用于治療炎癥的方法
【專利摘要】一種用于降低或減輕受試者中炎癥的方法，方法包括向受試者施用治療有效量的：(a)Ac-TMP-1或Ac-TMP-1的生物活性片段或變體；(b)Ac-TMP-2或Ac-TMP-2的生物活性片段或變體；或者(c)(a)和(b)的組合，從而降低或減輕受試者中的炎癥。一種用于預(yù)防或治療受試者中哮喘或炎癥性腸病的方法，方法包括向受試者施用治療有效量的：(a)Ac-TMP-1或Ac-TMP-1的生物活性片段或變體；(b)Ac-TMP-2或Ac-TMP-2的生物活性片段或變體；或者(c)(a)和(b)的組合，從而預(yù)防或治療受試者中的哮喘或炎癥性腸病。受試者可以是包括人類在內(nèi)的哺乳動物。
【專利說明】用于治療炎癥的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于治療炎癥的方法。更具體而言，本發(fā)明涉及鉤蟲排泄/分泌的蛋 白用于降低、減輕和/或預(yù)防炎癥的用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 炎癥是免疫系統(tǒng)響應(yīng)所感知到的損傷或威脅而發(fā)動的非特異性反應(yīng)。與免疫系統(tǒng) 更加精確定制的適應(yīng)性反應(yīng)不同，炎癥是固有的防御反應(yīng)。炎癥可與免疫系統(tǒng)的適應(yīng)性反 應(yīng)協(xié)同工作，適應(yīng)性反應(yīng)進(jìn)展得更緩慢但更精確地祀向至有害物（harmfulagent)，例如可 引起局部損傷的病原體。
[0003] 當(dāng)與感染有關(guān)時，因響應(yīng)許多類型的損傷而發(fā)生炎癥，損傷包括物理創(chuàng)傷、燒傷 (例如，由于輻射、熱或腐蝕性物質(zhì)）、化學(xué)或顆粒刺激物、細(xì)菌或病毒病原體、以及局部缺 氧（局部缺血）。炎癥也與自身免疫疾病和過敏性反應(yīng)有關(guān)。炎癥包括發(fā)紅、發(fā)熱、腫脹和 疼痛的典型癥狀，并且可能伴有發(fā)炎的器官或組織的功能降低。
[0004] 盡管已知許多用于治療炎癥的方法，它們都具有局限性，特別是對于廣泛的 (broadbased)功效。因此，需要用于降低、減輕和/或預(yù)防與多種原因有關(guān)的炎癥的新方 法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明涉及用于治療和/或預(yù)防炎癥和/或炎癥相關(guān)疾病或病況的方法和組合 物。
[0006] 以廣泛的形式，本發(fā)明涉及可源自或可獲自鉤蟲的一種或多種組織金屬蛋白酶抑 制蛋白用于降低、減輕和/或預(yù)防炎癥和/或炎癥相關(guān)疾病或病況（比如哮喘和/或炎癥 性腸?。┑挠猛?，其中所述鉤蟲包括但不限于犬鉤口線蟲（Ancylostomacaninum)。
[0007] 一方面，本發(fā)明提供一種用于降低或減輕受試者中炎癥的方法，方法包括向受試 者施用治療有效量的：（a)Ac-TMP-USEQIDNO:1)或Ac-TMP-I的生物活性片段或變體、 (b)Ac-TMP-2(SEQIDNO:2)或Ac-TMP-2的生物活性片段或變體、或（c) (a)和（b)的組合 的步驟。
[0008] 在一個實(shí)施方式中，此方面還包括向受試者施用至少一種其它藥劑的步驟。
[0009]適當(dāng)?shù)?，根?jù)上述實(shí)施方式，至少一種其它藥劑選自非留體類抗炎藥（NSAID)、氨 基水楊酸鹽、皮質(zhì)類固醇、免疫抑制劑、抗細(xì)胞因子/細(xì)胞因子受體劑（如抗TNFa劑、抗 IL-5劑、抗IL-13劑、抗IL-17劑和抗IL-6R劑）、抗生素、及其組合。
[0010] 在一些實(shí)施方式中，炎癥與受試者中的疾病、病癥和/或病況有關(guān)，或者炎癥是受 試者中的疾病、病癥和/或病況所繼發(fā)的，尤其是免疫疾病、病癥和/或病況。
[0011] 在某些實(shí)施方式中，疾病是消化道或呼吸系統(tǒng)疾病。
[0012] 在另一實(shí)施方式中，疾病、病癥和/或病況是基線療法難以治療的。
[0013] 適當(dāng)?shù)?，根?jù)上述實(shí)施方式，基線療法包括施用至少一種選自如下的基線藥劑：非 甾體類抗炎藥（NSAID)、氨基水楊酸鹽、皮質(zhì)類固醇、免疫抑制劑、抗細(xì)胞因子/細(xì)胞因子受 體劑（如抗TNFα劑、抗IL-5劑、抗IL-13劑、抗IL-17劑和抗IL-6R劑）、抗生素、及其組 合。
[0014] 在另一方面，本發(fā)明提供一種預(yù)防受試者中炎癥的方法，方法包括向受試者施 用治療有效量的：(a)Ac-TMP-USEQIDNO:1)或Ac-TMP-I的生物活性片段或變體、（b) Ac-TMP-2(SEQIDNO:2)或Ac-TMP-2的生物活性片段或變體、或（c) (a)和（b)的組合的 步驟。
[0015] 在一個實(shí)施方式中，此方面還包括向受試者施用至少一種其它藥劑的步驟。
[0016] 在另一方面，本發(fā)明提供一種治療和/或預(yù)防受試者中炎癥性腸病的方法，方法 包括向受試者施用治療有效量的：（a)Ac-TMP-USEQIDNO:1)或Ac-TMP-I的生物活性片 段或變體、（b)Ac-TMP-2(SEQIDNO:2)或Ac-TMP-2的生物活性片段或變體、或（c) (a)和 (b)的組合的步驟。
[0017] 在一個實(shí)施方式中，此方面還包括向受試者施用至少一種其它藥劑的步驟。
[0018]適當(dāng)?shù)兀鶕?jù)上述實(shí)施方式，至少一種其它藥劑選自非留體類抗炎藥（NSAID)、氨 基水楊酸鹽、皮質(zhì)類固醇、免疫抑制劑、抗細(xì)胞因子/細(xì)胞因子受體劑（如抗TNFa劑、抗 IL-5劑、抗IL-13劑、抗IL-17劑和抗IL-6R劑）、抗生素、及其組合。
[0019] 在另一方面，本發(fā)明提供一種治療和/或預(yù)防受試者中哮喘的方法，方法包括向 受試者施用治療有效量的：（a)Ac-TMP-USEQIDNO: 1)或Ac-TMP-I的生物活性片段或變 體、（b)Ac-TMP-2(SEQIDNO:2)或Ac-TMP-2的生物活性片段或變體、或（c) (a)和（b)的 組合的步驟。
[0020] 在一個實(shí)施方式中，此方面還包括向受試者施用至少一種其它藥劑的步驟。
[0021]適當(dāng)?shù)?，根?jù)上述實(shí)施方式，至少一種其它藥劑選自非留體類抗炎藥（NSAID)、氨 基水楊酸鹽、皮質(zhì)類固醇、免疫抑制劑、抗細(xì)胞因子/細(xì)胞因子受體劑（如抗TNFa劑、抗 IL-5劑、抗IL-13劑、抗IL-17劑和抗IL-6R劑）、抗生素、及其組合。
[0022] 優(yōu)選地，受試者是哺乳動物。
[0023] 更優(yōu)選地，受試者是人類。
[0024] 本發(fā)明的另一方面提供一種藥物組合物，其包含治療有效量的：(a)Ac-TMP-I(SEQ IDNO:1)或Ac-TMP-I的生物活性片段或變體、（b)Ac-TMP-2(SEQIDNO:2)或Ac-TMP-2 的 生物活性片段或變體、或（c) (a)和（b)的組合，以及藥學(xué)上可接受的載體賦形劑的稀釋劑。
[0025] 在一些實(shí)施方式中，藥物組合物可還包含至少一種其它藥劑。
[0026]至少一種其它藥劑可選自非留體類抗炎藥（NSAID)、氨基水楊酸鹽、皮質(zhì)類固醇、 免疫抑制劑、抗細(xì)胞因子/細(xì)胞因子受體劑（如抗TNFa劑、抗IL-5劑、抗IL-13劑、抗 IL-17劑和抗IL-6R劑）、抗生素、及其組合。
[0027] 適當(dāng)?shù)?，藥物組合物用于預(yù)防或治療炎癥和/或用于預(yù)防或治療炎癥相關(guān)的疾病 或病況。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028] 圖I.Ac-TMP-I的核苷酸序列和氨基酸序列（SEQIDNO:I) (Zhan等人，Am. J.Trop.Med.Hyg. 66:238-44, 2002) 〇
[0029] 圖2.Ac-TMP-2的核苷酸序列和氨基酸序列（SEQIDNO:2) (Zhan等人，Mol. Biochem.Parasitology162:142-48, 2008)。
[0030] 圖3.純化的重組Ac-TMP-I保護(hù)免受TNBS誘導(dǎo)的體重減輕。簡單而言，小鼠在第 〇天接受單次腹膜內(nèi)注射20μgAc-TMP-I(--ΜΡ)或模擬PBS注射（TNBS)。五小時后，在輕 度麻醉下，它們接受直腸內(nèi)注射45%乙醇中2. 5mg的2, 4, 6-三硝基苯磺酸（通常被稱為 TNBS)。從第0天至第3天，每日監(jiān)測小鼠的體重減輕。對照組（對照）沒有接受任何注射 也沒有施用TNBS。與接受模擬注射的TNBS組相比時，如各組小鼠平均值所示，Ac-TMP-I顯 著保護(hù)小鼠免受體重減輕。
[0031] 圖4.Ac-TMP-2保護(hù)小鼠免受TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型。在第0天用Ac-TMP-2或 載體（Vehicle)(PBS)治療小鼠。五小時后，它們被麻醉，并直腸內(nèi)注射45%乙醇中2.5mg 劑量的TNBS。每日監(jiān)測體重、總體外觀、大便和活動性。與載體對照組相比，用Ac-TMP-2治 療的小鼠顯著損失更少的體重。與對照相比，Ac-TMP-2治療的小鼠的臨床分?jǐn)?shù)（結(jié)合其它 監(jiān)測的參數(shù)）也顯著更少受到影響（***P〈〇. 001)。
[0032] 圖5.純化的重組Ac-TMP-2保護(hù)免受TNBS誘導(dǎo)的腸道病理。簡單而言，小鼠在 第〇天接受單次腹膜內(nèi)注射20μgAc-TMP-2 (--ΜΡ-2)或模擬PBS注射（TNBS)。五小時 后，在輕度麻醉下，它們接受直腸內(nèi)注射45 %乙醇中2. 5mg的TNBS。在第3天，處死小鼠 并測量臨床分?jǐn)?shù)、宏觀分?jǐn)?shù)和結(jié)腸長度（對于方法，參見Ruyssers等人，Inflamm.Bowel Dis.15:491-500, 2009)。對照組（對照）沒有接受任何注射也沒有施用TNBS。
[0033] 圖6.用熱和蛋白酶處理使Ac-TMP-2變性，消除其在TNBS結(jié)腸炎小鼠模型中的保 護(hù)特性。如此處使用宏觀分?jǐn)?shù)所示（結(jié)合結(jié)腸粘連（adhesion)、潰瘍、水腫和壁增厚），通過 胰蛋白酶處理和煮沸使Ac-TMP-2變性，這在TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型中消除Ac-TMP-2 誘導(dǎo)的保護(hù)。
[0034] 圖7.Ac-TMP-I在過敏性哮喘小鼠模型中保護(hù)免受炎癥。支氣管肺泡灌洗（BAL) 浸潤在AcES(犬鉤口線蟲排泄/分泌的蛋白）和重組Ac-TMP-I治療的小鼠中下降。在第 0天和第7天，采用兩次腹膜內(nèi)（i.p.)注射2mg氫氧化鋁（明礬）中的20μgBSA使小鼠 致敏。在第14天至第21天，小鼠i.p.注射20μgBSA、AcES或Ac-TMP-I(--ΜΡ)。從第18 至21天，在輕度麻醉下小鼠鼻內(nèi)（i.η.)注射50ygBSA。第24天，處死小鼠并收集BAL和 肺。簡言之，給小鼠放血，并將套管插入氣管。肺用Iml的PBS洗滌三次。對于差異BAL細(xì) 胞計(jì)數(shù)，用抗CCR3、抗GrU抗CD3和抗CD19單克隆抗體對細(xì)胞進(jìn)行染色，并且通過熒光激 活細(xì)胞分選（FACS)用FACScantoII流式細(xì)胞儀和FACSDiva軟件進(jìn)行分析。嗜酸性粒細(xì) 胞被定義為CCR3+CD3TD19、嗜中性粒細(xì)胞為Gr-1sCCR3TD3XDIT，淋巴細(xì)胞為CD3+CD19+。
[0035] 圖8.IL-5和IL-13Th2細(xì)胞因子在AcES和重組Ac-TMP-I治療的小鼠中降低。肺樣 本在含5%胎牛血清的鈣和無鎂Hanks平衡的鹽溶液中勻漿。用lmg/mlAcES或Ac-TMP-I 在體外再刺激細(xì)胞、或在37°C未刺激三天。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)珠陣列使用FACS陣列進(jìn)行復(fù)合的 IL-5和IL-13分析。
[0036] 圖9.重復(fù)實(shí)驗(yàn)顯示Ac-TMP-I在過敏性哮喘小鼠模型中介導(dǎo)的保護(hù)的穩(wěn)健性。在 Ac-TMP-I治療的小鼠中支氣管肺泡灌洗（BAL)浸潤減少。收集BAL細(xì)胞并通過（FACS)分 析。嗜酸性粒細(xì)胞被定義為CCR3+CD3XD19、嗜中性粒細(xì)胞為Gr-1SCCR3TD3TD19、淋巴細(xì) 胞為⑶3+CD19+。用Ac-TMP-I進(jìn)行治療顯著降低Th2細(xì)胞（如嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞） 進(jìn)入氣道的浸潤。
[0037] 圖10.促炎細(xì)胞因子IL-6、TNFa和IFNy在重組Ac-TMP-I治療的小鼠中降低。 肺樣本在含5%胎牛血清的鈣和無鎂Hanks平衡的鹽溶液中勻漿。用lmg/ml的AcES或 Ac-TMP-I在體外再刺激細(xì)胞、或在37°C未刺激三天。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)珠陣列使用FACS陣列 進(jìn)行復(fù)合的11^-6、幾-12、了嚦〇和正^^分析。
[0038] 圖11.IL-17A在重組Ac-TMP-I治療的小鼠中降低。肺樣本在含5%胎牛血清的鈣 和無鎂Hanks平衡的鹽溶液中勻漿。用lmg/ml的AcES或Ac-TMP-I在體外再刺激細(xì)胞、或 在37°C未刺激三天。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)珠陣列進(jìn)行復(fù)合的IL-17A和MCP-I分析。
[0039] 圖12.Ac-TMP-I在哮喘小鼠模型中預(yù)防OVA誘導(dǎo)的肺細(xì)胞浸潤。與未經(jīng)免疫的 (na〗_ve) (PBS)小鼠相比，來自未經(jīng)治療的OVA攻擊的小鼠的支氣管肺泡灌洗樣本顯示細(xì) 胞數(shù)目的顯著升高。然而，用Ac-TMP-I治療顯著降低來自O(shè)VA攻擊的小鼠的支氣管肺泡灌 洗樣本的總細(xì)胞浸潤。與升高的總細(xì)胞計(jì)數(shù)相符，來自未經(jīng)治療的OVA攻擊的小鼠的BAL 樣本的差異細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示出嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的顯著升高。然而，用Ac-TMP-I治療 防止這種嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤到OVA攻擊的小鼠的肺中。來自O(shè)VA攻擊的小鼠的 腹膜灌洗的總細(xì)胞數(shù)目、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞或嗜中性粒細(xì)胞沒有增加。不像在肺中， Ac-TMP-I不改變總腹膜細(xì)胞計(jì)數(shù)。然而，它的確導(dǎo)致腹膜嗜酸性粒細(xì)胞的顯著減少。針對 BAL和腹膜灌洗總細(xì)胞計(jì)數(shù)，提供來自重復(fù)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。
[0040] 圖13.Th2細(xì)胞因子在Ac-TMP-I治療的小鼠的肺中降低。從個體小鼠的肺中制 備全蛋白提取物，并通過細(xì)胞計(jì)數(shù)珠陣列（CBA)分析IL-5、IL-10和IL-13含量。當(dāng)用 Ac-TMP-I治療時，IL-5、IL-10和IL-13水平顯著降低。如圖12所示，用Ac-TMP-I治療降 低了這些細(xì)胞因子的水平，證實(shí)了炎癥的降低。
[0041] 圖14.促炎細(xì)胞因子在Ac-TMP-I治療的小鼠的肺中降低。從個體小鼠的肺中制 備全蛋白提取物，并通過細(xì)胞計(jì)數(shù)珠陣列（CBA)分析MCP-I和IL-17A含量。Ac-TMP-I存在 時兩種細(xì)胞因子均降低。
[0042] 圖15.Ac-TMP-2在哮喘小鼠模型中預(yù)防OVA誘導(dǎo)的肺細(xì)胞浸潤。與未經(jīng)免疫的 (PBS)小鼠相比，來自未經(jīng)治療的OVA攻擊的小鼠的支氣管肺泡灌洗樣本顯示嗜酸性粒細(xì) 胞、淋巴細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的顯著升高。相反地，在來自這些小鼠的腹膜灌洗樣本中沒有 觀察到這種升高。用Ac-TMP-2治療顯著防止這種嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞 浸潤到OVA攻擊的小鼠的肺中。然而，Ac-TMP-2對來自腹膜灌洗樣本的差異細(xì)胞計(jì)數(shù)沒有 顯著影響。
[0043] 圖16.Ac-TMP-2保護(hù)小鼠免受OVA誘導(dǎo)的肺細(xì)胞浸潤。（A)和⑶在獲得的支氣 管肺泡（A)和腹膜（B)灌洗液中的差異細(xì)胞計(jì)數(shù)。在將套管插入氣管并用3XImLPBS洗 滌之后獲得BALF。通過將3X5mL補(bǔ)充有5%FCS的RPMI注射入腹膜獲得腹膜灌洗。用抗 體對細(xì)胞進(jìn)行染色，并通過流式細(xì)胞術(shù)（FACSCantoII)進(jìn)行分析。在OVA氣霧攻擊之前用 Ac-TMP-2治療的小鼠中，支氣管肺泡灌洗液（BALF)中嗜酸性粒細(xì)胞（E)和淋巴細(xì)胞（L)的 數(shù)目高度顯著降低（P〈〇. 001)。（B)在Ac-TMP-2注射的部位（腹膜），沒有檢測到細(xì)胞數(shù)目 上的這種差異，這突顯出這樣的事實(shí)，即保護(hù)免受細(xì)胞浸潤被限制在炎癥部位。針對BAL和 腹膜灌洗總細(xì)胞計(jì)數(shù)，提供來自重復(fù)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。
[0044] 圖17.Th2細(xì)胞因子在Ac-TMP-2治療的小鼠的肺中降低。從個體小鼠的肺中制備 全蛋白提取物，并通過細(xì)胞計(jì)數(shù)珠陣列（CBA)分析IL-5和IL-13含量。當(dāng)用Ac-TMP-2治 療時，IL-5和IL-13水平都顯著降低。
[0045] 圖18.促炎細(xì)胞因子IL-6和IL-17A在重組Ac-TMP-2治療的小鼠中降低。從個體 小鼠的肺中制備全蛋白提取物，并通過細(xì)胞計(jì)數(shù)珠陣列（CBA)分析IFN-γ、IL-6和IL-17A 含量。沒有觀察到在IFN-Y水平中的變化，在我們的哮喘模型中這是預(yù)料之中的，然而經(jīng) Ac-TMP-2治療，IL-6和IL-17A水平都顯著降低。
[0046] 圖19.Ac-TMP-2在慢性哮喘小鼠模型中降低氣道浸潤。為了研究Ac-TMP-2對慢 性氣道炎癥的長期保護(hù)和功效，使小鼠對OVA致敏，并用5日每日OVA氣霧攻擊兩次，兩次 攻擊之間3周的休息期。（A)如前面所述獲得總細(xì)胞氣道浸潤。（B)差異細(xì)胞計(jì)數(shù)。無論 是在第一次攻擊期間施用Ac-TMP-2 (+/-)還是在兩次攻擊期間施用Ac-TMP-2 (+/+)，都顯 著保護(hù)小鼠免受嗜酸性粒細(xì)胞的氣道浸潤（P〈〇. 〇〇1)。
[0047] 圖20.在OVA誘導(dǎo)的哮喘中預(yù)防性和治療性Ac-TMP-2治療。為了評價當(dāng)以預(yù)防 性（0VA攻擊前）或在治療性（0VA攻擊后）模式施用時，Ac-TMP-2是否能夠局部施用（通 過鼻內(nèi)注射）以及是否其能夠預(yù)防炎癥的發(fā)展，使小鼠對OVA致敏，并且在用OVA氣霧攻擊 小鼠一周之前用4次i.n.Ac-TMP-2注射進(jìn)行治療（預(yù)防性），或者在攻擊開始后兩天用4 次i.n.Ac-TMP-2注射進(jìn)行治療（治療性）。（A)如前面所述獲得總細(xì)胞氣道浸潤。（B)差 異細(xì)胞計(jì)數(shù)。無論是預(yù)防性還是治療性方式用Ac-TMP-2治療小鼠，兩組均顯著保護(hù)免受嗜 酸性粒細(xì)胞的氣道浸潤（P〈〇. 001)。
[0048] 圖21.Th2細(xì)胞因子在預(yù)防性和治療性Ac-TMP-2治療中在BALF中降低。從個體 小鼠的肺中制備全蛋白提取物，并通過細(xì)胞計(jì)數(shù)珠陣列（CBA)分析白細(xì)胞介素-5和IL-13 含量。經(jīng)Ac-TMP-2預(yù)防性和治療性治療時，IL-5和IL-13水平都顯著降低（P〈0. 01和 P〈0. 001)。
[0049] 圖22.Ac-TMP-2誘導(dǎo)積累在黏膜上的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生。未經(jīng)免疫的小鼠采用 Ac-TMP-2或PBS(vcl)i.p.注射治療6天，并且分析腸系膜淋巴結(jié)（MLN)、脾臟和小腸固有 層（laminapropria)的Treg存在。（A)從Ac-TMP-2治療或未治療的小鼠的腸系膜淋巴 結(jié)、脾臟和小腸固有層中制備細(xì)胞。（B)來自MLN、脾臟、幽門淋巴結(jié)（PLN)和小腸黏膜固有 層（LP)的細(xì)胞用CCR9抗體（一種在MLN中產(chǎn)生的細(xì)胞上表達(dá)的特有標(biāo)記物）染色，并用 流式細(xì)胞術(shù)分析。數(shù)據(jù)顯示Ac-TMP-2誘導(dǎo)小腸粘膜中顯著的Treg積累，以及固有層中發(fā) 現(xiàn)的Treg上的CCR9表達(dá)說明它們源自腸系膜淋巴結(jié)（P〈0. 05)。
[0050] 圖23.Ac-TMP-2介導(dǎo)的免受炎癥的保護(hù)，依賴于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）。為了 研究Treg在我們的實(shí)驗(yàn)性哮喘模型中由Ac-TMP-2誘導(dǎo)的保護(hù)中的重要性，我們用白喉毒 素（DT)在經(jīng)工程改造而在Foxp3啟動子下表達(dá)DT受體的轉(zhuǎn)基因小鼠（DEREG小鼠）中選 擇性地耗盡Treg，其中DT受體是Treg的轉(zhuǎn)錄因子。使野生型對照（C57B1/6)和DEREG小 鼠致敏，并用OVA攻擊。相較于用OVA攻擊且暴露至DT的未治療小鼠，用Ac-TMP-2治療的 小鼠具有相當(dāng)?shù)臍獾姥装Y和BAL浸潤水平，其中用Ac-TMP-2治療的小鼠接受DT注射以耗 盡Treg(DEREG小鼠）。這些結(jié)果表明，在我們的小鼠哮喘模型中Treg通過Ac-TMP-2在炎 癥抑制中發(fā)揮必不可少的作用。
[0051] 圖24.在Ac-TMP-2治療的小鼠中Treg對于Th2細(xì)胞因子的抑制是重要的。從個 體小鼠的肺中制備全蛋白提取物，并通過細(xì)胞計(jì)數(shù)珠陣列（CBA)分析IL-5、IL-10和IL-13 含量。當(dāng)在野生型小鼠中用Ac-TMP-2治療時，IL-5、IL-10和IL-13水平顯著降低，然而在Treg被耗盡的DEREG小鼠中用Ac-TMP-2治療沒有顯著差異（#P〈0.Ol和*#P〈0. 001)。
[0052] 圖25.Ac-TMP-2誘導(dǎo)的Treg對于促炎細(xì)胞因子的抑制是重要的。從個體小鼠的 肺中制備全蛋白提取物，并通過細(xì)胞計(jì)數(shù)珠陣列（CBA)分析IFN-γ、白細(xì)胞介素-6、IL-9和 IL-17A、IL-23和MCP-I含量。在野生型小鼠中在Ac-TMP-2存在時，IFN-γ的水平低于檢 測水平（數(shù)據(jù)未示出），并且僅IL-6下調(diào)。正如預(yù)期的，在我們的小鼠哮喘模型中Th-I和 Th-17細(xì)胞因子水平保持在低水平或不變的水平。

【具體實(shí)施方式】
[0053] 本發(fā)明涉及用于降低、減輕和/或預(yù)防炎癥和/或炎癥性疾病或病況（比如哮喘 和/或炎癥性腸?。┑姆椒?。
[0054] 本發(fā)明至少部分地基于這樣一種出乎意料的發(fā)現(xiàn)，即可源自或可獲自鉤蟲的一種 或多種組織金屬蛋白酶抑制蛋白可用于降低、減輕和/或預(yù)防受試者中炎癥和/或炎癥性 疾病或病況（比如哮喘和/或炎癥性腸?。渲兴鲢^蟲包括但不限于犬鉤口線蟲。
[0055] 在具體的方面中，本發(fā)明涉及（a)Ac-TMP-1(SEQIDNO:1)或Ac-TMP-I的生物活 性片段或變體、（b)Ac-TMP-2(SEQIDNO:2)或Ac-TMP-2的生物活性片段或變體、或（c) (a) 和（b)的組合用于降低、減輕和/或預(yù)防炎癥和/或炎癥性疾病或病況（比如哮喘和/或 炎癥性腸?。┑挠猛尽?br> [0056] 貫穿本說明書，除非上下文另有要求，字眼"包括"、"包含"和"含有"將被理解為 暗示包括所述整體（integer)或整體的組,但不排除任何其它整體或整體的組。
[0057] 如本說明書中所用，不定冠詞"一"和"一個"可以指一個實(shí)體或多個實(shí)體（例如 蛋白），并且不應(yīng)被閱讀為或理解為僅限于單個實(shí)體。
[0058] -方面，本發(fā)明提供一種降低或減輕受試者中炎癥的方法，方法包括向受試者施 用治療有效量的：(a)Ac-TMP-1(SEQIDNO:1)或Ac-TMP-I的生物活性片段或變體、（b) Ac-TMP-2(SEQIDNO:2)或Ac-TMP-2的生物活性片段或變體、或（c) (a)和（b)的組合的 步驟。
[0059] 另一方面，本發(fā)明提供一種預(yù)防受試者中炎癥的方法，方法包括向受試者施用 治療有效量的：（a)Ac-TMP-1(SEQIDNO: 1)或Ac-TMP-I的生物活性片段或變體、（b) Ac-TMP-2(SEQIDNO:2)或Ac-TMP-2的生物活性片段或變體、或（c) (a)和（b)的組合的 步驟。
[0060] "降低"，正如在受試者中降低炎癥，意思是指與炎癥相關(guān)癥狀、方面或特性（如發(fā) 紅、發(fā)熱、腫脹、和/或疼痛）的減輕或縮短，或者受試者經(jīng)歷炎癥相關(guān)癥狀、方面或特性的 時間長度的減輕或縮短。這種降低不需要絕對是對受試者有益的。"減輕"，正如在受試者 中減輕炎癥，意思是指與炎癥相關(guān)癥狀、方面或特性（如發(fā)紅、發(fā)熱、腫脹、和/或疼痛）的 嚴(yán)重程度或嚴(yán)重性的降低。這種減輕不需要絕對是對受試者有益的?？墒褂闷胀夹g(shù)人員 已知的任何方法或標(biāo)準(zhǔn)（包括定性和定量的方法和標(biāo)準(zhǔn)）來確定受試者中炎癥的降低和/ 或減輕。
[0061] 應(yīng)當(dāng)理解的是，降低或減輕受試者中炎癥是一種在受試者中治療炎癥的的方法。 如此處所用，"治療"（或"治"或"處理"）是指在炎癥的跡象或癥狀已開始發(fā)展之后，改善 炎癥的跡象或癥狀的治療性干預(yù)。當(dāng)提及炎癥時，術(shù)語"改善"是指任何可觀察到的治療有 益效果?？墒褂闷胀夹g(shù)人員已知的任何方法或標(biāo)準(zhǔn)來確定有益效果。
[0062] 如此處所用，"預(yù)防"（或"防止"或"預(yù)防"）是指在炎癥的癥狀、方面或特性發(fā)作之 前起始的行為過程（如施用治療有效量的Ac-TMP-l/Ac-TMP-2或其生物活性片段或變體）， 從而預(yù)防或降低癥狀、方面（aspect)或特性。應(yīng)當(dāng)理解的是這樣的預(yù)防不需要絕對是對受 試者有益的。"預(yù)防性"治療是指目的在于降低發(fā)展成炎癥癥狀、方面或特性的風(fēng)險，而向沒 有表現(xiàn)出炎癥跡象或僅表現(xiàn)出早期跡象的受試者所施用的治療。
[0063] 如此處所用，"炎癥"是指針對各種類型損傷或感染的公知的局部反應(yīng)，其特征在 于發(fā)紅、發(fā)熱、腫脹和疼痛，并且常常還包括功能障礙或活動性降低。炎癥代表了一種早期 的防御性機(jī)制，以控制（contain)感染并防止感染從初始的病灶發(fā)生擴(kuò)散。炎癥中的主要 事件包括毛細(xì)血管擴(kuò)張以增加血流、改變微脈管系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)、導(dǎo)致血漿和蛋白以及白細(xì)胞 從循環(huán)中逃逸、以及白細(xì)胞從毛細(xì)管遷移并積累在損傷或感染部位。
[0064] 炎癥通常與受試者中的疾病、病癥和/或病況有關(guān)，或者炎癥是受試者中的疾病、 病癥和/或病況所繼發(fā)的，包括免疫疾病、病癥和/或病況（如自身免疫性疾病、病癥和/ 或病況）和過敏性反應(yīng)。示例性免疫疾病、病癥和/或病況包括但不限于阿狄森氏病、強(qiáng) 直性脊柱炎、乳糜瀉、慢性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病（CIDP)、慢性復(fù)發(fā)性多灶性骨髓炎 (CRMO)、克羅恩氏病、脫髓鞘性神經(jīng)病、腎小球性腎炎、肺出血腎炎綜合征、格雷夫斯病、格 林-巴利綜合征、橋本氏腦炎、橋本氏甲狀腺炎、低丙球蛋白血癥、特發(fā)性血小板減少性紫 癜（ITP)、胰島素依賴型糖尿?。?型）、幼年型關(guān)節(jié)炎、川崎綜合征、多發(fā)性硬化、重癥肌無 力、心肌梗塞后綜合征、原發(fā)性膽汁性肝硬化、牛皮癬、特發(fā)性肺纖維化、瑞特綜合征、類風(fēng) 濕關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)病、硬皮病、干燥綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE)、血小板減少性紫癜（TTP)、 潰瘍性結(jié)腸炎、脈管炎、白癜風(fēng)和韋格納肉芽腫。
[0065] 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員之一將理解，消化道疾?。ㄈ缏晕秆谆蜓装Y性腸病，如克 羅恩氏病或潰瘍性結(jié)腸炎）和呼吸系統(tǒng)疾?。ㄈ缦?、肺氣腫、慢性支氣管炎和慢性阻塞性 肺病（COPD))具有炎癥性組成，且因此尤其適用于采用公開的方法進(jìn)行治療。
[0066] 因此，在另一方面，本發(fā)明提供一種治療和/或預(yù)防受試者中炎癥性腸病的方法， 方法包括向受試者施用治療有效量的：(a)Ac-TMP-USEQIDNO:1)或Ac-TMP-I的生物活 性片段或變體、（b)Ac-TMP-2(SEQIDNO:2)或Ac-TMP-2的生物活性片段或變體、或（c) (a) 和（b)的組合的步驟。
[0067] 在一個實(shí)施方式中，炎癥性腸病是克羅恩氏病或潰瘍性結(jié)腸炎。
[0068] 在另一方面，本發(fā)明提供一種治療和/或預(yù)防受試者中哮喘的方法，方法包括向 受試者施用治療有效量的：（a)Ac-TMP-USEQIDNO: 1)或Ac-TMP-I的生物活性片段或變 體、（b)Ac-TMP-2(SEQIDNO:2)或Ac-TMP-2的生物活性片段或變體、或（c) (a)和（b)的 組合的步驟。
[0069] 正如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員之一還將理解，炎癥與受試者中的疾病、病癥和/或病 況有關(guān)，或者炎癥是受試者中的疾病、病癥和/或病況所繼發(fā)的，當(dāng)基線療法難以治療所述 疾病、病癥和/或病況時通常發(fā)生所述炎癥，例如基線療法包括非留體類抗炎藥（NSAID)、 氨基水楊酸鹽、皮質(zhì)類固醇、免疫抑制劑、抗細(xì)胞因子/細(xì)胞因子受體劑（如抗TNFa劑、抗 IL-5齊[J、抗IL-13劑、抗IL-17劑和抗IL-6R劑）、抗生素、及其組合。"難以治療"意指對治 療尤其是對一線治療耐受。
[0070] 術(shù)語"受試者"包括人類和獸受試者。例如，向受試者的施用可以包括向人類受試 者或獸受試者施用。優(yōu)選地，受試者是人類。然而，根據(jù)本發(fā)明的治療性用途還可以應(yīng)用于 哺乳動物，比如家養(yǎng)和伴侶動物、性能動物（performanceanimal)如馬、牲畜、以及實(shí)驗(yàn)動 物。
[0071] "施用"意指通過所選的途徑向受試者引入組合物（如包含Ac-TMP-l/Ac-TMP-2或 其生物活性片段或變體的藥物組合物）。
[0072] 術(shù)語"治療有效量"描述足以在受試者中實(shí)現(xiàn)所需效果的特定藥劑的量，其中受試 者待采用所述藥劑進(jìn)行治療。例如，這可以是包含Ac-TMP-I和/或Ac-TMP-2 (或其生物活 性片段或變體）的組合物的量，其是降低、減輕和/或預(yù)防炎癥所必須的。在一些實(shí)施方式 中，"治療有效量"足以降低或緩解炎癥的癥狀。在其它實(shí)施方式中，"治療有效量"是足以 實(shí)現(xiàn)所需生物效果的量，例如有效減少炎癥相關(guān)的發(fā)紅、發(fā)熱、腫脹和/或疼痛的量。
[0073] 理想情況下，藥劑的治療有效量是足以在受試者中誘導(dǎo)所需結(jié)果而不引起實(shí)質(zhì) 性細(xì)胞毒性效果的量。用于降低、減輕和/或預(yù)防炎癥的藥劑，例如Ac-TMP-I和/或 Ac-TMP-2 (或其生物活性片段或變體）的有效量，將依賴于待治療的受試者、任何相關(guān)疾 病、病癥和/或病況的類型和嚴(yán)重程度、以及治療性組合物的施用方式。
[0074] 治療過程期間，可以以單一劑量或以多劑量，例如每日，來施用包含Ac-TMP-I和/ 或Ac-TMP-2 (或其生物活性片段或變體）的組合物的治療有效量。然而，施用頻率依賴于 所采用的制劑、待治療的受試者、炎癥的嚴(yán)重程度以及療法或組合物的施用方式。
[0075] "Ac-ΤΜΡ-Ι"意指組織金屬蛋白酶抑制劑-1，一種來自犬鉤口線蟲（犬鉤蟲）的金 屬蛋白酶的組織抑制劑。Ac-TMP-I(UniProtKB/Swiss-Prot:#Q963I8)是一種140個氨基酸 的多肽。
[0076] "Ac-TMP-2"意指組織金屬蛋白酶抑制劑-2, 一種來自犬鉤口線蟲的金屬蛋白酶的 組織抑制劑。Ac-TMP-2 (UniProtKB/Swiss-Prot:#BlQ143)是一種 244 個氨基酸的多肽。
[0077] 如此處所用，"生物活性片段"描述Ac-TMP-I或Ac-TMP-2的部分或子序列，該部 分或子序列包含Ac-TMP-I或Ac-TMP-2的結(jié)構(gòu)域，所述生物活性片段具有不少于10%，優(yōu)選 不少于25 %，更優(yōu)選不少于50%，以及甚至更優(yōu)選不少于75%、80 %、85%、90 %或95%的 Ac-TMP-I或Ac-TMP-2的生物活性?？刹捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)可的通常用于鑒定這種活性 的標(biāo)準(zhǔn)測試方法和生物分析來評價這種活性。
[0078] Ac-TMP-I的片段可包含成熟Ac-TMP-I序列的小于120、小于110、小于100、小于 75、或小于50個連續(xù)氨基酸。Ac-TMP-2的片段可包含成熟Ac-TMP-2序列的小于220、小 于200、小于150、小于120、小于110、小于100、小于75、或小于50個連續(xù)氨基酸。也考慮 Ac-TMP-I和/或Ac-TMP-2的多個片段。
[0079] (蛋白的）"結(jié)構(gòu)域"是指蛋白的部分，其共享共同的結(jié)構(gòu)、理化和功能特征（例如 疏水性、極性、球狀、螺旋、或神經(jīng)生長因子樣（netrin-like) (NTR)結(jié)構(gòu)域）或特性（例如 蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)、受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、輔因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域等）。
[0080] 還考慮的是Ac-TMP-I和Ac-TMP-2的變體，相較于野生型Ac-TMP-l/Ac-TMP-2,所 述變體包含Ac-TMP-I(或其片段）或Ac-TMP-2 (或其片段）中的一個或多個氨基酸取代、 插入和/或刪除。
[0081] 通常情況下，相對于蛋白，"變體"蛋白具有已被不同氨基酸所替換的一個或多個 氨基酸。本領(lǐng)域中很好理解的是，一些氨基酸可以改變?yōu)榫哂写篌w相似的特性而不改變蛋 白活性性質(zhì)的其它氨基酸（即，保守取代）。
[0082] 還應(yīng)當(dāng)理解的是，參考序列（如Ac-TMP-l/Ac-TMP-2 (或其片段））的一個 或多個氨基酸殘基，可進(jìn)行修飾或刪除、或添加額外序列，而基本上不改變Ac-TMP-I/ Ac-TMP-2(或其片段）的生物活性。可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)可通常用于鑒定這種活性的 標(biāo)準(zhǔn)測試方法和生物分析來評價這種活性。
[0083] 術(shù)語"變體"包括Ac-TMP-I和Ac-TMP-2的模擬肽和直系同源物。"模擬肽"是 指含有能夠模仿或拮抗天然母體肽的生物作用的非肽結(jié)構(gòu)元件的分子。模擬肽的實(shí)例 包括肽化合物以及"逆反"0^壯〇-11^^^〇)肽（參見，例如美國專利號4,522,752)，其 中肽化合物中肽主鏈上取代有一個或多個苯二氮卓分子（見，例如James等人，Science 260:1937-42, 1993)。該術(shù)語也指除了天然存在的氨基酸以外的半體（moiety)，其在構(gòu)象上 和功能上作為蛋白中特定氨基酸的取代而沒有以顯著的程度負(fù)面干擾蛋白的功能。氨基酸 模擬物的實(shí)例包括D-氨基酸?？墒褂霉碾暮铣煞椒ㄖ苽淙〈幸粋€或多個D-氨基酸 的蛋白。其它取代包括具有帶有官能團(tuán)的變體側(cè)鏈的氨基酸類似物，如，例如b-氰丙氨酸、 刀豆氨酸、甲烯胱氨酸（djenkolicacid)、正亮氨酸、3-磷酸絲氨酸、高絲氨酸、二羥苯丙氨 酸、5-羥色氨酸、1-甲基組氨酸和3-甲基組氨酸。
[0084] Ac-TMP-I和Ac-TMP-2的"直系同源物"是指來自其它腸蠕蟲（即，鉤蟲、鞭 蟲和蛔蟲）的TMP直系同源物，其中腸蠕蟲包括人類鉤蟲，如例如美洲鉤蟲（Necator americanus)、十二指腸鉤蟲（Ancylostomaduodenale)和錫蘭鉤 口線蟲（Ancylostoma ceylanicum),以及豬鞭蟲，如例如豬毛尾線蟲（Trichurissuis)和毛首鞭形線蟲 (Trichuristrichiura)〇
[0085] 在一個實(shí)施方式中，蛋白變體或直系同源物與參考氨基酸序列如SEQIDNO:1或 SEQIDN0:2共享至少70%、優(yōu)選至少75%、80%或85%，更優(yōu)選至少90%、95%、98%、或 99 %的序列同一性。
[0086] 優(yōu)選地，序列同一性被測量超過至少60%，更優(yōu)選超過至少75%，更優(yōu)選超過至 少90%或更優(yōu)選超過至少95%、98%的參考序列的全長，或基本上是參考序列的全長。
[0087] 為了確定百分比序列同一'丨生，通過算法的計(jì)算機(jī)執(zhí)行算法（Intelligenetics的 Geneworks程序；WisconsinGeneticsSoftwarePackage版本 7. 0 中的GAP、BESTFIT、 FASTA以及TFASTA，遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)小組，WI，USA)或者通過檢查和任何各種入選方法 產(chǎn)生的最優(yōu)比對（即，覆蓋比對窗產(chǎn)生最高的同源性百分比），可進(jìn)行氨基酸和/或核 苷酸序列的最佳比對。還可以參考BLAST程序家族，例如Altschul等人，Nucl.Acids Res. 25:3389-402, 1997 所公開的。
[0088] 序列分析的詳細(xì)討論可見于CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，Ausubel 等人主編0〇1?1町167&5〇118 11^附，1995-1999)的19.3單元。
[0089] 可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員之一已知的各種標(biāo)準(zhǔn)、誘變方法來制備變體蛋白。突變 可涉及單基因、基因塊或整個染色體的核苷酸序列的修飾、以及一個或多個突變蛋白的隨 后生產(chǎn)。單基因中的改變可以是點(diǎn)突變的結(jié)果，點(diǎn)突變涉及DNA序列中單個核苷酸堿基的 刪除、添加或取代，或者它們可以是涉及插入或刪除大量核苷酸的改變的結(jié)果。
[0090] 暴露于化學(xué)或物理誘變劑之后發(fā)生突變。這種突變誘導(dǎo)劑包括電離輻射、紫外線 和多種（diversearrayof)化學(xué)劑，如燒基化劑和多環(huán)芳族經(jīng)，所有這些都能夠直接或間 接地與核酸相互作用（通常在一些代謝生物轉(zhuǎn)化之后）。當(dāng)復(fù)制或修復(fù)受到影響的DNA時， 這種環(huán)境劑引起的DNA損傷可導(dǎo)致堿基序列的修飾，并因此導(dǎo)致突變，其隨后可以在蛋白 水平上得以體現(xiàn)。通過使用特定的靶向方法，突變還可以是定點(diǎn)的。
[0091] 用于生產(chǎn)包含一個或多個突變的Ac-TMP-I和Ac-TMP-2的誘變方法，包括但不限 于隨機(jī)誘變（例如，基于通過插入已知DNA片段使基因失活的插入誘變、化學(xué)誘變、輻射誘 變、易錯PCR(Cadwell和Joyce,PCRMethodsAppl. 2:28-33, 1992))以及定點(diǎn)誘變（例如， 使用編碼所需突變的DNA序列的特異寡核苷酸引物序列）。定點(diǎn)誘變的其它方法公開于 美國專利號 5,220,007 ;5, 284, 760 ;5, 354, 670 ;5, 366, 878 ;5, 389, 514 ;5, 635, 377 ;以及 5, 789, 166。
[0092] 可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適方法來制備分離的Ac-TMP-I和 Ac-TMP-2 (包括片段和變體）。
[0093] 在一個實(shí)施方式中，通過化學(xué)合成生產(chǎn)Ac-TMP-I和Ac-TMP-2 (包括片段和變體）。 化學(xué)合成技術(shù)是本領(lǐng)域公知的，盡管如此技術(shù)人員可以參考，例如CURRENTPROTOCOLSIN PROTEINSCIENCE.Coligan等人編，JohnWiley&SonsNY(1995-2001)第 18 章的合適方法。
[0094] 在另一個實(shí)施方式中，Ac-TMP-I和Ac-TMP-2 (包括片段和變體）制備成重組蛋白。
[0095] 然而，重組蛋白的生產(chǎn)是本領(lǐng)域中公知的，技術(shù)人員可參考，例如Sambrook等 人，MOLECULARCLONING.ALaboratoryManual(ColdSpringHarborPress, 1989)，尤 其是 16 和 17 節(jié)；CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY.Ausubel等人編（John Wiley&Sons,Inc. 1995-1999)尤其是 10 和 16 章；以及CURRENTPROTOCOLSINPROTEIN SCIENCE.Coligan等人編（JohnWiley&Sons,Inc. 1995-1999)尤其是 1、5 和 6 章中表述的 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程。
[0096] 除了治療有效量的Ac-TMP-I和/或Ac-TMP-2 (或其生物活性片段或變體）以外， 可以向有需求的受試者施用本領(lǐng)域技術(shù)人員之一已知用于降低、減輕和/或預(yù)防炎癥（和/ 或用于治療或預(yù)防炎癥相關(guān)的疾病、病癥和/或病況）的一種或多種其它藥劑的各種組合。 艮P，除了治療有效量的Ac-TMP-I和/或Ac-TMP-2 (或其生物活性片段或變體）以外，可以 向受試者施用常規(guī)用于治療和/或預(yù)防炎癥的一種或多種其它藥劑。
[0097] 例如，在用于降低、減輕和/或預(yù)防炎癥的某些實(shí)施方案中，非甾體類抗炎藥 (NSAID)、氨基水楊酸鹽、皮質(zhì)類固醇、免疫抑制劑、抗細(xì)胞因子/細(xì)胞因子受體劑（如抗 TNFα劑、抗IL-5劑、抗IL-13劑、抗IL-17劑和抗IL-6R劑）尤其是抗細(xì)胞因子/細(xì)胞因 子受體抗體、抗生素及其組合可以與Ac-TMP-I和/或Ac-TMP-2 (或其生物活性片段或變 體）一同施用。
[0098] 在某些實(shí)施方式中，一種或多種其它藥劑提供對Ac-TMP-I和/或Ac-TMP-2 (或其 生物活性片段或變體）的節(jié)約效果。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，Ac-TMP-I和/或Ac-TMP-2 (或 其生物活性片段或變體）提供對一種或多種其它藥劑的節(jié)約效果。在更進(jìn)一步的實(shí)施方式 中，一種或多種其它藥劑提供對Ac-TMP-I和/或Ac-TMP-2 (或其生物活性片段或變體）作 用的互補(bǔ)效果，優(yōu)選消除或減少（和/或預(yù)防）一種或多種炎癥相關(guān)癥狀的頻率或嚴(yán)重程 度。
[0099] 如本領(lǐng)域技術(shù)人員之一眾所周知的，非甾體類抗炎藥（NSAID)也被稱為非甾體抗 炎藥劑（NSAIA)，是具有鎮(zhèn)痛、解熱和抗炎作用的藥物，并且包括水楊酸鹽（例如，阿司匹 林）和丙酸衍生物（例如布洛芬和萘普生）。
[0100] 本領(lǐng)域熟知氨基水楊酸鹽用于治療炎癥性腸?。ㄌ貏e是潰瘍性結(jié)腸炎），氨基水 楊酸鹽包括，例如巴柳氮、美沙拉嗪、奧沙拉嗪和柳氮磺批陡（sulfasalazine)。
[0101] 如本領(lǐng)域技術(shù)人員之一眾所周知的，皮質(zhì)類固醇是極為類似皮質(zhì)醇（由腎上腺分 泌的激素）的藥物。示例性的皮質(zhì)類固醇包括但不限于可的松、潑尼松、潑尼松龍和甲潑尼 龍。
[0102] 本領(lǐng)域熟知免疫抑制劑用于治療某些疾病或病況相關(guān)的炎癥，免疫抑制劑包括例 如藥物環(huán)孢素、硫唑嘌呤和麥考酚酸鹽/酯。
[0103] 如本領(lǐng)域技術(shù)人員之一眾所周知的，抗細(xì)胞因子/細(xì)胞因子受體劑（如抗TNFa 齊[J、抗IL-5齊[J、抗IL-13劑、抗IL-17齊[J和抗IL-6R劑）包括但不限于小分子抑制劑和抗體。
[0104] 在一些實(shí)施方式中，Ac-TMP-I和/或Ac-TMP-2 (或其生物活性片段或變體）與一 種或多種其它藥劑的組合在治療和/或預(yù)防炎癥當(dāng)中產(chǎn)生協(xié)同作用。因此，本發(fā)明還包括 一種在治療任何使用藥劑的病況（如炎癥和任何相關(guān)疾病、病癥和/或病況）中增強(qiáng)這種 藥劑治療有效性的方法。
[0105] 在一個實(shí)施方式中，在施用一種或多種其它藥劑之前，施用Ac-TMP-I和/或 Ac-TMP-2 (或其生物活性片段或變體）。在另一實(shí)施方式中，在施用一種或多種其它藥劑之 后，施用Ac-TMP-I和/或Ac-TMP-2 (或其生物活性片段或變體）。在又一實(shí)施方式中，在 施用一種或多種其它藥劑的同時，施用Ac-TMP-I和/或Ac-TMP-2 (或其生物活性片段或變 體）。在另一實(shí)施方式中，施用Ac-TMP-I和/或Ac-TMP-2 (或其生物活性片段或變體）并 且施用一種或多種其它藥劑（無論是相繼地還是同時地）導(dǎo)致炎癥的降低或減輕，而這種 降低或減輕高于在不施用另一種的情況下施用Ac-TMP-I和/或Ac-TMP-2 (或其生物活性 片段或變體）或者施用一種或多種其它藥劑時所產(chǎn)生的這種降低或減輕。
[0106] 如本領(lǐng)域技術(shù)人員之一所公知的，可通過可用于聯(lián)合治療性組合物的任何常規(guī) 方法/途徑，來施用Ac-TMP-I和/或Ac-TMP-2 (或其生物活性片段或變體）以及一種 或多種其它藥劑。這種方法包括但不限于，通過微針注射入特定組織部位的施用，如美 國專利6, 090, 790中描述的；應(yīng)用到炎癥部位的局部霜劑、洗劑或密封劑敷料（sealant dressing)，如美國專利6, 054, 122中描述的；或者釋放Ac-TMP-I和/或Ac-TMP-2(或其生 物活性片段或變體）的植入物，如國際公開WO99/47070中描述的。
[0107] 在此方面中，包含Ac-TMP-I和/或Ac-TMP_2(或其生物活性片段或變體）以及可 選地一種或多種其它藥劑的組合物，可以與如下聯(lián)合施用、或作為如下的組成而施用：生物 材料、生物聚合物、無機(jī)材料如羥基磷灰石或其衍生物、外科植入物、假體、傷口敷料、壓布 (compress)、繃帶等經(jīng)過適當(dāng)浸漬、涂布或以其它方式而包含所述組合物的。
[0108] 合適地，所述組合物包含合適的藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
[0109] 優(yōu)選地，所述藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑適于施用哺乳動物，并且更優(yōu) 選人類。
[0110] "藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑"指的是可以被安全地用于全身施用的固 體或液體填充劑、稀釋劑或包封物質(zhì)。取決于具體的施用途徑，可以使用在本領(lǐng)域中公知的 各種載體。這些載體可選自糖、淀粉、纖維素及其衍生物、麥芽、明膠、滑石、硫酸鈣、植物油、 合成油、多元醇、藻酸、磷酸鹽緩沖溶液、乳化劑、等滲鹽水和鹽（例如，包括鹽酸鹽、溴化物 和硫酸鹽的無機(jī)酸鹽，如醋酸鹽、丙酸鹽和丙二酸鹽的有機(jī)酸）、和無致熱原的水。
[0111] 描述藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑和賦形劑的一個有用參考是Remington's PharmaceuticalSciences(MackPublishingCo.NJUSA,1991)〇
[0112] 可以采用任何安全的施用途徑用于向受試者提供包含Ac-TMP-I和/或 Ac-TMP-2(或其生物活性片段或變體）以及可選地一種或多種其它藥劑的組合物。例如，可 采用口服、直腸、腸胃外、舌下、口腔、靜脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、肌內(nèi)、真皮內(nèi)、皮下、吸入、眼內(nèi)、腹膜 內(nèi)、腦室內(nèi)、經(jīng)皮等。
[0113] 劑型包括片劑、分散劑、混懸劑、注射劑、溶液、糖漿劑、錠劑、膠囊劑、栓劑、氣霧 齊U、經(jīng)皮貼劑等。這些劑型也可包括專門為此目的而設(shè)計(jì)的注射或植入控制釋放裝置，或經(jīng) 改造而用于以這種方式發(fā)揮額外作用的植入物的其它形式。Ac-TMP-I和/或Ac-TMP-2 (或 其生物活性片段或變體）以及可選地一種或多種其它藥劑的控制釋放，可以通過例如將 Ac-TMP-I和/或Ac-TMP-2 (或其生物活性片段或變體）以及可選地一種或多種其它藥劑同 疏水性聚合物進(jìn)行涂布而起作用，疏水性聚合物包括丙烯酸樹脂、蠟、高級脂肪醇、聚乳酸 和聚乙醇酸、以及某些纖維素衍生物如羥丙基甲基纖維素。此外，控制釋放可通過使用其它 聚合物基質(zhì)、脂質(zhì)體和/或微球而進(jìn)行。
[0114] 可以按照與劑量制劑兼容的方式，并且以藥學(xué)/治療有效的量施用上述組合物。 在本發(fā)明的上下文中，施用至受試者的劑量，應(yīng)足以在受試者中在一段適當(dāng)?shù)臅r間內(nèi)實(shí)現(xiàn) 有益反應(yīng)（例如，炎癥的降低）。待施用的Ac-TMP-I和/或Ac-TMP-2 (或其生物活性片段 或變體）的量可依賴于待治療的受試者，包括年齡、性別、體重和其總體健康狀況、取決于 本領(lǐng)域普通技術(shù)操作者的判斷的因素。
[0115] 此處所述組合物還可包括表達(dá)載體（vector)，如病毒載體（如，痘病毒、腺病毒和 腺病毒相關(guān)病毒（AAV)、逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體、以及源自單純皰疹病毒和巨細(xì)胞病毒的 載體）?；虔煼ㄒ策m用于這方面，例如根據(jù)美國專利5, 929, 040和美國專利5, 962, 427所 述的方法。
[0116] 因此，可以容易地理解本發(fā)明并付諸實(shí)際效果，提供以下非限制性實(shí)施例。
[0117] 實(shí)施例
[0118] 實(shí)施例1
[0119] 重組Ac-TMP-I和Ac-TMP-2 抑制IBD(TNBS模型）
[0120]動物和TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎
[0121] 在它們用于實(shí)驗(yàn)之前，允許六周齡的雄性瑞士C57B1/6小鼠（體重20_25g，西澳大 利亞州，珀斯，動物資源中心）適應(yīng)七天。根據(jù)澳洲動物權(quán)利和規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)它們。所有涉 及小鼠的程序得到詹姆斯庫克大學(xué)動物倫理委員會的批準(zhǔn)。
[0122] 通過Neurath等人（JExpMed182:1281-90, 1995)描述的TNBS腔內(nèi)注射來誘導(dǎo) 結(jié)腸炎。簡單地說，小鼠禁食24小時同時自由飲水。通過i.p.注射氯胺酮（50μg/kg)和 甲苯噻嗪（5μg/kg)的混合物將它們麻醉。接下來，通過3. 2cm長的柔性導(dǎo)管直腸內(nèi)注射 100μL45%乙醇溶液中的2. 5mgTNBS。TNBS注射后，小鼠在45°位置倒置保持一分鐘以 防止TNBS溶液的泄漏，然后將小鼠放置在其籠中自由獲得食物和水。
[0123] 實(shí)駘規(guī)稈
[0124] 在第 0 天，小鼠接受 20μg的AcES、Ac-TMP-1、Ac-TMP-2、變性Ac-TMP-2 或模擬 PBS注射的單次腹膜注射。五個小時后，在輕度麻醉下，它們接受直腸內(nèi)注射在45%乙醇中 的2至2. 5mg的TNBS。從第0天至第3天，每日監(jiān)測小鼠的體重減輕、活動性、總體外觀和 腹瀉的出現(xiàn)。在第3天，將小鼠處死并收集結(jié)腸用于評價炎癥（結(jié)腸長度、壁增厚、水腫和 潰瘍）。
[0125]
[0126] 在兩個獨(dú)立的TNBS結(jié)腸炎實(shí)驗(yàn)中，重組Ac-TMP-I和Ac-TMP-2提供對體重減輕的 優(yōu)異保護(hù)（圖3至圖6)。進(jìn)一步評價Ac-TMP-2的臨床和宏觀分?jǐn)?shù)以及結(jié)腸長度，Ac-TMP-2 在這方面在腸道病理中提供顯著的降低（圖4至圖6)。有趣的是，如宏觀分?jǐn)?shù)評價所示，通 過胰蛋白酶和加熱使Ac-TMP-2變性，在我們的炎癥性結(jié)腸炎小鼠模型中消除了Ac-TMP-2 的保護(hù)活性（圖6)。
[0127] 實(shí)施例2
[0128] 用重組Ac-TMP-I調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)性哮喘
[0129] 動物和BSA誘導(dǎo)的哮喘
[0130] 在第0天和第7天，采用兩次腹膜內(nèi)（i.p.)注射2mg氫氧化鋁（明礬）中的20μg BSA使小鼠致敏。在第14天至第21天，小鼠i.p.注射20μgAcES或Ac-TMP-I。從第18 至第21天，在輕度麻醉下小鼠鼻內(nèi)（i.η.)注射50ygBSA。第24天，處死小鼠并收集組織 樣本。
[0131]MM.
[0132] 為了研究AcES或Ac-TMP-I是否能夠在小鼠中防止過敏性氣道炎癥，在攻擊之前 連續(xù)4天，以及在攻擊的同時再持續(xù)4天，每日用AcES或Ac-TMP-I(20μgi.p.)治療BALB/ c小鼠。相較于PBS模擬注射組，AcES和Ac-TMP-I治療的小鼠顯示顯著降低的嗜酸性粒細(xì) 胞、肺的血管周和支氣管周的細(xì)胞浸潤（圖7和9)。與未經(jīng)免疫的組相比，PBS處理的BSA 攻擊的小鼠顯示增高的Th2細(xì)胞因子，如白介素（IL)-5和IL-13,以及炎癥標(biāo)記物如IL-6 的水平（圖8和10)。我們發(fā)現(xiàn)AcES和Ac-TMP-I治療（分別）導(dǎo)致肺中一倍至五倍以下 的IL-5、以及兩倍以下的IL-13(圖8)。在AcES或Ac-TMP-I治療的小鼠中，炎癥細(xì)胞因子 IL-6也降低兩至三倍（圖10)。有趣的是，雖然促炎細(xì)胞因子TNFa或IFNγ不直接與哮 喘誘導(dǎo)的炎癥有關(guān)，但在AcES治療的小鼠中，其水平（分別）增加三和五倍（圖10)。然 而，水平保持不受Ac-TMP-I治療的影響，這表明Ac-TMP-I被很好地耐受并不誘導(dǎo)炎癥反 應(yīng)。IL-12和MCP-I水平保持不受AcES或Ac-TMP-I治療的影響，這意味著防止BSA誘導(dǎo)的 炎癥不需要誘導(dǎo)Thl反應(yīng)，并且不影響單核細(xì)胞趨化作用（圖10和11)。出人意料的是， AcES或Ac-TMP-I治療誘導(dǎo)肺中IL-17A水平2至3倍的降低，其中高水平已被報道與嚴(yán)重 哮喘誘導(dǎo)的炎癥和氣道高反應(yīng)性相關(guān)（圖11)?？傊?，這些結(jié)果表明AcES和Ac-TMP-I顯著 降低BSA誘導(dǎo)的嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的氣道浸潤，以及Th2和Thl7反應(yīng)，以及促炎細(xì) 胞因子比如IL-6。
[0133] 實(shí)施例3
[0134] 用重組Ac-TMP-1/2調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)性哮喘
[0135] 動物和OVA誘導(dǎo)的哮喘
[0136] 在第0天和第7天，采用兩次腹膜內(nèi)（i.p.)注射2mg氫氧化鋁（明礬）（Pierce)中 的20ygOVA進(jìn)行致敏。在第14天至第21天，小鼠i.p.注射20ygAc-TMP-I或Ac-TMP-2。 從第18至22天，使用超聲霧化器將小鼠暴露于OVA(0. 25% )氣霧20min。第24天，分析 小鼠。
[0137] 第24天，處死小鼠并收集支氣管肺泡灌洗。計(jì)數(shù)細(xì)胞，并用抗SiglecF或抗CCR3、 抗GrU抗CD3和抗CD19單克隆抗體對細(xì)胞進(jìn)行染色，并且通過熒光激活細(xì)胞分選（FACS) 用FACScantoII流式細(xì)胞儀和FACSDiva軟件進(jìn)行分析。嗜酸性粒細(xì)胞被定義為CCR3+ 或SiglecF+CD3_CD19_，嗜中性粒細(xì)胞為Gr-l*SiglecF_CD3_CD19_，淋巴細(xì)胞為CD3+CD19+。
[0138] 第24天，處死小鼠并收集腹膜灌洗。簡言之，用5ml補(bǔ)充有5%FCS的冰冷HBSS 洗兩次腹膜。針對差異PL細(xì)胞計(jì)數(shù)，用抗CCR3、抗GrU抗CD3和抗CDl9單克隆抗體對細(xì)胞 進(jìn)行染色，并且通過熒光激活細(xì)胞分選（FACS)用FACScantoII流式細(xì)胞儀和FACSDiva 軟件進(jìn)行分析。
[0139] 取得來自每個個體小鼠的肺樣本，并在含5 %胎牛血清的鈣和無鎂Hanks平衡鹽 溶液中勻漿。用lmg/mlAc-TMP-I在體外再次刺激細(xì)胞、或在37°C未刺激保持三天。收集來 自這些培養(yǎng)物的上清，并通過細(xì)胞計(jì)數(shù)珠陣列和FACS分析評價IL-5、IL-10、IL-13、MCP-I 和IL-17A水平?；蛘?，在含蛋白酶混合物抑制劑的鈣和無鎂Hanks平衡鹽溶液中，從個體 小鼠的速凍肺中制備全蛋白提取物。通過CBA分析提取物含量。
[0140]
[0141] 在我們實(shí)驗(yàn)室之前產(chǎn)生的結(jié)果表明，AcES的復(fù)合組合物誘導(dǎo)多種T細(xì)胞反應(yīng)，包 括與嗜酸性粒細(xì)胞的腹膜浸潤相關(guān)的強(qiáng)Th2反應(yīng)。為了驗(yàn)證Ac-TMP-I或Ac-TMP-2在腹 膜中沒有比氣道誘導(dǎo)更強(qiáng)的趨化信號，與支氣管肺泡灌洗并行的是，收集未經(jīng)免疫的小鼠、 PBS模擬注射、Ac-TMP-I或Ac-TMP-2治療的小鼠的腹腔灌洗，并通過FACS分析（圖12,圖 15和圖16)。然而相較于模擬注射組，用Ac-TMP-I和Ac-TMP-2治療的小鼠氣道中顯示顯 著減低的嗜酸性粒細(xì)胞，在腹膜中沒有嗜酸性粒細(xì)胞浸潤（圖12、圖15和圖16)，這表示 Ac-TMP-I和Ac-TMP-2防止僅在過敏或炎癥反應(yīng)部分誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞。
[0142] 用OVA體外刺激，來自O(shè)VA攻擊的小鼠的肺細(xì)胞表現(xiàn)出提高水平的IL-5、IL-10和 IL-13分泌（圖13)。另一方面，當(dāng)用OVA刺激時，MCP-I和IL-17A的上清水平在PBS模擬 和OVA攻擊的小鼠肺細(xì)胞中均相似地提高（圖14)。與支氣管肺泡灌洗中的發(fā)現(xiàn)一致，在 Ac-TMP-I治療的小鼠OVA刺激的肺細(xì)胞中Th2細(xì)胞因子IL-5、IL-10和IL-13、以及促炎細(xì) 胞因子MCP-I和IL-17A的水平降低（圖13和14)。類似地，在Ac-TMP-2治療的小鼠中， 肺細(xì)胞因子含量顯著降低（圖17和18)表明Ac-TMP-2有效地抑制Th2和促炎細(xì)胞因子如 IL-6 和IL-17A。
[0143] 實(shí)施例4
[0144] 用重組Ac-TMP-2調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)性慢性哮喘
[0145] 動物和OVA誘導(dǎo)的慢件哮喘
[0146] 在第0天和第7天，采用兩次腹膜內(nèi)（i.p.)注射2mg氫氧化鋁（明礬）（Pierce) 中的20μgOVA進(jìn)行致敏。在第14天至第18天，小鼠i.p.注射20μgAc-TMP-2或PBS 對照溶液。從第17至20天以及36至40天，使用超聲霧化器將小鼠暴露于OVA(0. 25% ) 氣霧中保持20min。第36至40天，一組之前用Ac-TMP-2治療的小鼠再次i.p.注射20μg Ac-TMP-2。剩下的小鼠，無論之前用Ac-TMP-2治療與否，都i.p.注射PBS對照溶液。第42 天分析小鼠的氣道炎癥。
[0147] MS
[0148] 無論是僅在第一次OVA攻擊期間施用Ac-TMP-2 (+/_)或是在兩組OVA攻擊期間施 用Ac-TMP-2 (+/+)，為了評價Ac-TMP-2在慢性哮喘的小鼠模型中是否降低氣道炎癥，收集 未經(jīng)免疫的小鼠、PBS模擬注射治療的小鼠、或Ac-TMP-2治療的小鼠（+/-和+/+)的支氣 管肺泡灌洗，并通過FACS分析（圖19)。在這種OVA誘導(dǎo)的慢性哮喘模型中，無論是在第一 次攻擊期間（+/_)還是兩次攻擊（+/+)期間施用Ac-TMP-2,相較于PBS模擬注射治療的小 鼠，經(jīng)治療的小鼠顯示總細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的氣道浸潤的顯著降低（圖19)。
[0149] 實(shí)施例5
[0150] 用重組Ac-TMP-2調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)性哮喘
[0151] 動物和OVA誘導(dǎo)的哮喘
[0152] 在第0天和第7天，采用兩次腹膜內(nèi)（i.P.)注射2mg氫氧化錯（明研^) (Pierce) 中的20μgOVA進(jìn)行致敏。在第14天至第18天，一組OVA致敏的小鼠鼻內(nèi)（i.η.)注射 20μgAc-TMP-2 (預(yù)防性治療）。從第22至26天，使用超聲霧化器將OVA致敏的小鼠暴露 于OVA(0.25 % )氣霧中保持20min。第24至28天，第二組OVA致敏的小鼠鼻內(nèi)（i.η.)注 射20μgAc-TMP-2 (治療性治療）。第30天分析小鼠的氣道炎癥。
[0153] MS
[0154] 當(dāng)以預(yù)防性（Tp，OVA攻擊之前）或治療性（Tc,OVA攻擊之后）方式給予時，為 了確定通過鼻內(nèi)注射局部施用的Ac-TMP-2是否能夠減弱氣道炎癥，收集未經(jīng)免疫的小鼠、 PBS模擬注射治療的OVA攻擊的小鼠、或Ac-TMP-2治療的OVA攻擊的小鼠（Tc和Tp)的支 氣管肺泡灌洗，并通過FACS進(jìn)行分析，從中獲得總的和差異細(xì)胞計(jì)數(shù)（圖20)。無論小鼠是 否按照預(yù)防性或治療性方式進(jìn)行治療，鼻內(nèi)Ac-TMP-2顯著減弱總的和嗜酸性粒細(xì)胞的氣 道細(xì)胞浸潤（圖20)。重要的是，這些數(shù)據(jù)突顯出Ac-TMP-2不僅是經(jīng)腸胃外途徑還可以經(jīng) 局部施用來預(yù)防這種小鼠哮喘模型中的氣道炎癥。
[0155] 從未經(jīng)免疫的小鼠、PBS模擬注射治療的OVA攻擊的小鼠、或Ac-TMP-2治療的OVA 攻擊的小鼠（Tc和Tp)的肺制備全蛋白提取物，并通過細(xì)胞計(jì)數(shù)珠陣列（CBA)分析Th2細(xì) 胞因子IL-5和IL-13。相較于未經(jīng)免疫的組，PBS治療的OVA攻擊的小鼠顯示顯著提高的 IL-5和IL-13水平（圖21)。我們發(fā)現(xiàn)用Ac-TMP-2進(jìn)行治療，無論是預(yù)防性還是治療性方 式，均顯著降低IL-5和IL-13水平（圖21)?？傊@些發(fā)現(xiàn)說明當(dāng)鼻內(nèi)施用Ac-TMP-2時 顯著降低OVA誘導(dǎo)的嗜酸性粒細(xì)胞的氣道浸潤以及相關(guān)的Th2炎癥反應(yīng)。
[0156] 實(shí)施例6
[0157] 用重組Ac-TMP-2調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg)
[0158] 動物和調(diào)節(jié)件T細(xì)朐
[0159] 小鼠采用Ac-TMP-2 (20μg)或PBS腹膜內(nèi)注射6天，并且收集和分析腸系膜淋巴 結(jié)（MLN)、脾臟和小腸固有層（LP)的Treg存在。分離來自各組織的個體細(xì)胞，并染色Treg 標(biāo)記物⑶4、⑶25和Foxp3,隨后通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。來自MLN、脾臟和幽門淋巴結(jié) (PLN)以及LP的Treg進(jìn)一步用CCR9抗體染色，并通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析來確定其組織 來源。
[0160] 結(jié)果
[0161] 向未經(jīng)免疫的小鼠施用Ac-TMP-2顯著誘導(dǎo)Treg募集至小腸的固有層（圖22)。 相反地，用Ac-TMP-2進(jìn)行治療觀察到來自腸系膜淋巴結(jié)（MLN)的Treg的頻率顯著減少（圖 22) 。這些數(shù)據(jù)表明了Treg從MLN到腸黏膜的遷移模式。為了支持這一點(diǎn)，60%的固有層 Treg表達(dá)趨化因子受體CCR9,這表明它們已經(jīng)印刻在（imprintedin)內(nèi)臟相關(guān)引流淋巴 結(jié)中（即MLN)(圖22)。這種觀察與數(shù)據(jù)相符，表明MLN所產(chǎn)生的Treg積聚在粘膜上以便 維持對普遍存在的抗原的耐受（Navarro等人，MucosalImmunol. 4:53-652011)。
[0162] 實(shí)施例7
[0163] 用重組Ac-TMP-2調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)性哮喘中的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg)
[0164] 動物和OVA誘導(dǎo)的哮喘
[0165] 為了研究在我們的OVA誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性哮喘模型中Treg對Ac-TMP-2誘導(dǎo)的 保護(hù)的貢獻(xiàn)，我們在OVA致敏和暴露之前在選擇性地耗盡小鼠中Treg。通過在經(jīng)工程 改造而表達(dá)DT受體的轉(zhuǎn)基因小鼠中使用白喉毒素（DT)實(shí)現(xiàn)這種耗盡，其中DT受體 在Treg特異性Foxp3啟動子的控制下（DEREG小鼠；Lahl和SparwasserMethodsMol Biol. 707:157-722011)。然后在第0天和第7天，通過兩次i.p.注射2mg氫氧化鋁（明 研J(Pierce)中的20μgOVA使野生型和DEREG小鼠致敏。在第14天至第21天，致敏的野 生型和DEREG小鼠i.p.注射20μgAc-TMP-2或PBS對照溶液。從第18至22天，使用超 聲霧化器將OVA致敏的小鼠暴露于OVA(0. 25% )氣霧中保持20min。第24天，分析小鼠的 氣道炎癥。從采用PBS模擬注射或Ac-TMP-2治療的未經(jīng)免疫的野生型小鼠和致敏的野生 型以及DEREG小鼠中收集支氣管肺泡灌洗，并通過FACS分析，從中獲得差異細(xì)胞計(jì)數(shù)（圖 23) 。從各治療組小鼠的肺制備全蛋白提取物，并分析Th2相關(guān)細(xì)胞因子（圖24)和促炎細(xì) 胞因子（圖25)的蛋白表達(dá)。
[0166] MS
[0167] 與上述實(shí)施例3相似，用Ac-TMP-2治療顯著降低OVA攻擊的野生型小鼠的氣道炎 癥（圖23)。相反地，相較于用OVA攻擊的未治療的DEREG小鼠，用Ac-TMP-2治療的OVA攻 擊的DEREG小鼠顯示出相當(dāng)?shù)闹夤芊闻萁櫵剑▓D23)。與這些發(fā)現(xiàn)相符，Ac-TMP-2 治療時，Th2細(xì)胞因子IL-5、IL-10和IL-13以及促炎細(xì)胞因子IL-6的水平在OVA攻擊的 野生型小鼠中但不在OVA攻擊的DEREG小鼠中顯著降低（圖24和25)。總之，這些結(jié)果表 明，在我們的小鼠哮喘模型中Treg在Ac-TMP-2抗炎作用中發(fā)揮整體作用。
[0168] 在整個說明書中，目的是要描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，而非將本發(fā)明限制于任 何一個實(shí)施方式或特定的特征集合。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，根據(jù)本公開，在所示例 的【具體實(shí)施方式】中，在不脫離本發(fā)明的范圍內(nèi)可進(jìn)行各種修改和變化。
[0169] 此處提及的所有計(jì)算機(jī)程序、算法、專利和科學(xué)文獻(xiàn)在此引入作為參考。
【權(quán)利要求】
1. 一種用于降低或減輕受試者中炎癥的方法，方法包括向受試者施用治療有效量的： (a) Ac-TMP-l(SEQ ID NO :1)或Ac-TMP-1的生物活性片段或變體； (b) Ac-TMP-2(SEQ ID NO :2)或Ac-TMP-2的生物活性片段或變體；或 (c) (a)和（b)的組合； 的步驟，從而降低或減輕炎癥。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述炎癥與受試者中的疾病病癥或病況有關(guān)，或 者所述炎癥是受試者中的疾病病癥或病況所繼發(fā)的。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述疾病、病癥和/或病況是基線療法難以治療 的。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述基線療法包括施用至少一種選自如下的基線 藥劑：非留體類抗炎藥（NSAID)、氨基水楊酸鹽、皮質(zhì)類固醇、免疫抑制劑、抗細(xì)胞因子/細(xì) 胞因子受體劑、抗生素、及其組合。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或權(quán)利要求4所述的方法，其中至少首先將Ac-TMP-1 (SEQ ID NO: 1)或Ac-TMP-2 (SEQ ID NO :2)、或其生物活性片段與基線療法聯(lián)合施用。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3或權(quán)利要求4所述的方法，其中至少首先將Ac-TMP-1 (SEQ ID NO :1)或Ac-TMP-2(SEQ ID N0:2)、或其生物活性片段與至少一種基線藥劑聯(lián)合施用，其中以全 劑量以下施用所述基線藥劑。
7. -種用于預(yù)防受試者中炎癥的方法，方法包括向受試者施用治療有效量的： (a) Ac-TMP-1 (SEQ ID NO: 1)或Ac-TMP-1的生物活性片段或變體； (b) Ac-TMP-2 (SEQ ID NO :2)或Ac-TMP-2的生物活性片段或變體；或 (c) (a)和（b)的組合； 的步驟，從而預(yù)防炎癥。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述炎癥與受試者中的疾病、病癥或病況有關(guān)，或 者所述炎癥是受試者中的疾病、病癥或病況所繼發(fā)的。
9. 根據(jù)權(quán)利要求2-6或權(quán)利要求8中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述疾病、病癥和/或病 況是免疫疾病、病癥和/或病況。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述免疫疾病、病癥和/或病況選自：阿狄森氏 病、強(qiáng)直性脊柱炎、乳糜瀉、慢性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病（CIDP)、慢性復(fù)發(fā)性多灶性 骨髓炎（CRM0)、克羅恩氏病、脫髓鞘性神經(jīng)病、腎小球性腎炎、肺出血腎炎綜合征、格雷夫 斯病、格林-巴利綜合征、橋本氏腦炎、橋本氏甲狀腺炎、低丙球蛋白血癥、特發(fā)性血小板減 少性紫癜（ITP)、胰島素依賴型糖尿病（1型）、幼年型關(guān)節(jié)炎、川崎綜合征、多發(fā)性硬化、重 癥肌無力、心肌梗塞后綜合征、原發(fā)性膽汁性肝硬化、牛皮癬、特發(fā)性肺纖維化、瑞特綜合 征、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)病、硬皮病、干燥綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE)、血小板減少性紫癜 (TTP)、潰瘍性結(jié)腸炎、脈管炎、白癜風(fēng)和韋格納肉芽腫。
11. 根據(jù)權(quán)利要求2-6或權(quán)利要求8中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述疾病是消化道疾 病。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述疾病是慢性胃炎或炎癥性腸病。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述炎癥性腸病是克羅恩氏病或潰瘍性結(jié)腸 炎。
14. 根據(jù)權(quán)利要求2-6或權(quán)利要求8中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述疾病是呼吸系統(tǒng)疾 病。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述疾病選自哮喘、肺氣腫、慢性支氣管炎和慢 性阻塞性肺?。–OPD)。
16. -種用于預(yù)防和/或治療受試者中炎癥性腸病的方法，方法包括向受試者施用治 療有效量的： (a) Ac-TMP-l(SEQ ID N0:1)或Ac-TMP-1的生物活性片段或變體； (b) Ac-TMP-2(SEQ ID NO :2)或Ac-TMP-2的生物活性片段或變體；或 (c) (a)和（b)的組合； 的步驟，從而預(yù)防和/或治療炎癥性腸病。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述炎癥性腸病是克羅恩氏病或潰瘍性結(jié)腸 炎。
18. -種用于預(yù)防和/或治療受試者中哮喘的方法，方法包括向受試者施用治療有效 量的： (a) Ac-TMP-1 (SEQ ID NO: 1)或Ac-TMP-1的生物活性片段或變體； (b) Ac-TMP-2 (SEQ ID NO :2)或Ac-TMP-2的生物活性片段或變體；或 (c) (a)和（b)的組合； 的步驟，從而預(yù)防和/或治療哮喘。
19. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，還包括向受試者施用至少一種其它藥劑 的步驟。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述至少一種其它藥劑選自：非留體類抗炎藥 (NSAID)、氨基水楊酸鹽、皮質(zhì)類固醇、免疫抑制劑、抗細(xì)胞因子/細(xì)胞因子受體劑、抗生素、 及其組合。
21. 根據(jù)權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述受試者是哺乳動物。
22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述哺乳動物是人類。 23?-種藥物組合物，其包含治療有效量的：（a) Ac-TMP-1 (SEQ ID NO :1)或Ac-TMP-1 的生物活性片段或變體；(b) Ac-TMP-2 (SEQ ID NO :2)或Ac-TMP-2的生物活性片段或變體； 或（c) (a)和（b)的組合，以及藥學(xué)上可接受的載體賦形劑的稀釋劑。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的藥物組合物，其還包含至少一種其它藥劑。
25. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的藥物組合物，其中所述至少一種其它藥劑選自：非留體類 抗炎藥（NSAID)、氨基水楊酸鹽、皮質(zhì)類固醇、免疫抑制劑、抗細(xì)胞因子/細(xì)胞因子受體劑、 抗生素、及其組合。
【文檔編號】A61K38/57GK104411325SQ201380022472
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2013年3月13日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月13日
【發(fā)明者】A·勞卡斯, S·納瓦羅 申請人:詹姆斯庫克大學(xué)