聚乙二醇修飾的聚乙烯亞胺及其作為抗原蛋白載體的用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種聚乙二醇修飾的聚乙烯亞胺及其作為抗原蛋白載體的用途；所述聚乙二醇修飾的聚乙烯亞胺結構通式如式(I)所示：(I)，其中，n、a1、a2、b均為任一自然數(shù)，且a1、a2、b≥1，n≥10。所述的聚乙二醇修飾的聚乙烯亞胺可與蛋白質復合形成穩(wěn)定的納米粒子作為蛋白載體生物材料。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明制備的新型聚乙二醇修飾的聚乙烯亞胺具有較強的蛋白質結合性能，可以攜帶抗原蛋白被抗原提呈細胞識別并引起免疫反應；在提高抗原交叉提呈效果的同時也能夠顯著降低細胞毒性，有助于提高免疫治療效果，是一種優(yōu)良的治療性腫瘤疫苗的納米載體系統(tǒng)。
【專利說明】聚乙二醇修飾的聚乙烯亞胺及其作為抗原蛋白載體的用途
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術領域】，具體涉及一種聚乙二醇修飾的聚乙烯亞胺及其作為抗原蛋白載體的用途。
【背景技術】
[0002]治療性疫苗旨在打破機體的免疫耐受，提高機體的免疫應答。其作用機理是通過改善和增強對疫苗靶抗原的攝入、表達、處理、呈遞和激活免疫應答，從根本上重新激活機體對靶抗原的免疫應答能力。它能在已患病個體上誘導特異性免疫應答，清除病原體或異常細胞，使疾病得以治愈。作為一種新興的治療型疫苗，尤其是在腫瘤治療方面，有著廣闊的發(fā)展前景
[0003]但目前以蛋白質抗原為基礎的腫瘤疫苗的療效有限，其中一個重要原因是其誘導產生的免疫反應為體液免疫即以抗體反應為主的免疫反應,而能夠對腫瘤細胞起到殺傷作用的免疫反應是抗原特異性激活的細胞毒性T淋巴細胞免疫反應。因此，控制抗原在抗原提呈細胞(APCs)內部的處理過程和使其通過MHC-1途徑進行抗原提呈是激活細胞毒性T淋巴細胞的關鍵，而提高抗原交叉提呈反應效率對于提高治療性抗原效用具有非常重要的意義。
[0004]目前，通常作為生物載體材料得到應用的陽離子多聚物包括多聚賴氨酸(Poly-L-lysine, PLL)、多聚精氨酸、多聚組氨酸、組氨酸賴氨酸、殼聚糖(chitosan)、魚精蛋白、多胺樹突狀物(polyamidoaminedendrimer)、聚丙烯亞胺樹突狀物(polypropyIeniminedendrimers)、超支化聚合妝、聚乙烯亞胺(polyethylenimine, PEI)等。其中聚乙烯亞胺(Polyethylenimine, PEI)是由Boussif等在1995年最早發(fā)現(xiàn),其可縮合質粒DNA而不需受體介導，不需溶酶體抑制劑就可轉染細胞，之后，PEI相關的生物載體材料也成為了載體領域的研·究熱點。
[0005]聚乙烯亞胺是已經商業(yè)化的一種陽離子聚合物，每個單體(-CH2-CH2-NH2-)中含有2個碳原子和I個氮原子，即在PEI的骨架中每三個原子中含一個氨基，根據根據合成路線的不同和反應的溫度不同，經過酸催化氮丙啶單體聚合，分別形成線狀和鏈狀的聚合物結構。多聚物的分子量范圍很寬，其中以分子量為22kDa和25kDa的PEI應用最廣。目前的研究表明，PEI在體內和體外均有較高的轉染效率，而PEI的高轉染效率與它具有強大的緩沖能力有關。
[0006]在生理條件下，PEI鏈上的氨基并不完全質子化，當PEI復合物通過與細胞膜相互作用內吞進入細胞后，形成內涵體，之后內涵體與溶酶體融合，在溶酶體中PH值降低，溶酶體中的PEI氨基質子化程度大大提高，PEI吸收大量質子而改變了溶酶體的內環(huán)境，引起溶酶體腫脹破裂，使PEI復合物得以放入胞質。這就是常用的一種“質子海綿”效應假說。但在PEI溶酶體的逃逸機制上仍有一定的爭議。
[0007]利用抗原蛋白在一定條件下帶負電的特點，在先前的研究工作中，陳劍等人設計了一種基于PEI25K的新型抗原載體輸送系統(tǒng)，主要是將帶負電的抗原蛋白質和帶正電的PEI25K以靜電作用結合形成納米粒(Chen, J., et al., Improvedantigen cross-presentation by polyethyIeneimine-based nanoparticles.1nt JNanomedicine, 2011.6:p.77-84.)。研究表明，以PEI為基礎制備的納米粒子可以有效提高抗原交叉提呈反應，具有成為治療性腫瘤疫苗的納米載體系統(tǒng)的潛力。
[0008]但是單純的PEI作為載體在體內應用有諸多問題，如PE1-DNA復合物進入血循環(huán)時，復合物表面的陽性電荷就成了一道障礙。帶陽性電荷的復合物不僅導致紅細胞的聚集，也能夠和血漿成分如白蛋白、纖維蛋白原和補體C3等作用，導致聚集體的形成，顆粒增大；在循環(huán)內最后被肺臟毛細血管床捕獲，這給治療肺臟以外的疾病帶來很大困難；載體表面陽性電荷和聚合體形成也是PEI高毒性的一個主要原因；此外，特定細胞或組織的靶向性也很差，這些都成為限制其體內應用的重要因素之一。因此研究者們對如何進一步增強轉染效率并減輕其毒性作用需作進一步研究。
[0009]PEI的毒性作用于破壞細胞膜的完整性，在體內，細胞膜上的載脂蛋白會吸附PEI/DNA復合物，從而形成結構組成較復雜的多元聚集體，進而破壞膜的完整性。PEG是由乙二醇單體聚合而成的線性高分子材料，屬于可溶性的惰性聚合物，由于PEG分子中存在大量乙氧基能夠和水形成氫鍵，因此其可在周圍形成一定厚度的水合層，而對環(huán)境中的大分子及粒子產生“屏蔽”效應。多年來研究表明，PEG是無毒和抗免疫原性的水溶性大分子，有優(yōu)良的生物相容性。

【發(fā)明內容】

[0010]本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術存在的不足，提供一種新型的聚乙二醇修飾的聚乙烯亞胺及其作為蛋白載體生物材料的用途。本發(fā)明為了改善PEI的生物性能，采用引入聚乙二醇(PEG)的方法對PEI進行修飾。PEI經PEG修飾后，可形成囊泡狀結構屏蔽表面多余的正電荷，有利于體內的長循環(huán)給藥應用，且可增加陽離子多聚物復合物顆粒的可溶性，而且PEG化的PEI復合物還可以減少顆粒之間的相互聚集及降低復合物與血清蛋白(如補體)、紅細胞之間的相互聚集，延長在血液中的循環(huán)時間并降低全身毒性。因此用PEG修飾合成的PEG與PEI的聚合物作為基因遞釋載體有降低毒性、增加復合物穩(wěn)定性、延長體內循環(huán)時間等優(yōu)點。同樣，將PEI進行聚乙二醇修飾能夠增強其與蛋白相互作用，同時維持低毒性。因此，本發(fā)明提供的新型聚乙二醇修飾的聚乙烯亞胺在提高抗原交叉提呈效果的同時，顯著降低了細胞毒性，有助于提高免疫治療效果。
[0011]本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的:
[0012]第一方面，本發(fā)明涉及一種聚乙二醇修飾的聚乙烯亞胺，其結構通式如式(I)所示:
【權利要求】
1.一種聚乙二醇修飾的聚乙烯亞胺，其特征在于，其結構通式如式(I)所示:
2.一種如權利要求1所述的聚乙二醇修飾的聚乙烯亞胺的合成方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟: Α、在無水有機溶劑、吡啶存在的條件下，對甲苯磺酰氯與η倍摩爾比的單甲基聚乙二醇mPEG '
3.如權利要求2所述的聚乙二醇修飾的聚乙烯亞胺的合成方法，其特征在于，所述PEI的重均分子量為2000~25000。
4.如權利要求2所述的聚乙二醇修飾的聚乙烯亞胺的合成方法，其特征在于，所述單甲基聚乙二醇的重均分子量為400~10000。
5.—種如權利要求1所述的聚乙二醇修飾的聚乙烯亞胺作為蛋白載體生物材料的用途，其特征在于，所述的聚乙二醇修飾的聚乙烯亞胺可與蛋白質復合形成穩(wěn)定的納米粒子。
6.如權利要求5所述的聚乙二醇修飾的聚乙烯亞胺作為蛋白載體生物材料的用途，其特征在于，所述蛋白質為帶負電的蛋白質。
7.如權利要求5所述的聚乙二醇修飾的聚乙烯亞胺作為蛋白載體生物材料的用途，其特征在于，所述蛋白質為腫瘤抗原或病毒抗原。
8.如權利要求5所述的聚乙二醇修飾的聚乙烯亞胺作為蛋白載體生物材料的用途，其特征在于，所述納米粒子可作為腫瘤治療性疫苗的載體。
9.如權利要求5所述的聚乙二醇修飾的聚乙烯亞胺作為蛋白載體生物材料的用途，其特征在于，所述聚乙二醇修飾的聚乙烯亞胺的η為10~20中的任一自然數(shù)。
【文檔編號】A61P35/00GK103627005SQ201310554476
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年11月8日 優(yōu)先權日:2013年11月8日
【發(fā)明者】徐宇虹, 王輝, 陳劍, 盛瑞隆, 曹阿民 申請人:上海交通大學