一種用于抑制prrsv感染的脫氧核酶的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于抑制PRRSV感染的脫氧核酶，其核苷酸序列為SEQ?NO1。本發(fā)明的脫氧核酶能夠有效的抑制PRRSV感染。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種用于抑制PRRSV感染的脫氧核酶
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物酶【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的說(shuō)涉及一種用于抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)感染的脫氧核酶。
【背景技術(shù)】
[0002]豬繁殖與呼吸綜合征
[0003]豬繁殖與呼吸綜合征(porcine!^productive and respiratory syndrome, PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)感染引起的一種急性傳染病，該病的主要特征是繁殖障礙、呼吸道疾病、哺乳仔豬的高死亡率、免疫抑制和持續(xù)性感染等。PRRSV基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA，基因組3’非編碼區(qū)(3’ -UTR)有ploy (A)尾序列，5’非編碼區(qū)(5’ -UTR)有帽狀引導(dǎo)序列?；蚪M還有9個(gè)相互重疊的開(kāi)放閱讀框，ORFla和ORFlb主要編碼病毒的RNA復(fù)制酶和聚合酶；0RF2-7分別編碼GP2，E，GP3，GP4，GP5，基質(zhì)蛋白M和核衣殼蛋白N。
[0004]PRRSV侵入宿主細(xì)胞主要是通過(guò)與細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，利用細(xì)胞的內(nèi)吞作用而感染易感細(xì)胞。如豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)和猴腎細(xì)胞(MA-104，Marc-145)。至今已報(bào)道了四個(gè)獨(dú)立但功能相關(guān)的PRRSV受體:唾液酸粘附素Sn，硫酸乙酰肝素HS，波形蛋白Vimentin,清道夫受體蛋白0)163。
[0005]PRRSV于1987年在美國(guó)的北卡羅納、衣阿華等州的豬群中首次爆發(fā)，此后呈全球性流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)于1996年，由郭寶清首次在國(guó)內(nèi)某豬場(chǎng)分離到了 PRRSV。特別是2006年下半年，突變的PRRSV引起我國(guó)南方一些省份豬場(chǎng)爆發(fā)“高熱”綜合征，使我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)遭到了巨大的影響，以至于豬肉價(jià)格居高不下，影響了人們的生活水平。PRRSV—年四季都可發(fā)生，在每年的深秋至次年的早春，該病更為肆虐，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)的損失已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)某些A類(lèi)傳染病。盡管世界各養(yǎng)豬大國(guó)對(duì)PRRSV給予了足夠的重視，但到目前為止人們對(duì)PRRSV非編碼區(qū)，結(jié)構(gòu)蛋白及非結(jié)構(gòu)蛋白的功能、病毒的致病機(jī)制、病毒的持續(xù)性感染機(jī)制、機(jī)體對(duì)病毒的免疫機(jī)制等缺乏深入的認(rèn)識(shí)而難于防治，而且一旦豬場(chǎng)發(fā)生PRRS后，需要花很大的費(fèi)用和時(shí)間才能夠凈群，所以目前PRRS還是威脅各國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的主要疾病之一。目前主要依靠綜合防治措施控制該病的發(fā)生和傳播。預(yù)防本病的疫苗主要是滅活苗和弱毒苗，尚未有有效的治療措施。
[0006]脫氧核酶
[0007]脫氧核酶(DNAzyme)是利用體外分子進(jìn)化技術(shù)(systematic evolution ofligands by exponential enrichment, SELEX),從隨機(jī)脫氧核苷酸庫(kù)中獲得的一種具有酶活性的DNA分子。通過(guò)該技術(shù)已篩選出具有核酸酶活性、激酶活性、過(guò)氧化物酶活性等多種催化功能的脫氧核酶。作為一種潛在的強(qiáng)有力的RNA特異性切割工具，具有很好的應(yīng)用前景。目前最具有應(yīng)用前景的是經(jīng)典脫氧核酶“ 10-23 ”，無(wú)論是在體外應(yīng)用于RNA限制性?xún)?nèi)切酶，還是在體內(nèi)作為RNA水平上的基因失活劑，都具有很好的應(yīng)用前景。“10-23”型脫氧核酶由29個(gè)核苷酸組成，其中的催化中心有15個(gè)核苷酸(GGCTAGCTACAACGA)，催化中心的兩側(cè)各連有8個(gè)核苷酸的結(jié)合臂，用于結(jié)合底物RNA。DNAzyme最重要的一種性質(zhì)，也是目前研究最活躍的一個(gè)方面，是具有通過(guò)酯化作用而切割RNA分子的功能。DNAzyme這種獨(dú)特的性質(zhì)，使其有可能成為抗病毒感染、腫瘤等疾病的新型基因治療藥物和基因功能研究、核酸突變分析等的新型核酸工具酶。[0008]由于RNA核酶片段較大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，對(duì)靶位點(diǎn)的接近性差，并且合成十分困難，極易降解，使其應(yīng)用受到限制。而DNAzyme的高效性、高特異性、高穩(wěn)定性、短小精悍、易修飾、廉價(jià)低毒等特性使其作為一種新型的基因抑制工具，在多種領(lǐng)域的基因治療中得到了廣泛應(yīng)用，許多針對(duì)病毒感染性疾病設(shè)計(jì)的DNAzyme已經(jīng)進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)評(píng)估階段。隨著各種研究數(shù)據(jù)的積累和新型高效傳送載體的開(kāi)發(fā)，DNAzyme必將在病毒學(xué)研究及病毒性疾病的治療、酶學(xué)研究、生命進(jìn)化研究、分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)和醫(yī)藥生物技術(shù)等領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。
[0009]早在1997年，Santoro等就設(shè)計(jì)出可特異性切割人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV-1) gag/pol、env、vpr、tat 和 nef mRNA 起始編碼區(qū)的 DNAzyme。Banerjea 等則在 2003 年建立了快速鑒別靶標(biāo)RNA切割位點(diǎn)的方法，針對(duì)HIV-1病毒基因5’末端順式激活反應(yīng)元件(TAR)篩選出許多切割位點(diǎn)用于抑制病毒的復(fù)制。針對(duì)乙肝病毒，研究者設(shè)計(jì)的DNAzyme可在0.1~
2.5mmol/L范圍內(nèi)以劑量依賴(lài)方式特異性抑制相應(yīng)病毒基因的表達(dá)，并且抑制效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于反義寡核苷酸。此外，于樂(lè)成等以“10-23”型DNAzyme催化基序設(shè)計(jì)的針對(duì)丙型肝炎病毒(HCV) 5’非編碼區(qū)及部分C區(qū)的DNAzyme用于治療HCV感染，也觀察到了較好的抑制效果。DNAzyme還在其他病毒(呼吸道合胞病毒、人鼻病毒)中有很好的切割效果。盡管經(jīng)典“10~23”型脫氧核酶的切割范圍很廣，但是切割效率及特異性還有待于進(jìn)一步提高，尤其是避免隨機(jī)切割非靶位點(diǎn)帶來(lái)的副作用。目前對(duì)于脫氧核酶的結(jié)構(gòu)和功能已有初步了解，但多數(shù)研究仍處于實(shí)驗(yàn)階段。還必須尋找催化效率更高特異性更強(qiáng)的脫氧核酶，進(jìn)一步了解其結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的目的在于提供一種抑制PRRSV感染的脫氧核酶(ASON-Bulge-DNAzyme-PRRSV)，其核苷酸序列為 SEQ NOl:
[0011]59 -nnnnnnnnnnnnnnnnaagtacnnnnnnnnnnggctacaacgannnnnnnn-3> ；
[0012]其中η可以為a或g或c或t ;
[0013]其中5’ -aagtac-3’為一個(gè)非配對(duì)環(huán)“Bugle”，其可以增強(qiáng)脫氧核酶的切割效率和特異性；
[0014]其中優(yōu)選的脫氧核酶，其核苷酸序列為SEQ N02:
[0015]5’ -ggtaaaagcacaattcaagtacagatcaaaaggggctagctacaacgagcagaagc-3> ；
[0016]其中另一個(gè)優(yōu)選的脫氧核酶，其核苷酸序列為SEQ N03:
[0017]5’ -gtgttcccgtgcagcaaagatcttgggctgggctagctacaacgagccaatgg-3> ；
[0018]其中另一個(gè)優(yōu)選的脫氧核酶，其核苷酸序列為SEQ N04:
[0019]5’ -tttttttttttttttttttaagtacttttttttaaggctagctacaacgatacggccgc-3> ；
[0020]其中另一個(gè)優(yōu)選的脫氧核酶，其核苷酸序列為SEQ N05:
[0021]5’ -acttttaagttcacaggaggtacagggtgaaggggctagctacaacgaccggttgtg-3> ；
[0022]其中另一個(gè)優(yōu)選的脫氧核酶，其核苷酸序列為SEQ N06:[0023]5’ -tcgacaagaaacatgaaagtactccaaatgcgggctagctacaacgaccagaacc-3>。
[0024]本發(fā)明的抑制PRRSV的脫氧核酶的設(shè)計(jì)原理為:
[0025]本發(fā)明的脫氧核酶的結(jié)合部位通過(guò)Watson-Crick堿基配對(duì)與底物RNA分子結(jié)合，催化部位(5’ -GGCTAGCTACAACGA-3’)在RNA分子的一個(gè)未配對(duì)的嘌呤和一個(gè)已配對(duì)的嘧啶堿基處切割RNA ;同時(shí)，于5’端加入一個(gè)6bp非配對(duì)環(huán)“Bugle”(5’ -AAGTAC-3’ )，增強(qiáng)脫氧核酶的切割效率和特異性；其次，所設(shè)計(jì)的脫氧核酶不形成自身分子內(nèi)Watson-Crick堿基配對(duì)，同時(shí)，能夠避開(kāi)底物RNA中過(guò)長(zhǎng)分子內(nèi)堿基配對(duì)區(qū)和其它特殊高級(jí)結(jié)構(gòu)；利用加拿大科學(xué)院ZUKER編寫(xiě)的PCFOLD計(jì)算機(jī)軟件預(yù)測(cè)靶mRNA (M，5’_UTR，3’_UTR，ORFlb, CD163)切點(diǎn)兩翼堿基序列切割片段的結(jié)合自由能，最后，將設(shè)計(jì)好的脫氧核酶直接在核酸合成儀上大量合成。
[0026]本發(fā)明的脫氧核酶能夠有效的抑制PRRSV的感染，體外實(shí)驗(yàn)證明，其能有效的控制PRRSV感染Marc-145細(xì)胞，因此，可用于PRRSV感染的預(yù)防與治療。
[0027]本發(fā)明的有益效果:
[0028]脫氧核酶既可以針對(duì)RNA，也可以切割或修飾DNA。病毒的基因組較簡(jiǎn)單，加之病毒生存周期活細(xì)胞依賴(lài)的特殊性，使病毒對(duì)于核酸損傷特別敏感，同時(shí)也使DNAzyme在病毒感染性疾病的治療和診斷中的應(yīng)用具有很好的可操作性和可行性。本發(fā)明的脫氧核酶在切割效率和穩(wěn)定性上比經(jīng)典“10~23”脫氧核酶效果更好，可以更有效的抑制PRRSV。對(duì)該脫氧核酶的深入研 究，對(duì)PRRSV的致病機(jī)理及防治有重要意義。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0029]圖lASON-Bulge-DNAzyme-PRRSV 轉(zhuǎn)染后 72h 對(duì) PRRSV 的抑制效果。
【具體實(shí)施方式】
[0030]以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0031]材料來(lái)源
[0032]1.細(xì)胞、病毒及PRRSV陽(yáng)性豬血清
[0033]本發(fā)明中細(xì)胞Marc-145登載于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中，處于公開(kāi)狀態(tài)，科學(xué)工作者可向該菌種保藏中心索?。籔RRSV-S3毒株由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所病毒課題組從PRRSV感染病豬的內(nèi)臟組織中分離獲得(分離方法為:豬繁殖呼吸綜合征病毒S3毒株的分離及其免疫特性研究.動(dòng)物醫(yī)學(xué)，2002，23(4):87-90)，后期經(jīng)血清學(xué)試驗(yàn)，分子生物學(xué)試驗(yàn)，測(cè)序分析確定為美洲型PRRSV ；PRRSV陽(yáng)性豬血清由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所病毒課題組攻毒PRRSV陰性仔豬獲得。
[0034]2.工具酶和主要商品試劑
[0035](I)DMEM培養(yǎng)基(HycI ine )購(gòu)自上海皓嘉科技發(fā)展有限公司，胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco0
[0036](2) 100X青鏈霉素溶液:10,000單位/mL青霉素，10，000 μ g/ml鏈霉素溶于
0.85%NaCL溶液，-20°C保存。購(gòu)自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。
[0037](3) PBS 緩沖液(0.01M, pH=7.4):配制 400mL 溶液時(shí)，在 350mL ddH20 中加入:
[0038]
【權(quán)利要求】
1.一種用于抑制PRRSV感染的脫氧核酶，其核苷酸序列為SEQ NOl0
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫氧核酶，其核苷酸序列為SEQN02。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫氧核酶，其核苷酸序列為SEQN03。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫氧核酶，其核苷酸序列為SEQN04。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫氧核酶，其核苷酸序列為SEQN05。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫·氧核酶，其核苷酸序列為SEQN06。
【文檔編號(hào)】A61P31/14GK103525819SQ201310501257
【公開(kāi)日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月22日
【發(fā)明者】李紅, 易建中, 劉成倩 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院