβ的Β細(xì)胞表位片段 的基因如SEQIDNO:6所示。
[0015] 優(yōu)選的，所述編碼融合蛋白N-端的功能片段基因與編碼中部的功能片段基因直 接相連，編碼中部的功能片段基因與編碼C-端的功能片段的基因通過連接肽基因相連，所 述連接肽基因序列如SEQIDN0:8所示。
[0016] 優(yōu)選的，編碼本發(fā)明所述融合蛋白的基因，核苷酸序列如SEQIDN0:9所示。
[0017] 本發(fā)明還公開了一種表達(dá)載體，含有本發(fā)明所述融合蛋白的編碼基因，優(yōu)選核苷 酸序列如SEQIDN0:9所示，表達(dá)如SEQIDN0:10所示的氨基酸序列的融合蛋白。
[0018] 本發(fā)明還公開了制備本發(fā)明所述的融合蛋白的方法，包括如下步驟： (1) 設(shè)計(jì)得到本發(fā)明所述的核苷酸序列，SEQIDN0:4-6,SEQIDN0:8-9 ; (2) 構(gòu)建含上述的核苷酸序列表達(dá)載體并將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞，形成可表達(dá)本 發(fā)明所述的融合蛋白的重組細(xì)胞； (3) 培養(yǎng)步驟（2)重組細(xì)胞；優(yōu)選采用IPTG在25°C條件下低溫誘導(dǎo)所述融合蛋白的高 效可溶性表達(dá)； (4) 分離純化得到本發(fā)明所述的融合蛋白，優(yōu)選的，包括將誘導(dǎo)表達(dá)后的重組細(xì)胞懸 浮于非變性融合蛋白提取液中，經(jīng)裂解后離心分離得到包含可溶性融合蛋白的上清溶液； 對(duì)上清溶液進(jìn)行鎳離子親和柱層析分離純化，以咪唑濃度梯度溶液洗脫層析得到包含融合 蛋白的洗脫峰；對(duì)上述洗脫峰經(jīng)分子篩凝膠柱層析進(jìn)一步純化四聚體蛋白并除去其中多余 鹽，凍干保存用于制備Αβ多價(jià)表位疫苗的融合蛋白。
[0019] 本發(fā)明的目的還在于提供本發(fā)明所述的融合蛋白在制備預(yù)防或治療β-淀粉樣 蛋白沉積引起的疾病藥物中的應(yīng)用。所述淀粉樣蛋白沉積引起的疾病包括但不限于阿 爾茨海默病、淀粉樣血管病等。
[0020] 本發(fā)明的目的還在于提供一種藥物組合物，含有本發(fā)明所述的融合蛋白以及藥學(xué) 上可接受的載體或賦形劑。
[0021] 本發(fā)明通過長期而廣泛的研究發(fā)現(xiàn)，將大腸桿菌天門冬酰胺酶（EcA)與輔助性Τ 細(xì)胞表位（ThE)多肽和人Αβ42功能B細(xì)胞表位（Αβι15)多肽融合，可通過表位呈現(xiàn)方式、 抗原聚集方式和免疫細(xì)胞活化方式的改變，從而可從根本上克服Αβ42功能Β細(xì)胞表位的免 疫耐受，極大提高Αβ疫苗的體液免疫效果，顯著誘導(dǎo)免疫反應(yīng)向利于AD安全、有效防治的 Th2方向發(fā)展。
[0022] Αβi15表位是由人Αβ42分子N-端1~15號(hào)氨基酸殘基組成的多肽片段，該表位 所激