抗癌劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供對癌癥具有效果的新穎抗癌劑。將使用牛蒡子萃取物而調(diào)制的藥劑，以牛蒡苷元(arctigenin)的每1日投與量成為100mg以上的方式投與胰臓癌患者后，可見腫瘤縮小效果，又腫瘤位置標記的降低被確認。本發(fā)明是提供牛蒡苷元以每1日的投與量成為100mg以上的方式含有的抗癌劑。又，本發(fā)明是提供牛蒡苷元及牛蒡苷以牛蒡苷元/牛蒡苷＝0.7～1.3的重量比含有的抗癌劑。
【專利說明】抗癌劑

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明是關(guān)于含有牛蒡苷元（arctigenin)的抗癌劑。更詳細言之，本發(fā)明是關(guān)于 將牛蒡苷元以每1日的投與量為IOOmg以上的方式含有的抗癌劑。

【背景技術(shù)】
[0002] 胰臓癌是難治性癌的一種，所有患者的5年存活率一般被推定為2-3%。死于胰臓 癌的患者數(shù)量于最近20年間迅速地增加約2. 5倍，于2009年的統(tǒng)計，有26791人死于胰臓 癌。發(fā)生數(shù)與死亡數(shù)幾乎為相同數(shù)量，此癌癥占日本的癌癥死因的6%，以癌癥發(fā)生部位的 死亡數(shù)可知，依序為肺、胃、大腸、肝，胰臓是接著為第5位。
[0003] 可期待根治的治療僅為外科的切除，但胰臓癌于大多數(shù)的患者中，因在癌癥晚期 (第III+IV期）的狀態(tài)下表現(xiàn)，實際上可根治的切除可謂為所有胰臓癌患者的約10-20%。 每一期的生存期間中間值在第I、II期為約12-30個月，第III期為9-11個月，第IV期為 5-6個月左右，且預測后期極為不良，尤其對于不能切除的患者而言，一般認為幾乎無治愈 的可能性。
[0004] 對進行性胰臓癌的標準治療是吉西他濱（gemcitabine)，對吉西他濱無反應的情 形的標準治療法并未確立。對于進行性胰臓癌患者，即使對吉西他濱無反應的時候，同樣承 認有全身狀態(tài)良好的病例，此態(tài)樣的患者群（對吉西他濱不反應的胰臓癌）的有效治療法 的開發(fā)被認為是于所有胰臓癌的治療法開發(fā)的重要課題。
[0005] 近年來，已報告PANC-I、AsPC-1、BxPC-I及KP-3等來自胰臓癌的細胞在極度營 養(yǎng)饑餓狀態(tài)時亦可見有很強的耐性，解除其耐性有成為癌治療中新生化學的途徑的可能性 (專利文獻1)。
[0006] 使用胰臓癌細胞株P(guān)ANC-I，進行可解除在低營養(yǎng)狀態(tài)中的腫瘤細胞的生存能力的 物質(zhì)的篩選后，已報告牛蒡苷元是有效的（非專利文獻1)。
[0007] 本文中，牛蒡子（日文：5i )于第十五改正日本藥典（日局15)中被規(guī)定為 牛蒡（Arctium lappa Linne(Compositae))的果實。又，牛蒡子是于銀翅散、驅(qū)風解毒湯、 消風散等作為處方的草藥，被分類為專門醫(yī)藥品所使用的成分本質(zhì)。
[0008] 牛蒡子含有約7%被分類為木聚糖（Iignan)配糖體的牛蒡苷（arctiin)及約 0.6%的為其苷元（aglucon)的牛蒡苷元。由此等知識可知，含有牛蒡苷元的牛蒡子萃取物 是被期待可使用作為用于治療癌癥的抗癌劑。
[0009] (以往技術(shù)文獻）
[0010] 【專利文獻】
[0011] 【專利文獻1】日本公開專利公報「特開2002-065298號公報」
[0012] 【非專利文獻】
[0013] 【非專利文獻 I】S. AwaLe, J. Lu, S. K. KaLauni, Y. Kurashima, Y. Tezuka，S. Kadota, H. Esumi, Cancer Res. , 2006, 66(3), 1751-1757)


【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] (本發(fā)明要解決的問題）
[0015] 本發(fā)明是以提供對癌癥具有效果的新穎抗癌劑為目的。
[0016] (本發(fā)明解決問題的技術(shù)手段）
[0017] 現(xiàn)在已知的牛蒡子，牛蒡子中的牛蒡苷元含量為約0.6%的低值。又難溶于水。因 此，以熟知利用的熱水萃取法，要制造高含量含有牛蒡苷元的牛蒡子萃取物是非常困難的。
[0018] 同時，使用于胰臓癌等的治療時，期待提供有效成分的牛蒡苷元成為一定含量的 牛蒡子萃取物，但如上述，于含有高量牛蒡苷元的牛蒡子萃取物的制造，將牛蒡苷變換為牛 蒡苷元，并控制使難溶于水的牛蒡苷元含有一定量是困難的。
[0019] 此外，使用于胰臓癌等的治療時，牛蒡苷元為主要有效成分的同時，含有一定含量 的牛蒡苷元及牛蒡苷的牛蒡子萃取物，已知抗癌效果特別優(yōu)異。因此，對于含有高含量牛蒡 苷元的牛蒡子萃取物的制造，期望可控制牛蒡苷元及牛蒡苷成為一定含量的制造方法。尤 其，期望可制造以約1 :1的重量比的方式含有牛蒡苷元及牛蒡苷的牛蒡子萃取物的方法。
[0020] 本發(fā)明為為了解決此等課題而專心進行檢討的結(jié)果，利用調(diào)整作為原料的牛蒡子 內(nèi)存在的β-葡萄糖苷酶（glucosidase)酶活性、裁切牛蒡子的粒徑、將牛蒡苷酶變換為牛 蒡苷元時的溫度及由牛蒡子萃取牛蒡苷元及牛蒡苷時的溫度，而發(fā)現(xiàn)將牛蒡苷元作成一定 含量的技術(shù)、以及調(diào)節(jié)牛蒡苷元及牛蒡苷的含有比的技術(shù)。
[0021] 而且，本發(fā)明使用利用此等技術(shù)所獲得的牛蒡子萃取物，將牛蒡苷元以每1日的 投與量為IOOmg以上的方式調(diào)制的制劑投與胰臓癌患者后，觀察腫瘤縮小效果的同時，確 認腫瘤位置標記的降低。本發(fā)明是基于如此驚人的發(fā)現(xiàn)而完成的。
[0022] S卩，本發(fā)明是提供牛蒡苷元以每1日的投與量為IOOmg以上的方式含有的抗癌劑。
[0023] 又，本發(fā)明是提供牛蒡苷以每1日的投與量為IOOmg以上的方式含有的上述抗癌 劑。
[0024] 又，本發(fā)明是提供牛蒡苷元及牛蒡苷以牛蒡苷元/牛蒡苷=0. 7?1. 3的重量比 的方式含有的抗癌劑。
[0025] 又，本發(fā)明是提供上述牛蒡苷元及上述牛蒡苷是來自牛蒡子的上述抗癌劑。
[0026] 又，本發(fā)明是提供用以治療對吉西他濱的治療無反應的胰臓癌的上述抗癌劑。
[0027] 又，本發(fā)明是提供含有牛蒡苷元的抗癌干細胞劑。
[0028] 又，本發(fā)明是提供牛蒡苷元以每1日的投與量為IOOmg以上的方式含有的抗癌干 細胞劑。
[0029](發(fā)明效果）
[0030] 依據(jù)本發(fā)明，可提供對癌癥具有效果的新穎抗癌劑。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031] 圖1顯示本發(fā)明的一實施例的顆粒劑投與前（A)、投與開始1個月后⑶、2個月后 (C)及3個月后（D)的胸腹部電腦斷層成像的結(jié)果圖。
[0032] 圖2顯示本發(fā)明的一實施例的顆粒劑投與前（A)、投與開始1個月后（B)、2個月后 (C)及3個月后（D)的胸腹部電腦斷層成像的結(jié)果圖。
[0033] 圖3顯示本發(fā)明的一實施例的顆粒劑投與前（A)、投與開始1個月后（B)、2個月后 (C)及3個月后（D)的胸腹部電腦斷層成像的結(jié)果圖。
[0034] 圖4顯示腫瘤模型動物（CAPAN-1異種移植（Xenografts))中的抗腫瘤性評價的 結(jié)果圖。
[0035] 圖5顯示腫瘤模型動物（PSN-1異種移植）中的抗腫瘤性評價的結(jié)果圖。
[0036] 圖6顯示對癌干細胞的PI染色（死細胞染色）及胰臓癌干細胞位置標記 (CD44，CD24，ESA)染色的結(jié)果圖。
[0037] 圖7顯示對癌干細胞的PI染色及胰臓癌干細胞位置標記（⑶44, c-Met)染色的結(jié) 果圖。
[0038] 圖8顯示對癌干細胞的PI染色及胰臓癌干細胞位置標記染色的結(jié)果（與順鉬 (cisplatin)處理的比較）圖。

【具體實施方式】
[0039] 以下，詳細說明本發(fā)明。揭示的條件為一例，并未限定于此例。
[0040] 本發(fā)明的抗癌劑以每1日的投與量為IOOmg以上的方式含有作為有效成分的牛蒡 苷元。牛蒡苷元可為來自含有牛蒡苷元的植物，例如可來自牛蒡子。即，本發(fā)明的抗癌劑可 以來自植物的萃取物，例如來自牛蒡子而得的牛蒡子萃取物中所含的牛蒡苷元作為有效成 分來含有。
[0041] 本發(fā)明的抗癌劑進一步以每1日的投與量為IOOmg以上的方式含有作為有效成分 的牛蒡苷。牛蒡苷可來自含有牛蒡苷的植物，例如可來自牛蒡子。即，本發(fā)明的抗癌劑是可 以來自植物的萃取物，例如來自牛蒡子而得的牛蒡子萃取物中所含的牛蒡苷作為有效成分 來含有。
[0042] 本發(fā)明的抗癌劑又可以牛蒡苷元/牛蒡苷=0. 7?1. 3的重量比（I. 0?1. 9的 摩爾比）的方式含有作為有效成分的牛蒡苷元及牛蒡苷。牛蒡苷元及牛蒡苷可來自含有牛 蒡苷元及牛蒡苷的植物，例如可來自牛蒡子。即，本發(fā)明的抗癌劑是以牛蒡苷元/牛蒡苷= 0. 7?1. 3的重量比的方式含有牛蒡苷元及牛蒡苷的植物萃取物，例如可含有牛蒡子萃取 物。又，于此抗癌劑，牛蒡苷元可以以每1日的投與量為IOOmg以上的方式含有，又牛蒡苷 可以以每1日的投與量為IOOmg以上的方式含有。
[0043] 含有牛蒡苷元及牛蒡苷的植物并未特別限定，但例如包含牛蒡（burdock) (芽（sprout) ·葉?根莖）、紅花（safflower)、矢車菊（cornflower)、翼薊（Cirsium vulgare)、聖薊（blessed thistle)(薊屬（Cnicus))、大薊（cardon)、蘇格蘭大翅薊 (Onopordum acanthium)、伊利里亞大翅薊（Onopordum illyricum)、邊境連翅（Forsythia X intermedia)、朝鮮連翅（Forsythia ovata)、連翅（Forsythia suspensa Vahl)、支那 連翅（Forsythia viridissima Lindl)、古月麻（sesame)、械葉牽牛(Ipomoea cairica)、 金不換（Polygala chinensis)、亞洲絡(luò)石（T. asiaticum var. intermedium)、日本絡(luò) 石(Trachelospermum asiaticum)、絡(luò)石(Trachelospermum foetidum Nakai)、細 梗絡(luò)石(Trachelospermum gracilipes)、夾竹桃(Nerium indicum Nerium)、絡(luò)石 (Trachelospermum jasminoides var. pubescens)、南嶺売花（Wikstroemia indica)、連 草（Polygonum orientale L )、山搜（Cerasus jamasakura)、阿拉伯芥（Arabidopsis thaliana)、千穗谷（Amaranthus hypochondriacus)、胡桃木（walnut)、燕麥（Avena sativa)、思佩耳特小麥（Triticum spelta L.)、軟質(zhì)小麥、白粉柏（Cupressus Iusitanica)及日本榧樹（Torreya nucifera)等。其中，牛蒡及連翅因牛蒡苷元含量高而 為較佳。
[0044] 于本發(fā)明，牛蒡苷元及牛蒡苷是來自牛蒡子的情形，可為使用后述的牛蒡子萃取 物的制造方法而獲得的牛蒡子萃取物。因此，可使制造時的生產(chǎn)性提升、便宜且簡便地調(diào)制 抗癌劑。又，使用牛蒡子以外的植物的情形，亦可利用利用后述的制造方法，容易地獲得含 有牛蒡苷元及牛蒡苷的萃取物。
[0045] 利用后述的牛蒡子萃取物的制造方法所獲得的萃取物粉末是以牛蒡苷元/牛蒡 苷=0. 7?1. 3的重量比的方式含有牛蒡苷元及牛蒡苷。從而利用此牛蒡子萃取物的制造 方所獲得的萃取物粉末，與熟知的牛蒡子萃取物相比，可使用作為具有優(yōu)異抗癌效果的本 發(fā)明的抗癌劑。
[0046] 本發(fā)明的抗癌劑可進一步含有任意成分。例如，本發(fā)明的抗癌劑可為提供含有藥 學上可容許的基劑、載體、賦形劑、崩解劑、潤滑劑及著色劑等形態(tài)者。
[0047] 于抗癌劑使用的載體及賦形劑為例，包含乳糖、葡萄糖、白糖、甘露糖醇 (mannitol)、糊精（dextrin)、馬鈴薯淀粉、玉米淀粉、碳酸|丐、磷酸|丐、硫酸|丐及結(jié)晶纖維素 等。
[0048] 又，結(jié)合劑之例包含淀粉、明膠（gelatin)、糖楽、黃蓍膠（tragacanth)、聚乙烯 醇（polyvinyl alcohol)、聚乙烯醚（polyvinyl ether)、聚乙烯批咯陡酮（polyvinyl pyrrolidone)、輕基丙基纖維素 （hydroxypropyl cellulose)、甲基纖維素 （methyl cellulose)、乙基纖維素 （ethyl cellulose)及羧基甲基纖維素 （carboxymethyl cellulose)等。
[0049] 又，崩壞劑之例包含淀粉、瓊脂、明膠末、結(jié)晶纖維素、碳酸鈣、碳酸氫鈉、褐藻酸鈉 (sodium alginate)、羧基甲基纖維素鈉及羧基甲基纖維素 I丐等。
[0050] 又，潤滑劑之例包含硬脂酸鎂（magnesium stearate)、氫化植物油、滑石（talc) 及聚乙二醇（macrogol)等。又，著色劑可使用可容許添加于醫(yī)藥品的任意著色劑。
[0051] 又，因應必要，抗癌劑可以白糖、明膠、精制蟲膠（shellac)、明膠、甘油 (glycerin)、山梨糖醇（sorbitol)、乙基纖維素、輕基丙基纖維素、輕基丙基甲基纖維素、 聚乙烯批咯陡酮、酞酸乙酸纖維素 （phthalic acid cellulose acetate)、輕基丙基甲基 纖維素酞酸酯（hydroxypropyl methylcellulose phthalate)、甲基丙烯酸甲酯（methyl methacrylate)及甲基丙烯酸（methacrylic acid)聚合物等，以一層以上的層加以被膜。
[0052] 又，因應必要，可添加 pH調(diào)節(jié)劑、緩沖劑、安定化劑及可溶化劑等。
[0053] 又，抗癌劑可以任意形態(tài)的制劑來提供。例如，抗癌劑作為經(jīng)口投與制劑，可為糖 衣錠、口腔錠（backal)、包衣錠及可嚼錠等的錠劑、片劑（troche)、丸劑、散劑及包含軟膠 囊的膠囊劑、顆粒劑、懸浮劑、乳劑、包含干糖楽的糖楽劑、酏劑（elixir)等的液劑。
[0054] 又，抗癌劑可為用以非經(jīng)口投與的靜脈注射、皮下注射、腹腔內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、 經(jīng)皮投與、經(jīng)鼻投與、經(jīng)肺投與、經(jīng)腸投與、口腔內(nèi)投與及經(jīng)黏膜投與等的投與用的制劑。例 如，可為注射劑、經(jīng)皮吸收帶、氣溶膠劑及栓劑等。又，因萃取物粉末具有特殊的味道，可作 成將萃取物粉末包覆的制劑、以被覆劑被覆的膜衣劑。
[0055] 另一方面，利用后述的牛蒡子萃取物的制造方法所獲得的萃取物粉末亦可以此形 態(tài)下作為抗癌劑來使用。
[0056] 本發(fā)明的抗癌劑可混合經(jīng)純化的牛蒡苷元及其他成分來制造，亦可使用利用以下 記載的方法制造的牛蒡子萃取物來制造。
[0057] 牛蒡子萃取物是經(jīng)由草藥裁切步驟、萃取步驟（酶變換步驟及利用有機溶劑的萃 取步驟）、固液分離步驟、濃縮步驟及干燥步驟而被制造。
[0058] (草藥裁切步驟）
[0059] 本發(fā)明的抗癌劑所使用的牛蒡子萃取物的制造方法中，將作為原料的牛蒡子裁切 成適合萃取的大小。作為原料的草藥是有因應植物的不同部位或礦物、動物等各種的大小、 形狀、堅固度、特質(zhì)的裁切的必要。
[0060] 牛蒡子可使用本項【技術(shù)領(lǐng)域】者眾所皆知的任意手段來裁切。例如，可使用市售的 裁切機。
[0061] 以本發(fā)明的抗癌劑所使用的牛蒡子萃取物的制造方法，可事先測定牛蒡子內(nèi)存在 的酶的β-葡萄糖苷酶的活性，而可選擇適合本發(fā)明的制造的牛蒡子。
[0062] 就測定葡萄糖苷酶的活性的方法而言，例如將P-硝基苯基-β-D-批 喃葡萄糖苷（P _nitrophenyl_i3-D-glucopyranoside) (C12H15N08 :分子量 301. 25) (SIGMA-ALDRICH公司制）作為基質(zhì)，使其與牛蒡子粉碎品作用，經(jīng)測定生成的P-硝基苯酚 (p-nitrophenol)的400nm吸光度的變化，可測定酶活性。就表示酶活性的單位而言，可將 于1分鐘生成1微摩爾的P-硝基苯酚的酶量作為1單位⑶來表示。
[0063] 為了獲得以牛蒡苷元/牛蒡苷=0. 7?1. 3的重量比的方式含有牛蒡苷元及牛蒡 苷的牛蒡子萃取物，可使用牛蒡子內(nèi)存在的β -葡萄糖苷酶的活性為〇. 4U/g以上、較佳為 lU/g以上的牛蒡子。
[0064] 低于0.4U/g的情形，水解變的不充分，牛蒡苷元的重量會下降，變的無法有效率 地獲得所期望的牛蒡子萃取物。
[0065] 又，本發(fā)明的抗癌劑所使用的牛蒡子萃取物的制造方法是可使用裁切成任意粒徑 的牛蒡子。一般認為經(jīng)裁切的牛蒡子的粒徑越小則酶變換會被促進，萃取物生產(chǎn)率亦提升。 與此相反，粒徑過小時，酶變換過快而制程管理變困難，于的后的步驟的正確的固液分離上 有發(fā)生障礙的情形。
[0066] 為了獲得以牛蒡苷元/牛蒡苷=0. 7?1. 3的重量比的方式含有牛蒡苷元及牛蒡 苷的牛蒡子萃取物，如以下的實施例所示，牛蒡子被裁切為9. 5_以下的粒徑，例如以皆可 通過9. 5mm篩的方式被裁切。
[0067] 又，為了獲得以牛蒡苷元/牛蒡苷=0. 7?1. 3的重量比的方式含有牛蒡苷元及 牛蒡苷的牛蒡子萃取物，將牛蒡子的粒徑裁切成全部通過9. 5mm篩，并期望例如60?100% 分布于0· 85mm的篩，更佳為65?80%分布于0· 85mm的篩。
[0068] (萃取步驟）
[0069] 萃取步驟是草藥萃取物粉末制造步驟中對于品質(zhì)上最重要的步驟。利用此萃取步 驟，決定草藥萃取物粉末的品質(zhì)。本發(fā)明的牛蒡子萃取物的制造方法，為了萃取牛蒡子萃取 物，分成酶變換步驟及利用有機溶劑的萃取步驟的兩階段來進行萃取。
[0070] (酶變換步驟）
[0071] 酶變換步驟是本發(fā)明的抗癌劑所使用的牛蒡子萃取物的制造方法中的重要步驟。 酶變換步驟是利用牛蒡子內(nèi)存在的酶β-葡萄糖苷酶，將牛蒡子所含的牛蒡苷酶變換為牛 蒡苷元的步驟。
[0072] 具體而言，將上述步驟準備的牛蒡子裁切物，經(jīng)由保持于適當?shù)臏囟仁功耞葡萄 糖苷酶作用，使進行由牛蒡苷至牛蒡苷元的反應。例如，于裁切的牛蒡子中添加水等的任意 溶液，利用于30°C左右的溫度加以攪拌，可將牛蒡子保持于任意溫度。
[0073] 為了獲得以牛蒡苷元/牛蒡苷=0. 7?1. 3的重量比的方式含有牛蒡苷元及牛蒡 苷的牛蒡子萃取物，將經(jīng)裁切的牛蒡子保持于30°C左右的溫度，例如20?50°C之間的溫 度。
[0074] 低于20°C的情形，水解變的不充分，牛蒡苷元的重量比會下降，變的無法有效率地 獲得所期望的牛蒡子萃取物。另一方面，較50°C更高溫的情形，酶會失活，牛蒡苷元的重量 比會降下，變的無法有效率地獲得所期望的牛蒡子萃取物。
[0075] 又，保持時間只要保持于上述溫度即可，并未特別限制，例如可保持約30分鐘。利 用保持于20?50°C之間，可不需保持時間，將適當量的牛蒡苷酶變換為牛蒡苷元，而獲得 以牛蒡苷元：牛蒡苷（重量比）為約1 :1的方式含有的牛蒡子萃取物。
[0076](利用有機溶劑的萃取步驟）
[0077] 利用有機溶劑的萃取步驟是使用任意的適當有機溶劑，而自牛蒡子萃取牛蒡苷元 及牛蒡苷的步驟。即，利用上述的酶變換步驟，牛蒡苷元成為高含量的狀態(tài)下，添加適當溶 齊IJ，來萃取牛蒡子萃取物的步驟。例如，于牛蒡子萃取物中添加適當溶劑，以適當時間加熱 攪拌而萃取牛蒡子萃取物。又，除加熱攪拌以外，亦可使用加熱回流、滴下式萃取、浸漬式萃 取或加壓式萃取法等的本項【技術(shù)領(lǐng)域】者眾所皆知的任意萃取法，可萃取牛蒡子萃取物。
[0078] 因牛蒡苷元為水難溶性，利用添加有機溶劑，可使牛蒡苷元的生產(chǎn)率提升。有 機溶劑可使用任意的有機溶劑。例如，可使用甲醇（methanol)、乙醇（ethanol)及丙醇 (propanol)等的醇，以及丙酮（acetone)?？紤]安全性的方面時，用于本發(fā)明的抗癌劑的牛 蒡子萃取物的制造方法是使用乙醇作為有機溶劑為較佳。
[0079] 經(jīng)加熱攪拌來萃取牛蒡子萃取物的情形，加熱攪拌可于任意溫度下進行，但為了 獲得以牛蒡苷元/牛蒡苷=〇. 7?1. 3的重量比的方式含有牛蒡苷元及牛蒡苷的牛蒡子萃 取物，保持于80°C以上的溫度，例如80?90°C之間的溫度。
[0080] 又，加熱攪拌的時間只要于上述溫度下加熱攪拌即可，并未特別限定，經(jīng)由約30 分鐘，例如30?60分鐘加熱攪拌，可于溶劑中自牛蒡子萃取牛蒡苷兀及牛蒡苷。
[0081] 牛蒡苷元及牛蒡苷的生產(chǎn)率是加熱攪拌的時間越長而越提升。然而，加熱攪拌的 時間長時，不必要的油脂類會溶出過多，而對濃縮步驟的負荷變大。因而，加熱攪拌的時間 是因應狀況加以適宜決定為宜。
[0082] 又，牛蒡苷元及牛蒡苷的生產(chǎn)率是因乙醇量越多而牛蒡苷元及牛蒡苷的溶解度變 高，故生產(chǎn)率亦提升。然而，乙醇量多時，不必要的油脂類亦會溶出過多，對濃縮步驟的負荷 變大。因而，投入量是因應狀況加以適宜決定為宜。此外利用這個步驟的加熱攪拌，可同時 將牛蒡子萃取物滅菌及殺菌。
[0083](固液分離步驟）
[0084] 固液分離步驟是將萃取結(jié)束的牛蒡子由萃取液加以分離的步驟。固液分離可使用 本項【技術(shù)領(lǐng)域】者眾所皆知的任意方法來進行。固液分離法例如有過濾法、沉降法及離心法 等。工業(yè)上以離心法為較佳。
[0085](濃縮步驟）
[0086] 濃縮步驟是在干燥之前自牛蒡子萃取液去除溶劑的步驟。由牛蒡子萃取液的溶劑 的去除可使用本項【技術(shù)領(lǐng)域】者眾所皆知的任意方法來進行。
[0087] 然而，自利用上述步驟所獲得的牛蒡子的萃取液是不進一步長時間暴露于高溫中 為較佳。
[0088] 例如，利用使用減壓濃縮法，不長時間暴露于高溫，可濃縮牛蒡子萃取液。
[0089] 牛蒡子萃取液的濃縮是可濃縮至可獲得所期望濃度的牛蒡子萃取物的濃度。
[0090] 例如，于以下的干燥步驟，濃縮至可適當進行干燥的程度為較佳。又，于以下的步 驟，使牛蒡子萃取物干燥而作成粉末制劑的情形，濃縮進行至獲得適當制劑特性的濃度為 較佳。
[0091] 因牛蒡苷元及牛蒡苷是水難溶性，牛蒡苷元及牛蒡苷附著于以下的干燥步驟的制 造裝置內(nèi)的量很多，最終的生產(chǎn)率會大幅降低。因此，為了防止牛蒡苷元及牛蒡苷附著于制 造裝置，可于此濃縮步驟所獲得的牛蒡子萃取液中添加糊精。糊精的添加量是例如相對于 濃縮液的固體成分為15?30%左右為較佳。
[0092] (干燥步驟）
[0093] 將利用上述步驟所獲得的牛蒡子萃取物完成為粉末狀的步驟。干燥是可使用本項

【技術(shù)領(lǐng)域】者眾所皆知的任意方法來進行。例如，就干燥法而言，已知凍結(jié)干燥及噴霧干燥 等，但若為實驗室程度者，通常使用前者，若為量產(chǎn)程度，則通常使用后者。
[0094] 經(jīng)由以上制造步驟，可獲得以牛蒡苷元/牛蒡苷=0. 7?1. 3的重量比的方式 含有牛蒡苷元及牛蒡苷的牛蒡子萃取物。此牛蒡子萃取物的制造方法必須包含于20°C? 50°C的溫度下進行酶變換的步驟，而不需要包含全部的其他步驟。
[0095] 又，經(jīng)由以上的制造步驟，可便宜且簡便地獲得牛蒡苷元的濃度為高的牛蒡子萃 取物。從而利用使用由此方法所獲得的牛蒡子萃取物，可便宜且簡便地制造本發(fā)明的抗癌 劑。
[0096] 又，因由以上的制造步驟所獲得的牛蒡子萃取物的牛蒡苷元濃度為高，與使用熟 知的牛蒡子萃取物的情形作比較，可將抗癌劑的每1日的全部量作成少量。因而可減輕患 者的負擔。
[0097] 又，本發(fā)明亦提供制造以牛蒡苷元/牛蒡苷=0. 7?1. 3的重量比（I. 0?1. 9 的摩爾比）的方式含有牛蒡苷元及牛蒡苷的牛蒡子萃取物的方法，其包含裁切牛蒡子的步 驟、利用牛蒡子內(nèi)存在的β-葡萄糖苷酶將牛蒡子內(nèi)存在的牛蒡苷酶變換為牛蒡苷元的步 驟，其中所述酶變換是于20°C?50°C的溫度下使反應的步驟。
[0098] 又，本發(fā)明是提供制造上述的牛蒡子萃取物的方法，其是于裁切的步驟中，將牛蒡 子裁切為〇. 85mm?9. 5mm的粒徑。
[0099] 此外，本發(fā)明是提供制造牛蒡子內(nèi)存在的葡萄糖苷酶的酶活性為牛蒡子Ig中 為0. 4U以上的上述牛蒡子萃取物的方法。
[0100] 又，本發(fā)明是提供包含于酶變換步驟的后，經(jīng)由添加有機溶劑，萃取含有牛蒡苷元 及牛蒡苷的萃取物的步驟的制造上述牛蒡子萃取物的方法。
[0101] 又，本發(fā)明是提供有機溶劑為乙醇的制造上述牛蒡子萃取物的方法。
[0102] 又，本發(fā)明是提供制造上述牛蒡子萃取物的方法，其中萃取的步驟為于約為80°C 下萃取。
[0103] 此外，本發(fā)明提供由上述方法所獲得的牛蒡苷元/牛蒡苷以0. 7?1. 3的重量比 的方式含有的牛蒡子萃取物。
[0104] 此外，本發(fā)明提供含有由上述方法所獲得的牛蒡苷元/牛蒡苷以0. 7?1. 3的重 量比的方式含有的牛蒡子萃取物的抗癌劑。
[0105] 依據(jù)本發(fā)明，可提供牛蒡苷元以每1日的投與量為IOOmg以上的方式含有的具有 抗腫瘤效果的抗癌劑。又依據(jù)本發(fā)明，可提供牛蒡苷元及牛蒡苷以牛蒡苷元/牛蒡苷= 0. 7?1. 3 (重量比）的方式含有的抗癌劑。本發(fā)明的抗癌劑投與癌癥患者，例如胰臓癌患 者時，可期待安定的腫瘤增殖抑制或抗腫瘤效果。又，本發(fā)明的抗癌劑可使用作為用以治療 對吉西他濱的治療為無反應的胰臓癌的胰臓癌治療劑。
[0106] 又，于以下的試驗例7,顯示含有牛蒡苷元及牛蒡苷的顆粒劑的毒性是非常地低。 因而，本發(fā)明的抗癌劑可于非常少的副作用下提供高抗癌效果。
[0107] 又，于以下的試驗例8及試驗例9,顯示牛蒡苷元對胰臓及肝臓的癌干細胞具有殺 傷效果。由此可知，顯示牛蒡苷元不僅對固形癌的腫瘤本體，亦對癌干細胞有作用而利用殺 傷發(fā)揮抗癌作用。又，顯示牛蒡苷元不僅對胰臓癌，亦會殺傷其他癌癥的癌干細胞，具有抗 癌效果。因而，本發(fā)明提供用于治療各種癌癥的抗癌劑。
[0108] 又，本發(fā)明亦提供含有牛蒡苷元的抗癌干細胞劑。抗癌干細胞劑是指具有殺傷癌 干細胞效果的藥劑。癌干細胞是指于癌細胞中具有干細胞性的細胞。
[0109] 本發(fā)明的抗癌干細胞劑可為與上述本發(fā)明的抗癌劑相同構(gòu)成的。即，抗癌干細胞 劑的牛蒡苷元可以每1日的投與量為IOOmg以上的方式含有。又，抗癌干細胞劑可進一步 含有牛蒡苷，牛蒡苷以每1日的投與量可為IOOmg以上的方式含有。抗癌干細胞劑的牛蒡 苷元及牛蒡苷可以牛蒡苷元/牛蒡苷=0. 7?1. 3的重量比的方式來含有。牛蒡苷元及牛 蒡苷可為來自含有牛蒡苷元及牛蒡苷的植物，例如可為來自牛蒡子。
[0110] 于以下的試驗例8及試驗例9,顯示牛蒡苷元具有選擇性殺傷癌干細胞的效果，尤 其于癌細胞的周圍環(huán)境附近且于營養(yǎng)饑餓條件，具有選擇性殺傷癌干細胞的效果。因而，因 本發(fā)明的抗癌干細胞劑經(jīng)由殺傷癌干細胞，可抑制癌細胞的增殖，故可適合利用作為抗癌 劑。
[0111] [實施例]
[0112] (試驗例）
[0113] 驗證牛蒡子的酶活性及酶變換條件（溫度與時間）對牛蒡苷元/牛蒡苷（重量 比）的影響，即驗證兩者的因果關(guān)系。
[0114] (酶活性的測定）
[0115] 將產(chǎn)地或批次相異的牛蒡子利用Willey氏粉碎機加以粉碎，將此牛蒡子粉碎品 0. Ig以IOmL的水稀釋，作成試料溶液。
[0116] 作為基質(zhì)溶液，于p-硝基苯基_β-D-批喃葡萄糖苷0. 15g中添加水而作成固定 容量25mL，調(diào)制20mmol/L P-硝基苯基-β -D-吡喃葡萄糖苷水溶液。于0. lmol/L乙酸緩 沖液ImL中添加20mmol/L P-硝基苯基-β -D-吡喃葡萄糖苷水溶液0. 5mL，調(diào)制反應混合 液，并于37°C進行預備加熱約5分鐘。
[0117] 于反應混合液中添加試料溶液0. 5mL并于37°C使反應15分鐘后，添加作為反應停 止液的0. 2mol/L碳酸鈉水溶液2mL而使反應停止。測定此液的400nm中的吸光度，由未進 行酶反應的空白組溶液的變化量利用下式求得酶活性。
[0118] 酶活性（U/g)=(試料溶液的吸光度-空白組溶液的吸光 度）X4mLX 1/18. l(p-硝基苯酚的上述測定條件下的毫摩爾分子吸光系數(shù)：cm2/ μ mol) X 1/光路長（cm) X 1/反應時間（分鐘）X 1/0. 5mLX 1/試料溶液濃度（g/mL)
[0119] 如表1所示，確認各牛蒡子的酶活性為0. 12?8. 23U/g。
[0120] (試驗例1)
[0121] 于酶活性為0. 12、0. 27、0. 40U/g (試料1-3)的經(jīng)裁切牛蒡子Ig中添加水7mL，于 酶反應溫度15°C、20°C的溫度條件下，將各自反應溫度的反應時間設(shè)定為30分鐘，反應后 添加乙醇并于80°C進行萃取，定量獲得的萃取物的牛蒡苷元及牛蒡苷，求得牛蒡苷元/牛 蒡苷重量比。結(jié)果示于表1的比較例1，2、實施例1。
[0122] 酶活性為0. 40U/g的試料3是于酶反應溫度20°C、反應時間30分鐘下獲得牛蒡苷 元/牛蒡苷（重量比）=〇· 82的牛蒡子萃取物。
[0123] 另一方面，于酶反應溫度15°C、反應時間30分鐘，牛蒡苷元/牛蒡苷（重量比）= 069、酶反應溫度為20°C以上者為較佳。
[0124] 又，酶活性為低于0. 40U/g的試料1及試料2,由于即使酶反應溫度為20°C，亦無 法滿足牛蒡苷元/牛蒡苷（重量比）=〇. 70以上，故牛蒡子的酶活性是0. 40U/g以上為較 佳。
[0125] (試驗例2)
[0126] 于酶活性為4. 03U/g(試料5)的經(jīng)裁切牛蒡子Ig中添加水7mL，于酶反應溫度 30°C、40°C、5(rC、6(rC的溫度條件下，于各自反應溫度的反應時間設(shè)定為15分鐘、30分鐘 (僅30°C及60°C )，反應后以乙醇進行萃取，將獲得的萃取物的牛蒡苷元及牛蒡苷定量，求 得牛蒡苷元/牛蒡苷重量比。
[0127] 結(jié)果示于表1的實施例3。于酶反應溫度30°C、反應時間15分鐘，獲得牛蒡苷元 /牛蒡苷（重量比）=〇. 7,于酶反應溫度30°C、反應時間30分鐘，獲得牛蒡苷元/牛蒡苷 (重量比）=L 0,于酶反應溫度40°C、反應時間15分鐘，獲得牛蒡苷元/牛蒡苷（重量比） =1. 2,于酶反應溫度50°C、反應時間15分鐘,獲得牛蒡苷元/牛蒡苷（重量比）=1. 2的 牛蒡子萃取物。
[0128] 另一方面，于酶反應溫度60°C、反應時間15分鐘，牛蒡苷元/牛蒡苷（重量比）= 0.4,于酶反應溫度60°C、反應時間30分鐘，牛蒡苷元/牛蒡苷（重量比）=0.5。由以上 可知，酶反應溫度是低于60°C為較佳。
[0129] (試驗例3)
[0130] 于酶活性為I. 42U/g (試料4)的經(jīng)裁切牛蒡子Ig中添加水7mL，并于酶反應溫度 25°C的溫度條件下設(shè)定反應時間為10分鐘、30分鐘，反應后以乙醇進行萃取，將獲得的萃 取物的牛蒡苷元及牛蒡苷定量，求得牛蒡苷元/牛蒡苷重量比。
[0131] 結(jié)果示于表1的實施例2。酶反應溫度25°C、反應時間10分鐘下，牛蒡苷元/牛蒡 苷（重量比）=0· 74,于相同反應時間30分鐘,獲得牛蒡苷元/牛蒡苷（重量比）=0· 85 的牛蒡子萃取物。
[0132] 由以上可知，即使酶活性I. 42U/g，可獲得所欲結(jié)果。
[0133] [表 1]
[0134]

【權(quán)利要求】
1. 一種抗癌劑，其是以每1日的投與量為lOOmg以上的方式含有牛蒡苷元 (arctigenin)〇
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗癌劑，其進一步以每1日的投與量為lOOmg以上的方式含 有牛蒡苷（arctiin)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗癌劑，其是以牛蒡苷元/牛蒡苷=0. 7?1. 3的重量比含 有牛蒡苷元及牛蒡苷。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的抗癌劑，其中所述牛蒡苷元及所述牛蒡苷是來自牛蒡子。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項所述的抗癌劑，其是用于治療對吉西他濱 (gemcitabine)的治療效果不佳的胰臓癌。
6. -種抗癌干細胞劑，其含有牛蒡苷元。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗癌干細胞劑，其是以每1日的投與量為lOOmg以上的方式 含有牛蒡苷元。
【文檔編號】A61K36/28GK104379143SQ201380016479
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年3月26日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月26日
【發(fā)明者】江角浩安, 池田公史, 三好千香, 門田重利, 大洼敏樹, 與茂田敏, 布施貴史, 川島孝則, 千葉殖干 申請人:客樂諧制藥株式會社, 獨立行政法人國立癌癥研究中心, 國立大學法人富山大學