抗cd4抗體和抗融合肽的綴合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及綴合物，所述綴合物包含2個或多個抗融合肽和抗-CD4抗體(mAb?CD4)，特征是1-8個抗融合肽分別與所述抗-CD4抗體的重鏈和／或輕鏈的一個末端綴合，并涉及所述綴合物的藥物用途。
【專利說明】抗CD4抗體和抗融合肽的綴合物
[0001]本申請為2008年7月18日提交的、發(fā)明名稱為“抗⑶4抗體和抗融合肽的綴合物”的PCT申請PCT / EP2008 / 005894的分案申請，所述PCT申請進(jìn)入中國國家階段的日期為2010年I月20日，申請?zhí)枮?00880025361.4。
[0002]本發(fā)明涉及抗⑶4抗體和抗融合肽的綴合物，其中2至8個抗融合肽各自與抗⑶4抗體的重鏈和/或輕鏈的一個末端綴合?？谷诤想牡陌被崴娇梢圆煌⑾嗨苹蛳嗤?br> [0003]發(fā)明背景
[0004]人免疫缺陷病毒(HIV)對細(xì)胞的感染受感染細(xì)胞的膜與病毒膜融合過程的影響。認(rèn)為該過程的普遍方案如下:病毒被膜糖蛋白復(fù)合體(gpl20 / gp41)與位于感染細(xì)胞膜上的細(xì)胞表面受體相互作用。gpl20結(jié)合例如⑶4受體和共受體(例如，CCR-5或CXCR-4)的組合導(dǎo)致gpl20 / gp41復(fù)合體構(gòu)象的改變。該構(gòu)象改變的結(jié)果是gp41蛋白能夠插入到靶細(xì)胞的膜內(nèi)。所述插入是膜融合過程的開始。由于天然存在的多態(tài)性，已知gp41蛋白的氨基酸序列在不同HIV株之間不同。但是可以識別相同的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，更精確的，融合信號、兩個七殘基重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域(HR1、HR2)和跨膜結(jié)構(gòu)域(N-至C-端方向)。提示，融合(或致融(fusogenic))結(jié)構(gòu)域參與了細(xì)胞膜的被插入和分解。HR區(qū)域由多個包含7個氨基酸(“七殘基(heptad)，，)序列段(stretch)構(gòu)成(參見例如，Shu, W.等人，Biochemistry38 (1999) 5378-5385)。除了七殘基外，還存在一個或多個亮氨酸拉鏈-樣基序。上述組成是gp41蛋白卷曲螺旋結(jié)構(gòu)形成以及源自這些結(jié)構(gòu)域的肽的原因。卷曲螺旋總體來說是由兩個或多個相互作用的螺旋構(gòu)成的寡聚體。具有從gp41的HRl或HR2結(jié)構(gòu)域推測的氨基酸序列的肽是有效的HIV攝入細(xì)胞內(nèi)的體外和體內(nèi)抑制劑(例如這樣的肽，參見例如 US5, 464，933、US5, 656，480、US6, 258，782、US6, 348，568 或 US6, 656，906)。例如，T20(還已知為 DP178,Fuze(m(i),HR2 肽)、T651(US6，479，055)和 T2635 (W02004 /029074)是HIV感染非常有效的抑制劑。已經(jīng)嘗試使用例如氨基酸置換或化學(xué)交聯(lián)來增加 HR2 衍生肽的功效(Sia, S.K.等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA99 (2002) 14664-14669 ；Otaka, A.等人，Angew.Chem.1nt.Ed.41 (2002) 2937-2940)。
[0005]肽與一些分子的綴合可以改變其藥物動力學(xué)的性質(zhì)，例如，可以增加此類肽綴合物的血清半衰期。例如，報(bào)道了以下的綴合，聚乙二醇(PEG)和白介素-6(EP0442724)，PEG和紅細(xì)胞生成素(W001 / 02017)，包含內(nèi)皮抑制素和免疫球蛋白的嵌合分子(US2005 /008649)，基于融合蛋白的分泌抗體(US2002 / 147311)，包含白蛋白的融合多肽(US2005 /0100991 ;人血清白蛋白US5，876，969)，PEG化多肽(US2005 / 0114037)以及干擾素融合體。現(xiàn)有技術(shù)還描述了包含多花白樹毒蛋白和抗體(W094 / 26910)的免疫毒素，修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白-抗體融合蛋白(US2003 / 0226155)，抗體-細(xì)胞因子融合蛋白(US2003 /0049227)，和由具有免疫刺激性、膜轉(zhuǎn)運(yùn)或嗜同性活性的肽和抗體組成的融合蛋白(US2003 / 0103984)。在W02004 / 085505中，報(bào)道了由生物學(xué)活性化合物與大分子化學(xué)連接組成的長效生物學(xué)活性綴合物。
[0006]根據(jù)表面糖蛋白⑶4和⑶8的存在，將T-淋巴細(xì)胞分成CD4+-和OT8+-T-細(xì)胞。CD4表面糖蛋白的絡(luò)合作用可以起始例如，T-細(xì)胞增殖或淋巴因子的釋放。CD4是55kDa的膜糖蛋白，通過與抗原呈遞細(xì)胞上的MHC II類抗原相互作用，在起始T細(xì)胞應(yīng)答中發(fā)揮中心作用，所述抗原呈遞細(xì)胞將肽展示給T細(xì)胞上的抗原特異性受體。用p56Ick—T淋巴細(xì)胞活化涉及的酪氨酸激酶，通過在胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中的基序，將效應(yīng)傳遞至細(xì)胞質(zhì)(Brady, R.L.和 Barclay, A.N.，Cu rr.Top.Microbiol.Tmmunol.205 (1996) 1-18 ；Rudd, C.E.等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85 (1988) 5190-5194 ；ffeilette, A.等人，Eur.J.1mmunol.20 (1990) 1397-1400)。CD4表面受體是H1-病毒進(jìn)入細(xì)胞必需的靶。在HIV感染后，CD4+-淋巴細(xì)胞成為無功能的細(xì)胞。
[0007]在US2006 / 0121480中，報(bào)道了用于預(yù)防輔助T細(xì)胞和其他靶細(xì)胞被HIV感染的方法，所述方法是通過將靶細(xì)胞暴露在至少一種附著抑制劑和至少一種融合抑制劑的協(xié)同組合下。在W02004 / 103312中，報(bào)道了用作HIV融合抑制劑的肽。在W02001 / 43779中，報(bào)道了抗⑶4分子和HIV-1融合抑制肽的綴合物。在W02004 / 108885中，報(bào)道了具有抗HIV藥物的FC嵌合蛋白。
[0008]發(fā)明概述
[0009]發(fā)明包括這樣的綴合物，所述綴合物包含兩個或多個抗融合肽和抗-⑶4抗體(mAb⑶4)，特征是2至8個抗融合肽分別與所述抗⑶4抗體的重鏈和/或輕鏈的一個末端綴合(僅如果當(dāng)mAb⑶4包含8個末端時，即包含例如兩條重鏈和兩條輕鏈，才可能每個mAb⑶4具有8個抗融合肽的數(shù)量；如果mAb⑶4包含較少數(shù)量的C-和N-端，例如scFv，綴合物中最大可能的抗融合肽的相應(yīng)數(shù)量也降低，即降低至少于8)。
[0010]在一個實(shí)施方案中，抗-CD4抗體鏈的羧基端氨基酸與抗融合肽的氨基端氨基酸綴合，或者抗融合肽的羧基端氨基酸與抗體鏈的氨基端氨基酸綴合，優(yōu)選的通過具有或不具有中間接頭的肽鍵。`
[0011]在另一個實(shí)施方案中，綴合物的特征是如下通式
[0012]mAb CD4-[接頭][抗融合肽]?
[0013]其中，對于每種抗融合肽，m是獨(dú)立的為0(8卩，在mAb⑶4和抗融合肽之間為肽鍵)或者I (即，在mAb⑶4和抗融合肽之間為接頭)，n是從2至8的整數(shù)，在一個實(shí)施方案中，是從2至8的偶數(shù)，優(yōu)選的2或4。
[0014]在一個實(shí)施方案中，mAb CD4的重鏈和/或輕鏈與抗融合肽的優(yōu)選綴合物(“鏈綴合物”)選自(從N-端至C-端方向):
[0015](I)[抗融合肽]-[接頭]m_[重鏈]
[0016](2)[重鏈]-[接頭]m_ [抗融合肽]
[0017](3)[抗融合肽]-[接頭]m_ [重鏈]-[抗融合肽]
[0018](4)[抗融合肽]-[接頭]m_ [輕鏈]
[0019](5)[輕鏈]-[接頭]m_ [抗融合肽]
[0020](6)[抗融合肽]-[接頭]m_ [輕鏈]-[抗融合肽]
[0021 ] (7)[抗融合肽]-[接頭]m_ [重鏈]-[接頭]m_ [抗融合肽]
[0022](8)[抗融合肽]-[接頭]m_ [輕鏈]-[接頭]m_ [抗融合肽]
[0023]其中，所述鏈綴合物(之中或之間)的接頭可以是相同或不同的，其中m是整數(shù)I或O，在所述鏈綴合物(之中或之間)，m可以是獨(dú)立的相同或不同的。肽或mAb CD4鏈的左側(cè)意指N-端,右側(cè)意指C-端。因此,在(I)中,抗融合肽的C-端通過肽鍵或接頭與mAb⑶4的重鏈N-端相連。
[0024] 在另一個實(shí)施方案中，鏈綴合物被裝配成包含mAb CD4(例如，由兩條輕鏈和兩條重鏈組成，包括恒定的Fe結(jié)構(gòu)域、scFv片段或Fab片段)的根據(jù)發(fā)明的綴合物。
[0025]優(yōu)選的鏈綴合物是(2)、(3)、⑷和(7)。根據(jù)發(fā)明的優(yōu)選綴合物包括2x[mAb⑶4輕鏈]和 2x ⑵，2x [mAb CD4 輕鏈]和 2x (3)，或 2x [mAb CD4 重鏈]和 2x ⑷，或 2x [mAb CD4輕鏈]和2x(7)。重鏈和/或輕鏈優(yōu)選的包括恒定區(qū)。
[0026]在其它實(shí)施方案中，根據(jù)發(fā)明的綴合物的特征是包含可變的重鏈結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域由免疫球蛋白構(gòu)架和⑶R3區(qū)組成，所述⑶R3區(qū)選自SEQ ID NO:29、30或31的重鏈CDR3序列。
[0027]在其它實(shí)施方案中，綴合物的特征是包含可變的重鏈結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域由免疫球蛋白構(gòu)架和CDR3區(qū)、CDR2區(qū)和CDRl區(qū)組成，所述CDR3區(qū)選自SEQ ID N0:29、30或31的CDR3序列，所述CDR2區(qū)選自SEQ ID NO:26、27或28的CDR2序列，所述CDRl區(qū)選自SEQID NO: 23、24 或 25 的 CDRl 序列。
[0028]在另一個實(shí)施方案中，綴合物的特征是包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域，其中重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:8或10。
[0029]在一個實(shí)施方案中，綴合物的特征是包含可變的輕鏈結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域由免疫球蛋白構(gòu)架和⑶Rl區(qū)、⑶R2區(qū)和⑶R3區(qū)組成，所述⑶Rl區(qū)選自SEQ ID NO:13、14、15或16，所述 CDR2 區(qū)選自 SEQ ID NO: 17、18 或 19，所述 CDR3 區(qū)選自 SEQ ID NO:20、21 或 22。
[0030]在另一個實(shí)施方案中，綴合物的特征是包含SEQ ID NO:7的⑶R作為重鏈⑶R，和SEQ ID NO:1 的 CDR 作為輕鏈 CDR, SEQ ID NO:8 的 CDR 作為重鏈 CDR，和 SEQ ID NO:2 的⑶R作為輕鏈⑶R, SEQ ID NO: 10的⑶R作為重鏈⑶R JPSEQ ID NO:4的⑶R作為輕鏈CDR, SEQ ID NO: 11 的 CDR 作為重鏈 CDR JPSEQ ID NO:5 的 CDR 作為輕鏈 CDR，或者 SEQ IDNO:12的CDR作為重鏈CDR, SEQ ID NO:6的CDR作為輕鏈CDR0
[0031 ] 在一個實(shí)施方案中，綴合物的特征是包括可變的重鏈和輕鏈結(jié)構(gòu)域，獨(dú)立的選自:
[0032]a)氨基酸序列SEQ ID NO:7定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和氨基酸序列SEQ ID NO:1定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0033]b)氨基酸序列SEQ ID NO:8定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和氨基酸序列SEQ ID NO:2定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0034]c)氨基酸序列SEQ ID NO:10定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和氨基酸序列SEQ ID NO:4定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0035]d)氨基酸序列SEQ ID NO:11定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和氨基酸序列SEQ ID NO:5定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0036]e)氨基酸序列SEQ ID NO:12定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和氨基酸序列SEQ ID NO:6定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。
[0037]在另一個實(shí)施方案中，綴合物的特征是包括氨基酸序列SEQ ID NO:7定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和氨基酸序列SEQ ID NO:1定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；或氨基酸序列SEQ ID NO:8定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和氨基酸序列SEQ ID NO:2定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；或氨基酸序列SEQ ID NO:10定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和氨基酸序列SEQ ID NO:4定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；氨基酸序列SEQ ID NO:11定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和氨基酸序列SEQ ID NO:5定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；或氨基酸序列SEQ ID NO: 12定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和氨基酸序列SEQ IDNO:6定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；接頭(其選自氨基酸甘氨酸(G)和天冬酰胺(N)，三肽GST，和SEQ ID NO:46-76);以及抗融合肽(其選自SEQ ID NO:35-44的抗融合肽)。
[0038]在一個實(shí)施方案中，綴合物的特征是包括抗融合肽，其選自抗融合肽C34、T20、T1249、T651、T2635、N36、DP107 或 afp_l。
[0039]在另一個實(shí)施方案中，綴合物的特征是在重鏈的每個C-端或輕鏈的每個N-端包括抗融合肽(兩個抗融合肽)。在一個實(shí)施方案中，綴合物的特征是在重鏈的每個C-端和輕鏈的每個N-端包括抗融合肽(4個抗融合肽)。在另一個實(shí)施方案中，綴合物的特征是在重鏈的2個C-端和輕鏈的2個N-端包括抗融合肽(4個抗融合肽)。
[0040]在一個實(shí)施方案中，綴合物的特征是包括2條SEQ ID NO:1的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，2個(2)型綴合物，每個所述(2)型綴合物包含SEQ ID NO:7的重鏈可變結(jié)構(gòu)域、SEQ ID NO:75的接頭和SEQ ID NO:42的抗融合肽；特征是包括2條SEQ ID NO:2的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，2個(2)型綴合物，每個所述(2)型綴合物包含SEQ ID NO:8的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，SEQ IDNO:75的接頭和SEQ ID NO:42的抗融合肽；特征是包括2條SEQ ID NO:4的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，2個(2)型綴合物，每個所述(2)型綴合物包含SEQ ID NO:10的重鏈可變結(jié)構(gòu)域、SEQID NO:75的接頭和SEQ ID NO:42的抗融合肽；特征是包括2條SEQ ID NO:5的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，2個(2)型綴合物，每個所述(2)型綴合物包含SEQ ID NO:11的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，SEQ ID NO:75的接頭和SEQ ID NO:42的抗融合肽；或者，特征是包括2條SEQ ID NO:6的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，2個(2)型綴合物，每個所述(2)型綴合物包含SEQ ID NO:12的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，SEQ ID NO:75的接頭和SEQ ID NO:42的抗融合肽。
[0041]在一個實(shí)施方案中，綴合物的特征是所述抗-⑶4抗體是IgGl亞類或IgG4亞類的。在一個實(shí)施方案中，所述抗`-CD4抗體還是IgG4或IgGl或IgG2亞類的，具有在氨基酸位置S228、L234、L235和/或D265的突變，和/或包含PVA236突變。在另一個實(shí)施方案中，綴合物的特征是所述IgG4亞類的抗-⑶4抗體具有S228P突變，且所述IgGl亞類的抗-CD4抗體具有L234A和L235A突變。
[0042]發(fā)明包括了用于生產(chǎn)根據(jù)發(fā)明的綴合物的方法，特征是方法包括:
[0043]a)在適合綴合物表達(dá)的條件下，培養(yǎng)包含一個或多個質(zhì)粒的細(xì)胞，每個質(zhì)粒包含一種或多種編碼根據(jù)發(fā)明的綴合物的核酸分子，
[0044]b)從細(xì)胞或上清液中回收綴合物。
[0045]在一個實(shí)施方案中，編碼與抗融合肽相連或不相連的mAb⑶4的輕鏈和重鏈的基因位于相同的表達(dá)載體或不同的表達(dá)載體上。
[0046]發(fā)明還包括藥物組合物，所述組合物含有根據(jù)發(fā)明的綴合物，以及可藥用的賦形劑或載體。
[0047]發(fā)明還包括了根據(jù)發(fā)明的綴合物的用途，用于生產(chǎn)用于治療病毒感染的藥物。在一個實(shí)施方案中，用途的特征是所述病毒感染是HIV感染。
[0048]發(fā)明包括了根據(jù)發(fā)明的綴合物的用途，用于治療需要抗病毒治療的患者，優(yōu)選的抗HIV治療。
[0049]發(fā)明的詳述[0050]本發(fā)明報(bào)道了這樣的綴合物，所述綴合物包含兩個或多個抗融合肽和抗-⑶4抗體(mAb CD4)，特征是2至8個抗融合肽分別與所述抗-CD4抗體的重鏈和/或輕鏈的一個末端綴合。僅在如果mAb⑶4包含8個末端時，即包含例如兩條重鏈和兩條輕鏈，每個mAb⑶4上8個抗融合肽的數(shù)量才有可能。如果mAb⑶4包含較少數(shù)量的C-和N-端，例如scFv，綴合物中最大可能的抗融合肽的相應(yīng)數(shù)量也降低，即降低至少于8。
[0051]“抗融合肽”是這樣的肽，所述肽抑制與膜融合相關(guān)的事件，或膜融合事件本身，包括抑制由于膜融合導(dǎo)致的病毒對未感染細(xì)胞的感染等。上述抗融合肽在一個實(shí)施方案中是線性肽。例如，它們可以源自gp41胞外域，例如DP107、DP178。此類肽的實(shí)例可見于 US5, 464，933、US5, 656，480、US6, 013，263、US6, 017，536、US6, 020，459、US6, 093，794、US6, 060，065、US6, 258，782、US6, 348，568、US6, 479，055、US6, 656，906、W01996 / 19495、W01996 / 40191、TO1999 / 59615、TO2000 / 69902 和 TO2005 / 067960 中。例如，此類肽的氨基酸序列包括或者可以選自US5, 464，933的SEQ ID NO:1-10 ；US5, 656，480的SEQID NO: 1-15 ;US6, 013，263 的 SEQ ID NO: 1-10 和 16-83 ;US6, 017，536 的 SEQ ID NO: 1-10、20-83 和 139-149 ；US6, 093，794 的 SEQ ID NO: 1-10、17-83 和 210-214 ；US6, 060，065 的 SEQID NO: 1-10、16-83 和 210-211 ；US6, 258，782 的 SEQ ID NO:1286 和 1310 ；US6,348，568 的SEQ ID NO:1129、1278-1309、1311 和 1433 ;US6, 479，055 的 SEQ ID NO: 1-10 和 210-238 ;US6,656,906 的 SEQ ID NO:1-171、173-216、218-219、222-228、231、233-366、372-398、400-456,458-498,500-570,572-620,622-651,653-736,739-785,787-811,813-823,825、827-863、865-875、877-883、885、887-890、892-981、986-999、1001-1003、1006-1018、1022-1024、1026-1028、1030-1032、1037-1076、1078-1079、1082-1117、1120-1176、I179-1213、1218-1223、1227-1237、1244-1245、1256-1268、127卜1275、1277、1345-1348、1350-1362、1364、 1366、1368、1370、1372、1374-1376、1378-1379、1381-1385、1412-1417、1421-1426、1428-1430、1432、1439-1542、1670-1682、1684-1709、1712-1719、1721-1753、1755-1757 ;或者W02005 / 067960的SEQ ID NO:5_95。在一個實(shí)施方案中，抗融合肽具有包含5-100個氨基酸的氨基酸序列，優(yōu)選的10-75個氨基酸，更優(yōu)選的15-50個氨基酸。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗融合肽是034、1'-20、1'-1249、1'-651、1'-2635、^36(1?0(^，1工等人，Curr.Pharm.Des.10(2004) 1805-1825)和 DP-107 (Wild，C.等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA91 (1994) 12676-12680)。在一個實(shí)施方案中，根據(jù)發(fā)明的綴合物包含一個或多個抗融合肽和抗-CD4抗體(mAb CD4)，其中，i)所述抗融合肽是具有5-100個氨基酸的氨基酸序列的線性肽，和ii) I至8個抗融合肽分別與所述抗-CD4抗體的重鏈和/或輕鏈的一個末端綴合。在另一個實(shí)施方案中，根據(jù)發(fā)明的綴合物包含一個或多個抗融合肽和抗-CD4抗體(mAb CD4),其中，i)所述抗融合肽源自gp41胞外域,和ii) I至8個抗融合肽分別與所述抗-⑶4抗體的重鏈和/或輕鏈的一個末端綴合。術(shù)語“gp41胞外域”表示HIV-1gpieo的始于氨基酸位置561且止于氨基酸位置620的氨基酸序列，或者HIV-lgp41的始于氨基酸位置50且止于氨基酸位置109的氨基酸序列(SEQ ID NO:66)(還參見例如Bar，S.和Alizon, M.J.Virol.78(2004)811-820)。
[0052]術(shù)語“抗體”涵蓋了抗體結(jié)構(gòu)的多種形式，包括完整的抗體和抗體片段。在一個實(shí)施方案中，根據(jù)發(fā)明的抗體是人抗體、人源化抗體、嵌合抗體或T細(xì)胞抗原缺失抗體(參見例如W098 / 33523、W098 / 52976和W000 / 34317)。抗體的遺傳加工例如描述在 Morrison, S.L.等人，Proc.Natl.Acad Sc1.USA81 (1984) 6851-6855 ；US5, 202，238和 US5, 204，244 ；Riechmann, L.等人，Nature332 (1988) 323-327 ；Neuberger, M.S.等人，Nature314 (1985) 268-270 ；Lonberg, N.，Nat.Biotechnol.23(2005) 1117-1125。
[0053]“抗體片段”包括全長抗-⑶4抗體的一部分，優(yōu)選的其可變結(jié)構(gòu)域，或至少其抗原結(jié)合部分?？贵w片段的實(shí)例是例如單鏈抗體分子(scFv)、Fab、F(ab)2片段等，只要其保留了抗-⑶4抗體的結(jié)合特征。scFv抗體例如，描述在Huston, J.S., Methods inEnzymo1.203(1991)46-88中。Huston還描述了用于連接用于本發(fā)明的多肽的接頭和方法。
[0054]“CD4” 意指人 CD4,描述在例如 Brady, R.L.和 Barclay, A.N.，Curr.Top.Microbiol.1mmunol.205(1996) 1-18 以及 SwissProt P01730 中。術(shù)語“結(jié)合 CD4 的抗體”、“抗-CD4抗體”或“mAb CD4”在本申請中是可互換的使用的，表示特異性結(jié)合CD4并且優(yōu)選的抑制HIV與靶細(xì)胞的融合的抗體?？梢栽诨诩?xì)胞的體外ELISA測定中測試結(jié)合(使用表達(dá)⑶4的CHO細(xì)胞)。如果在IOOng / ml的抗體濃度時，討論的抗體導(dǎo)致S / N(信號/噪聲)比例為5或更高，優(yōu)選的10或更高，則發(fā)現(xiàn)了結(jié)合。術(shù)語“抑制HIV與靶細(xì)胞融合”指抑制HIV與測定中測量的靶細(xì)胞融合，所述測定包括在存在討論的抗體的條件下，將所述靶細(xì)胞Uf^BPBMC)與病毒接觸(所述抗體的濃度為有效抑制病毒和所述細(xì)胞之間的膜融合的濃度)，以及測量例如，熒光素酶報(bào)道基因活性或HIV p24抗原濃度。術(shù)語“膜融合”指表達(dá)CD4多肽的第一細(xì)胞與表達(dá)HIV env蛋白的第二細(xì)胞或病毒之間的融合。通過報(bào)道基因測定(例如，通過熒光素酶報(bào)道基因測定)，通過遺傳改造的細(xì)胞和/或病毒，確定膜融合。
[0055]在本申請中使用的術(shù)語“嵌合”表示抗體或抗體結(jié)構(gòu)域包含源自非人動物的抗體的氨基酸序列，以及源自人起源的抗體的氨基酸序列。
[0056]在例如Reimann, K.A.等人，Aids Res.Human Retrovir.13 (1997) 933-943、EP0512112、US5，871，732、EP0840618、EP0854885、EP1266965、US2006 / 0051346、W097 /46697、WOOl / 43779、US6, 136，310、W091 / 009966 中提及了優(yōu)選的抗-CD4 抗體。特別優(yōu)選的抗-CD4 抗體描述在 US5, 871, 732,和 Reimann, K.A.等人，Aids Res.HumanRetrovir.13(1997)933-943，`以及W091 / 009966中。特別優(yōu)選的抗-CD4抗體的特征是當(dāng)向人施用時，是非免疫抑制性的或非缺失的抗體，并且也不阻斷HIVgpl20與人CD4的結(jié)合。在一個實(shí)施方案中，優(yōu)選的抗-CD4抗體的特征還在于所述抗體包含可變重鏈結(jié)構(gòu)域，所述可變重鏈結(jié)構(gòu)域由免疫球蛋白構(gòu)架和⑶R3區(qū)組成，所述⑶R3區(qū)選自SEQ ID NO:29、30或31的重鏈CDR3序列。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體包含可變重鏈區(qū)，所述可變重鏈區(qū)由免疫球蛋白構(gòu)架和⑶R3區(qū)、⑶R2區(qū)和⑶Rl區(qū)組成，所述⑶R3區(qū)選自SEQ ID NO:29、或30或31的CDR3序列，所述CDR2區(qū)選自SEQ ID NO:26或27的CDR2序列，所述CDRl區(qū)選自SEQ ID NO:23或24的⑶Rl序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，重鏈可變結(jié)構(gòu)域還顯示在SEQID NO:8,10或12中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗-⑶4抗體還包含可變輕鏈結(jié)構(gòu)域，所述可變輕鏈結(jié)構(gòu)域由免疫球蛋白構(gòu)架和⑶Rl區(qū)、⑶R2區(qū)和⑶R3區(qū)組成，所述⑶Rl區(qū)選自SEQID NO: 13、14或15的CDRl序列，所述CDR2區(qū)選自SEQ ID NO:17或18的CDR2序列，所述⑶R3區(qū)選自SEQ ID NO:20或21的⑶R3序列。在一個實(shí)施方案中，抗-⑶4抗體的特征是包含 SEQ ID NO:8 的 CDR 作為重鏈 CDR，和 SEQ ID NO:2 的 CDR 作為輕鏈 CDR，SEQ ID NO:10的CDR作為重鏈CDRJP SEQ ID NO:4的CDR作為輕鏈CDR，SEQ ID NO: 11的CDR作為重鏈CDR，和SEQ ID NO:5的CDR作為輕鏈CDR，或者SEQ ID NO: 12的CDR作為重鏈CDR，和SEQ ID NO:6的CDR作為輕鏈CDR0
[0057]可以根據(jù)Kabat, E.A.等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda,MD (1991)的標(biāo)準(zhǔn)定義確定 CDR 序列。SEQ ID NO:13-31 中顯示了 SEQ ID NO:1 至 SEQ IDNO:12 的 CDR0 [0058]在一個實(shí)施方案中，抗-⑶4抗體包括可變的重鏈和輕鏈結(jié)構(gòu)域，獨(dú)立的選自:
[0059]a)氨基酸序列SEQ ID NO:8定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和SEQ ID NO:2定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0060]b)氨基酸序列SEQ ID NO:10定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和SEQ ID NO:4定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0061]c)氨基酸序列SEQ ID NO:11定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和SEQ ID NO:5定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
[0062]d)氨基酸序列SEQ ID NO:12定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和SEQ ID NO:6定義的輕
鏈可變結(jié)構(gòu)域。
[0063]在一個實(shí)施方案中，根據(jù)發(fā)明的綴合物中使用的抗體的特征是恒定結(jié)構(gòu)域是人源的。此類恒定結(jié)構(gòu)域是本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)中普遍已知的，例如Kabat (參見例如，Johnson,G.和 Wu, T.T.,Nucleic Acids Res.28 (2000) 214-218)描述的。例如，在一個實(shí)施方案中，有效的人IgGl重鏈恒定區(qū)(Ch1-絞合部-Ch2-Ch3)包含獨(dú)立的選自SEQ ID NO:32、33的氨基酸序列。例如，有效的人kappa( K)輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域包括SEQ ID NO: 34的kappa輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(K輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域，Cl)的氨基酸序列。在另一個實(shí)施方案中，抗體的可變結(jié)構(gòu)域是小鼠起源的，并包括根據(jù)Kabat的小鼠抗體的抗體可變結(jié)構(gòu)域序列構(gòu)架(參見例如，Johnson, G.和 Wu，T.T.，Nucleic Acids Res.28 (2000) 214-218)。在另一個實(shí)施方案中，抗體的可變結(jié)構(gòu)域是小鼠起源的，并且已經(jīng)人源化。
[0064]優(yōu)選的抗-⑶4抗體表現(xiàn)出與具有可變結(jié)構(gòu)域I (US5，871，732)或可變結(jié)構(gòu)域2 (Reimann, K.A.等人，Aids Res.Human Retrovir.13(1997)933-943)的抗體結(jié)合相同的CD4表位，或者由于結(jié)合的空間位阻或競爭性結(jié)合，被具有可變結(jié)構(gòu)域I或可變結(jié)構(gòu)域2的抗體抑制與CD4的結(jié)合。根據(jù)01son，W.C.等人，(J.Virol.73 (1999) 4145-4155描述的用于表位制圖的方法，通過使用丙氨酸掃描研究表位結(jié)合。信號降低75%或更多表示突變的氨基酸對所述抗體表位識別有貢獻(xiàn)。如果研究的抗體和具有可變結(jié)構(gòu)域I或可變結(jié)構(gòu)域2的抗體識別對表位有貢獻(xiàn)的氨基酸，則發(fā)現(xiàn)抗體與相同表位的結(jié)合。
[0065]術(shù)語“表位”表示能夠與抗體特異性結(jié)合的蛋白決定簇。表位通常由化學(xué)活性表面的分子群組成，例如氨基酸或糖側(cè)鏈，并通常具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征，以及特定的電荷特征。構(gòu)象性表位和非構(gòu)象性表位的區(qū)別是在存在變性溶劑的條件下喪失與前者而非后者的結(jié)合。
[0066]本文中使用的術(shù)語“可變結(jié)構(gòu)域”(輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域，重鏈(Vh)的可變結(jié)構(gòu)域)表示抗體的成對輕鏈和重鏈的單個結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域直接涉及抗體與靶抗原的結(jié)合?？勺兘Y(jié)構(gòu)域通常是成對輕鏈和重鏈的N-端結(jié)構(gòu)域。輕鏈和重鏈的可變結(jié)構(gòu)域具有相同的常規(guī)結(jié)構(gòu)，即，它們具有“免疫球蛋白構(gòu)架”，且每個結(jié)構(gòu)域包括四個“構(gòu)架區(qū)”(FR)，其序列是普遍保守的，通過三個“高變區(qū)”(或“互補(bǔ)決定區(qū)”，⑶R)連接。構(gòu)架區(qū)采用了 β_折疊構(gòu)象,⑶R可以形成連接β-折疊結(jié)構(gòu)的環(huán)。通過構(gòu)架區(qū)維持每條鏈的⑶R的三維結(jié)構(gòu)，并且所述CDR與其它鏈的CDR共同形成抗原結(jié)合位點(diǎn)?？贵w重鏈和輕鏈CDR3區(qū)在根據(jù)發(fā)明的抗體的結(jié)合特異性/親和力中發(fā)揮了特別重要的作用，因此提供了發(fā)明的另一個對象。
[0067]當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“抗體的抗原-結(jié)合部分”或“抗體的抗原-結(jié)合位點(diǎn)”指抗體的負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基?？贵w的抗原結(jié)合位點(diǎn)包括來自“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基?！皹?gòu)架”或“FR”區(qū)是本文定義的高變區(qū)殘基以外的那些可變結(jié)構(gòu)域區(qū)域。因此，抗體的輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域從N-至C-端包括區(qū)域FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4(免疫球蛋白構(gòu)架)。特別地，重鏈的⑶R3區(qū)是最主要負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的區(qū)域并且限定了抗體。在一個實(shí)施方案中，根據(jù)發(fā)明的抗體的特征是它的重鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含SEQID N0:29 或 SEQ ID NO:30 的 CDR3 序列。根據(jù) Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteinsof Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda, MD(1991)的標(biāo)準(zhǔn)定義來確定互補(bǔ)決定區(qū)(O)R)和構(gòu)架(FR)區(qū)。
[0068]抗-CD4抗體的“Fe部分”不直接參與CD4的結(jié)合，但表現(xiàn)出不同的效應(yīng)子功能。根據(jù)重鏈恒定區(qū)氨基酸序列，將抗體(免疫球蛋白)分為以下類別:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM0 一些上述類別進(jìn)一步分成亞類(同種型)，即，IgG分為IgGl、IgG2、IgG3和IgG4，或IgA分為IgAl和IgA2。根據(jù)抗體所屬的免疫球蛋白類別，將免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)分別標(biāo)識為 α (alpha, IgA)、δ (delta, IgD)、ε (epsilon, IgE)、y (gamma, IgG)和 μ (miu,IgM)。在一個實(shí)施方案中，根據(jù)發(fā)明的抗體屬于IgG類別?！翱贵w的Fe部分”是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的術(shù)語，是基于抗體的木瓜蛋白酶切割而定義的。根據(jù)發(fā)明的抗體含有人Fe部分或者源自人起源的Fe部分作為Fe部分。在發(fā)明的其它實(shí)施方案中，F(xiàn)e部分是人抗體IgG4亞類的Fe部分，或人抗體IgGl、IgG2或IgG3亞類的Fe部分，所述Fe部分經(jīng)過修飾使得不能檢測到如下文所定義的任何Fe Y受體(例如，F(xiàn)e Y RIIIa)結(jié)合和/或Clq結(jié)合。在一個實(shí)施方案中，F(xiàn)e部分是人Fe部分，優(yōu)選的來自人IgG4亞類，或人IgGl亞類的突變Fe部分。在另一個實(shí)施方案中，F(xiàn)e`部分是來自人IgGl亞類的Fe部分，具有L234A和L235A的突變。在其它實(shí)施方案中，F(xiàn)e部分是SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33的Fe部分，SEQ ID NO:32具有突變L234A和L235A，SEQ ID NO:33具有突變S228P。當(dāng)IgG4表現(xiàn)出降低的Fe Y受體(FcYRIIIa)結(jié)合時，其它IgG亞類的抗體表現(xiàn)出強(qiáng)烈的結(jié)合。然而，Pro238、Asp265、Asp270、Asn297 (缺失 Fe 糖類)、Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434或/和Hi s435是這樣的殘基，如果改變也提供降低的Fe Y受體結(jié)合(Shields, R.L.等人，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604 ；Lund, J.等人，F(xiàn)ASEBJ.9 (1995) 115-119 ；Morgan, A.等人，Immunology86 (1995) 319-324 ;EP0307434)。在一個實(shí)施方案中，在Fe Y受體與IgG4亞類或與IgGl或IgG2亞類的結(jié)合方面，根據(jù)發(fā)明的抗體具有在L234、L235和/或D265的突變，和/或含有PVA236突變。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變是S228P、L234A、L235A、L235E和/或PVA236 (PVA236意指來自IgGl的氨基酸位置233-236的氨基酸序列ELLG (以單字母氨基酸代碼給出)，或IgG4的EFLG被PVA取代)，優(yōu)選的，IgG4的突變S228P，和IgGl的L234A和L235A。抗體的Fe部分直接參與ADCC (依賴抗體的細(xì)胞毒性)和CDC (依賴補(bǔ)體的細(xì)胞毒性)。補(bǔ)體活化(CDC)是通過補(bǔ)體因子Clq與大部分IgG抗體亞類的Fe部分結(jié)合來起始的。通過在所謂的結(jié)合位點(diǎn)的定義的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，導(dǎo)致Clq與抗體的結(jié)合。此類Fe部分結(jié)合位點(diǎn)是現(xiàn)有技術(shù)已知的，描述在例如 Lukas, T.J.等人，J.1mmunol.127(1981)2555-2560 ；Brunhouse, R.和 Cebra,J.J.，Mol.1mmunol.16 (1979) 907-917 ；Burton, D.R.等人，Nature288 (1980) 338-344 ；Thommesen, J.Ε.等人，Mol.1mmunol.37 (2000) 995-1004 ;Idusogie, Ε.Ε.等人，J.1mmunol.164 (2000) 4178-4184 ；Hezareh, Μ.等人，J.Virol.75 (2001) 12161-12168 ；Morgan, A.等人，Immunology86 (1995) 319-324 ;和 EP0307434 中。此類 Fe 部分結(jié)合位點(diǎn)的特征是氨基酸 L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331 和 P329 (根據(jù) Kabat 的 EU指數(shù)編號)等。IgGl、IgG2和IgG3亞類的抗體通常表現(xiàn)出補(bǔ)體激活，包括Clq和C3結(jié)合，而IgG4不激活補(bǔ)體系統(tǒng)，也不結(jié)合Clq和/或C3。不結(jié)合Fe Y受體和/或補(bǔ)體因子Clq的抗-CD4抗體不引發(fā)抗體依賴性細(xì)胞毒作用(ADCC)和/或依賴補(bǔ)體細(xì)胞毒性(CDC)。在一個實(shí)施方案中，該抗體的特征是它結(jié)合CD4，含有源自人起源的Fe部分，并且不結(jié)合Fe Y受體和/或補(bǔ)體因子Clq。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該抗體是人抗體，或人源化抗體，或T細(xì)胞抗原缺失抗體?？梢愿鶕?jù)Idusogie, Ε.E.等人，J.1mmunol.164 (2000) 4178-4184來測量Clq結(jié)合。如果在此類測定中，對于討論的抗體，492-405nm的光密度(OD)低于8μ g /ml的抗體濃度時未修飾的野生型抗體Fe部分的人Clq結(jié)合值的15%，則沒有發(fā)現(xiàn)“Clq結(jié)合”。ADCC可以作為抗體與人NK細(xì)胞上的人Fe Y RIIIa的結(jié)合來測量。在20 μ g / ml的抗體濃度確定結(jié)合。“無Fe Y受體結(jié)合”或“無ADCC”意指與相同的抗體如人IgGl (SEQ IDNO:32)的結(jié)合相比，在20 μ g / ml的抗體濃度時，與人NK細(xì)胞上的人Fe Y RIIIa的結(jié)合達(dá) 30%。
[0069]根據(jù)發(fā)明的綴合物中使用的抗體還包括，具有“保守序列修飾”的此類抗體(變體抗體)，所述修飾是這樣的氨基酸序列修飾，它們不影響或不改變根據(jù)發(fā)明的抗體的上述特征?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)引入修飾，例如定點(diǎn)誘變和PCR-介導(dǎo)的誘變。保守性氨基酸取代包括這樣的取代，其中用具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基替換了氨基酸殘基。本領(lǐng)域已經(jīng)定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支側(cè)鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香側(cè)鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。因此，在一個實(shí)施方案中，可以用來自相同側(cè)鏈家族的另一個氨基酸殘基取代人抗-CD4抗體中預(yù)測的非必需氨基酸殘基。因此，“變體”抗-CD4抗體在本文中指氨基酸序列不同于“親本”抗-CD4抗體的氨基酸序列的分子，所述不同是在重鏈CDR3區(qū)之外的親本抗體的一個或多個可變結(jié)構(gòu)域區(qū)域中，添加、缺失和/或取代在一個實(shí)施方案中達(dá)10處，在另一個實(shí)施方案中，約2至約5處。每個其它的重鏈CDR區(qū)包含最多一個單氨基酸添加、缺失和/或取代。發(fā)明包括修飾結(jié)合CD4的親本抗體的CDR氨基酸序列的方法，特征是從SEQ ID NO:8或10的重鏈可變結(jié)構(gòu)域中選擇重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和/或從SEQ ID NO:2或4的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中選擇輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，提供編碼所述初始可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的核酸，修飾所述核酸使得重鏈CDRl中的一個氨基酸被修飾，重鏈CDR2中的一個氨基酸被修飾，輕鏈CDRl中的1-3個氨基酸被修飾，輕鏈CDR2中的1_3個氨基酸被修飾，和/或輕鏈CDR3中的1-3個氨基酸被修飾，在抗體結(jié)構(gòu)中表達(dá)和摻入所述修飾的可變結(jié)構(gòu)域氨基酸序列，測量所述抗體是否結(jié)合CD4，并且如果抗體結(jié)合CD4，則選擇一個或多個所述修飾的可變結(jié)構(gòu)域/CDR0在一個實(shí)施方案中，此類修飾是保守的序列修飾?？梢酝ㄟ^基于分子建模的誘變來實(shí)施氨基酸序列修飾，如 Riechmann, L.等人，Nature332 (1988) 323-327,和 Queen, C.等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86 (1989) 10029-10033 中描述的。
[0070]本申請中使用的術(shù)語“接頭”或“肽接頭”表示天然和/或合成起源的肽接頭。所述接頭由線性的氨基酸鏈組成，其中20個天然存在的氨基酸是單體構(gòu)件。鏈具有1-50個氨基酸的長度，優(yōu)選的在I和28個氨基酸之間，特別優(yōu)選的在3和25個氨基酸之間。接頭可以包含重復(fù)的氨基酸序列，或天然存在的多肽序列，例如具有絞合部功能的多肽。通過允許肽正確的折疊和適當(dāng)?shù)某蔬f，接頭可以實(shí)施其生物學(xué)活性，所述接頭具有保證肽與抗-CD4抗體綴合的功能。在一個實(shí)施方案中，接頭是“合成的肽接頭”，其被設(shè)計(jì)為富含甘氨酸、谷氨酸和/或絲氨酸殘基。這些殘基排列成例如多達(dá)5個氨基酸的小重復(fù)單元，如GGGGS、QQQQG或SSSSG。該小重復(fù)單元可以重復(fù)2_5次，形成多聚單元。在多聚單元的氨基-和/或羧基末端，可以添加多達(dá)6個額外的任意的、天然存在的氨基酸。其它的合成肽接頭包括單個氨基酸，其重復(fù)在10-20次之間，并可以在氨基-和/或羧基-末端包括多達(dá)6個額外的任意的、天然存在的氨基酸，例如接頭GSSSSSSSSSSSSSSSG(SEQ ID NO:64)中的絲氨酸。表2中顯示了優(yōu)選的接頭。在一個實(shí)施方案中，接頭選自[GQ4]3GNN(SEQ ID NO: 50),LSLSPGK(SEQ ID NO:46)、LSPNRGEC(SEQ ID NO:47)、LSLSGG(SEQ ID NO:71)、LSLSPGG(SEQID NO:72)、G3[SGJ2SG (SEQ ID NO:75)、或 G3 [SGj2SG2 (SEQ ID NO:76)。所有的肽接頭都可以由核酸分子編碼，從而可以重組的表達(dá)。當(dāng)接頭自身是肽時，抗融合肽通過在兩個氨基酸之間形成的肽鍵與接頭連接。在抗融合肽和與抗融合肽綴合的抗-CD4抗體鏈之間引入肽接頭。因此，分別存在2種或3種可能的序列(從氨基-至羧基-端的方向):a)抗融合肽-肽接頭-抗-CD4抗體多肽鏈，或b)抗-CD4抗體多肽鏈-肽接頭-抗融合肽，或c)抗融合肽-肽接頭-抗-CD4抗體多肽鏈-肽接頭-抗融合肽。
[0071]在發(fā)明的一個實(shí)施方案中，綴合物的特征是包含i)氨基酸序列SEQ ID N0:8定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和SEQ ID NO:2定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；或氨基酸序列SEQ ID NO:10定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和SEQ ID NO:4定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；或氨基酸序列SEQ ID NO:11定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和SEQ ID NO:5定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；或氨基酸序列SEQ IDNO: 12定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和SEQ `ID NO:6定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；ii)接頭，其選自氨基酸甘氨酸(G)和天冬酰胺(N)，三肽GSTJP SEQ ID NO:46-76或80或81 ;以及iii)抗融合肽，其選自SEQ ID NO:35-44或83的抗融合肽。本發(fā)明的其它方面是SEQ ID NO:42的抗融合肽afp-Ι。在一個實(shí)施方案中，抗融合肽是SEQ ID NO:36、38、39，或42或83的抗融合肽。在另一個實(shí)施方案中，接頭是SEQ ID N0:46、47、50、64、71、72、75或76的接頭。
[0072]在一個實(shí)施方案中，mAb⑶4的重鏈和/或輕鏈與抗融合肽的綴合物(“鏈綴合物”)選自以下順序的鏈綴合物(I)[抗融合肽]-[接頭]m_[重鏈]，(2)[重鏈]-[接頭]m_ [抗融合肽]，(3)[抗融合肽]-[接頭]m_ [重鏈]-[抗融合肽]，(4)[抗融合肽]-[接頭]m_[輕鏈]，(5)[輕鏈]-[接頭]m_[抗融合肽]，(6)[抗融合肽]-[接頭]m_[輕鏈]-[抗融合肽]，(7)[抗融合肽]-[接頭]m_[重鏈]_[接頭]m_[抗融合肽]，(8)[抗融合肽]-[接頭]m_ [輕鏈]-[接頭]m_ [抗融合肽]，其中，在所述鏈綴合物之中或之間，接頭可以是相同或不同的，其中m是整數(shù)I或0，并且在所述鏈綴合物之中或之間，m可以是獨(dú)立的相同或不同的。例如，在包含鏈綴合物(7)和mAb CD4輕鏈的綴合物中，鏈綴合物(7)的兩個接頭可以是相同的，即，具有相同的氨基酸序列和長度，或者可以是不同的，即，具有不同的氨基酸序列和/或長度，或者可以缺失其中之一或兩者。例如，在包含鏈綴合物(2)和(4)的綴合物中，鏈綴合物(2)中含有的接頭和鏈綴合物(4)中含有的接頭可以是相同的，即，具有相同的氨基酸序列和長度，或者可以是不同的，即，具有不同的氨基酸序列和/或長度，或者可以缺失其中之一或兩者。在鏈綴合物中，可以存在(m=l)或缺失(m=0)接頭。優(yōu)選的鏈綴合物是鏈綴合物(2)、(3)、(4)和(7)。本發(fā)明的一個實(shí)施方案是包含2x [mAb CD4輕鏈]和2x鏈綴合物(2)的綴合物。該綴合物包含2條不綴合的抗-CD4抗體輕鏈，和2條抗-CD4抗體重鏈，每條重鏈通過其C-端與單個抗融合肽的N-端綴合，任選的通過中間接頭。本發(fā)明的另一個實(shí)施方案是包含兩條mAb CD4輕鏈和兩條鏈綴合物(3)的綴合物。另一個實(shí)施方案是包含兩條mAb CD4重鏈和兩條鏈綴合物(4)的綴合物。本發(fā)明的另一個實(shí)施方案是包含兩條mAb CD4輕鏈和兩條鏈綴合物(7)的綴合物。重鏈和/或輕鏈優(yōu)選的包括恒定區(qū)(Fe)。
[0073]發(fā)明還提供了用于生產(chǎn)藥物組合物的方法，所述藥物組合物包括有效量的根據(jù)發(fā)明的綴合物，和可藥用的載體，以及根據(jù)發(fā)明的綴合物用于此類方法的用途。
[0074]發(fā)明還提供了有效量的根據(jù)發(fā)明的綴合物的用途，用于生產(chǎn)藥物，所述藥物優(yōu)選的與可藥用的載體共同用于治療患有AIDS的患者。
[0075]本申請中使用的術(shù)語“氨基酸”表示羧基α -氨基酸類群，所述氨基酸可以由核酸直接或以前體形式編碼。單個氨基酸由三個核苷酸組成的核酸編碼，稱為密碼子或堿基三聯(lián)體。每個氨基酸至少由一個密碼子編碼。這已知為“遺傳密碼的簡并性”。本申請中使用的術(shù)語“氨基酸”表示天然存在的羧基α-氨基酸，其包括丙氨酸(三字母密碼:ala，單字母密碼:A)、精氨酸(arg, R)、天冬酰胺(asn, N)、天冬氨酸(asp, D)、半胱氨酸(cys, C)、谷氨酰胺(gln，Q)、谷氨酸(glu，E)、甘氨酸(gly，G)、組氨酸(his，H)、異亮氨酸(ile，I)、亮氨酸(leu, L)、賴氨酸(lys, K)、甲硫氨酸(met, Μ)、苯丙氨酸(phe, F)、脯氨酸(pro, P)、絲氨酸(ser, S)、蘇氨酸(thr, T)、色氨酸(trp, W)、酪氨酸(tyr, Y)和纟顏氨酸(val, V)。
[0076]本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，可用于實(shí)施本發(fā)明的方法和技術(shù)，描述在例如Ausubel，F(xiàn).Μ.編著，Current Protocols in Molecular Biology,卷 I 至 III (1997) ,Wiley 和 Sons ;Sambrook 等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 2 版，Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)中。
[0077]在一個實(shí)施方案中，在根據(jù)發(fā)明的綴合物中，抗-CD4抗體鏈的羧基端氨基酸通過肽鍵與抗融合肽的氨基-端氨基酸綴合，或者抗融合肽的羧基端氨基酸通過肽鍵與抗-CD4抗體鏈的氨基-端氨基酸綴合。在一個實(shí)施方案中，中間接頭存在于抗融合肽和抗-CD4抗體鏈之間。因此，根據(jù)發(fā)明的綴合物的特征是通式:
[0078]mAb CD4-[接頭][抗融合肽]?
[0079]其中，對于每個抗融合肽，m是獨(dú)立的為O (即，在mAb CD4和抗融合肽之間直接的肽鍵)或者I (即，在mAb⑶4和抗融合肽之間存在接頭)，且η是從2至8的整數(shù)。在一個實(shí)施方案中，η是從2至8的整數(shù)。在另一個實(shí)施方案中，η是從2至8的偶數(shù)。在另一個實(shí)施方案中，η是從2至4的整數(shù)。在另一個實(shí)施方案中，η是整數(shù)2或4。發(fā)明的一個實(shí)施方案是這樣的綴合物，其特征是在抗CD4抗體的重鏈的每個C-端或在抗-CD4抗體輕鏈的每個N-端包含抗融合肽。在該實(shí)施方案中，兩個抗融合肽與一個抗-CD4抗體綴合。在另一個實(shí)施方案中，綴合物的特征是在重鏈的每個C-端和在輕鏈的每個N-端包含抗融合肽。在該實(shí)施方案中，四個抗融合肽與一個抗-CD4抗體綴合。
[0080]與mAb⑶4相比，引入mAb⑶4重鏈和/或輕鏈的抗融合肽尺寸小。例如,最小的免疫球蛋白，G型免疫球蛋白，具有約150kDa的分子量；在一個實(shí)施方案中，抗融合肽具有小于12.5kDa的大小(分子量)，等價于約100個氨基酸，通常小于7.5kDa，等價于約60個氨基酸。在一個實(shí)施方案中，抗融合肽具有從5至100個氨基酸殘基的氨基酸序列，優(yōu)選的從10至75個氨基酸殘基，更優(yōu)選的從15至50個氨基酸殘基。本發(fā)明的綴合物可用于藥物、治療和/或診斷用途?？梢耘cmAb CD4重鏈和/或輕鏈綴合的抗融合肽的數(shù)量，從I至抗-CD4抗體多肽鏈的氨基和羧基末端的組合數(shù)。當(dāng)本發(fā)明涵蓋了不同類型的抗-CD4抗體時，抗融合肽的可能數(shù)量可以改變。在含有兩條重鏈和兩條輕鏈的抗-CD4抗體的情況下，氨基-末端(N-端)和羧基-末端(C-端)的組合數(shù)是8，這同時是綴合的抗融合肽能夠達(dá)至I撤最大總數(shù)；例如，在抗-⑶4抗體片段(例如，單鏈抗體(scFv))的情況下，末端的組合數(shù)以及因此能綴合的抗融合肽的最大數(shù)是2。如果單個抗融合肽與mAb CD4綴合，則肽可以占據(jù)抗-CD4抗體鏈的任何一個末端。同樣，如果mAb CD4綴合了最大可能數(shù)量的肽，則所有的末端都被單個肽占據(jù)。如果與mAb CD4綴合的肽數(shù)量小于最大可能數(shù)，則在抗-CD4抗體鏈的末端存在不同的肽分布是可能的。例如，如果G或E型免疫球蛋白綴合了 4個抗融合肽，則可能有5種不同的組合(參見表1)。在2種組合中，一種類型的所有末端，即抗-⑶4抗體鏈的所有4個氨基端或所有4個羧基端都分別與一個單個抗融合肽綴合。未綴合其它的末端。在一個實(shí)施方案中，這導(dǎo)致修飾/綴合在抗-CD4抗體的一個區(qū)域的分配。在其它情況下，多肽與多數(shù)的兩個末端綴合。在這些組合中，綴合的肽分布在抗-⑶4抗體的不同區(qū)域。在兩種情況下，綴合的末端總數(shù)都是4。
[0081 ] 復(fù)1:4個肽與由4條多肽鏈組成的抗-⑶4抗體的末端綴合的可能組合[0082]
【權(quán)利要求】
1.綴合物，其包含2個或多個抗融合肽，以及抗-CD4抗體，特征是2-8個抗融合肽各自與所述抗-CD4抗體的重鏈和/或輕鏈的一個末端綴合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的綴合物，特征是抗-CD4抗體鏈的羧基端氨基酸與抗融合肽的氨基端氨基酸綴合，或者抗融合肽的羧基端氨基酸與抗體鏈的氨基端氨基酸綴合，優(yōu)選的通過具有或不具有中間接頭的肽鍵。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的綴合物，特征是綴合物具有通式 niAb⑶4-[接頭]m-[抗融合妝]n 其中，對于每種抗融合肽而言，m是獨(dú)立的為O或者1， 其中，η是從2至8的整數(shù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的綴合物，特征是η是2或4。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的綴合物，特征是綴合物包含mAbCD4的重鏈和/或輕鏈以及抗融合肽(“鏈綴合物”)，選自(從N-端至C-端方向): (1)[抗融合肽]-[接頭]m_[重鏈] (2)[重鏈]-[接頭]m_[抗融合肽] (3)[抗融合肽]-[接頭]m_[重鏈]-[抗融合肽] ⑷[抗融合肽]-[接頭]m_[輕鏈] (5)[輕鏈]-[接頭]m_[抗融合肽] (6)[抗融合肽]-[接頭]m_[輕鏈]-[抗融合肽] (7)[抗融合肽]-[接頭]m_[重鏈]_[接頭]m_[抗融合肽] (8)[抗融合肽]-[接頭]m_[輕鏈]_[接頭]m_[抗融合肽] 其中，在所述鏈綴合物中，接頭可以是相同或不同的，其中m是整數(shù)I或O，在所述鏈綴合物中，m可以是獨(dú)立的相同或不同的。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的綴合物，其包括 2x[mAb CD4輕鏈]和2x鏈綴合物(2)， 2x[mAb CD4輕鏈]和2x鏈綴合物(3)， 2x [mAb CD4重鏈]和2x鏈綴合物(4)，或 2x[mAb CD4輕鏈]和2x鏈綴合物(7)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或4的綴合物，特征是所述可變的重鏈結(jié)構(gòu)域由免疫球蛋白構(gòu)架和CDR3區(qū)組成，所述CDR3區(qū)選自SEQ ID NO:29、30或31的重鏈CDR3序列。。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的綴合物，特征是綴合物包含可變的重鏈結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域由免疫球蛋白構(gòu)架和CDR3區(qū)、CDR2區(qū)和CDRl區(qū)組成，所述CDR3區(qū)選自SEQ ID N0:29、30或31的CDR3序列，所述CDR2區(qū)選自SEQ ID NO: 26、27或28的CDR2序列，所述CDRl區(qū)選自SEQID NO: 23、24 或 25 的 CDRl 序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或4的綴合物，特征是其包含SEQID NO:8或10的重鏈可變結(jié)構(gòu)域。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或4的綴合物，特征是其包含可變的輕鏈結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域由免疫球蛋白構(gòu)架和⑶Rl區(qū)、⑶R2區(qū)和⑶R3區(qū)組成，所述⑶Rl區(qū)選自SEQ ID NO:13、14、15或16，所述 CDR2 區(qū)選自 SEQ ID NO: 17、18 或 19，所述 CDR3 區(qū)選自 SEQ ID NO:20、21 或 22。
11.根據(jù)權(quán)利要求1或4的綴合物，特征是其包含SEQID NO:7的⑶R作為重鏈⑶R，和 SEQ ID NO:1 的 CDR 作為輕鏈 CDR, SEQ ID NO:8 的 CDR 作為重鏈 CDR，和 SEQ ID NO:2的⑶R作為輕鏈⑶R，SEQ ID NO: 10的⑶R作為重鏈⑶R，和SEQ ID NO:4的⑶R作為輕鏈CDR, SEQ ID NO: 11 的 CDR 作為重鏈 CDR JPSEQ ID NO:5 的 CDR 作為輕鏈 CDR，或者 SEQ IDNO:12的CDR作為重鏈CDR, SEQ ID NO:6的CDR作為輕鏈CDR0
12.根據(jù)權(quán)利要求1或4的綴合物，特征是包括可變的重鏈和輕鏈結(jié)構(gòu)域，獨(dú)立的選自: a)氨基酸序列SEQID NO:7定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和氨基酸序列SEQ ID NO:1定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域； b)氨基酸序列SEQID NO:8定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和氨基酸序列SEQ ID NO:2定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域； c)氨基酸序列SEQID NO:10定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和氨基酸序列SEQ ID NO:4定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域； d)氨基酸序列SEQID NO:11定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和氨基酸序列SEQ ID NO:5定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域； e)氨基酸序列SEQID NO:12定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和氨基酸序列SEQ ID NO:6定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。
13.根據(jù)權(quán)利要求1或4的綴合物，特征是其包括氨基酸序列SEQID NO:7定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和氨基酸序列SEQ ID NO:1定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；或氨基酸序列SEQ ID NO:8定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和氨基酸序列SEQ ID NO:2定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；或氨基酸序列SEQ ID NO:10定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和氨基酸序列SEQ ID NO:4定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；或氨基酸序列SEQ ID NO: 11定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和氨基酸序列SEQ ID NO:5定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；或氨基酸序列SEQ ID NO: 12定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和氨基酸序列SEQID NO:6定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；接頭；以及抗融合肽，所述接頭選自氨基酸甘氨酸(G)和天冬酰胺(N)，三肽GST，和SEQ ID NO:46-76或80或81，所述抗融合肽選自SEQ ID NO:35-44或83的抗融合肽。
14.根據(jù)權(quán)利要求1或4的綴合物，特征是綴合物包括抗融合肽，其選自抗融合肽C34、T20、T1249、T651、T2635、N36、DP107 或 afp_l，或 afp_2。
15.根據(jù)權(quán)利要求1或4的綴合物，特征是其在重鏈的每個C-端或輕鏈的每個N-端包括抗融合肽。
16.根據(jù)權(quán)利要求1或4的綴合物，特征是其在重鏈的每個C-端和輕鏈的每個N-端包括抗融合肽。
17.根據(jù)權(quán)利要求1或4的綴合物，特征是包括2條SEQID NO:1的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，2個(2)型綴合物，每個所述(2)型綴合物包含SEQ ID NO:7的重鏈可變結(jié)構(gòu)域、SEQ IDNO:75的接頭和SEQ ID NO:42的抗融合肽；特征是包括2條SEQ ID NO:2的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，2個(2)型綴合物，每個所述(2)型綴合物包含SEQ ID NO:8的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，SEQID NO:75的接頭和SEQ ID NO:42的抗融合肽；特征是包括2條SEQ ID NO:4的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，2個(2)型綴合物，每個所述(2)型綴合物包含SEQ ID NO:10的重鏈可變結(jié)構(gòu)域、SEQ ID NO:75的接頭和SEQ ID NO:42的抗融合肽；特征是包括2條SEQ ID NO:5的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，2個(2)型綴合物，每個所述(2)型綴合物包含SEQ ID NO: 11的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，SEQ ID NO:75的接頭和SEQ ID NO:42的抗融合肽；或者，特征是包括2條SEQ ID NO:6的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，2個(2)型綴合物，每個所述(2)型綴合物包含SEQ ID NO:12的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，SEQ ID NO:75的接頭和SEQ ID NO:42的抗融合肽。
18.根據(jù)權(quán)利要求1或4的綴合物，特征是所述抗-⑶4抗體是IgGl亞類或IgG4亞類的。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的綴合物，特征是所述IgG4亞類的抗-CD4抗體具有S228P突變，且所述IgGl亞類的抗-⑶4抗體具有L234A和L235A突變。
20.根據(jù)權(quán)利要求1或4的綴合物，特征是所述抗-CD4抗體是人抗體、人源化抗體、嵌合抗體或T細(xì)胞抗原缺失抗體。
21.用于生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求1的綴合物的方法，特征是方法包括: a)在適合綴合物表達(dá)的條件下，培養(yǎng)包含一個或多個質(zhì)粒的細(xì)胞，所述質(zhì)粒包含一種或多種編碼根據(jù)發(fā)明的綴合物的核酸分子， b)從細(xì)胞或上清液中回收綴合物。
22.SEQ ID NO:42的抗融合肽。
23.藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1的綴合物，以及可藥用的賦形劑或載體。
24.根據(jù)權(quán)利要求 1的綴合物的用途，其用于制備用于治療病毒感染的藥物。
【文檔編號】A61P31/18GK103554271SQ201310547459
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2008年7月18日 優(yōu)先權(quán)日:2007年7月20日
【發(fā)明者】S·費(fèi)舍爾, E·科佩茨基, S·里斯, S·桑庫拉特里 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司