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      鐵帚清濁片在制備抑制肝癌細(xì)胞h22細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用的制作方法

      文檔序號(hào):1276468閱讀:278來(lái)源:國(guó)知局
      鐵帚清濁片在制備抑制肝癌細(xì)胞h22細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用的制作方法
      【專利摘要】本發(fā)明屬于中藥【技術(shù)領(lǐng)域】,具體涉及一種鐵帚清濁片在制備抑制肝癌細(xì)胞H22細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用及鐵帚清濁片的制備方法。本發(fā)明的鐵帚清濁片在制備抑制肝癌細(xì)胞H22細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用,所述鐵帚清濁片由豬殃殃417g、鐵掃帚417g、粉萆薢333g、魚腥草417g、蒲公英417g、黑螞蟻250g、預(yù)知子417g、車前子250g、茯苓250g、山藥250g、益智167g、菟絲子250g、沙苑子250g、金櫻根333g、遠(yuǎn)志125g、甘草50g作為原料藥制成,采用超臨界萃取和微波萃取制備而成,使得薯蕷皂苷元含量有很大提高。
      【專利說(shuō)明】鐵帚清濁片在制備抑制肝癌細(xì)胞H22細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用
      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001]本發(fā)明屬于中藥【技術(shù)領(lǐng)域】,具體涉及一種鐵帚清濁片在制備抑制肝癌細(xì)胞H22細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用及鐵帚清濁片的制備方法。
      【背景技術(shù)】
      [0002]鐵帚清濁丸標(biāo)準(zhǔn)號(hào)WS-10190 (ZD-0190) 2002,記載于國(guó)家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編內(nèi)科外科婦科分冊(cè)。由豬殃殃417g、鐵掃帚417g、粉萆蘚333g、魚腥草417g、蒲公英417g、黑螞蟻250g、預(yù)知子417g、車前子250g、獲茶250g、山藥250g、益智167g、英絲子250g、沙苑子250g、金樓根333g、遠(yuǎn)志125g、甘草50g作為原料藥制成,具有清熱解毒、利濕去池的功效。用于慢性前列腺炎下焦?jié)駸嶙C。
      [0003]現(xiàn)有技術(shù)中,尚未有鐵帚清濁丸在在制備抑制肝癌細(xì)胞H22細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用的報(bào)道,也未見(jiàn)有鐵帚清濁丸提取制備方面采用超臨界和微波技術(shù)的報(bào)道,而直接粉碎、滲漉、揮發(fā)油提取,水煎煮的方法,工藝粗糙、落后,雜質(zhì)多,導(dǎo)致患者用量過(guò)大,不方便服用,嚴(yán)重影響了本品在臨床上應(yīng)用。

      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0004]發(fā)明目的:本發(fā)明的目的在于提供一種鐵帚清濁片在制備抑制肝癌細(xì)胞H22細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
      [0005]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種鐵帚清濁片的制備方法。
      [0006]本發(fā)明的目的是通過(guò)如下的方案實(shí)現(xiàn)的:
      [0007]鐵帚清濁片在制備抑制肝癌細(xì)胞H22細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用,所述鐵帚清濁片由豬殃殃417g、鐵掃帚417g、粉萆蘚333g、魚腥草417g、蒲公英417g、黑螞蟻250g、預(yù)知子417g、車前子250g、獲茶250g、山藥250g、益智167g、英絲子250g、沙苑子250g、金樓根333g、遠(yuǎn)志125g、甘草50g作為原料藥制成,所述鐵帚清池片的制備方法由下列步驟組成:取鐵掃帚、黑螞蟻、魚腥草、益智,加入到CO2超臨界萃取器中,乙醇作為夾帶劑,夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%,萃取壓力15-30MPa,溫度30_50°C,CO2流量l_3ml/g生藥.min,萃取時(shí)間330-370min,得超臨界萃取物,備用;取其余中藥,粉碎成粗粉,加入15L的60%乙醇,投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取,萃取功率600-800W,萃取2次,每次15-25分鐘,合并萃取液,濃縮,加到Diaion HP-10大孔吸附樹(shù)脂柱上,50%乙醇洗脫,收集5倍量柱體積洗脫液,減壓回收乙醇,濃縮并干燥,得微波提取物,備用;將上述超臨界萃取物和微波提取物混合,加入淀粉,70%乙醇制顆粒,干燥,壓片,制成500片,每片重0.5g。
      [0008]優(yōu)選的,上述的鐵帚清濁片在制備抑制肝癌細(xì)胞H22細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用,其特征在于,所述鐵帚清濁片的制備方法由下列步驟組成:取鐵掃帚、黑螞蟻、魚腥草、益智,加入到CO2超臨界萃取器中,乙醇作為夾帶劑,夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%,萃取壓力25MPa,溫度40°C,CO2流量5ml/g生藥.π?η,萃取時(shí)間350min,得超臨界萃取物,備用;取其余中藥,粉碎成粗粉,加入15L的30%乙醇,投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取,萃取功率700W,萃取2次,每次20分鐘,合并萃取液,濃縮,加到Diaion HP-1O大孔吸附樹(shù)脂柱上,50%乙醇洗脫,收集5倍量柱體積洗脫液,減壓回收乙醇,濃縮并干燥,得微波提取物,備用;將上述超臨界萃取物和微波提取物混合,加入淀粉,70%乙醇制顆粒,干燥,壓片,制成500片,每片重0.5g。
      [0009]現(xiàn)有技術(shù)中,鐵帚清濁丸每次6g,一日3次。鐵帚清濁丸服藥量大,且丸劑味道不好,患者依從性差。采用本發(fā)明方法制備成的鐵帚清濁片每片重0.5g,每次僅需3片,一日服用3次。在具有更多活性成分的條件下大大減少了服用量。此結(jié)論可以通過(guò)下述試驗(yàn)證明。且制備成片劑,患者隨水吞下即可,服藥量小且無(wú)苦味,患者易于接受。
      [0010]試驗(yàn)一、不同方法制備的鐵帚清濁片中薯蕷皂苷元含量的比較
      [0011]1、儀器及試藥本發(fā)明鐵帚清濁片:按實(shí)施例1方法制備,使用4785g原料藥,經(jīng)提取制成500片,每片重0.5g。原鐵帚清濁丸,按照WS-10190(ZD-0190)2002標(biāo)準(zhǔn)方法制備。Agilentl200高效液相色譜儀;METTLER AE240電子分析天平;薯蕷皂苷元對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)。
      [0012]2、方法
      [0013]照高效液相色譜法(中國(guó)藥典2010年版一部附錄VI D)測(cè)定。
      [0014]色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;甲醇一乙腈(60:40)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)為206nm。理論板數(shù)按薯蕷皂苷元峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。
      [0015]對(duì)照品溶液的制備精密稱取在60°C減壓干燥4小時(shí)的薯蕷皂苷元對(duì)照品適量,加甲醇制成每Iml含0.15mg的溶液,即得。
      [0016]供試品溶液的制備取本品20片,研細(xì),取0.25g,精密稱定,置50ml圓底燒瓶中,加2mol/L硫酸溶液30ml,加熱回流2小時(shí),取出,冷卻,濾過(guò),用適量水洗滌容器及濾渣,濾洛烘干(70~80°C ),用氯仿加熱回流3次(20ml、15ml、15ml),每次15分鐘,濾過(guò),合并濾液,揮干氯仿,殘?jiān)恿鲃?dòng)相適量使溶解,轉(zhuǎn)移至IOml量瓶中,加流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,用微孔濾膜(0.45 μ m)濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。
      [0017]對(duì)照產(chǎn)品供試品溶液的制備取本品10g,精密稱定,研細(xì),取0.50g,精密稱定,置50ml圓底燒瓶中,加2mol/L硫酸溶液30ml,加熱回流2小時(shí),取出,冷卻,濾過(guò),用適量水洗滌容器及濾渣,濾渣烘干(70~80°C),用氯仿加熱回流3次(20ml、15ml、15ml),每次15分鐘,濾過(guò),合并濾液,揮干氯仿,殘?jiān)恿鲃?dòng)相適量使溶解,轉(zhuǎn)移至IOml量瓶中,加流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,用微孔濾膜(0.45 μ m)濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。
      [0018]含粉萆蘚以薯蕷皂苷元(C27H42O3)計(jì),不得少于0.030mg。
      [0019]3、結(jié)果
      [0020]結(jié)果表明,本發(fā)明鐵帚清濁片中薯蕷皂苷元的含量為1.2-2.4mg/片;而原鐵帚清濁丸中薯蕷皂苷元的含量為0.32mg/g,每次服`用量3片的薯蕷皂苷元含量為原丸劑IOg含量的4-8倍,在服用量減少的情況下,薯蕷皂苷元含量有很大提高。
      [0021]上述研究表明,采用本發(fā)明制備方法制備的鐵帚清濁片,有效成分含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于WS-10190 (ZD-0190) 2002標(biāo)準(zhǔn)記載的方法制備的鐵帚清濁丸。
      【具體實(shí)施方式】[0022]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作更進(jìn)一步的說(shuō)明,以便本領(lǐng)域的技術(shù)人員更了解本發(fā)明,但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例,凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
      [0023]實(shí)施例1
      [0024]取豬殃殃417g、鐵掃帚417g、粉萆蘚333g、魚腥草417g、蒲公英417g、黑螞蟻250g、預(yù)知子417g、車前子250g、獲茶250g、山藥250g、益智167g、英絲子250g、沙苑子250g、金櫻根333g、遠(yuǎn)志125g、甘草50g,將鐵掃帚、黑螞蟻、魚腥草、益智,加入到CO2超臨界萃取器中,乙醇作為夾帶劑,夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%,萃取壓力25MPa,溫度40°C,CO2流量5ml/g生藥.min,萃取時(shí)間350min,得超臨界萃取物,備用;取其余中藥,粉碎成粗粉,加入15L的30%乙醇,投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取,萃取功率700W,萃取2次,每次20分鐘,合并萃取液,濃縮,加到Diaion HP-10大孔吸附樹(shù)脂柱上,50%乙醇洗脫,收集5倍量柱體積洗脫液,減壓回收乙醇,濃縮并干燥,得微波提取物,備用;將上述超臨界萃取物和微波提取物混合,加入淀粉,70%乙醇制顆粒,干燥,壓片,制成500片,每片重0.5g。 [0025]經(jīng)檢測(cè),成品中薯蕷皂苷元的含量為2.38mg/片。
      [0026]實(shí)施例2
      [0027]取豬殃殃417g、鐵掃帚417g、粉萆蘚333g、魚腥草417g、蒲公英417g、黑螞蟻250g、預(yù)知子417g、車前子250g、獲茶250g、山藥250g、益智167g、英絲子250g、沙苑子250g、金櫻根333g、遠(yuǎn)志125g、甘草50g,將鐵掃帚、黑螞蟻、魚腥草、益智,加入到CO2超臨界萃取器中,乙醇作為夾帶劑,夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4%,萃取壓力15MPa,溫度30°C,CO2流量lml/g生藥.min,萃取時(shí)間370min,得超臨界萃取物,備用;取其余中藥,粉碎成粗粉,加入15L的60%乙醇,投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取,萃取功率600W,萃取2次,每次15分鐘,合并萃取液,濃縮,加到Diaion HP-10大孔吸附樹(shù)脂柱上,50%乙醇洗脫,收集5倍量柱體積洗脫液,減壓回收乙醇,濃縮并干燥,得微波提取物,備用;將上述超臨界萃取物和微波提取物混合,加入淀粉,70%乙醇制顆粒,干燥,壓片,制成500片,每片重0.5g。
      [0028]經(jīng)檢測(cè),成品中薯蕷皂苷元的含量為1.27mg/片。
      [0029]實(shí)施例3
      [0030]取豬殃殃417g、鐵掃帚417g、粉萆蘚333g、魚腥草417g、蒲公英417g、黑螞蟻250g、預(yù)知子417g、車前子250g、獲茶250g、山藥250g、益智167g、英絲子250g、沙苑子250g、金櫻根333g、遠(yuǎn)志125g、甘草50g,將鐵掃帚、黑螞蟻、魚腥草、益智,加入到CO2超臨界萃取器中,乙醇作為夾帶劑,夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為6%,萃取壓力30MPa,溫度50°C,CO2流量3ml/g生藥.min,萃取時(shí)間3300min,得超臨界萃取物,備用;取其余中藥,粉碎成粗粉,加入15L的60%乙醇,投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取,萃取功率800W,萃取2次,每次25分鐘,合并萃取液,濃縮,加到Diaion HP-10大孔吸附樹(shù)脂柱上,50%乙醇洗脫,收集5倍量柱體積洗脫液,減壓回收乙醇,濃縮并干燥,得微波提取物,備用;將上述超臨界萃取物和微波提取物混合,加入淀粉,70%乙醇制顆粒,干燥,壓片,制成500片,每片重 0.5g。
      [0031]經(jīng)檢測(cè),成品中薯蕷皂苷元的含量為1.84mg/片。[0032]實(shí)施例4:鐵帚清濁片抑制小鼠肝癌細(xì)胞H22細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究資料
      [0033]1.實(shí)驗(yàn)材料
      [0034]1.1實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞株
      [0035]小鼠肝癌細(xì)胞H22細(xì)胞,山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫(kù),DMEM+10%FBS常規(guī)培養(yǎng)。
      [0036]1.2實(shí)驗(yàn)藥物
      [0037]研究藥物:本發(fā)明鐵帚清濁片:按實(shí)施例1方法制備。
      [0038]藥液儲(chǔ)液:稱取IOOmg鐵帚清池片,溶于5ml無(wú)水乙醇中,0.2 μ m濾器過(guò)濾,500 μ Idoff管分裝,-20°c存儲(chǔ),同時(shí)0.2 μ m濾器過(guò)濾無(wú)水乙醇以備對(duì)照組之用。[0039]1.3實(shí)驗(yàn)試劑
      [0040]DMEM(GIBC0 公司 Cat.N0.12100_061Lot.N0.758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司Lot.N0.100419) ;NaHC03(上海久億化學(xué)試劑有限公司Cat.N0.11810_033Lot.N0.1088387) ;Trypsin (AMRESC0 公司);EDTA (AMRESC0 公司);Penicillin G Sodium Salt(AMRESCO公司I) !Streptomycin Sulfate(AMRESCO);無(wú)水乙醇(溜博亞杜蘭經(jīng)貿(mào)有限公司);MTT (Biosharp 批號(hào):0793) =PBS (實(shí)驗(yàn)室自配);
      [0041]1.4實(shí)驗(yàn)器材
      [0042]萊卡倒置顯微鏡(德國(guó)Leica型號(hào):DMIL);可見(jiàn)-紫外光微孔板檢測(cè)儀(美國(guó)MD公司型號(hào):SPECTRAMAX190);C02培養(yǎng)箱(F0RMA型號(hào):3111);超凈臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司制造型號(hào)=SW-CJ-ZFD);純水儀(美國(guó)Spring公司型號(hào):S/N020579);精密移液器(法國(guó)吉爾森公司型號(hào):P2);電子天平(德國(guó)賽多利斯有限公司型號(hào):BT323S);全自動(dòng)高壓滅菌鍋(日本SANYO公司型號(hào):MLS-3020);臺(tái)式電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司型號(hào):DHG9123A);冰箱(西門子公司型號(hào):KG18V21TI);液氮罐(CBS型號(hào):2001);低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠型號(hào):ΚΑ-1000);0.2μπι濾器(MILLIP0RE 型號(hào):SLGP033RB);lcm 培養(yǎng)皿(NEST 公司)、96孔培養(yǎng)板(NEST公司);細(xì)胞計(jì)數(shù)板;離心管、移液管、Tips若干。
      [0043]2.實(shí)驗(yàn)方法
      [0044]I) H22細(xì)胞用DMEM+10%FBS于37°C、5%C02進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)(IOcm培養(yǎng)皿),當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí),收集細(xì)胞,棄去培養(yǎng)液,PBS輕洗3遍,加入3ml0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA,37°C消化2min后,向其中加入5ml完全培養(yǎng)基中和反應(yīng),吹打細(xì)胞后將其轉(zhuǎn)入離心管中,1000rpm離心5min,調(diào)整細(xì)胞懸液濃度3X IO4個(gè)/ml。
      [0045]2)將細(xì)胞種入96孔培養(yǎng)板中,每孔加入細(xì)胞懸液180 μ 1,培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中(37°C,5%C02)常規(guī)培養(yǎng)。
      [0046]3)根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況,一般長(zhǎng)至50%_70%,加入鐵帚清濁片溶液,繼續(xù)培養(yǎng)24h。
      [0047]4) 24h 后加入 20 μ I MTT 溶液(5mg/ml,即 0.5%MTT),繼續(xù)培養(yǎng) 4h。
      [0048]5) 4h后扣板法倒去上清,用吸水紙輕輕拍干,每孔如入200 μ I 二甲基亞砜,置搖床上低速振蕩lOmin,使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490nm處測(cè)量各孔的吸光值。
      [0049]6)同時(shí)設(shè)置本底(不加細(xì)胞,只加培養(yǎng)液),對(duì)照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜),每組設(shè)定6個(gè)復(fù)孔。
      [0050]7)結(jié)果以藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率表示:細(xì)胞增值抑制率(%)=(對(duì)照孔OD值-給藥孔OD值)、對(duì)照孔OD值X 100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
      [0051]3.統(tǒng)計(jì)處理[0052]采用Microsoft Excel2007軟件中的相關(guān)分析和Student t檢驗(yàn),數(shù)據(jù)以mean± S.D.表不。
      [0053]4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
      [0054]MTT法實(shí)驗(yàn)后統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,當(dāng)劑量達(dá)到5mg/ml時(shí),對(duì)H22細(xì)胞增殖抑制有差異(p〈0.05),劑量在10mg/ml時(shí)該差異具有顯著性(P〈0.01),當(dāng)劑量達(dá)到15-20mg/ml時(shí)有極顯著性差異(P〈0.001)。
      [0055]表1鐵帚清濁片對(duì)H22細(xì)胞增殖抑制影響研究(X土 SD)
      [0056]
      【權(quán)利要求】
      1.鐵帚清濁片在制備抑制肝癌細(xì)胞H22細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用,所述鐵帚清濁片由豬殃殃417g、鐵掃帚417g、粉萆蘚333g、魚腥草417g、蒲公英417g、黑螞蟻250g、預(yù)知子417g、車前子250g、獲茶250g、山藥250g、益智167g、英絲子250g、沙苑子250g、金樓根333g、遠(yuǎn)志125g、甘草50g作為原料藥制成,其特征在于,所述鐵帚清濁片的制備方法由下列步驟組成:取鐵掃帚、黑螞蟻、魚腥草、益智,加入到CO2超臨界萃取器中,乙醇作為夾帶劑,夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%,萃取壓力15-30MPa,溫度30_50°C,CO2流量l_3ml/g生藥.min,萃取時(shí)間330-370min,得超臨界萃取物,備用;取其余中藥,粉碎成粗粉,加入15L的60%乙醇,投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取,萃取功率600-800W,萃取2次,每次15-25分鐘,合并萃取液,濃縮,加到Diaion HP-1O大孔吸附樹(shù)脂柱上,50%乙醇洗脫,收集5倍量柱體積洗脫液,減壓回收乙醇,濃縮并干燥,得微波提取物,備用;將上述超臨界萃取物和微波提取物混合,加入淀粉,70%乙醇制顆粒,干燥,壓片,制成500片,每片重0.5g。
      2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鐵帚清濁片在制備抑制肝癌細(xì)胞H22細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用,其特征在于,所述鐵帚清濁片的制備方法由下列步驟組成:取鐵掃帚、黑螞蟻、魚腥草、益智,加入到CO2超臨界萃取器中,乙醇作為夾帶劑,夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%,萃取壓力25MPa,溫度40°C,CO2流量5ml/g生藥.min,萃取時(shí)間350min,得超臨界萃取物,備用;取其余中 藥,粉碎成粗粉,加入15L的30%乙醇,投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取,萃取功率700W,萃取2次,每次20分鐘,合并萃取液,濃縮,加到Diaion HP-10大孔吸附樹(shù)脂柱上,50%乙醇洗脫,收集5倍量柱體積洗脫液,減壓回收乙醇,濃縮并干燥,得微波提取物,備用;將上述超臨界萃取物和微波提取物混合,加入淀粉,70%乙醇制顆粒,干燥,壓片,制成500片,每片重0.5g。
      【文檔編號(hào)】A61P1/16GK103690864SQ201310746646
      【公開(kāi)日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2013年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月30日
      【發(fā)明者】孫亞平 申請(qǐng)人:孫亞平
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