一種“胞內(nèi)觸發(fā)”式還原敏感型藥物聯(lián)合基因靶向共傳遞體的制備及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明為一種“胞內(nèi)觸發(fā)”式還原敏感型藥物聯(lián)合基因靶向共傳遞體。該傳遞體為一種基因和藥物的雙載藥系統(tǒng)，由二硫鍵交聯(lián)的聚乙烯亞胺、聚丙交酯乙交酯共聚物及表面修飾的靶向性小分子構(gòu)成。傳遞體表面修飾的主動(dòng)靶向基團(tuán)可將藥物靶向至腫瘤部位并富集；聚合物內(nèi)部交聯(lián)的二硫鍵可在細(xì)胞內(nèi)高還原條件下斷裂，載體構(gòu)架解體從而釋放藥物。共傳遞體可有效載入基因和疏水性小分子藥物，同時(shí)保證基因穩(wěn)定性；在還原條件下共傳遞體降解并釋放基因和小分子藥物；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示該傳遞體對(duì)腫瘤具有顯著靶向性。
【專利說(shuō)明】一種“胞內(nèi)觸發(fā)”式還原敏感型藥物聯(lián)合基因靶向共傳遞體的制備及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及高分子聚合物基因載體和基因治療領(lǐng)療領(lǐng)域。具體涉及一種用于基因載體的聚合物和以該聚合物為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)并構(gòu)建的一種“胞內(nèi)觸發(fā)”式還原敏感型藥物聯(lián)合基因靶向共傳遞體。本發(fā)明涉及交聯(lián)型聚乙烯亞胺的合成及表征、共傳遞體的制備方法及其應(yīng)用。共傳遞體涉及疏水性小分子藥物、基因與納米粒形成的復(fù)合物、制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]據(jù)統(tǒng)計(jì)，在中國(guó)惡性腫瘤是僅次于心腦血管疾病的第二大殺手，而絕大多數(shù)患者首選手術(shù)切除、放射治療和化學(xué)藥物治療。這些療法對(duì)早期腫瘤患者可獲得快速且有效的治療，但對(duì)晚期伴有局部擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移者，并未顯著延長(zhǎng)患者的生存期和改善病人的生存質(zhì)量，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)化療藥物巨大的毒副作用以及在使用過(guò)程中產(chǎn)生的耐藥性問(wèn)題。近年來(lái)，研究者發(fā)現(xiàn)癌癥是一種基因病，是人體細(xì)胞在外環(huán)境因素的作用下，內(nèi)在多種前癌基因被激活和抑癌基因失活的多階段長(zhǎng)期演變的過(guò)程。因此，基因治療對(duì)于徹底根治腫瘤具有重要意義。
[0003]基因治療(gene therapy)是指將外源正?；蚪柚线m的載體被導(dǎo)入靶細(xì)胞，以糾正或補(bǔ)償因基因缺陷和異常引起的疾病，以達(dá)到治療目的。siRNA(小干擾RNA)是一類特異性和選擇性地抑制靶基因表達(dá)的雙鏈RNA，因其特異性、高效性以及作為基因治療藥物的巨大潛力而備受青睞。目前，RNAi技術(shù)在神經(jīng)退行性病變、心腦血管系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、消化系統(tǒng)疾病、遺傳性疾病、免疫相關(guān)性疾病等多種疾病的病因機(jī)制研究、診斷利治療方面都具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。人工合成的siRNA寡聚藥物的開(kāi)發(fā)正在成為一個(gè)熱點(diǎn)。
[0004]對(duì)于特異性抑制腫瘤中某種酶的表達(dá)而同時(shí)不干擾其在正常細(xì)胞中表達(dá)的siRNA，其載體必須具備腫瘤靶向性。例如，環(huán)氧合酶(COX)是花生四烯酸合成前列腺素(PG)的關(guān)鍵限速酶。結(jié)構(gòu)型C0X-1在 組織細(xì)胞中表達(dá)，催化生理性前列腺素合成而參與機(jī)體生理功能的調(diào)節(jié)；誘生型C0X-2較容易在激素、炎性細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和腫瘤啟動(dòng)子引起細(xì)胞激活后誘導(dǎo)產(chǎn)生。大量研究表明C0X-2在多種腫瘤形成的早期階段呈高表達(dá)狀態(tài)，可通過(guò)促血管生成、加速腫瘤細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡等促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。采用RNAi技術(shù)抑制編碼C0X-2的mRNA的表達(dá)，進(jìn)而抑制C0X-2蛋白的翻錄，因而可促使腫瘤細(xì)胞的凋亡。然而，C0X-2在正常組織中均有表達(dá)并且發(fā)揮重要的生理作用。因此，構(gòu)建C0X-2的siRNA必須靶向性地對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)生作用，而不能干擾正常細(xì)胞內(nèi)C0X-2的表達(dá)。
[0005]然而，研究發(fā)現(xiàn)基因治療雖然可以將人的正?；蚧蛴兄委熥饔玫耐庠椿蛲ㄟ^(guò)一定方式導(dǎo)入人體靶細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行有效表達(dá)，糾正基因缺陷以治療癌癥，并已被公認(rèn)為是當(dāng)前根治癌癥的有效手段，可是基因治療過(guò)程中容易出現(xiàn)免疫原性問(wèn)題，因此仍需通過(guò)與其他傳統(tǒng)療法，如外科手術(shù)、放療、化療等結(jié)合應(yīng)用，從而發(fā)揮協(xié)同增效、綜合治療的優(yōu)勢(shì)。由于大部分的抗腫瘤小分子藥物存在嚴(yán)重毒副作用、水溶性低及無(wú)靶向性等缺點(diǎn)，其臨床應(yīng)用受到了極大限制。近些年研究發(fā)現(xiàn)，高分子材料作為抗癌藥物載體可有效解決上述問(wèn)題，達(dá)到良好的抑瘤效果，但其連續(xù)使用會(huì)產(chǎn)生耐藥性問(wèn)題。因此，設(shè)計(jì)并構(gòu)建一種基因藥物與小分子抗癌藥物的靶向共傳遞體給藥系統(tǒng)具有一定意義。
[0006]目前基因的遞送技術(shù)主要有以下幾種:(I)直接轉(zhuǎn)染。即直接注射到組織或細(xì)胞內(nèi)。直接轉(zhuǎn)染過(guò)程中基因很容易被降解，需要大劑量應(yīng)用，可能會(huì)激發(fā)細(xì)胞毒性反應(yīng)。(2)滅活病毒載體轉(zhuǎn)染。病毒載體轉(zhuǎn)染效率高，但存在很嚴(yán)重的安全問(wèn)題，而且目的基因容量小，制備復(fù)雜，成本高，不能體內(nèi)反復(fù)使用。(3)非病毒載體轉(zhuǎn)染，包括脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和聚合物納米粒轉(zhuǎn)染。非病毒載體由于具有低毒、低免疫反應(yīng)，外源基因整合幾率低、無(wú)基因插入片段大小限制，以及使用簡(jiǎn)單、制備方便、便于保存和檢驗(yàn)等優(yōu)勢(shì)，日益受到人們重視。在生理?xiàng)l件下，核苷酸序列帶有一定負(fù)電，易于被陽(yáng)離子片段通過(guò)靜電作用吸附，從而能夠保證基因載遞送過(guò)程中的完整性。因此陽(yáng)離子聚合物已經(jīng)成為非病毒載體中深入研究的重點(diǎn)。聚乙烯亞胺(PEI)分子中每?jī)蓚€(gè)碳原子就相應(yīng)有一個(gè)質(zhì)子化的氮原子，由于這些氮原子構(gòu)成的伯氨、仲氨和叔氨基團(tuán)的PKa值不同，使PEI幾乎在任何pH條件下都有吸收質(zhì)子的能力。PEI “質(zhì)子海綿”特性使其能在細(xì)胞內(nèi)含體的酸性環(huán)境中吸收H+，使內(nèi)含體內(nèi)滲透壓增高，導(dǎo)致膜不穩(wěn)定甚至破裂，從而使被吞噬的復(fù)合物逃逸出來(lái)，避免基因降解，保證高效的轉(zhuǎn)染效率。
[0007]還原型谷胱甘肽(GSH)是動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)含量最豐富的含有巰基的生物小分子，還原型谷胱甘肽(GSH)/氧化型谷胱甘肽(GSSG)是體內(nèi)最主要的氧化還原對(duì)。在細(xì)胞內(nèi)外不同的環(huán)境中GSH/GSSG的含量存在顯著的差異。由于還原型輔酶II (NADPH)利谷胱甘肽還原酶的作用，細(xì)胞內(nèi)GSH濃度是細(xì)胞外環(huán)境的100-1000倍，從而使細(xì)胞內(nèi)環(huán)境保持較強(qiáng)的還原性。此外，研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中GSH濃度比正常組織至少高4倍，因此，比正常組織有更高的還原性。在本發(fā)明中，還原環(huán)境敏感型納米粒傳遞系統(tǒng)是基于二硫鍵交聯(lián)的聚乙烯亞胺，將二硫鍵作為還原環(huán)境刺激-響應(yīng)的開(kāi)關(guān)，使其在細(xì)胞外環(huán)境下穩(wěn)定存在，而在腫瘤細(xì)胞內(nèi)還原環(huán)境下發(fā)生斷裂。
[0008]生物可降解材料聚乳酸/羥基乙酸共聚物(PLGA)是乳酸與羥基乙酸共聚合而成的，具有良好的穩(wěn)定性和生物相容性，易于被細(xì)胞吞噬，對(duì)小分子疏水性藥物具有良好的包封率和載藥量，可有效解決抗腫瘤藥物存在的水溶性不良的問(wèn)題，同時(shí)不僅能增加難溶性藥物的溶解度，而且也能增加藥物的穩(wěn)定性和溶出速率，甚至在一定程度上可以改變藥物的動(dòng)力學(xué)和藥理性質(zhì)。
[0009]靶向給藥系統(tǒng)是一類能使藥物濃集定位于病變組織、器官、細(xì)胞或細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的新型給藥系統(tǒng)，是抗腫瘤藥物的首選給藥系統(tǒng)。其靶向機(jī)制主要有被動(dòng)靶向、主動(dòng)靶向以及物理化學(xué)靶向。被動(dòng)靶向主要是利用腫瘤部位的EPR效應(yīng)，通過(guò)控制制劑粒徑大小而積累于腫瘤部位；物理化學(xué)靶向是指控制磁場(chǎng)、熱、光、PH等，從而使得給藥系統(tǒng)在腫瘤部位釋放藥物；主動(dòng)靶向是根據(jù)腫瘤細(xì)胞表面受體而設(shè)計(jì)的靶向系統(tǒng)。針對(duì)腫瘤細(xì)胞表面過(guò)度表達(dá)的膜多糖或者膜蛋白，用多糖對(duì)給藥系統(tǒng)進(jìn)行修飾，可以明顯增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的親和力。透明質(zhì)酸(HA)是一種在細(xì)胞外基質(zhì)、結(jié)締組織和高等動(dòng)物的器官中廣泛分布的天然蛋白多糖。CD44是一類跨膜糖蛋白，是細(xì)胞表面最重要的HA受體。目前研究表明多種腫瘤細(xì)胞表面高度表達(dá)CD44分子。利用HA水溶性和腫瘤細(xì)胞靶向性的特點(diǎn)，將其作為藥物載體已成為抗腫瘤藥物研究熱點(diǎn)之一。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的目的之一在于提供一種還原敏感型聚合物材料，其特征是低分子量聚乙烯亞胺通過(guò)二硫鍵交聯(lián)得到；該聚合物與聚丙交酯乙交酯共聚物形成納米粒，同時(shí)在其表面包被透明質(zhì)酸。這種遞送系統(tǒng)可以同時(shí)主動(dòng)靶向遞送基因和小分子疏水性藥物至腫瘤部位，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)二硫鍵斷裂釋放藥物和基因，從而降低毒性，提高藥物和基因在腫瘤內(nèi)濃度，達(dá)到良好的治療效果。
[0011]本發(fā)明的目的之二在于提供一種“胞內(nèi)觸發(fā)”式還原敏感型藥物聯(lián)合基因靶向共傳遞體的制備方法。
[0012]本發(fā)明的目的之三在于提供該“胞內(nèi)觸發(fā)”式還原敏感型藥物聯(lián)合基因靶向共傳遞體在抗腫瘤領(lǐng)域中的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
[0014](I)聚乙烯亞胺與二硫鍵交聯(lián)試劑反應(yīng)，得到二硫鍵交聯(lián)型低分子量聚乙烯亞胺(PEIss)。該反應(yīng)需要氮?dú)獗Ｗo(hù)、避光條件下進(jìn)行。所述聚乙烯亞胺還包括其衍生物。
[0015](2) 二硫鍵交聯(lián)型低分子量聚乙烯亞胺與聚丙交酯乙交酯共聚物通過(guò)乳化溶劑揮發(fā)法制備納米粒。
[0016](3)透明質(zhì)酸通過(guò)共價(jià)鍵或者非共價(jià)鍵覆蓋在納米粒子表面。所述透明質(zhì)酸還包括其衍生物。
[0017]本發(fā)明中用于合成二硫鍵交聯(lián)型低分子量聚乙烯亞胺的交聯(lián)劑可以為二硫代二丙酸丁二酰亞胺酯，二甲氧基-二硫代丙基亞胺鹽酸鹽，N, N’ -胱胺雙丙烯酰胺，優(yōu)選N，N’-胱胺雙丙烯酰胺；聚乙烯亞胺分子量為1800Da~750，OOODa，優(yōu)選1800Da ;反應(yīng)溶劑可以為DMS0、DMF、甲醇、/K，優(yōu)選甲醇-水(80%);交聯(lián)劑與聚乙烯亞胺的摩爾比例范圍為1:4~1:1，優(yōu)選1:2 ;反應(yīng)溫度范圍為室溫~60°C;反應(yīng)時(shí)間為2-10天，優(yōu)選3天；反應(yīng)要求在避光、氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下進(jìn)行。合成反應(yīng)純化，既可以采用透析袋透析純化，也可以采用離心濃縮管純化，優(yōu)選離心濃縮管，以節(jié)約時(shí)間，便于冷凍干燥。
[0018]本發(fā)明采用乳化溶劑揮發(fā)法制備納米粒，采用的有機(jī)相溶劑可以是二氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸、丙酮以及上述幾種溶劑的混合溶劑，優(yōu)選二氯甲烷；采用的表面活性劑可以是泊洛沙姆、聚乙烯醇、吐溫80等，優(yōu)選泊洛沙姆188，濃度為1%至10%，優(yōu)選5% ;乳化方法可以采用超聲法或者高速剪切法，優(yōu)選超聲法，乳化時(shí)間為5min至30min，優(yōu)選15min ；聚丙交酯乙交酯共聚物分子量為5000Da至40000Da，嵌段比為50:50、75:25，優(yōu)選分子量10，OOODa，嵌段比50:50 ;聚丙交酯乙交酯共聚物和二硫鍵交聯(lián)型低分子量聚乙烯亞胺質(zhì)量比為1:1至20:1，優(yōu)選10:1。
[0019]本發(fā)明采用透明質(zhì)酸通過(guò)共價(jià)鍵或者非共價(jià)鍵覆蓋于納米粒表面。共價(jià)鍵修飾優(yōu)選1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺將透明質(zhì)酸糖環(huán)上的羧基和二硫鍵交聯(lián)型低分子量聚乙烯亞胺上氨基進(jìn)行?；磻?yīng)。非共價(jià)鍵修飾優(yōu)選通過(guò)靜電作用，將帶負(fù)電的透明質(zhì)酸與帶正電的二硫鍵交聯(lián)型低分子量聚乙烯亞胺孵育一定時(shí)間。
[0020]本發(fā)明以 多種疏水性小分子抗癌藥物(如紫杉醇、多西他賽、阿霉素等)其中一種為模型，按照上述方法制備載藥納米粒，載藥量為50% -100%，24-120h可完全釋放。
[0021]本發(fā)明提供了 “胞內(nèi)觸發(fā)”式還原敏感型藥物聯(lián)合基因靶向傳遞體在胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、膽囊癌、直結(jié)腸腺癌、食管腺癌、宮頸癌、腦星形細(xì)胞瘤中應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1為本發(fā)明中二硫鍵交聯(lián)型低分子量聚乙烯亞胺利用AVANCE500MHZ核磁共振儀測(cè)定的1HNMR掃描圖。
[0023]圖2為本發(fā)明中納米粒利用原子力顯微鏡測(cè)定的形態(tài)與粒徑圖。
[0024]圖3為本發(fā)明中納米粒與SiRNA利用瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定的結(jié)合能力電泳圖，左圖為電泳條帶亮度積分轉(zhuǎn)化為光密度值繪制的結(jié)合百分?jǐn)?shù)曲線，右圖為電泳成像圖，按電泳槽甬道從左到右順序，N/P = 0,0.25.0.5，1，2，5，10，20。
[0025]圖4為本發(fā)明中納米粒與SiRNA結(jié)合后利用瓊脂糖凝膠電泳考察其抗核酸酶降解能力電泳圖，左圖為將電泳條帶亮度轉(zhuǎn)化為光密度值繪制的降解百分?jǐn)?shù)曲線，右圖a，b，c加樣分別為裸siRNA，PLGA-PEIss/siRNA復(fù)合物及PLGA-PEI/siRNA復(fù)合物，電泳槽甬道加樣從左到右分別為復(fù)合物與Rnase孵育0，5，15，30，45，60，120，240min后的產(chǎn)物。
[0026]圖5為本發(fā)明中還原敏感型納米粒與SiRNA結(jié)合后利用瓊脂糖凝膠電泳考察其還原敏感性，上圖加樣為PE1-PLGA/siRNA復(fù)合物，下圖加樣為PEIss-PLGA/siRNA復(fù)合物，電泳槽甬道加樣從左到右分別為U/ug(肝素鈉/siRNA) = 0,0.015，0.03，0.0375，0.075，
0.15，0.3。
[0027]圖6為本發(fā)明中載多西他賽的還原敏感納米粒體外釋放曲線。
[0028]圖7為本發(fā)明中透明質(zhì)酸修飾的還原敏感納米粒在體組織分布?！ぁ揪唧w實(shí)施方式】
[0029]下面結(jié)合實(shí)施例，以二硫鍵交聯(lián)試劑:N，N'-雙(丙稀酰)胱胺為例，但不限于此，對(duì)發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明:
[0030]實(shí)施例1
[0031 ] 二硫鍵交聯(lián)型低分子量聚乙烯亞胺的合成與表征
[0032](I)合成條件
[0033]稱取聚乙烯亞胺(Mw = 1800) Ig (0.56mmol)，置于三頸圓底燒瓶中，加入甲醇-水(80%)9ml使溶解。稱取N，N'-雙(丙稀酰)胱胺0.07g(0.28mmol)，加入甲醇-水(80% ) Iml使溶解，并緩慢滴加至三頸燒瓶中。攪拌，55°C、氮?dú)獗Ｗo(hù)、避光反應(yīng)3天。透析純化，冷凍干燥得到二硫鍵交聯(lián)型低分子量聚乙烯亞胺。
[0034](2)結(jié)構(gòu)表征
[0035]取二硫鍵交聯(lián)型低分子量聚乙烯亞胺干燥純品適量，溶于D2O中，通過(guò)核磁共振(1H-NMR)對(duì)其進(jìn)行結(jié)果確證。聚乙烯亞胺的1H-NMR圖譜中，特征峰集中在2.5~2.9處；而二硫鍵交聯(lián)的低分子量聚乙烯亞胺的1H-NMR圖譜中，在δ = 3.47，3.08，2.38出現(xiàn)的峰分別歸屬CBA的亞甲基峰以及丙烯酰胺雙鍵在Michael加成反應(yīng)后所生成的亞甲基。結(jié)果見(jiàn)圖1。
[0036]實(shí)施例2
[0037]納米粒的制備與質(zhì)量評(píng)價(jià)
[0038](I)納米粒的制備[0039]配制20mg/ml 二硫鍵交聯(lián)型低分子量聚乙烯亞胺丙酮儲(chǔ)備液:稱取二硫鍵交聯(lián)型低分子量聚乙烯亞胺0.2g，加入0.05g吐溫80，溶于IOml丙酮中，避光，超聲溶解。[0040]有機(jī)相溶液配制:稱取聚丙交酯乙交酯共聚物(10，000Da50:50)0.2g，加入0.1g吐溫80，溶于2ml 二氯甲烷中，超聲溶解。加二硫鍵交聯(lián)型低分子量聚乙烯亞胺丙酮儲(chǔ)備液1ml,補(bǔ)加丙酮至IOml,混勻。[0041]水相溶液配制:稱取0.5g泊洛沙姆188，溶于IOml水中。[0042]將有機(jī)相加入到水相中，使用超聲波細(xì)胞粉碎儀將混合溶液超聲15mint)45°C旋蒸5min,除去有機(jī)溶劑。0.45 μ m濾膜濾過(guò),得空白納米粒。[0043]在有機(jī)相溶液中，加入一定量的多西他賽丙酮溶液，即得載藥納米粒。[0044](2)納米粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)[0045]原子力顯微鏡分析，將空白納米粒稀釋至適宜濃度，滴加于潔凈的蓋玻片上，室溫靜置過(guò)夜，風(fēng)干。置于原子力顯微鏡下，調(diào)節(jié)后顯微觀察納米粒形態(tài)與粒徑，結(jié)果見(jiàn)圖2。[0046]實(shí)施例3[0047]透明質(zhì)酸的修飾與體外內(nèi)評(píng)價(jià)[0048](1)透明質(zhì)酸修飾[0049]非共價(jià)結(jié)合:取載藥納米粒適量，加入透明質(zhì)酸溶液，混勻孵育15min，得透明質(zhì)酸修飾的納米粒。[0050]共價(jià)結(jié)合:將適量透明質(zhì)酸溶液與載藥納米粒混勻，加入1.0moI/L的鹽酸，使反應(yīng)物的PH值到6.5。另取適量1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺，溶解于二甲基亞砜-水(50%)中，再緩慢加入反應(yīng)物溶液中，常溫?cái)嚢杌旌?4h后，用1.0mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH。透析后，冷凍干燥得透明質(zhì)酸修飾的納米粒。[0051]取透明質(zhì)酸修飾后的納米粒適量，與siRNA溶液按一定比例混勻，孵育15min。即得雙載藥納米粒。[0052](2)體內(nèi)外評(píng)價(jià)[0053]瓊脂糖凝膠電泳分析，取透明質(zhì)酸修飾的空白納米粒子，與siRNA按氮磷比(N:P)為O:1，0.25:1,0.5:1，1:1,2:1,5:1,10:1，20:1混勻，孵育后，瓊脂糖電泳分析兩者靜電結(jié)合能力，結(jié)果見(jiàn)圖3。[0054]瓊脂糖凝膠電泳分析，按N:P比為10:1配制PLGA-PEI/siRNA和PLGA-PEI_ss/siRNA納米粒復(fù)合物溶液，總體積為10uL，每份溶液含siRNA0.4ug。將RNase溶液(40ug/ml)加入復(fù)合物，并在37°C條件下分別孵育0、5、15、30、60、120、240min。反應(yīng)結(jié)束時(shí)，立即存放于-20°C冰箱。待全部時(shí)間點(diǎn)取樣完畢，加入肝素溶液(10%)1111，使得~1^(肝素鈉/siRNA) = 0.0375，siRNA從復(fù)合物中游離出來(lái)。取上述混合液于2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。電壓85V，電泳時(shí)間為30min，紫外燈下觀察電泳結(jié)果。同時(shí)做裸siRNA的陰性對(duì)照。利用凝膠成像軟件將電泳條帶亮度轉(zhuǎn)化為光密度值繪制降解動(dòng)力學(xué)曲線，計(jì)算復(fù)合物在核酸酶中的降解速率常數(shù)。結(jié)果見(jiàn)圖4。[0055]瓊脂糖凝膠電泳分析，新鮮配制載基因納米粒，加入還原型谷胱甘肽(GSH)使得終濃度為20%。納米粒在還原型谷胱甘肽(GSH)的作用下二硫鍵斷裂，載體架構(gòu)被破壞，從而釋放siRNA。37°C孵育30min后，吸取Iul按照不同U/μ g(肝素鈉/siRNA) = 0,0.015，0.03，0.0375，0.075，0.15，0.3加入肝素鈉溶液，使得終體積為10ul。瓊脂糖凝膠電泳考察還原敏感性，結(jié)果見(jiàn)圖5。
[0056]取載多西他賽納米粒適量放入透析袋中，分別以pH7.4，pH5.8的磷酸鹽緩沖液為釋放介質(zhì)(含0.5% 1'?的1180，5(%小牛血清)，置于371:恒溫振蕩箱。分別于不同時(shí)間點(diǎn)
0.5h，lh, 2h，4h，8h，12h，18h，24h，72h，取Iml樣品冷藏保存，同時(shí)再加入Iml乙腈，HPLC法測(cè)量游離藥物含量，并計(jì)算其累計(jì)釋放率，結(jié)果見(jiàn)圖6。
[0057]取透明質(zhì)酸修飾前后的納米粒子適量，分別載以熒光染料Dir。取H22荷瘤小鼠15只，分別給以0.2ml生理鹽水，載Dir的PLGA-PEI納米粒，載Dir的PLGA-PE1-HA納米粒以及載Dir的PLGA-PEIss納米粒，載Dir的PLGA-PE1-HA納米粒8h后，解剖小鼠各臟器于活體成像儀中進(jìn)行熒光強(qiáng)度觀察并計(jì)算平均熒光強(qiáng)度，結(jié)果見(jiàn)圖7。
【權(quán)利要求】
1.一種“胞內(nèi)觸發(fā)”式還原敏感型藥物聯(lián)合基因靶向傳遞體，其特征是，所述傳遞體是化學(xué)藥物和基因聯(lián)合給藥的納米粒傳遞系統(tǒng)；聚合物可通過(guò)二硫鍵交聯(lián)，并且在其表面通過(guò)主動(dòng)靶向基團(tuán)包被進(jìn)行修飾。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述傳遞體中二硫鍵的引入包含但不局限于二硫代二丙酸丁二酰亞胺酯，二甲氧基-二硫代丙基亞胺鹽酸鹽，N, N’ -胱胺雙丙烯酰胺。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述傳遞體中主動(dòng)靶向基團(tuán)的修飾可以是多糖類如透明質(zhì)酸、甘露糖等，或者多肽蛋白類如RGD序列、轉(zhuǎn)鐵蛋白等。其中靶向基團(tuán)的修飾可以是共價(jià)鍵鍵合或者非共價(jià)鍵鍵合。
4.如權(quán)利要求1中所述的傳遞體，其特征是聚乙烯亞胺(polyethylenimines,PEI)或二硫鍵交聯(lián)的聚乙烯亞胺(PEIss)與聚丙交酯乙交酯共聚物(poly(lactic-co-glycolicacid), PLGA)質(zhì)量比為1:1_1:60，其中主動(dòng)靶向基團(tuán)的分子量為3000道爾頓~150萬(wàn)道爾頓；聚乙烯亞胺(或二硫鍵交聯(lián)的聚乙烯亞胺)分子量范圍為600道爾頓~70，000道爾頓；聚丙交酯乙交酯共聚物分子量范圍為5000道爾頓~10，000道爾頓，其中丙交酯:乙交酯的比例為25:75~75:25o
5.權(quán)利I中所要求的二硫鍵交聯(lián)型低分子量聚乙烯亞胺制備方法，包括以下步驟: (1)將聚乙烯亞胺和交聯(lián)劑按照一定摩爾比例分別溶于適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)溶劑中，一定溫度、避光、氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下攪拌反應(yīng)一定時(shí)間。 (2)反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)溶液于適當(dāng)透析液中透析純化，冷凍干燥即得二硫鍵交聯(lián)的聚乙烯亞胺共聚物。
6.如權(quán)利要求5中所述的制備方法，其反應(yīng)溶劑可以是惰性溶劑，如DMSO、DMF、甲醇、水，優(yōu)選甲醇-水(80%);反應(yīng)要求在避光、氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下進(jìn)行。交聯(lián)劑與聚乙烯亞胺的摩爾比例范圍為1:4~I 反應(yīng)溫度范圍為室溫~60°C,反應(yīng)時(shí)間為24~120h,透析液為水或無(wú)機(jī)鹽類，干燥采用冷凍干燥法`。
7.權(quán)利I中所要求的納米粒傳遞體的制備方法，包括以下步驟: (1)將聚丙交酯乙交酯共聚物和疏水性小分子藥物、聚乙烯亞胺(PEI)或二硫鍵交聯(lián)的聚乙烯亞胺(PEIss)按照一定的質(zhì)量比分別溶于適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑或水性溶劑中，并加入一定比例的吐溫-80。將上述溶液混合均勻后緩慢加入到一定濃度表面活性劑的水性溶液中。于冰水浴條件下，運(yùn)用超聲波細(xì)胞粉碎儀間斷超聲數(shù)分鐘后，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸掉有機(jī)溶劑，得到載小分子藥物的PLGA-PEI納米?；騊LGA-PEIss納米粒。以不同N:P將納米粒與基因混合均勻，室溫孵育一定時(shí)間后通過(guò)靜電自組裝形成基因-小分子藥物雙載藥PLGA-PEI 或 PLGA-PEIss 復(fù)合物溶液。 (2)將主動(dòng)靶向小分子物質(zhì)溶于去離子水中配制成10%(W/V)的溶液，在攪拌條件下將該溶液與雙載藥納米?；旌?，室溫避光攪拌24h，得主動(dòng)靶向基團(tuán)修飾的PLGA-PEI納米?；騊LGA-PEIss納米粒。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，聚丙交酯乙交酯共聚物和聚乙烯亞胺或二硫鍵交聯(lián)的聚乙烯亞胺質(zhì)量比范圍為5:1-60:1 ;聚丙交酯乙交酯共聚物濃度范圍為0.1mg/ml-10mg/ml ;吐溫-80濃度范圍為0.01% -1% ;表面活性劑的種類為:泊洛沙姆188，聚乙烯醇，濃度范圍為0.1% -5%。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的共傳遞體其特征在于粒徑小于2μ m。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述方法，其特征在于溶解共傳遞體的溶媒為磷酸鹽緩沖液、HEBS(4-羥乙基哌嗪乙磺酸)緩沖液、氯化鈉溶液或葡萄糖溶液；PLGA-PEI納米?；騊LGA-PEIss納米粒與基因的濃度范圍為0.01mg/ml-10mg/ml, N:P比范圍為1:1_1:100 ；主動(dòng)靶向小分子物質(zhì)與聚乙烯亞胺或二硫鍵交聯(lián)的聚乙烯亞胺的摩爾比范圍為1:10-10:I ;疏水性小分子藥物的載藥量為1% _10%。
11.根據(jù)權(quán)利I的要求所述的疏水性小分子藥物包括紫杉醇、多西他賽、阿霉素等抗腫瘤藥物以及激素類藥物、中藥單體等。
12.根據(jù)權(quán)利I的要求所述的基因可以是含報(bào)告基因、抗癌基因、細(xì)胞因子基因能在真核細(xì)胞中重組表達(dá)的質(zhì)粒DNA，寡聚核苷酸或是小干擾RNA。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的共傳遞體在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的應(yīng)用，用途在于可成功轉(zhuǎn)染人體以及動(dòng)物來(lái)源的內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞以及多種腫瘤細(xì)胞等。
14.根據(jù)權(quán)利要求9所述的共傳遞體在制備治療相應(yīng)疾病藥品中的應(yīng)用，該共傳遞體的給藥途徑包括:注射、口服和黏膜給藥，應(yīng)用于腫瘤等基因的化學(xué)藥物聯(lián)合基因協(xié)同治療 。
【文檔編號(hào)】A61K48/00GK103566379SQ201310456509
【公開(kāi)日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2013年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月30日
【發(fā)明者】沈雁, 王玨, 涂家生, 汪步海, 張俊玲 申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué)