一種疫苗組合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種疫苗組合物，該疫苗組合物包括免疫量的豬肺炎支原體抗原、免疫量的豬流感病毒抗原以及免疫量的豬藍(lán)耳病毒抗原。該疫苗組合物各抗原不僅不產(chǎn)生抗原成分的相互干擾或影響，反而有相互增強(qiáng)免疫效果的作用，一次免疫即可達(dá)到單一抗原二次免疫的免疫效果和抗體持續(xù)水平，同時具備安全性好、制備方法簡單、免疫方便快捷、降低免疫成本等優(yōu)點。CCTCC No： V2012342012.08.13CCTCC No： V2012332012.08.13CCTCC No： M20122302012.06.13
【專利說明】一種疫苗組合物及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種疫苗組合物，以及該疫苗組合物的制備方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome， PRRS)，又稱豬藍(lán)耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的以母豬發(fā)熱、流產(chǎn)，斷奶前后的仔豬死亡率升 高，不同年齡豬呼吸障礙等為臨床特征的疾病。豬繁殖與呼吸綜合征病毒又稱豬藍(lán)耳病毒， 是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒，病毒有2個血清型，即美洲型和歐洲型。目前，該病是 嚴(yán)重影響世界養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要疾病之一。疫苗接種是預(yù)防該病最有效的方法。
[0003] 豬流感（Swine influenza, SI)是當(dāng)前危害養(yǎng)豬業(yè)的一種重要的呼吸系統(tǒng)疾病，主 要表現(xiàn)為高熱、咳嗽和呼吸困難等特征，是規(guī)?；B(yǎng)豬場普遍存在且難以根除的群發(fā)性疫 病之一。豬流感主要由A型豬流感病毒（Swine influenza virus, SIV)引發(fā)，據(jù)國內(nèi)外的 文獻(xiàn)報道，豬體內(nèi)的A型流感病毒血清亞型有H1N1、H1N2、H1N7、H3N2、H3N6、H4N6、H5N1和 H9N2,國內(nèi)的豬流感病毒血清亞型主要以H1N1、H1N2、H3N2、H5N1和H9N2為主，而其中又以 H1N1和H3N2亞型為主。由于豬流感病毒對呼吸道上皮有高度特異的親嗜性，易使呼吸道上 皮管壁受損，導(dǎo)致胸膜肺炎放線桿菌、巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌、鏈球菌、豬繁殖與呼吸綜合 征病毒、豬圓環(huán)病毒的繼發(fā)感染或混合感染，增加疫情的復(fù)雜性，給養(yǎng)豬業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì) 損失。
[0004] 豬支原體性肺炎（Mycoplasma pneumonia of swine，MPS)是由豬肺炎支原體 (Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp)引發(fā)的一種慢性肺炎，又稱豬地方流行性肺炎，也是豬 呼吸道疾病綜合征的重要病原之一。長期以來，本病一直被認(rèn)為是對養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì) 損失、最常發(fā)生、流行最廣、最難凈化的重要疫病之一。豬肺炎支原體是條件性致病菌，發(fā)生 本病后，可使機(jī)體抵抗力降低，極易繼發(fā)感染豬藍(lán)耳病毒、豬流感病毒等，使病情加重和病 死率升1?。
[0005] 自20世紀(jì)90年代中期以來，由豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬肺炎支原體、豬流感 病毒等主要原發(fā)性病原體引起的PRDC給世界各國養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的損失。臨床PRDC中， 上述三種病原即豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬肺炎支原體、豬流感病毒常常以混合感染形 式出現(xiàn)。而目前針對這三種病原的感染尚無法實現(xiàn)一種疫苗免疫抵抗這三種病原引起的混 合感染。
[0006] 對于多病原混合感染所致疾病的免疫，采用單苗免疫時需要多次注射，由于抗菌 藥物的使用常常會引起耐藥性及藥物殘留問題，單苗多次注射不僅會引發(fā)應(yīng)激和安全問 題，并且在混合感染的情況下，免疫預(yù)防效果質(zhì)量下降。因此，本領(lǐng)域需要能產(chǎn)生保護(hù)性免 疫應(yīng)答以同時抵抗豬肺炎支原體、豬藍(lán)耳病毒及豬流感病毒感染的聯(lián)合疫苗，減少所述感 染的發(fā)生率和/或減輕所述感染的嚴(yán)重性，或預(yù)防與所述感染有關(guān)的臨床表現(xiàn)。
[0007] 與單一疫苗相比，聯(lián)合疫苗不僅方便、多效、低成本，還可以減少疫苗接種次數(shù)，避 免因漏種而不能得到全程免疫；另外，疫苗大多不耐熱，其生產(chǎn)、運輸、存貯、銷售乃至全部 使用過程均需在較低溫度下進(jìn)行，即所謂的"冷鏈"，這種環(huán)環(huán)相扣的冷鏈運作，費用極高， 使疫苗成本居高不下，而使用聯(lián)合疫苗，則可以大大降低冷鏈運作的費用，因此具有顯著的 優(yōu)越性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的主要目的在于提供一種疫苗組合物，所述疫苗 組合物包括免疫量的豬肺炎支原體抗原、免疫量的豬流感病毒抗原與免疫量的豬藍(lán)耳病毒 抗原。
[0009] 優(yōu)選地，所述豬肺炎支原體抗原為滅活形式的豬肺炎支原體全病原抗原、活的形 式的豬肺炎支原體抗原、豬肺炎支原體亞單位抗原、豬肺炎支原體重組活載體抗原和豬肺 炎支原體DNA載體的抗原；所述豬流感病毒抗原為滅活形式的豬流感病毒全病毒抗原、活 的形式的豬流感病毒抗原、豬流感病毒亞單位抗原、豬流感病毒重組活載體抗原和豬流感 病毒DNA載體的抗原；所述豬藍(lán)耳病毒抗原為滅活形式的豬藍(lán)耳病毒全病毒抗原、活的形 式的豬藍(lán)耳病毒抗原、豬藍(lán)耳病毒亞單位抗原、豬藍(lán)耳病毒重組活載體抗原和豬藍(lán)耳病毒 DNA載體的抗原。
[0010] 本發(fā)明所用的術(shù)語"疫苗"或"疫苗組合物"可互換使用，是指包含至少一種在動 物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的免疫原性物質(zhì)的藥物組合物。
[0011] 本發(fā)明中術(shù)語"豬肺炎支原體抗原"是指包含至少一種在對豬給藥后能誘導(dǎo)、刺激 或增強(qiáng)抗豬肺炎支原體感染的免疫應(yīng)答的抗原的任何組合物。優(yōu)選地，所述豬肺炎支原體 抗原是豬肺炎支原體全病原，優(yōu)選滅活形式的豬肺炎支原體全病原、改良的豬肺炎支原體 活病原或減毒形式的豬肺炎支原體病原；含有至少豬肺炎支原體的免疫原性氨基酸序列的 嵌合病毒；任何其它含至少豬肺炎支原體的免疫原性氨基酸序列的多肽、亞單位或其他成 分。
[0012] 豬肺炎支原體抗原還可以包含以下疫苗組合物中的任一種或幾種抗原：如勃林 格殷格翰動物保健(美國）有限公司生產(chǎn)的豬支原體肺炎滅活疫苗、西班牙海博萊生物大 藥廠的喜可舒的J株豬支原體肺炎滅活疫苗、美國先靈葆雅公司的豬支原體肺炎滅活疫苗 (Myco Silencer馨）、美國普泰克公司的MycoGard疫苗、美國輝瑞公司的RespiFend的MH P-5722-3株疫苗、梅里亞動物保健公司的豬克喘的BQ14株疫苗、南京天邦生產(chǎn)的豬肺炎支 原體的168株疫苗以及普萊柯生物工程股份有限公司分離的豬肺炎支原體HN0613株制備 的疫苗。
[0013] 本發(fā)明中術(shù)語"豬流感病毒抗原"是指包含至少一種在對豬給藥后能誘導(dǎo)、刺激或 增強(qiáng)抗豬流感病毒感染的免疫應(yīng)答的抗原的任何組合物。優(yōu)選地，所述豬流感病毒抗原是 豬流感全病毒抗原，包括本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的臨床分離的野毒株，優(yōu)選為滅活形式的豬 流感全病毒、改良的豬流感活病毒或減毒形式的豬流感病毒；含有至少豬流感病毒的免疫 原性氨基酸序列的嵌合病毒；任何至少含有豬流感病毒的免疫原性氨基酸序列的多肽、亞 單位或其他成分。
[0014] 本發(fā)明中術(shù)語"豬藍(lán)耳病毒抗原"是指包含至少一種在對豬給藥后能誘導(dǎo)、刺激或 增強(qiáng)抗豬藍(lán)耳病毒感染的免疫應(yīng)答的抗原的任何組合物。優(yōu)選地，所述豬藍(lán)耳病毒抗原是 豬藍(lán)耳全病毒抗原，包括本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的臨床分離的野毒株，優(yōu)選為滅活形式的豬 藍(lán)耳全病毒，改良的豬藍(lán)耳活病毒或減毒形式的豬藍(lán)耳病毒；含有至少豬藍(lán)耳病毒的免疫 原性氨基酸序列的嵌合病毒；任何其它含至少豬藍(lán)耳病毒的免疫原性氨基酸序列的多肽、 亞單位或其他成分。
[0015] 更優(yōu)選地，本發(fā)明疫苗組合物中，所述豬肺炎支原體抗原為滅活形式的豬肺炎支 原體J株或HN0613株全病原抗原；所述豬流感病毒抗原為滅活形式的豬流感病毒（H1N1亞 型）ZJS株或豬流感病毒（H3N2亞型）WX株中的一株或兩株的全病毒抗原；所述豬藍(lán)耳病毒 抗原為活的形式的豬藍(lán)耳病毒R98株、ATCCVR-2332株或CH-1R株中的一株或幾株的全病 毒抗原。
[0016] 豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp) J株，保藏于美國菌種保藏中心 ATCC 25934。
[0017] 豬肺炎支原體 HN0613(Mycoplasma hyopneumoniae strain HN0613)，已在中國典 型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱：CCTCC;地址：中國武漢武漢大學(xué))進(jìn)行保藏，保藏日期：2012年 6 月 13 日，保藏號為 CCTCC N0:M2012230。
[0018] 豬流感病毒（H1N1 亞型）ZJS 株（Swine influenza virus (H1N1 subtype)strain ZJS)和豬流感病毒（H3N2 亞型)WX 株（Swine influenza virus(H3N2subtype)strain WX)， 均在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱：CCTCC;地址：中國武漢武漢大學(xué)）進(jìn)行保藏，保藏 日期：2012 年 08 月 13 日，保藏號分別為 CCTCC N0:V201233 和 CCTCC N0:V201234。
[0019] 豬藍(lán)耳病毒R98株，公開于豬繁殖與呼吸綜合征病毒R98弱毒株的分離鑒定與 0RFs3?7基因特性研究（中國獸醫(yī)學(xué)報，2008年1月，第28卷，第1期）
[0020] 豬藍(lán)耳病毒ATCCVR-2332株，保藏于美國菌種保藏中心，保藏號為ATCCVR-2332。
[0021] 豬藍(lán)耳病毒CH-1R株，該毒株公開于中國專利申請CN100523177C，以保藏號CGMCC No. 1883保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
[0022] 進(jìn)一步優(yōu)選地，本發(fā)明疫苗組合物中，所述豬肺炎支原體抗原為滅活形式的豬肺 炎支原體HN0613株全病原抗原；所述豬流感病毒抗原為滅活形式的豬流感病毒（H1N1亞 型）ZJS株和豬流感病毒（H3N2亞型）WX株全病毒抗原；所述豬藍(lán)耳病毒抗原為活的形式的 豬藍(lán)耳病毒CH-1R株全病毒抗原。
[0023] 優(yōu)選地，所述疫苗組合物滅活疫苗部分進(jìn)一步包括獸藥學(xué)上可接受的佐劑，所述 佐劑為水佐劑；所述疫苗組合物活疫苗部分還包括凍干保護(hù)劑。
[0024] 更優(yōu)選地，所述佐劑為GEL 01佐劑。
[0025] 本發(fā)明所用術(shù)語"水佐劑"又稱"水基佐劑"或"水溶性佐劑"，是一種聚合物水溶 性分散體，用于提高水溶性疫苗的功效和安全性，可以由高分子量聚丙烯酸類合成聚合物 組成。
[0026] 優(yōu)選地，本發(fā)明疫苗組合物中，所述豬肺炎支原體抗原滅活前含量為107_°? 2X 101(I_°MHDCE/頭份；所述豬流感病毒抗原滅活前含量為104_°?107_°EID 5(I/頭份；所述豬 藍(lán)耳病毒抗原含量為1〇4_°?l〇6_°TCID 5(l/頭份。
[0027] 更優(yōu)選地，所述豬肺炎支原體抗原滅活前含量為108_°?101(I_°MHDCE/頭份；所述豬 流感病毒抗原滅活前含量為1〇 5_°?l〇7_°EID5(l/頭份；所述豬藍(lán)耳病毒抗原含量為105_°? 10 6 °TCID5Q/頭份。
[0028] 最優(yōu)選地，所述豬肺炎支原體抗原滅活前含量為109_°MHDCE/頭份；所述豬流感病 毒抗原滅活前含量為l〇 6_°EID5(l/頭份；所述豬藍(lán)耳病毒抗原含量為106_°TCID5(I/頭份。
[0029] 優(yōu)選地，所述疫苗組合物還包括其它豬的病原體抗原，其選自豬偽狂犬病毒（PRV) 抗原、豬瘟病毒抗原、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌抗原和豬圓環(huán)病毒抗原中的一種或幾種。
[0030] 本發(fā)明的另一目的在于提供了一種本發(fā)明所述疫苗組合物的制備方法，包括如下 步驟：
[0031] (1)繁殖培養(yǎng)豬肺炎支原體，滅活；
[0032] (2)繁殖培養(yǎng)豬流感病毒，滅活；
[0033] ( 3 )繁殖培養(yǎng)豬藍(lán)耳病毒；
[0034] (4)將所述滅活豬肺炎支原體抗原和豬流感病毒抗原按比例混合，并與所述豬藍(lán) 耳活病毒抗原分開保藏。
[0035] 具體方法如下：分別繁殖培養(yǎng)豬肺炎支原體、豬流感病毒和豬藍(lán)耳病毒獲得菌液； 將豬肺炎支原體菌液和豬流感病毒液分別滅活，然后將滅活檢驗合格的豬肺炎支原體抗原 和豬流感病毒抗原分別進(jìn)行濃縮處理；將所述豬肺炎支原體抗原、豬流感病毒抗原與疫苗 佐劑混合制得抗豬肺炎支原體、豬流感病毒的二聯(lián)疫苗組合物（即滅活疫苗部分）；將豬藍(lán) 耳病毒抗原與凍干保護(hù)劑混合制備抗豬藍(lán)耳病毒的疫苗組合物（即活疫苗部分)。使用時可 將抗豬肺炎支原體、豬流感病毒的二聯(lián)疫苗組合物稀釋抗豬藍(lán)耳病毒的疫苗組合物，得到 抗豬肺炎支原體、豬流感病毒和豬藍(lán)耳病毒的三聯(lián)疫苗組合物，也可將抗豬肺炎支原體、豬 流感病毒的疫苗組合物與抗豬藍(lán)耳病毒的疫苗組合物分別單獨使用。
[0036] 優(yōu)選地，將所述豬肺炎支原體抗原和豬流感病毒抗原與Gel 01佐劑混合制得含 量為12% (V/V)的滅活疫苗部分；將豬藍(lán)耳病毒抗原與凍干保護(hù)劑以1:1 (V/V)的比例混合 制得活疫苗部分；然后用所述滅活疫苗部分按比例稀釋所述活疫苗部分，優(yōu)選比例為1:1 (頭份/頭份)，制成豬支原體肺炎、豬流感和豬藍(lán)耳病三聯(lián)疫苗。
[0037] 本發(fā)明中的術(shù)語"頭份"是指每頭豬注射的疫苗量。
[0038] 本發(fā)明的又一目的在于提供所述疫苗組合物在制備預(yù)防和治療豬呼吸道疾病綜 合征的藥物中的應(yīng)用，其中，所述應(yīng)用包括用免疫量的豬肺炎支原體抗原、免疫量的豬流感 病毒抗原和免疫量的豬藍(lán)耳病毒抗原免疫豬，所述豬免疫時為3?4周齡。
[0039] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種免疫試劑盒，所述免疫試劑盒包括含所述豬肺炎 支原體抗原和豬流感病毒抗原的抗原組合物以及所述豬藍(lán)耳病毒抗原，其中，含所述豬肺 炎支原體抗原和豬流感病毒抗原的抗原組合物與所述豬藍(lán)耳病毒抗原分開保藏。
[0040] 優(yōu)選地，上述免疫試劑盒中所述豬肺炎支原體抗原、豬流感病毒抗原為滅活形式 的全病原抗原，所述豬藍(lán)耳病毒抗原為活的形式的全病毒抗原。
[0041] 技術(shù)效果
[0042] 首先，本發(fā)明的豬支原體肺炎、豬流感和豬藍(lán)耳病三聯(lián)疫苗，在一定抗原含量范圍 內(nèi)不僅不會產(chǎn)生抗原成份的相互免疫干擾或影響，而且三種抗原混合后在產(chǎn)生保護(hù)性免疫 應(yīng)答的同時，還意外發(fā)現(xiàn)豬肺炎支原體、豬流感病毒和豬藍(lán)耳病毒的抗原有相互增強(qiáng)免疫 效果的作用。如本發(fā)明后續(xù)實施例所證明的，三聯(lián)疫苗免疫一次即可達(dá)到各單苗二次免疫 的抗體持續(xù)水平，該現(xiàn)象出乎本領(lǐng)域普通技術(shù)人員預(yù)料。
[0043] 其次，本發(fā)明的豬支原體肺炎、豬流感和豬藍(lán)耳病三聯(lián)疫苗與豬支原體肺炎、豬流 感和豬藍(lán)耳病的單疫苗相比，在對豬注射免疫過程中，豬體的應(yīng)激反應(yīng)出人預(yù)料地小，因此 本發(fā)明的三聯(lián)疫苗安全性更佳，可以避免多次接種免疫出現(xiàn)的不良反應(yīng)。
[0044] 此外，本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)的困難，首次將豬肺炎支原體、豬流感病毒和豬藍(lán)耳 病毒抗原按照合適的比例聯(lián)合使用，改變了之前人們認(rèn)為豬支原體肺炎、豬流感和豬藍(lán)耳 病這三種疾病難以同時進(jìn)行預(yù)防進(jìn)而獲得三聯(lián)疫苗的認(rèn)識偏見。
[0045] 最后，本發(fā)明的豬支原體肺炎、豬流感和豬藍(lán)耳病三聯(lián)疫苗含有三種抗原、可以同 時預(yù)防三種疾病，該聯(lián)合疫苗具有制備方法簡單、方便、多效、低成本、疫苗效價含量高等特 點；同時，與單一疫苗相比，聯(lián)合疫苗可以減少疫苗的接種次數(shù)，避免因漏種而不能得到全 程免疫，而且降低免疫成本，節(jié)約免疫程序；另外，由于疫苗大多不耐熱，其生產(chǎn)、運輸、儲存 乃至全部使用過程均需在較低溫度下進(jìn)行，即所謂的"冷鏈"，這種環(huán)環(huán)相扣的冷鏈運作，費 用極高，使疫苗成本居高不下，而使用本發(fā)明所述的聯(lián)合疫苗，則可以大大降低冷鏈運作的 費用，因此具有顯著的優(yōu)越性。

【具體實施方式】
[0046] 下面結(jié)合具體實施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。這些實施例僅是舉例說明，不應(yīng)被視為 對本發(fā)明總體范圍的任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下對本發(fā)明 技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行的任何修改和替換，均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0047] 本發(fā)明實施例中用豬肺炎支原體HN0613株、豬流感病毒（H1N1亞型）ZJS株和豬 流感病毒（H3N2亞型）WX株、豬藍(lán)耳病毒CH-1R株為例說明本發(fā)明。
[0048] 本發(fā)明實施例中肺病變指數(shù)評分標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)7個肺葉病變程度進(jìn)行評定，最大得 分為28分。特異性損傷的肺葉面積為0時，記為0分，1%?25%記為1分，26%?50%記為 2分，51%?75%記為3分，大于75%為4分。
[0049] 本發(fā)明實施例統(tǒng)計分析方法為：統(tǒng)計7個肺葉的肺病變指數(shù)，確定病變程度。用 SPSS計算機(jī)軟件進(jìn)行AN0VA分析，比較各組間差異，確定病變差異的有效性。
[0050] 本實施例中的疫苗組合物、三聯(lián)疫苗均指預(yù)防或治療豬肺炎支原體、豬流感病毒 和豬藍(lán)耳病毒感染的疫苗組合物，即至少包含豬肺炎支原體抗原、豬流感病毒抗原和豬藍(lán) 耳病毒抗原的疫苗組合物。
[0051] 實施例1豬肺炎支原體抗原、豬流感病毒抗原和豬藍(lán)耳病毒抗原的制備
[0052] 1、豬肺炎支原體抗原制備
[0053] 1. 1菌株來源：
[0054] 制造及檢驗本品用的豬肺炎支原體囷株為HN0613株，在中國典型培養(yǎng)物保減中 心(簡稱：CCTCC;地址：中國武漢武漢大學(xué))進(jìn)行保藏，保藏日期：2012年6月13日，保藏 編號：CCTCC NO:M2012230。
[0055] 1. 2豬肺炎支原體生產(chǎn)用種子的制備：
[0056] -級種子的繁殖：凍干菌種（HN0613株，保藏編號為CCTCC No. M2012230)，用液體 培養(yǎng)基稀釋，劃線接種于固體培養(yǎng)基平皿上，置37°C培養(yǎng)7d，選擇生長良好的菌落，接種于 固體培養(yǎng)基斜面上，37°C培養(yǎng)7d，作為一級種子。
[0057] 二級種子的繁殖：取少量液體培養(yǎng)基洗一級種子的斜面培養(yǎng)物，接種于液體培養(yǎng) 基大管中，置37°C培養(yǎng)7d，經(jīng)檢驗純粹后作為二級種子。
[0058] 液體培養(yǎng)基的配方（按1065ml計）：牛心浸出液300ml，ddH20360ml，校正pH值到 7. 4, 121°C滅菌15分鐘。再加入下列過濾除菌的成份：Hank' s平衡鹽溶液（10X)40ml， 0. 25%酚紅10ml豬血清200ml，5%水解乳蛋白100ml，25%酵母浸出液20ml，10000IU/ml青 霉素10ml，1%醋酸鉈溶液25ml。
[0059] 固體培養(yǎng)基的配方：在液體培養(yǎng)基中加入15g Noble Agar即可。
[0060] 1· 3制苗用菌液的制備：
[0061] 將液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的豬肺炎支原體二級種子液以1:10 (ν/ν)接種于液體培養(yǎng)基 中。37°C下培養(yǎng)3?6日，培養(yǎng)物下降0.5個pH值以上，純粹檢驗合格后，再以同樣的方式 擴(kuò)大培養(yǎng)(繼代次不超過6代)。培養(yǎng)結(jié)束后，取樣，進(jìn)行純粹檢驗，應(yīng)純粹。
[0062] 1. 4豬肺炎支原體菌體含量測定：
[0063] 用PCR方法對培養(yǎng)物進(jìn)行計數(shù)。10倍系列稀釋所檢培養(yǎng)物，然后做PCR，PCR檢 出的最低限量為3X 1(Γ3μ g (相當(dāng)于1000個左右的菌體)，按稀釋的倍數(shù)計數(shù)菌體數(shù)(沈青 春，譚青松，王琴，等.PCR方法測定Mhp培養(yǎng)物菌數(shù)[J]，中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2006, 28 (1): 55?57)。培養(yǎng)物含量應(yīng)為1?2X109MHDCE/ml。（MHDCE=豬肺炎支原體DNA細(xì)胞等同物， 即1MHDCE相當(dāng)于1個豬肺炎支原體)。
[0064] 1. 5豬肺炎支原體菌液的滅活與濃縮：
[0065] 將檢驗合格的豬肺炎支原體菌液，按菌液體積總量緩慢加入終濃度為0. 2%的 甲醛溶液（V/V)，放37°C滅活，其間每隔4小時攪拌一次，24小時后取出，進(jìn)行滅活檢驗。 將滅活檢驗合格的豬肺炎支原體菌液采用超濾濃縮技術(shù)進(jìn)行濃縮，濃縮后抗原含量為 10 nMHDCE/ml。
[0066] 2、豬藍(lán)耳病毒抗原制備
[0067] 菌株來源：豬藍(lán)耳病毒CH-1R株，以保藏號CGMCC No. 1883保藏于中國微生物菌種 保藏管理委員會普通微生物中心。
[0068] 將Marcl45或MA104細(xì)胞系經(jīng)EDTA-胰酶消化液分散傳代，以細(xì)胞生長液繼續(xù)培 養(yǎng)，形成致密單層時，備用，用于繼續(xù)傳代或接種病毒。將豬藍(lán)耳病毒CH-1R株病毒液，按 M. 0. I. =0. 001?0. 01的劑量接入已經(jīng)生長成良好細(xì)胞單層的細(xì)胞瓶，進(jìn)一步優(yōu)選接毒劑 量為M. 0. I. =0. 001?0. 005,吸附1小時后，加入細(xì)胞維持液于細(xì)胞系單層，繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng) 70%?80%細(xì)胞出現(xiàn)病變后收獲，收獲的毒液凍融1?2次后置-20°C以下保存，取少量做 半成品檢驗，抗原液病毒含量l〇 8_°TCID5(l/ml，按照國家標(biāo)準(zhǔn)檢驗均符合規(guī)定。
[0069] 3、豬流感病毒抗原制備
[0070] 3. 1菌株來源：
[0071] 豬流感病毒（H1N1亞型)ZJS株和（H3N2亞型)WX株，均在中國典型培養(yǎng)物保藏中心 (簡稱：CCTCC;地址：中國武漢武漢大學(xué)）進(jìn)行保藏，保藏編號分別為CCTCC N0:V201233 和 CCTCC N0:V201234。
[0072] 3. 2豬流感病毒液的制備：
[0073] 將豬流感病毒（H1N1亞型）ZJS株（以下簡稱"SIV H1N1"）和豬流感病毒（H3N2亞 型)WX株("SIV H3N2")毒種分別按病毒感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，M. 0.1.)為 〇. 001的接種量分別接種于長滿單層的MDCK (ATCC CCL-34TM)細(xì)胞上，37°C吸附30分鐘， 加入含有3%體積比的犢牛血清的D-MEM液體培養(yǎng)基(用購自美國Life Technologies公司 的D-MEM干粉培養(yǎng)基按照其說明書配制)，置37°C繼續(xù)培養(yǎng)，每日觀察2次，細(xì)胞生長良好， 72h收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，凍融3次，收獲病毒，并使用PBS將SIV H1N1病毒液稀釋至病毒滴度 為108_°EID5Q/ml，同樣，使用PBS將SIV H3N2病毒液稀釋至病毒滴度為108_°EID5Q/ml。
[0074] 3. 3豬流感病毒液的處理、滅活：
[0075] 將SIV H1N1和SIV H3N2病毒液用中空纖維（0. 5μπι?2μπι)濾柱(購自GE Healthcare Life Sciences)過濾，除去細(xì)胞碎片，再加入0· 2%?0· 3%的甲醒溶液37°C滅 活 18h。
[0076] 實施例2豬支原體肺炎、豬流感和豬藍(lán)耳病三聯(lián)疫苗的制備
[0077] 1、豬支原體肺炎、豬流感滅活疫苗部分的制備
[0078] 1.1稀釋劑的配制
[0079] 無菌的PBS緩沖溶液：在900ml純化水內(nèi)溶解8g氯化鈉、0. 25g氯化鉀、3. 63g磷 酸氫二鈉、0. 24g磷酸二氫鉀，然后定容至1L，121°C高壓滅菌30min備用。
[0080] 1. 2疫苗佐劑處理
[0081] Gel 01佐劑滅菌：將Gel 01佐劑轉(zhuǎn)入可滅菌容器內(nèi)，121°C高壓滅菌30min備用。
[0082] 1. 3 配苗
[0083] 通過無菌操作，將實施例1中制備的濃縮豬肺炎支原體抗原和豬流感病毒抗原 與佐劑、防腐劑、稀釋劑等按照不同配比混合后，用乳化機(jī)低速攪拌30min。滅活疫苗部分 豬肺炎支原體抗原含量為1〇 7_°?2X 101(I_°MHDCE/頭份，豬流感病毒抗原含量為104_°? 107_°EID 5(I/頭份，其中豬肺炎支原體抗原和豬流感病毒抗原在所述滅活疫苗部分的含量為 12% (V/V)〇
[0084] 2、豬藍(lán)耳病活疫苗部分的制備
[0085] 將檢驗合格的豬藍(lán)耳病各收次病毒液，混合于同一容器，與凍干保護(hù)劑（2wt%明 膠水溶液與15wt%乳糖水溶液以1:1 (v/v)比例配制)以1:1 (v/v)比例混合后充分混勻，定 量分裝，迅速進(jìn)行冷凍真空干燥，成品含量為1〇4?106TCID 5(I/頭份。
[0086] 3、三聯(lián)疫苗的制備
[0087] 將實施例1中所制備的各抗原按照表1中各組疫苗的配比進(jìn)行疫苗配制。使用前 取滅活疫苗部分稀釋活疫苗部分。
[0088] 表1各組疫苗配比
[0089]

【權(quán)利要求】
1. 一種疫苗組合物，所述疫苗組合物包括免疫量的豬肺炎支原體抗原、免疫量的豬流 感病毒抗原以及免疫量的豬藍(lán)耳病毒抗原。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其中，所述豬肺炎支原體抗原為滅活形式的豬 肺炎支原體全病原抗原、活的形式的豬肺炎支原體抗原、豬肺炎支原體亞單位抗原、豬肺炎 支原體重組活載體抗原和豬肺炎支原體DNA載體的抗原； 所述豬流感病毒抗原為滅活形式的豬流感病毒全病毒抗原、活的形式的豬流感病毒抗 原、豬流感病毒亞單位抗原、豬流感病毒重組活載體抗原和豬流感病毒DNA載體的抗原；以 及 所述豬藍(lán)耳病毒抗原為滅活形式的豬藍(lán)耳病毒全病毒抗原、活的形式的豬藍(lán)耳病毒抗 原、豬藍(lán)耳病毒亞單位抗原、豬藍(lán)耳病毒重組活載體抗原和豬藍(lán)耳病毒DNA載體的抗原。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的疫苗組合物，其中，所述豬肺炎支原體抗原為滅活形式的豬 肺炎支原體HN0613株全病原抗原；所述豬流感病毒抗原為滅活形式的豬流感病毒（H1N1亞 型）ZJS株和豬流感病毒（H3N2亞型）WX株全病毒抗原；所述豬藍(lán)耳病毒抗原為活的形式的 豬藍(lán)耳病毒CH-1R株全病毒抗原。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物滅活疫苗部分進(jìn)一步包 括佐劑，所述佐劑為水佐劑；所述疫苗組合物活疫苗部分還包括凍干保護(hù)劑。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其中，所述豬肺炎支原體抗原滅活前含量為 1〇8·。?1〇1a〇 MHDCE/頭份；所述豬流感病毒抗原滅活前含量為1〇5·。?l〇7』EID5〇/頭份；所 述豬藍(lán)耳病毒抗原含量為1〇 5_°?106_°TCID5(I/頭份；優(yōu)選地，所述豬肺炎支原體抗原滅活前 含量為10 9_°MHDCE/頭份；所述豬流感病毒抗原滅活前含量為106_°EID5(I/頭份；所述豬藍(lán)耳 病毒抗原含量為10 6_°TCID5(I/頭份。
6. -種制備所述疫苗組合物的方法，所述方法包括如下步驟： (1) 繁殖培養(yǎng)豬肺炎支原體，滅活； (2) 繁殖培養(yǎng)豬流感病毒，滅活； (3) 繁殖培養(yǎng)豬藍(lán)耳病毒； (4) 將所述滅活豬肺炎支原體抗原和豬流感病毒抗原混合，并與所述豬藍(lán)耳活病毒抗 原分開保藏。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1?5任一項所述的疫苗組合物在制備預(yù)防和治療豬呼吸道疾病綜合 征的藥物中的應(yīng)用。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其中，所述豬免疫時為3?4周齡。
9. 一種免疫試劑盒，所述免疫試劑盒包括含所述豬肺炎支原體抗原和豬流感病毒抗原 的抗原組合物以及所述豬藍(lán)耳病毒抗原，其中，含所述豬肺炎支原體抗原和豬流感病毒抗 原的抗原組合物與所述豬藍(lán)耳病毒抗原分開保藏。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的免疫試劑盒，其中，所述豬肺炎支原體抗原、豬流感病毒抗 原為滅活形式的全病原抗原，所述豬藍(lán)耳病毒抗原為活的形式的全病毒抗原。
【文檔編號】A61P31/04GK104248759SQ201310589600
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2013年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月19日
【發(fā)明者】張許科, 孫進(jìn)忠, 田克恭 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司