一種具高度腫瘤識別和環(huán)境響應釋藥能力的樹狀聚合物遞藥系統(tǒng)及其構建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具高度腫瘤識別和環(huán)境響應釋藥能力的樹狀聚合物遞藥系統(tǒng)，包括樹狀聚合物Dendrimers、抗腫瘤藥物Drug、未修飾配體的親水嵌段PEG和具有特異性腫瘤識別能力的靶向配體鏈，所述Dendrimers為帶有胺基的樹狀聚合物，以其為中心，未修飾配體的親水嵌段PEG和靶向配體鏈均連接至其表面，靶向配體鏈為聚乙二醇—靶向配體嵌合物PEG-X，Drug通過酸敏感化學鍵—腙鍵鏈接至樹狀聚合物表面。該遞藥系統(tǒng)能夠實現(xiàn)藥物的主動靶向和被動靶向相結合以及在腫瘤微環(huán)境以及細胞器內響應釋藥等多種功能，有利于提高靶向效率和藥物在腫瘤部位的蓄積，增強藥效，是一種很有潛力的多功能腫瘤靶向遞藥系統(tǒng)。
【專利說明】一種具高度腫瘤識別和環(huán)境響應釋藥能力的樹狀聚合物遞藥系統(tǒng)及其構建方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種具高度腫瘤識別和環(huán)境響應釋藥能力的樹狀聚合物遞藥系統(tǒng)及其構建方法。
【背景技術】
[0002]癌癥是一個全球主要的死亡原因。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計，每年世界上有1000萬人患上癌癥，而死于癌癥的人數(shù)約600萬，占全球死亡人數(shù)的12%。我國每年新增癌癥患者180萬，死亡140萬，平均每3分鐘就有1.3人死于癌癥，而且癌癥的發(fā)病率呈急劇上升趨勢，因此，癌癥的治療具有重要的意義。腫瘤的治療手段包括手術治療，放化療，生物免疫等，化療是治療腫瘤的主要手段之一，但是化療治療腫瘤在殺傷腫瘤細胞的同時，也將正常細胞和免疫細胞一同殺滅，缺乏選擇性。此外，藥物本身的理化性質缺陷，如分子大小、溶解性、滲透性、穩(wěn)定性、與血漿蛋白結合等，也極大限度地影響了藥物的療效。因此提高藥物在腫瘤部位的濃度，減少藥物在正常組織器官中的分布，研制有效地腫瘤靶向給藥系統(tǒng)顯得尤為迫切。
[0003]樹狀大分子是高度枝化的單分散大分子，其分子結構由中心核、重復單元以及末端基團構成，具有高度的幾何對稱性。低代數(shù)的樹狀大分子是開放的結構，但隨著代數(shù)的增長，其整體結構逐漸呈現(xiàn)球形，內部存在空腔，可以包裹藥物分子。樹狀大分子的精密骨架結構可以很好地保護其攜帶的藥物，而大量的末端基團可以選擇性的進行改性或偶聯(lián)以提高生物利用度。樹狀大分子規(guī)整的分子結構和單一分散性較其它的納米顆粒相比有明顯的優(yōu)勢，作為藥物、基因、疫苗載體或是生物探針在體內使用時可以提高其在生物體內的有效分布。
[0004]血液和正常組織細胞外液的pH (extracellular pH, pHe)均維持在7.4，正常組織細胞內液的pH (intracellular pH, pHi)為7.2。但是腫瘤組織的pHe值在5.5~7.3之間，相比血液和正常組織偏酸。研究發(fā)現(xiàn)這是由于腫瘤組織處于缺氧狀態(tài)，通過無氧糖酵解途徑進行能量代謝所致。腫瘤細胞的旺盛生長伴隨著糖酵解產物乳酸的大量產生，腫瘤部位的血管分布混亂導致生成的乳酸不能被有效清除，從而形成了腫瘤細胞外的酸性環(huán)境。進而載藥復合物被內吞入胞，在胞內轉運的過程中也經(jīng)歷一系列酸性微環(huán)境，從內涵體pH5~6的環(huán)境到溶酶體中pH4~5的環(huán)境?；谏鲜瞿[瘤組織特定的生理環(huán)境，pH敏感性聚合物載藥系統(tǒng)逐漸受到研究者的關注。目前，基于EPR效應設計腫瘤被動靶向藥物制劑已經(jīng)成為抗腫瘤藥物研究設計的一種有效手段。腫瘤組織細胞膜上存在多種特異性受體，如轉鐵蛋白受體、ανβ3/5受體、葉酸受體、低密度脂蛋白受體、腫瘤壞死因子受體家族和超家族等，有些受體已證實可作為腫瘤靶向的靶點，提高靶向效率。通過配體-受體介導的環(huán)境響應主動靶向給藥系統(tǒng)已經(jīng)成為癌癥治療研究的熱點。

【發(fā)明內容】
[0005]本發(fā)明目的是:提供一種具高度腫瘤識別和環(huán)境響應釋藥能力的樹狀聚合物遞藥系統(tǒng)，該遞藥系統(tǒng)能夠實現(xiàn)藥物的主動靶向和被動靶向結合以及在腫瘤微環(huán)境以及細胞器內響應釋藥等多種功能，有利于提高靶向效率和藥物在腫瘤部位的蓄積，增強藥效。
[0006]本發(fā)明的技術方案:一種具高度腫瘤識別和環(huán)境響應釋藥能力的樹狀聚合物遞藥系統(tǒng)，其特征在于包括樹狀聚合物Dendrimers、抗腫瘤藥物Drug、未修飾配體的親水嵌段和具有特異性腫瘤識別能力的祀向配體鏈，所述樹狀聚合物Dendrimers為中心,未修飾配體的親水嵌段和祀向配體鏈均連接至其表面，所述抗腫瘤藥物Drug通過酸敏感化學鍵鏈接至樹狀聚合物表面；
[0007]其中所述樹狀聚合物選自表面帶有胺基的樹狀聚合物；
[0008]所述親水嵌段選自聚乙二醇PEG ；
[0009]所述靶向配體鏈為聚乙二醇一靶向配體嵌合物PEG-X，其中的靶向配體X選自乳糖、半乳糖、殼聚糖及其修飾物、葉酸、多肽、單克隆抗體中的一種；
[0010]所述酸敏感化學鍵選自腙鍵hyd ；
[0011]所述抗腫瘤藥物Drug為阿霉素及其鹽酸鹽。
[0012]進一步的，本發(fā)明中抗腫瘤藥物、未修飾配體的親水嵌段和靶向配體鏈三者基于樹狀聚合物Dendrimers的摩爾百分百計分別為:Drug5%_10%，PEG5%_10%和PEG_X3%_15%。
[0013]進一步的，本發(fā)明中所述表面帶有胺基的樹狀聚合物Dendrimers是指聚酰胺-胺PAMAM、聚丙烯亞胺PEI和聚賴氨酸PLL中的一種。所述聚酰胺-胺PAMAM進一步優(yōu)選
3.0代~5.0代的聚酰胺-胺PAMAM之一，其中最為優(yōu)選的是4.0代的聚酰胺-胺PAMAM。
[0014]進一步的，本發(fā)明中所述靶向配體鏈PEG-Χ是通過將靶向配體X連接到末端氨基化的PEG鏈NH2-PEG-NH2的一端，生成X-PEG-NH2，再經(jīng)二琥珀酰亞胺辛二酸酯DSS活化得到一端帶有-NHS功能基團的配體鏈NHS-PEG-X，最后與Dendrimers上的_NH2反應而得到。
[0015]進一步的，本發(fā)明中所述未修飾配體的親水嵌段(PEG)、靶向配體鏈(PEG-X)中的PEG的分子量在2000-5000 Da之間，且后者的PEG分子量大于或等于前者，在具體優(yōu)化的實施例中兩者進一步優(yōu)選2000 Da。
[0016]進一步的，本發(fā)明中所述靶向配體X優(yōu)選葉酸(FA)。
[0017]進一步的，本發(fā)明所述的遞藥系統(tǒng)為納米級顆粒狀復合物，其粒徑優(yōu)選為20-200nm。
[0018]需要指出的是本發(fā)明中涉及的靶向配體X的比例采用細胞毒性實驗篩選，所選細胞為高表達配體相應受體的腫瘤細胞。
[0019]本發(fā)明提供的一種具高度腫瘤識別和環(huán)境響應釋藥能力的樹狀聚合物遞藥系統(tǒng)，其一方面，利用親水嵌段PEG對樹狀聚合物載體進行修飾，提高載體系統(tǒng)的分子量和溶解度，掩蔽樹狀聚合物表面大量nh2_的強正電，從而避免納米粒子之間的聚集吸附和巨噬細胞的識別，減低對正常細胞的毒性，增強EPR效應，延長在體內的循環(huán)時間，結合靶向配體，在受體介導的作用下，有利于藥物在腫瘤部位的有效蓄積。
[0020]另一方面，根據(jù)腫瘤組織及腫瘤細胞微環(huán)境的特定生理條件，抗腫瘤藥物通過酸敏感的腙鍵連接到樹狀聚合物表面。使樹狀聚合物遞藥系統(tǒng)經(jīng)被動靶向和主動靶向的雙重作用下，在到達腫瘤部位后，或/和進入腫瘤細胞后在酸性細胞器中，由于pH降低，酸敏感化學鍵一腙鍵自動斷裂并釋放抗腫瘤藥物并有效發(fā)揮其細胞毒性作用。[0021]本發(fā)明另一目的是提供上述的一種具有高度腫瘤識別和環(huán)境響應釋藥能力的樹狀聚合物遞藥系統(tǒng)的構建方法，其特征在于包括下述步驟:
[0022]1)靶向配體鏈的合成:以靶向配體X與末端氨基化的親水嵌段(具有雙功能基團的PEG鏈)NH2-PEG-NH2 —端的胺基通過酰胺反應生成NH2-PEG-X，并經(jīng)二琥珀酰亞胺辛二酸酯DSS活化后生成NHS-PEG-X ；
[0023]2)樹狀聚合-親水嵌段Dendrimers-PEG的合成:以Dendrimers的胺基與單功能聚乙二醇PEG-NHS的琥拍酰亞胺基團反應生成反應生成PEG-Dendrimers,后經(jīng)與氯甲酸對硝基苯酯、水合肼反應，生成帶有酰肼基團的PEG-Dendrimer-HNNH2 ；
[0024]3)抗腫瘤藥物的腙鍵連接:抗腫瘤藥物Drug的羰基與上述步驟2)中生成的PEG-Dendrimer-HNNH2 的酸餅基團反應，生成 PEG-Dendrimer-hyd-Drug ；
[0025]4)遞藥系統(tǒng)的構建:通過控制 NHS-PEG-X 與 PEG-Dendrimer-hyd-Drug 的投料摩爾比為 η,0 < η < 64:1,同時控制 PEG-Dendrimer-hyd-Drug 與 PEG-NHS 的投料摩爾比為m，0≤ m≤ 1:64，制備出含有特定Drug、PEG和X比例的所述遞藥系統(tǒng)X-PEG-Dendrimer-hyd-Drug 復合物。
[0026]本發(fā)明的優(yōu)點是:
[0027]本發(fā)明提供的一種具有高度腫瘤識別能力且腫瘤微環(huán)境響應釋藥的樹狀聚合物遞藥系統(tǒng)的特點如下:
[0028]( 1)納米級粒徑，均一穩(wěn)定；
[0029](2)多重靶向功能，包括親水嵌段修飾長循環(huán)的被動靶向、受體介導的主動靶向以及腫瘤組織響應釋藥等功能；
[0030](3)通過改變親水嵌段分子量、樹狀聚合物的代數(shù)，實現(xiàn)對載藥量、分子量大小和納米系統(tǒng)表面電荷的控制，進一步優(yōu)化納米系統(tǒng)的體內行為；
[0031](4)表面修飾靶向配體，可以使載藥系統(tǒng)特異性的運送到腫瘤組織，減少對正常組織器官的毒副作用。優(yōu)化配體連接數(shù)目，進一步提高腫瘤靶向效率；
[0032](5)藥物分子與載體之間的酸敏感化學鍵在體外和體內循環(huán)時穩(wěn)定而不釋放藥物，從而減少了對正常組織器官的毒副作用，到達弱酸性的腫瘤部位以及內吞后進入酸性細胞器，酸敏感化學鍵發(fā)生斷裂釋放游離藥物，隨后進入細胞核，發(fā)揮細胞毒性作用。
[0033]概括來講，本發(fā)明提供的遞藥系統(tǒng)既能充分利用聚乙二醇延長體內循環(huán)時間和利用配體促進腫瘤主動識別和入胞的功能，又能在到達腫瘤部位后，或/和進入腫瘤細胞后在酸性細胞器中酸敏感化學鍵一腙鍵自動斷裂并釋放藥物，高效發(fā)揮對腫瘤細胞的毒性作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]下面結合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步描述:
[0035]圖1為FPP-hyd-DOX的屮核磁共振圖譜；
[0036]圖2為本發(fā)明具體實施例的納米遞藥系統(tǒng)PP-hyd-DOX的透射電鏡圖譜；
[0037]圖3為本發(fā)明具·體實施例的納米遞藥系統(tǒng)FPP-hyd-DOX的透射電鏡圖譜；
[0038]圖4為本發(fā)明具體實施例的納米遞藥系統(tǒng)PP-hyd-DOX在不同pH條件下的體外釋放圖；[0039]圖5為本發(fā)明具體實施例的納米遞藥系統(tǒng)FPP-hyd-DOX在不同pH條件下的體外釋放圖；
[0040]圖6為本發(fā)明具體實施例的納米遞藥系統(tǒng)PAMAM和PEG-PAMAM的細胞毒性檢測曲線圖；
[0041]圖7為本發(fā)明具體實施例的納米遞藥系統(tǒng)PP-hyd-DOX和FPP-hyd-DOX的細胞毒性檢測曲線圖；
[0042]圖8為流式細胞儀定量測定本發(fā)明具體實施例的納米遞藥系統(tǒng)的細胞攝取圖；
[0043]圖9為本發(fā)明具體實施例的納米遞藥系統(tǒng)的細胞攝取定量柱狀圖；
[0044]圖10為本發(fā)明樹狀聚合物遞藥系統(tǒng)的通用結構示意圖。 [0045]圖中:1、樹狀聚合物；2、親水嵌段；3、靶向配體；4、抗腫瘤藥物；5、酸敏感化學鍵。
【具體實施方式】
[0046]下面結合具體實施例，進一步闡明本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍:
[0047]實施例1:提供本發(fā)明一種具高度腫瘤識別和環(huán)境響應施藥能力的樹狀聚合物遞藥系統(tǒng)的具體復合物(葉酸-聚乙二醇-聚酰胺-胺-腙鍵-阿霉素/FA-PEG-PAMAM-hyd-DOX，簡寫為 FPP-hyd-DOX)
[0048]該具體復合物的結構參見圖10所示，其以樹狀聚合物1為中心，未修飾配體的親水嵌段2和靶向配體鏈均連接至其表面，所述靶向配體鏈為親水嵌段一祀向配體3嵌合物；抗腫瘤藥物4通過酸敏感化學鍵5鏈接至樹狀聚合物1表面。本實施例中的樹狀聚合物選用聚酰胺-胺4代PAMAM，親水嵌段選用聚乙二醇PEG，靶向配體X選用葉酸FA，聚乙二醇PEG和葉酸FA之間嵌合形成靶向配體鏈PEG — FA ;酸敏感化學鍵選用腙鍵hyd，所述抗腫瘤藥物Drug選用阿霉素D0X。
[0049]同時提供上述具體復合物的合成方法，其具體步驟如下:
[0050]1) FA-PEG-NHS 的合成
[0051]FA (0.lmmol)和三乙胺(0.5mmol)溶解在 DMS0 中，加入 DCC (0.lmmol)和 NHS(0.lmmol)，氮氣保護，避光室溫攪拌過夜。活化后的FA反應液加入到PEG-(NH2)2(0.lmmol)的DMS0溶液中，避光室溫攪拌反應24h后過濾，透析，冷凍干燥得黃色固體FA-PEG-NH2。FA-PEG-NH2的DMS0溶液，加入10倍量的DSS，攪拌過夜，干燥得淡黃色固體FA-PEG-NHS。
[0052]該合成步驟的反應式如下:
[0053]
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FA-PEG-NHS
[0054]2) PEG-PAMAM-hyd-DOX (簡寫為 PP-hyd-DOX)的合成
[0055]精密稱取CH30-PEG-NHS (10 μ mol)和 4 代 PAMAM (1 μ mol )，溶于 PBS 緩沖液(pH8.2)中，室溫避光攪拌24h，TLC跟蹤反應進程。反應結束后，超濾，冷凍干燥，得白色固體PEG-PAMAM。PEG-PAMAM (1 μ mol)溶于無水CH2C12后置于冰浴中，迅速加入氯甲酸對硝基苯酯(30 μ mol)和催化量的DMAP，氮氣保護，室溫攪拌反應24h。冰乙醚沉淀產物，將產物溶于N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)中，加入85%水合肼(50 μ mo 1)，70°C加熱回流24h。透析，冷凍干燥后再一次溶于DMF (含4μ 1三乙胺)中，然后加入D0X (5(^11101)，氮氣保護下601:避光回流24h。反應結束后透析、冷凍干燥，產物_20°C保存。
[0056]該合成步驟的反應式如下:
[0057]
【權利要求】
1.一種具高度腫瘤識別和環(huán)境響應釋藥能力的樹狀聚合物遞藥系統(tǒng)，其特征在于包括樹狀聚合物Dendrimers、抗腫瘤藥物Drug、未修飾配體的親水嵌段和具有特異性腫瘤識別能力的祀向配體鏈，所述樹狀聚合物Dendrimers為中心，未修飾配體的親水嵌段和祀向配體鏈均連接至其表面，所述抗腫瘤藥物Drug通過酸敏感化學鍵鏈接至樹狀聚合物表面；其中所述樹狀聚合物選自表面帶有胺基的樹狀聚合物；所述親水嵌段選自聚乙二醇PEG ；所述靶向配體鏈為聚乙二醇一祀向配體嵌合物PEG-X，其中的靶向配體X選自乳糖、半乳糖、殼聚糖及其修飾物、葉酸、多肽、單克隆抗體中的一種；所述酸敏感化學鍵選自腙鍵hyd ；所述抗腫瘤藥物Drug為阿霉素及其鹽酸鹽。
2.根據(jù)權利要求1所述的遞藥系統(tǒng)，其特征在于，基于樹狀聚合物Dendrimers的摩爾百分百計，Drug5%-10%, PEG5%-10%, PEG_X3%_15%。
3.根據(jù)權利要求1所述的遞藥系統(tǒng)，其特征在于，所述表面帶有胺基的樹狀聚合物Dendrimers是指聚酰胺-胺PAMAM、聚丙烯亞胺PEI和聚賴氨酸PLL中的一種。
4.根據(jù)權利要求3所述的遞藥系統(tǒng)，其特征在于，所述聚酰胺-胺PAMAM為3.0代~5.0代的聚酰胺-胺PAMAM之一。
5.根據(jù)權利要求1所述的遞藥系統(tǒng)，其特征在于，所述PEG-Χ是通過將靶向配體X連接到末端氨基化的PEG鏈NH2-PEG-NH2的一端，生成X-PEG-NH2，再經(jīng)二琥珀酰亞胺辛二酸酯DSS活化得到一端帶有-NHS功能基團的配體鏈NHS-PEG-X，最后與Dendrimers上的_NH2反應而得到。
6.根據(jù)權利要求1或5所述的遞藥系統(tǒng)，其特征在于，所述PEG的分子量為2000-5000Da。
7.根據(jù)權利要求1或5所述的遞藥系統(tǒng)，其特征在于，所述靶向配體X為葉酸。
8.根據(jù)權利要求1所述的遞藥系統(tǒng)，其特征在于，該遞藥系統(tǒng)的粒徑為20-200nm。
9.一種如權利要求1~8任意一項所述具有高度腫瘤識別和環(huán)境響應釋藥能力的樹狀聚合物遞藥系統(tǒng)的構建方法，其特征在于包括下述步驟:1)靶向配體鏈的合成:以靶向配體X與末端氨基化的親水嵌段nh2-peg-nh2—端的胺基通過酰胺反應生成NH2-PEG-X，并經(jīng)二琥珀酰亞胺辛二酸酯/DSS活化后生成NHS-PEG-X ；2)樹狀聚合-親水嵌段Dendrimers-PEG的合成:以Dendrimers的胺基與單功能聚乙二醇PEG-NHS的琥珀酰亞胺基團反應生成PEG-Dendrimers，后經(jīng)與氯甲酸對硝基苯酯、水合肼反應，生成帶有酰肼基團的PEG-Dendrimer-HNNH2 ；3)抗腫瘤藥物的腙鍵連接:抗腫瘤藥物Drug的羰基與上述步驟2)中生成的PEG-Dendrimer-HNNH2 的酸餅基團反應，生成 PEG-Dendrimer-hyd-Drug ；4)遞藥系統(tǒng)的構建:通過控制NHS-PEG-X與PEG-Dendrimer-hyd-Drug的投料摩爾比為 η,0 < η < 64:1,同時控制 PEG-Dendrimer-hyd-Drug 與 PEG-NHS 的投料摩爾比為m，0≤m≤1:64，制備出含有特定Drug、PEG和X比例的所述遞藥系統(tǒng)X-PEG-Dendrimer-hyd-Drug 復合物。
【文檔編號】A61P35/00GK103655587SQ201310557600
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月11日 優(yōu)先權日:2013年11月11日
【發(fā)明者】程麗芳, 程亮, 陳大為, 胡青 申請人:蘇州大學