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      一種膽石通利片的制備方法及其在制備抑制腹水瘤細(xì)胞sac-ⅱc3細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用的制作方法

      文檔序號:1273080閱讀:219來源:國知局
      一種膽石通利片的制備方法及其在制備抑制腹水瘤細(xì)胞sac-ⅱc3細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用的制作方法
      【專利摘要】本發(fā)明屬于中藥【技術(shù)領(lǐng)域】,具體涉及一種膽石通利片的制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明的膽石通利片的制備方法,由金錢草225g、茵陳225g、郁金90g、陳皮150g、黃芩45g、乳香35g、芒硝80g、白礬35g、大黃45g、三棱45g、梔子45g、甘草25g、沒藥35g作為原料藥制成,采用超微粉碎、超臨界萃取、微波萃取和大孔樹脂吸附制備而成,使得橙皮苷含量有很大提高。本發(fā)明還提供了膽石通利片在制備抑制小鼠腹水瘤細(xì)胞SAC-ⅡC3細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
      【專利說明】一種膽石通利片的制備方法及其在制備抑制腹水瘤細(xì)胞SAC-1I C3細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用
      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001]本發(fā)明屬于中藥【技術(shù)領(lǐng)域】,具體涉及一種膽石通利片的制備方法及其在制備抑制小鼠腹水瘤細(xì)胞SAC-1I C3細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
      【背景技術(shù)】
      [0002]膽石通利膠囊標(biāo)準(zhǔn)號WS-10324 (ZD-0324) -2002,記載于國家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編內(nèi)科肝膽分冊。由金錢草225g、茵陳225g、郁金90g、陳皮150g、黃芩45g、乳香35g、芒硝80g、白帆35g、大黃45g、三棱45g、桅子45g、甘草25g、沒藥35g作為原料藥制成,具有清熱利膽,化瘀排石的功效。用于肝膽濕熱所致的急、慢性膽囊炎,膽結(jié)石等。
      [0003]現(xiàn)有技術(shù)中,尚未有膽石通利膠囊在提取制備方面采用超微粉碎、CO2超臨界萃取、微波技術(shù)和大孔樹脂吸附技術(shù)提取的報(bào)道,而中藥直接打粉取、水煎煮的方法,工藝粗糙、落后,雜質(zhì)多,導(dǎo)致患者用量過大,不方便服用,嚴(yán)重影響了本品在臨床上應(yīng)用。

      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0004]為了解決上述的技術(shù)問題,本發(fā)明提供了一種膽石通利片的制備方法。
      [0005]本發(fā)明的另一個目的在于提供一種膽石通利片在制備抑制小鼠腹水瘤細(xì)胞SAC-1I C3細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。 [0006]本發(fā)明的目的是通過如下的方案實(shí)現(xiàn)的:
      [0007]—種膽石通利片的制備方法,由金錢草225g、茵陳225g、郁金90g、陳皮150g、黃岑45g、乳香35g、芒硝80g、白帆35g、大黃45g、三棱45g、桅子45g、甘草25g、沒藥35g作為原料藥制成,所述的制備方法由下列步驟組成:芒硝、白帆超微粉碎成粒度范圍5-45 μ m的細(xì)粉備用;取乳香、沒藥,粉碎成細(xì)粉,加入到CO2超臨界萃取器中,乙醇作為夾帶劑,夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%,萃取壓力15-30MPa,溫度30_50°C,CO2流量l_3ml/g生藥.min,萃取時間180-220min,得超臨界萃取物,備用;萃取后的乳香、沒藥殘洛與其他九味藥材,粉碎,加入3.6L的70%乙醇,投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取,萃取功率600-800W,萃取2次,每次5-10分鐘,合并萃取液,濃縮,加到Diaion HP-10大孔吸附樹脂柱上,70%乙醇洗脫,收集5倍量柱體積洗脫液,減壓回收乙醇,濃縮并干燥,得微波提取物,將超微粉碎后的芒硝、白礬、超臨界萃取物、微波提取物混合加入淀粉,70%乙醇制顆粒,干燥,壓片,制成500片,每片重0.3g。
      [0008]上述的膽石通利片的制備方法中,所述C02超臨界萃取中夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。
      [0009]上述的膽石通利片的制備方法中,所述CO2超臨界萃取中萃取壓力為25MPa。
      [0010]上述的膽石通利片的制備方法中,所述CO2超臨界萃取中萃取溫度為60°C。
      [0011]上述的膽石通利片的制備方法中,所述CO2超臨界萃取中CCV流量2ml/g生藥.min。[0012]上述的膽石通利片的制備方法中,所述CO2超臨界萃取中萃取時間為200min。
      [0013]上述的膽石通利片的制備方法中,所述微波萃取功率為700W。
      [0014]上述的膽石通利片的制備方法中,所述微波萃取每次萃取時間為8分鐘。
      [0015]上述的膽石通利片在制備抑制小鼠腹水瘤細(xì)胞SAC-1I C3細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
      [0016]現(xiàn)有技術(shù)中,膽石通利膠囊口服,一次5粒,一日3次。膽石通利膠囊服藥量大。采用本發(fā)明方法制備成的膽石通利片每片重0.3g,每次僅需2片,一日服用3次。在具有更多活性成分的條件下大大減少了服用量。此結(jié)論可以通過下述試驗(yàn)證明。
      [0017]試驗(yàn)一、不同方法制備的膽石通利片中橙皮苷含量的比較
      [0018]1、儀器及試藥本發(fā)明膽石通利片:按實(shí)施例1方法制備,使用IOSOg原料藥,經(jīng)提取制成500片,每片重0.3g。原膽石通利膠囊,按照WS-10324 (ZD-0324) -2002標(biāo)準(zhǔn)方法制備,作為對照。Agilentl200高效液相色譜儀;AE240電子分析天平;橙皮苷對照品(中國藥品生物制品檢定所)。
      [0019]2、方法
      [0020]照高效液相色譜法(中國藥典2010年版一部附錄V D)測定。
      [0021]色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用十八烷基硅烷健合硅膠為填充劑;甲醇一水(40: 60)為流動相;檢測波長為284nm;理論板數(shù)按橙皮苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。
      ·[0022]對照品溶液的制備精密稱取橙皮苷對照品適量,加甲醇制成每Iml含38μ g的溶液,即得。
      [0023]本發(fā)明產(chǎn)品供試品溶液的制備取本發(fā)明的膽石通利片,研細(xì),取0.06g,,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入稀乙醇25ml,稱定重量,密塞,超聲處理(功率250w,頻率30kHz)40分鐘,放冷,稱定重量,并用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。
      [0024]對照品供試品溶液的制備取本對照的膽石通利膠囊,混勻,研細(xì),取0.15g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入稀乙醇25ml,稱定重量,密塞,超聲處理(功率250w,頻率30kHz)40分鐘,放冷,稱定重量,并用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。
      [0025]測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μ 1,注入液相色譜儀,測定,即得。
      [0026]3、結(jié)果
      [0027]結(jié)果表明,本發(fā)明膽石通利片中橙皮苷的含量為6-10mg/片;而原膽石通利膠囊中橙皮苷的含量為1.45mg/粒,每片橙皮苷含量相當(dāng)于原膠囊劑含量的4-6倍,在服用量減少的情況下,橙皮苷含量有很大提高。
      [0028]上述研究表明,采用本發(fā)明制備方法制備的膽石通利片,有效成分含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于WS-10324 (ZD-0324) -2002標(biāo)準(zhǔn)記載的方法制備的膽石通利膠囊。
      【具體實(shí)施方式】
      [0029]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作更進(jìn)一步的說明,以便本領(lǐng)域的技術(shù)人員更了解本發(fā)明,但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例,凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
      [0030]實(shí)施例1[0031]取金錢草225g、茵陳225g、郁金90g、陳皮150g、黃芩45g、乳香35g、芒硝80g、白礬35g、大黃45g、三棱45g、桅子45g、甘草25g、沒藥35g:將芒硝、白礬超微粉碎成粒度范圍5-45 μ m的細(xì)粉備用;取乳香、沒藥,粉碎成細(xì)粉,加入到CO2超臨界萃取器中,乙醇作為夾帶劑,夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%,萃取壓力25MPa,溫度40°C,CO2流量2ml/g生藥.min,萃取時間200min,得超臨界萃取物,備用;萃取后的乳香、沒藥殘?jiān)c其他九味藥材,粉碎,加入3.6L的70%乙醇,投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取,萃取功率700W,萃取2次,每次8分鐘,合并萃取液,濃縮,加到Diaion HP-1O大孔吸附樹脂柱上,70%乙醇洗脫,收集5倍量柱體積洗脫液,減壓回收乙醇,濃縮并干燥,得微波提取物,將超微粉碎后的芒硝、白礬、超臨界萃取物、微波提取物混合加入淀粉,70%乙醇制顆粒,干燥,壓片,制成500片,每片重0.3g。
      [0032]經(jīng)檢測,成品中橙皮苷的含量為9.86mg/片。 [0033]實(shí)施例2
      [0034]取金錢草225g、茵陳225g、郁金90g、陳皮150g、黃芩45g、乳香35g、芒硝80g、白礬35g、大黃45g、三棱45g、桅子45g、甘草25g、沒藥35g:將芒硝、白礬超微粉碎成粒度范圍5-45 μ m的細(xì)粉備用;取乳香、沒藥,粉碎成細(xì)粉,加入到CO2超臨界萃取器中,乙醇作為夾帶劑,夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4%,萃取壓力30MPa,溫度50°C,CO2流量3ml/g生藥.π?η,萃取時間180min,得超臨界萃取物,備用;萃取后的乳香、沒藥殘?jiān)c其他九味藥材,粉碎,加入3.6L的70%乙醇,投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取,萃取功率600W,萃取2次,每次8分鐘,合并萃取液,濃縮,加到Diaion HP-1O大孔吸附樹脂柱上,70%乙醇洗脫,收集5倍量柱體積洗脫液,減壓回收乙醇,濃縮并干燥,得微波提取物,將超微粉碎后的芒硝、白礬、超臨界萃取物、微波提取物混合加入淀粉,70%乙醇制顆粒,干燥,壓片,制成500片,每片重0.3g。
      [0035]經(jīng)檢測,成品中橙皮苷的含量為6.42mg/片。
      [0036]實(shí)施例3
      [0037]取金錢草225g、茵陳225g、郁金90g、陳皮150g、黃芩45g、乳香35g、芒硝80g、白礬35g、大黃45g、三棱45g、桅子45g、甘草25g、沒藥35g:將芒硝、白礬超微粉碎成粒度范圍5-45 μ m的細(xì)粉備用;取乳香、沒藥,粉碎成細(xì)粉,加入到C02超臨界萃取器中,乙醇作為夾帶劑,夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為6%,萃取壓力15MPa,溫度30°C,C02流量lml/g生藥.min,萃取時間220min,得超臨界萃取物,備用;萃取后的乳香、沒藥殘?jiān)c其他九味藥材,粉碎,加入3.6L的70%乙醇,投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取,萃取功率800W,萃取2次,每次10分鐘,合并萃取液,濃縮,加到Diaion HP-1O大孔吸附樹脂柱上,70%乙醇洗脫,收集5倍量柱體積洗脫液,減壓回收乙醇,濃縮并干燥,得微波提取物,將超微粉碎后的芒硝、白礬、超臨界萃取物、微波提取物混合加入淀粉,70%乙醇制顆粒,干燥,壓片,制成500片,每片重0.3g。
      [0038]經(jīng)檢測,成品中橙皮苷的含量為8.26mg/片。
      [0039]實(shí)施例4:膽石通利片抑制小鼠腹水瘤細(xì)胞SAC-1I C3細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究資料
      [0040]1.實(shí)驗(yàn)材料
      [0041]1.1實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞株
      [0042]小鼠腹水瘤細(xì)胞SAC-1I C3細(xì)胞,山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫,DMEM+10%FBS常規(guī)培養(yǎng)。
      [0043]1.2實(shí)驗(yàn)藥物
      [0044]研究藥物:本發(fā)明膽石通利片:按實(shí)施例1方法制備。
      [0045]藥液儲液:稱取IOOmg膽石通利片,溶于5ml無水乙醇中,0.2 μ m濾器過濾,500 μ Idoff管分裝,-20°c存儲,同時0.2 μ m濾器過濾無水乙醇以備對照組之用。
      [0046]1.3實(shí)驗(yàn)試劑
      [0047]DMEM(GIBC0 公司 Cat.N0.12100_061Lot.N0.758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司Lot.N0.100419) ;NaHC03(上海久億化學(xué)試劑有限公司Cat.N0.11810_033Lot.N0.1088387) ;Trypsin (AMRESC0 公司);EDTA (AMRESC0 公司);Penicillin G Sodium Salt(AMRESCO公司I) !Streptomycin Sulfate(AMRESCO);無水乙醇(溜博亞杜蘭經(jīng)貿(mào)有限公司);MTT (Biosharp 批號:0793) =PBS (實(shí)驗(yàn)室自配);
      [0048]1.4實(shí)驗(yàn)器材
      [0049]萊卡倒置顯微鏡(德國Leica型號:DMIL);可見-紫外光微孔板檢測儀(美國MD公司型號:SPECTRAMAX190);C02培養(yǎng)箱(F0RMA型號:3111);超凈臺(蘇凈集團(tuán)安泰公司制造型號=SW-CJ-ZFD);純水儀(美國Spring公司型號:S/N020579);精密移液器(法國吉爾森公司型號:P2);電子天平(德國賽多利斯有限公司型號:BT323S);全自動高壓滅菌鍋(日本SANYO公司型號:MLS-3020);臺式電 熱鼓風(fēng)干燥箱(上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司型號:DHG9123A);冰箱(西門子公司型號:KG18V21TI);液氮罐(CBS型號:2001);低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠型號:ΚΑ-1000);0.2μπι 濾器(MILLIP0RE 型號:SLGP033RB);Icm 培養(yǎng)皿(NEST 公司)、96孔培養(yǎng)板(NEST公司);細(xì)胞計(jì)數(shù)板;離心管、移液管、Tips若干。
      [0050]2.實(shí)驗(yàn)方法
      [0051]I) SAC-1I C3 細(xì)胞用 DMEM+10%FBS 于 37°C、5%C02 進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)(10cm 培養(yǎng)皿),當(dāng)細(xì)胞生長至對數(shù)期時,收集細(xì)胞,棄去培養(yǎng)液,PBS輕洗3遍,加入3ml0.25%胰蛋白酶-0.049ffiDTA,37°C消化2min后,向其中加入5ml完全培養(yǎng)基中和反應(yīng),吹打細(xì)胞后將其轉(zhuǎn)入離心管中,1000rpm離心5min,調(diào)整細(xì)胞懸液濃度3X IO4個/ml。
      [0052]2)將細(xì)胞種入96孔培養(yǎng)板中,每孔加入細(xì)胞懸液180 μ 1,培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中(37°C,5%C02)常規(guī)培養(yǎng)。
      [0053]3)根據(jù)細(xì)胞生長情況,一般長至50%_70%,加入膽石通利片溶液,繼續(xù)培養(yǎng)24h。
      [0054]4) 24h 后加入 20 μ I MTT 溶液(5mg/ml,即 0.5%MTT),繼續(xù)培養(yǎng) 4h。
      [0055]5) 4h后扣板法倒去上清,用吸水紙輕輕拍干,每孔如入200 μ I 二甲基亞砜,置搖床上低速振蕩lOmin,使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490nm處測量各孔的吸光值。
      [0056]6)同時設(shè)置本底(不加細(xì)胞,只加培養(yǎng)液),對照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜),每組設(shè)定6個復(fù)孔。
      [0057]7)結(jié)果以藥物對細(xì)胞的抑制率表示:細(xì)胞增值抑制率(%)=(對照孔OD值-給藥孔OD值)、對照孔OD值X 100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
      [0058]3.統(tǒng)計(jì)處理
      [0059]采用Microsoft Excel2007軟件中的相關(guān)分析和Student t檢驗(yàn),數(shù)據(jù)以mean+ S.D.表不。
      [0060]4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果[0061]MTT法實(shí)驗(yàn)后統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,與對照組比較,當(dāng)劑量達(dá)到5mg/ml時,對SAC-1I C3細(xì)胞增殖抑制有差異(p〈0.05),劑量在10mg/ml時該差異具有顯著性(P〈0.01),當(dāng)劑量達(dá)到15-20mg/ml時有極顯著性差異(Ρ〈0.001)。
      [0062]表1膽石通利片對SAC-1I C3細(xì)胞增殖抑制影響研究(X土 SD)
      [0063]
      【權(quán)利要求】
      1.一種膽石通利片的制備方法,由金錢草225g、茵陳225g、郁金90g、陳皮150g、黃芩45g、乳香35g、芒硝80g、白礬35g、大黃45g、三棱45g、桅子45g、甘草25g、沒藥35g作為原料藥制成,其特征在于,所述的制備方法由下列步驟組成:芒硝、白礬超微粉碎成粒度范圍5-45 μ m的細(xì)粉備用;取乳香、沒藥,粉碎成細(xì)粉,加入到CO2超臨界萃取器中,乙醇作為夾帶劑,夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%,萃取壓力15-30MPa,溫度30_501:,0)2流量l-3ml/g生藥.min,萃取時間180_220min,得超臨界萃取物,備用;萃取后的乳香、沒藥殘?jiān)c其他九味藥材,粉碎,加入3.6L的70%乙醇,投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取,萃取功率600-800W,萃取2次,每次5-10分鐘,合并萃取液,濃縮,加到Diaion HP-1O大孔吸附樹脂柱上,70%乙醇洗脫,收集5倍量柱體積洗脫液,減壓回收乙醇,濃縮并干燥,得微波提取物,將超微粉碎后的芒硝、白礬、超臨界萃取物、微波提取物混合加入淀粉,70%乙醇制顆粒,干燥,壓片,制成500片,每片重0.3g。
      2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膽石通利片的制備方法,其特征在于,所述CO2超臨界萃取中夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。
      3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膽石通利片的制備方法,其特征在于,所述CO2超臨界萃取中萃取壓力為25MPa。
      4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膽石通利片的制備方法,其特征在于,所述CO2超臨界萃取中萃取溫度為60°C。
      5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膽石通利片的制備方法,其特征在于,所述CO2超臨界萃取中CO2 流量 2ml/g 生藥.min。
      6.據(jù)權(quán)利要求1所述的膽石通利片的制備方法,其特征在于,所述CO2超臨界萃取中萃取時間為200min。
      7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膽石通利片`的制備方法,其特征在于,所述微波萃取功率為700W。
      8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膽石通利片的制備方法,其特征在于,所述微波萃取每次萃取時間為8分鐘。
      9.權(quán)利要求1所述的膽石通利片在制備抑制小鼠腹水瘤細(xì)胞SAC-1I C3細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
      【文檔編號】A61P35/00GK103784872SQ201310671277
      【公開日】2014年5月14日 申請日期:2013年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月10日
      【發(fā)明者】孫波 申請人:濟(jì)南新起點(diǎn)醫(yī)藥科技有限公司
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