用于治療成膠質(zhì)細胞瘤的組合療法
【專利摘要】本發(fā)明關(guān)注治療診斷有成膠質(zhì)細胞瘤的患者的方法，包括對所述患者施用包含有效量的抗VEGF抗體和化療劑的療法。
【專利說明】用于治療成膠質(zhì)細胞瘤的組合療法
[0001] 對相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求來自2012年8月7日提交的美國臨時申請No. 61/680672,2012年 10月16日提交的美國臨時申請No.61/714438,和2013年2月5日提交的美國臨時申請 No. 61/760763的權(quán)益，其各自通過提述并入本文用于所有目的。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明一般關(guān)注用抗VEGF抗體治療疾病和病理學(xué)狀況。更具體地，本發(fā)明關(guān)注與 一種或多種別的抗腫瘤治療劑組合使用抗VEGF抗體來治療易感于或診斷有成膠質(zhì)細胞瘤 的人患者。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 膠質(zhì)瘤占據(jù)所有惡性腦和CNS腫瘤的81 %。成膠質(zhì)細胞瘤-世界衛(wèi)生組織（WHO) IV級星形細胞瘤-占據(jù)惡性膠質(zhì)瘤的60 %至70%，且仍然是最具攻擊性的膠質(zhì)瘤亞型。它 大多發(fā)生在成人中（診斷時的中值年齡：64歲）且其發(fā)病率在美國估測為3. 05/100' 000， 而在歐洲低于2/100' 000。成膠質(zhì)細胞瘤的預(yù)后仍然特別差，1年和5年總體存活分別為 29%和 3%(CentralBrainTumorRegistryoftheUnitedStates(2005)，（CBTRUS; http://www.cbtrus.org)〇
[0006] 盡管已在成膠質(zhì)細胞瘤的治療中取得了一些進展，但該疾病面臨著高度未滿足的 醫(yī)療需要和有限的治療選項。具體地，貝伐單抗（bevacizumab)(Avastin?)，一種祀向促血 管生成性血管內(nèi)皮生長因子（VEGF)的單克隆抗體，具有重要的治療潛力。
[0007] 發(fā)明概述
[0008] 本發(fā)明提供用于治療診斷有成膠質(zhì)細胞瘤的患者，包括新診斷有成膠質(zhì)細胞瘤的 患者的方法和試劑盒。
[0009] 本發(fā)明的一個實施方案提供治療診斷有成膠質(zhì)細胞瘤的患者的方法，包括對所述 患者施用包含有效量的抗VEGF抗體、有效量的化療劑和放療的療法，其中與接受所述化療 劑而沒有抗VEGF抗體的成膠質(zhì)細胞瘤患者相比，所述治療延長所述患者的中值無進展存 活時間。在一個實施方案中，所述患者具有〈2的WHO體能狀態(tài)（performancestatus)。在 一些實施方案中，所述化療劑是替莫挫胺（temozolomide)。在一些實施方案中，有效量的替 莫唑胺是口服施用的mg/m2。在一些實施方案中，替莫唑胺的有效量是口服施用的200mg/ m2。在一些實施方案中，所述抗VEGF抗體結(jié)合A4. 6.1表位。在一些實施方案中，所述抗 VEGF抗體是貝伐單抗。在一些實施方案中，所述抗VEGF抗體包含可變重鏈（VH)和可變輕 鏈（禮），其中所述￥11具有5￡〇10勵:2的氨基酸序列且所述￥1具有5￡〇10勵 ：1的氨基 酸序列。在一些實施方案中，所述抗VEGF抗體的所述有效量是每兩周靜脈內(nèi)10mg/kg，例如 最初在90分鐘內(nèi)靜脈內(nèi)施用，隨后在60分鐘內(nèi)然后在30分鐘內(nèi)輸注施用。在一些實施方 案中，所述抗VEGF抗體的所述有效量是每三周靜脈內(nèi)15mg/kg，例如最初在90分鐘內(nèi)靜脈 內(nèi)施用，隨后在60分鐘內(nèi)，然后在30分鐘內(nèi)輸注施用。在上文描述的方法中，所述抗VEGF 抗體在第一個周期首先對所述患者施用，然后所述抗VEGF抗體的隨后施用在所述化療劑 之前或之后。在另一個實施方案中，所述抗VEGF抗體與所述化療劑和放療同時施用。在一 些實施方案中，中斷對患者施用類固醇。
[0010] 在上文描述的用于治療診斷有成膠質(zhì)細胞瘤的患者的方法中，與接受所述化療劑 而未接受所述抗VEGF抗體的成膠質(zhì)細胞瘤患者相比，所述中值無進展存活時間延長了約 4. 4個月，危害比（hazardratio,HR)等于0.64。在另一個實施方案中，與接受所述化療劑 而未接受所述抗VEGF抗體的成膠質(zhì)細胞瘤患者相比，所述中值無進展存活時間延長了至 少4個月或更長，危害比（HR)等于0.64。在另一個實施方案中，與接受所述化療劑而未接 受所述抗VEGF抗體的成膠質(zhì)細胞瘤患者相比，所述中值無進展存活時間延長了至少4個月 或更長，危害比（HR)為約0.55至約0.74。。在另一個實施方案中，與接受所述化療劑而未 接受所述抗VEGF抗體的成膠質(zhì)細胞瘤患者相比，所述中值無進展存活時間延長了約4. 4個 月，危害比（HR)為約0. 55至約0. 74。在上文所述方法的又一個實施方案中，患者低于65 歲齡。在上文所述方法的再一個實施方案中，患者等于或大于65歲齡。在上文所述方法的 一個實施方案中，患者具有約4周的無治療間期（treatfreeinterval,TFI)。
[0011] 本發(fā)明的另一個實施方案提供包含基本結(jié)合表位A4. 6. 1的抗VEGF抗體、化療劑 和包裝插頁或標(biāo)簽的試劑盒，所述包裝插頁或標(biāo)簽具有治療診斷有成膠質(zhì)細胞瘤的患者的 說明書，包括對所述患者施用有效量的抗VEGF抗體和化療劑，其中與接受所述化療劑而未 接受所述抗VEGF抗體的成膠質(zhì)細胞瘤患者相比，所述治療延長所述患者的中值無進展存 活時間。在上文所述試劑盒的另一個實施方案中，所述抗VEGF抗體是貝伐單抗且所述化療 劑是替莫唑胺。
[0012] 附圖簡述
[0013] 圖1顯示雙臂III期研宄設(shè)計治療次序，如實施例1中更詳細披露的。研宄治療在 成膠質(zhì)細胞瘤的減腫塊手術(shù)（debulkingsurgery)或活組織檢查后4周至7周之間開始， 且包括3個不同階段：同時期（其中10mg/kg貝伐單抗或安慰劑與替莫唑胺和放療組合每 兩周施用，接著是28天的治療間斷），維持期（其中10mg/kg貝伐單抗或安慰劑與替莫唑胺 組合每兩周施用），和單一療法期（其中15mg/kg貝伐單抗或安慰劑每三周施用，直至疾病 進展）。
[0014] 圖2顯示來自III期AVAglio試驗的PFS的KaplanMeier曲線。
[0015] 發(fā)明詳述
[0016] 定義
[0017]"抗血管發(fā)生劑"或"血管發(fā)生抑制劑"指直接或是間接抑制血管發(fā)生 (angiogenesis)、血管生成（vasculogenesis)或不想要的血管通透性的小分子量物 質(zhì)、多核苷酸、多肽、分離的蛋白質(zhì)、重組蛋白、抗體或其偶聯(lián)物或融合蛋白。應(yīng)當(dāng)理解， 抗血管發(fā)生劑包括那些結(jié)合并阻斷血管發(fā)生因子或其受體的血管發(fā)生活性的藥劑。例 如，抗血管發(fā)生劑是整篇說明書定義的或本領(lǐng)域已知的血管發(fā)生劑的抗體或其它拮抗 劑，例如但不限于VEGF-A的抗體、VEGF-A受體（例如KDR受體或Flt-1受體）的抗體、 VEGF-trap、抗FTOFR抑制劑諸如Gleevec?(ImatinibMesylate)?？寡馨l(fā)生劑還包 括天然血管發(fā)生抑制劑，例如血管他丁（angiostatin)、內(nèi)皮他?。╡ndostatin)等。參 見例如Klagsbrun和D'Amore，Annu.Rev.Physiol. 53:217-39(1991);Streit和Det mar, 0ncogene22:3172-3179 (2003)(例如列舉惡性黑素瘤中抗血管發(fā)生療法的表3); Ferrara&Alitalo,Nature Medicine 5(12):1359-1364(1999) ;Tonini等，Oncogene 22:6549-6556(2003)(例如列舉已知抗血管發(fā)生因子的表2) ;Sato, Int. J. Clin. Oncol. 8:200-206(2003)(例如列舉臨床試驗中所使用的抗血管發(fā)生劑的表1)。
[0018] 術(shù)語"抗體"在本文中以最廣義使用，且涵蓋多種抗體結(jié)構(gòu)，包括但不限于單克隆 抗體、多克隆抗體、多特異性抗體（例如雙特異性抗體）、及抗體片段，只要它們展現(xiàn)出期望 的抗原結(jié)合活性。
[0019] 術(shù)語"腹水"或腹部腹水指在腹部中過量累積的流體。腹水流體經(jīng)常含有自由漂 移的從癌性生長脫斷的癌細胞。腹部腹水的呈現(xiàn)通常指示與沒有腹部腹水的患者相比更具 癥狀性的疾病或更差的結(jié)果。
[0020] 術(shù)語"貝伐單抗"，又稱為"rhuMAbVEGF"或"Avastin?"，是依照Presta等，Cancer Res. 57:4593-4599(1997)產(chǎn)生的重組人源化抗VEGF單克隆抗體。它涵蓋突變的人IgGl框 架區(qū)和來自鼠抗人VEGF單克隆抗體A. 4. 6. 1 (其阻斷人VEGF對其受體的結(jié)合）的抗原結(jié) 合互補決定區(qū)。貝伐單抗的大約93%的氨基酸序列（包括大部分框架區(qū)）衍生自人IgGl， 而大約7%的序列衍生自鼠抗體A4. 6.1。貝伐單抗與由雜交瘤ATCCHB10709產(chǎn)生的單克 隆抗VEGF抗體A4. 6. 1結(jié)合相同的表位。
[0021] 術(shù)語"癌癥"和"癌性"指或描述哺乳動物中特征通常為細胞生長不受調(diào)控的生 理疾患。此定義中包括良性和惡性癌癥以及休眠腫瘤（dormanttumor)或微轉(zhuǎn)移。癌癥 的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母細胞瘤（blastoma)、肉瘤、和白血病。此類癌癥的更具 體例子包括但不限于，成膠質(zhì)細胞瘤（GBM)，包括例如原神經(jīng)（proneural)GBM、神經(jīng)GBM、經(jīng) 典GBM和間充質(zhì)GBM。其他癌癥包括，例如乳腺癌、鱗狀細胞癌、肺癌（包括小細胞肺癌、非 小細胞肺癌、肺腺癌、和肺鱗癌）、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌（gastricorstomachcancer) (包括胃腸癌）、胰腺癌、卵巢癌、宮頸癌、肝癌（livercancer)、膀胱癌、肝瘤（hepatoma)、 結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌（kidneyorrenalcancer)、肝 癌（livercancer)、前列腺癌、夕卜陰癌、甲狀腺癌、肝癌（hepaticcarcinoma)、及各種類型 的頭和頸癌，以及B細胞淋巴瘤（包括低級/濾泡性非何杰金（Hodgkin)氏淋巴瘤（NHL)、 小淋巴細胞性（SL)NHL、中級/濾泡性NHL、中級彌漫性NHL、高級成免疫細胞性NHL、高級 成淋巴細胞性NHL、高級小無核裂細胞性NHL、貯積?。╞ulkydisease)NHL、套細胞淋巴瘤、 AIDS相關(guān)淋巴瘤、和瓦爾登斯特倫氏（Waldenstrom)巨球蛋白血癥）、慢性淋巴細胞性白血 ?。–LL)、急性成淋巴細胞性白血病（ALL)、毛細胞性白血病、慢性成髓細胞性白血病、和移 植后淋巴增殖性病癥（PTLD)、以及與瘢痣病（phakomatoses)、水腫（諸如與腦瘤有關(guān)的） 和梅格斯（Meigs)氏綜合征有關(guān)的異常血管增殖。
[0022] "化療劑"指可用于治療癌癥的化學(xué)化合物?；焺┑睦影捎糜谥委煱?癥的化學(xué)化合物?；焺┑睦影瘎╊悾╝lkylatingagents)，諸如替莫挫胺，燒 化劑達卡巴嘆（acarbazine)的咪挫四嘆衍生物?；焺┑钠渌影?，例如帕利他 塞（paclitaxel)或托泊替康（topotecan)或聚乙二醇化的脂質(zhì)體多柔比星（pegylated liposomaldoxorubicin) (PLD)?；焺┑钠渌影瘎╊悾╝lkylating agents)，諸如塞替派（thiotepa)和CYTOXAN? 環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide);磺 酸燒基醋類（alkylsulfonates)，諸如白消安（busulfan)、英丙舒凡（improsulfan) 和哌泊舒凡（piposulfan);氮丙啶類（aziridines)，諸如苯佐替派（benzodepa)、 卡波醌（carboquone)、美妥替派（meturedepa)和烏瑞替派（uredepa);乙撐亞胺類 (ethylenimines)和甲基蜜胺類（methylamelamines)，包括六甲蜜胺（altretamine)、三 乙撐蜜胺（triethylenemelamine)、三乙撐磷酰胺（triethylenephosphoramide)、三乙撐 硫代磷酰胺（triethylenethiophosphoramide)和三輕甲蜜胺（trimethylolomelamine); 番蒸枝內(nèi)醋類（acetogenins)(尤其是布拉他辛（bullatacin)和布拉他辛酮 (bullatacinone));喜樹喊(camptothecin);苔蘚抑素(bryostatin)；callystatin； CC_1065(包括其阿多來新（adozelesin)、卡折來新（carzelesin)和比折來新（bizelesin) 合成類似物）；隱藻素類（cryptophycins)(特別是隱藻素1和隱藻素8);多拉司他 ?。╠olastatin) ;duocarmycin(包括合成類似物，KW-2189和CB1-TM1);艾權(quán)塞洛素 (eleutherobin);pancratistatin;sarcodictyin;海綿抑素（spongistatin);氮芥類 (nitrogenmustards)，諸如苯丁酸氮芥（chlorambucil)、萘氮芥（chlornaphazine)、膽 磷酰胺（cholophosphamide)、雌莫司?。╡stramustine)、異環(huán)磷酰胺（ifosfamide)、雙氯 乙基甲胺（mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥（mechlorethamineoxidehydrochloride)、 美法侖（melphalan)、新氮芥（novembichin)、苯芥膽留醇（phenesterine)、潑尼莫 司?。╬rednimustine)、曲磷胺（trofosfamide)、尿啼啶氮芥（uracilmustard);亞 硝脲類（nitrosoureas)，諸如卡莫司?。╟armustine)、氯脲菌素（chlorozotocin)、 福莫司汀（fotemustine)、洛莫司汀（lomustine)、尼莫司?。╪imustine)和雷莫司 ?。╮animustine);抗生素類，諸如稀二炔類（enediyne)抗生素（例如加利車霉素 (calicheamicin)，尤其是加利車霉素yll和加利車霉素〇11(參見例如Agnew(1994) Chem.Intl.Ed.Engl.33:183_186);蒽環(huán)類抗生素（dynemicin)，包括dynemicinA;二麟 酸鹽類（bisphosphonates)，諸如氯膦酸鹽（clodronate);埃斯波霉素（esperamicin); 以及新制癌素（neocarzinostatin)發(fā)色團和相關(guān)色蛋白稀二炔類抗生素發(fā)色團）、阿 克拉霉素（aclacinomycin)、放線菌素（actinomycin)、氨茴霉素（anthramycin)、偶氮 絲氨酸（azaserine)、博來霉素（bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、carabicin、 洋紅霉素（carminomycin)、嗜癌霉素（carzinophilin)、色霉素（chromomycin)、方文線 菌素D(dactinomycin)、柔紅霉素（daunorubicin)、地托比星（detorubicin)、6_ 二 氮-5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN?多柔比星（doxorubicin)(包括嗎啉代多柔比 星、氰基嗎啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脫氧多柔比星）、表柔比星（epirubicin)、 依索比星（esorubicin)、伊達比星（idarubicin)、麻西羅霉素（marcellomycin)、絲裂霉素 類（mitomycins)諸如絲裂霉素C、霉酷酸（mycophenolicacid)、諾拉霉素（nogalamycin)、 橄欖霉素（olivomycin)、培洛霉素（peplomycin)、泊非霉素（potfiromycin)、卩票呤 霉素（puromycin)、三鐵阿霉素（quelamycin)、羅多比星（rodorubicin)、鏈黑菌 素（streptonigrin)、鏈佐星（streptozocin)、殺結(jié)核菌素（tubercidin)、烏苯美司 (ubenimex)、凈司他?。▃inostatin)、佐柔比星（zorubicin);抗代謝物類，諸如甲氨蝶呤 (methotrexate)和5-氟尿啼啶（5-FU);葉酸類似物，諸如二甲葉酸（denopterin)、甲氨 蝶呤（methotrexate)、蝶羅呤（pteropterin)、三甲曲沙（trimetrexate);卩票呤類似物，諸 如氟達拉濱（fludarabine)、6_ 疏基卩票呤（mercaptopurine)、硫咪卩票呤（thiamiprine)、 硫鳥卩票呤（thioguanine);啼啶類似物，諸如安西他濱（ancitabine)、阿扎胞苷 (azacitidine)、6_ 氮尿苷（azauridine)、卡莫氟（carmofur)、阿糖胞苷（cytarabine)、 雙脫氧尿苷（dideoxyuridine)、去氧氟尿苷（doxifluridine)、依諾他濱（enocitabine)、 氟尿苷（floxuridine);雄激素類，諸如卡魯睪酮（calusterone)、丙酸屈他雄酮 (dromostanolonepropionate)、表硫雄酉享（epitiostanol)、美雄焼（mepitiostane)、 睪內(nèi)醋（testolactone);抗腎上腺類，諸如氨魯米特（aminoglutethimide)、米托坦 (mitotane)、曲洛司坦（trilostane);葉酸補充劑，諸如亞葉酸（folinicacid);醋葡 醛內(nèi)醋（aceglatone);醛磷酰胺糖苷（aldophosphamideglycoside);氨基乙酰丙酸 (aminolevulinicacid);恩尿啼啶（eniluracil);安 口丫啶（amsacrine);bestrabucil; 比生群（bisantrene);依達曲沙（edatraxate);地磷酰胺（defosfamide);地美可辛 (demecolcine);地口丫酉昆（diaziquone);elformithine;依利醋鞍（elliptiniumacetate)； 埃坡霉素（epothilone);依托格魯（etoglucid);硝酸鎵；輕脲（hydroxyurea);香 蒴多糖（lentinan);氯尼達明（lonidamine);美登木素生物堿類（maytansinoids)， 諸如美登素（maytansine)和安絲菌素（ansamitocin);米托胍腙（mitoguazone); 米托蒽醌（mitoxantrone);莫呢達醇（mopidamol);二胺硝卩丫啶（nitracrine);噴 司他?。╬entostatin);蛋氨氮芥（phenamet);卩比柔比星（pirarubicin);洛索蒽醌 (losoxantrone);鬼白酸（podophyllinicacid) ;2_ 乙基酰餅（ethylhydrazide);丙卡 巴餅（procarbazine) ;PSK(K多糖復(fù)合物（JHSNaturalProducts，Eugene，Oreg.);雷 佐生（razoxane);根霉素（rhizoxin);西佐喃（sizofuran);螺方定鍺（spirogermanium); 細交鏈孢菌酮酸（tenuazonicacid);三亞胺醌（triaziquone) ;2,2'，2"-三氯三乙 胺；單端孢菌素類（trichothecenes)(尤其是T-2毒素、琉孢菌素（verrucarin)A、桿孢 菌素（roridin)A和蛇行菌素（anguidin));烏拉坦（urethan);長春地辛（vindesine); 達卡巴嗪（dacarbazine);甘露莫司?。╩annomustine);二溴甘露醇（mitobronitol);二 溴衛(wèi)矛醇（mitolactol);呢泊溴焼（pipobroman);gacytosine;阿糖胞苷（arabinoside) ("Ara-C"）；環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide);塞替派（thiotepa);類紫杉醇類（taxoids)， 例如TAXOL? 帕利他塞（paclitaxel) (Bristol-MyersSquibbOncology，Princeton，N. J.)、ABRAXANE?不含克列莫佛（Cremophor)、清蛋白改造納米顆粒劑型帕利他塞 (AmericanPharmaceuticalPartners，Schaumberg，Illinois)和TAXOTERE? 多西他 M(doxetaxel) (Rhone"PoulencRorer,Antony,France);苯丁酸氮芥（chlorambucil)； GEMZAR?吉西他濱（gemcitabine) ;6-硫鳥卩票呤（thioguanine);疏基卩票呤 (mercaptopurine);甲氨蝶呤（methotrexate);鉬類似物，諸如順鉬（cisplatin)、奧沙利 銷（oxaliplatin)和卡銷（carboplatin);長春喊（vinblastine);銷（platinum);依托 泊苷（etoposide)(VP_16);異環(huán)磷酰胺（ifosfamide);米托蒽醌（mitoxantrone);長春 新堿（vincristine) ;TsfAVELBINE? 長春瑞濱（vinorelbine);能滅瘤（novantrone); 替尼泊苷（teniposide);依達曲沙（edatrexate);道諾霉素（daunomycin);氨基蝶呤 (aminopterin);希羅達（xeloda);伊本麟酸鹽（ibandronate);伊立替康（irinotecan) (Camptosa^CPT-ll)(包括伊立替康及5-FU和亞葉酸的治療方案）；拓撲異構(gòu)酶抑制 劑RFS2000;二氟甲基鳥氨酸（DMF0);類視黃酸類（retinoids)，諸如視黃酸（retinoic acid);卡培他濱（capecitabine);考布他?。╟ombretastatin);亞葉酸（leucovorin) (LV);奧沙利鉑（oxaliplatin)，包括奧沙利鉑治療方案（FOLFOX) ;lapatinib(Tykerb?)、 PKC-a、Raf、H-Ras、EGFR(例如erlotinib(Tarceva?))和VEGF-A的抑制齊I」，其降低細胞 增殖；及任何上述物質(zhì)的藥學(xué)可接受的鹽、酸或衍生物。
[0023] 術(shù)語"同時（concurrently) "在本文中用于指施用兩種或更多種治療劑，其中所述 施用至少部分在時間上重疊。因而，同時施用包括如下的劑量給藥方案，一種或多種藥劑的 施用中斷后繼續(xù)施用一種或多種其它藥劑。
[0024] 術(shù)語"有效量"指在哺乳動物中有效治療疾病或病癥的藥物量。在癌癥的情況中， 藥物的治療有效量可減少癌細胞數(shù)；縮小腫瘤大??；抑制（即一定程度減緩，優(yōu)選停止）癌 細胞浸潤到周圍器官中；抑制（即一定程度減緩，優(yōu)選停止）腫瘤轉(zhuǎn)移；一定程度抑制腫瘤 生長；和/或一定程度減輕與癌癥有關(guān)的一種或多種癥狀。就藥物可預(yù)防現(xiàn)有的癌細胞生 長和/或殺死現(xiàn)有癌細胞的程度而言，它可以是細胞抑制的和/或細胞毒性的。對于癌癥 治療，可例如通過評估存活持續(xù)時間、無進展存活（PFS)持續(xù)時間、響應(yīng)率（RR)、響應(yīng)持續(xù) 時間和/或生活質(zhì)量來測量體內(nèi)功效。
[0025] "表位A4. 6. 1"指由抗VEGF抗體貝伐單抗(AVASTIN?)識別的表位（見Muller Y等，Structure15September1998,6:1153 - 1167)。在本發(fā)明的某些實施方案中，所述抗 VEGF抗體包括但不限于，與由雜交瘤ATCCHB10709產(chǎn)生的抗VEGF抗體A4. 6. 1結(jié)合相同 表位的單克隆抗體；根據(jù)Presta等（1997)CancerRes. 57:4593-4599生成的重組人源化抗 VEGF單克隆抗體。
[0026] "人抗體"指擁有與由人或人細胞生成的或利用人抗體全集或其它人抗體編碼序 列自非人來源衍生的抗體的氨基酸序列對應(yīng)的氨基酸序列的抗體。人抗體的此定義明確排 除包含非人抗原結(jié)合殘基的人源化抗體。
[0027] "人源化"抗體指包含來自非人HVR的氨基酸殘基和來自人FR的氨基酸殘基的嵌 合抗體。在某些實施方案中，人源化抗體會包含至少一個，通常兩個基本上整個可變域，其 中所有或基本上所有HVR(例如，⑶R)對應(yīng)于非人抗體的那些，且所有或基本上所有FR對 應(yīng)于人抗體的那些。任選地，人源化抗體可以至少包含自人抗體衍生的抗體恒定區(qū)的一部 分?？贵w，例如非人抗體的"人源化形式"指已經(jīng)經(jīng)歷人源化的抗體。
[0028] 在用于本文時，術(shù)語"高變區(qū)"或"HVR"指抗體可變域中在序列上高變的和/或 形成結(jié)構(gòu)上限定的環(huán)（"高變環(huán)"）的每個區(qū)。一般地，天然的4鏈抗體包含6個HVR;三 個在VH中（Hl、H2、H3)，且三個在VL中（Ll、L2、L3)。HVR-般包含來自高變環(huán)和/或 來自"互補決定區(qū)"（CDR)的氨基酸殘基，后一種是最高序列變異性的和/或牽涉抗原 識別。例示性高變環(huán)存在于氨基酸殘基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、 53-55 (H2)和 96-101 (H3)。（Chothia和Lesk，J.Mol.Biol. 196:901-917 (1987))。例示性 CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2 和CDR-H3)存在于L1 的氨基酸殘基 24-34、 L2 的 50-56、L3 的 89-97、Hl的 31-35B、H2 的 50-65、和H3 的 95-102(Kabat等，Sequences ofProteinsofImmunologicalInterest, 5thEd.PublicHealthService,National InstitutesofHealth,Bethesda，MD(1991))。除了VH中的CDR1 外，CDR-般包含形成高 變環(huán)的氨基酸殘基。⑶R還包含"特異性決定殘基"，或"SDR"，其是接觸抗原的殘基。SDR 包含在稱作縮短的-⑶R，或a-⑶R的⑶R區(qū)內(nèi)。例示性的a-⑶R(a-⑶R-L1、a-⑶R-L2、 &-〇?-13、&-〇)1?-111、&-〇)1?-112、和&-〇)1?-113)存在于11的氨基酸殘基31-34、12的5〇-55、 L3 的 89-96、H1 的 31-35B、H2 的 50-58、和H3 的 95-102 (見Almagro*Fransson，F(xiàn)ront. Biosci. 13:1619-1633(2008))。除非另有指示，可變域中的HVR殘基和其它殘基（例如，F(xiàn)R 殘基）在本文中依照Kabat等，見上文編號。
[0029] "個體"或"受試者"是哺乳動物。哺乳動物包括但不限于馴養(yǎng)的動物（例如，牛、 綿羊、貓、犬、和馬）、靈長類（例如，人和非人靈長類諸如猴）、家兔、和嚙齒類（例如，小鼠 和大鼠）。在某些實施方案中，個體或受試者是人。
[0030] 對于本發(fā)明的方法，術(shù)語"指導(dǎo)"受試者意味著通過任何手段，但是優(yōu)選書面地，諸 如以包裝插頁或其它書面推廣材料的形式提供關(guān)于可應(yīng)用療法、藥物、治療、治療方案等等 的指導(dǎo)。
[0031] 術(shù)語"靜脈內(nèi)輸注"指以在超過約5分鐘，優(yōu)選約30-90分鐘的一段時間內(nèi)，將藥 物導(dǎo)入動物或人受試者的靜脈，盡管依照本發(fā)明，靜脈內(nèi)輸注或可施用10小時或更短。
[0032] 術(shù)語"靜脈內(nèi)推注"或"靜脈內(nèi)推進（intravenouspush) "指在約15分鐘內(nèi)或更 短，優(yōu)選5分鐘或更短，將藥物施用到動物或人的靜脈中使得身體接受藥物。
[0033] "分離的"抗體是已經(jīng)自其天然環(huán)境的成分分開的抗體。在一些實施方案中，抗體 純化至大于95%或99%的純度，如通過例如電泳（例如，SDS-PAGE、等電聚焦（IEF)、毛細 管電泳）或?qū)游觯ɡ?，離子交換或反相HPLC)測定的。關(guān)于用于評估抗體純度的方法的 綜述，見例如Flatman等，J.Chromatogr.B848:79-87 (2007) 〇
[0034] "維持"(maintenance)劑量在本文中指在治療期間或之后施用于受試者的一個或 多個劑量的治療劑。通常，維持劑量以隔開的治療間隔施用，例如以大約每周，大約每兩周， 大約每三周，或大約每四周的間隔施用。
[0035] "維持療法"意指為了降低疾病復(fù)發(fā)或進展的可能性而給予的治療方案。維持療法 可提供任意長度的時間，包括長至受試者終身的延長的時段。維持療法可在初始療法之后 或與初始或別的療法聯(lián)合提供。用于維持療法的劑量可變化，而且可包括與其它類型的療 法使用的劑量相比降低的劑量。亦見本文中的"維持"。
[0036] 術(shù)語"銷售"在本文中用于描述產(chǎn)品（例如藥物）的宣傳、出售或分發(fā)。銷售具體 包括包裝、登廣告、和任何目的在于使產(chǎn)品商業(yè)化的商業(yè)活動。
[0037] "轉(zhuǎn)移"或"轉(zhuǎn)移性"指癌自其原發(fā)部位傳播至身體中的其它位置。癌細胞能脫離 原發(fā)性腫瘤，滲透入淋巴管和血管，經(jīng)由血流而循環(huán)，和在身體中其它地方的正常組織中的 遠端病灶中生長（轉(zhuǎn)移）。轉(zhuǎn)移可以是局部的或遠端的。轉(zhuǎn)移是一個連續(xù)過程，視腫瘤細胞 自原發(fā)性腫瘤脫落、經(jīng)由血流而傳播、并在遠端部位停止而定。在新的部位，該細胞建立血 供且能生長至形成危及生命的團塊。腫瘤細胞內(nèi)的刺激性和抑制性分子途徑兩者調(diào)節(jié)這種 行為，而且腫瘤細胞與遠端部位中的宿主細胞之間的相互作用也是重要的。
[0038] "單一療法"意指如下的治療方案，其在治療期的過程期間只包括單一治療劑來治 療癌癥或腫瘤。使用VEGF特異性拮抗劑的單一療法意味著在治療期期間在沒有別的抗癌 療法的情況中施用所述VEGF特異性拮抗劑。
[0039] 術(shù)語"單克隆抗體"在用于本文時指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成 群體的各抗體個體是相同的和/或結(jié)合相同表位，除了可能的變體抗體，例如含有天然存 在的突變或在單克隆抗體制備物的產(chǎn)生期間出現(xiàn)，這類變體一般以少量存在。與典型的包 含針對不同決定簇（表位）的不同抗體的多克隆抗體制備物不同，單克隆抗體制備物的每 種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。如此，修飾語"單克隆"指示抗體自一群基本上同 質(zhì)的抗體獲得的特性，而不應(yīng)解釋為要求通過任何特定方法來生成抗體。例如，可以通過多 種技術(shù)來生成要依照本發(fā)明使用的單克隆抗體，包括但不限于雜交瘤方法、重組DNA方法、 噬菌體展示方法、和利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因動物的方法，本文 中描述了用于生成單克隆抗體的此類方法和其它例示性方法。
[0040]術(shù)語"藥物配制劑"指處于如下的形式，使得容許其中含有的活性成分的生物學(xué) 活性是有效的，且不含對會接受配制劑施用的受試者具有不可接受的毒性的別的組分的制 劑。
[0041] "藥學(xué)可接受載體"指藥物配制劑中與活性成分不同的，且對受試者無毒的成分。 藥學(xué)可接受載體包括但不限于緩沖劑、賦形劑、穩(wěn)定劑、或防腐劑。
[0042] 對于本發(fā)明的方法，術(shù)語"宣傳（promoting)"意味著通過任何手段，包括書面地， 諸如以包裝插頁的形式提供、登廣告、出售、或描述具體藥物、藥物組合、或治療模態(tài)。宣傳 在本文中指治療劑，諸如VEGF拮抗劑，例如抗VEGF抗體或化療劑用于適應(yīng)證，諸如乳腺癌 治療的宣傳，而此類宣傳得到食品和藥品管理局（FDA)批準，認為已證明與受試者群體中 統(tǒng)計上顯著的治療功效和可接受的安全性有關(guān)。
[0043] "無進展存活（Progressionfreesurvival) (PFS) "指自治療（或隨機化）至第一 次疾病進展或死亡的時間。例如，它是患者自治療啟動或自初始診斷起，限定的一段時期， 例如諸如約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個 月、約9個月、約1年、約2年、約3年等仍然活著且沒有癌癥回返（return)的時間。在本 發(fā)明的一個方面，可以通過MacDonald響應(yīng)標(biāo)準評估PFS，如記載于MacDonald等，JClin Oncol1990 ;8:1277-80)的。
[0044]受試者"群體"指一組癌癥受試者，諸如臨床試驗中的，或?qū)μ囟ㄟm應(yīng)證諸如乳腺 癌療法的FDA批準之后腫瘤學(xué)家看到的。
[0045] "受試者"指哺乳動物，包括但不限于人或非人哺乳動物，諸如牛、馬、犬、綿羊、或 貓。優(yōu)選地，受試者指人。在本文中，患者也是受試者。
[0046] "存活"指患者保持存活，包括無進展存活（PFS)和總體存活（overallsurvival) (〇S)。存活可通過Kaplan-Meier法來評估，而且存活的任何差異可使用分層時序檢驗 (stratifiedlog-ranktest)來計算。
[0047] "總體存活"指患者自治療啟動或自初始診斷起保持一定時期活著，諸如約1年、約 2年、約3年、約4年、約5年、約10年等。在本發(fā)明根本的研宄中，用于存活分析的事件是 任何原因的死亡。
[0048] "總體響應(yīng)率"或"客觀響應(yīng)率"（0RR) -在最少量時間經(jīng)歷癌癥大?。ɑ?qū)τ谘?為量）降低的人的百分數(shù)；0RR是完全和部分響應(yīng)率的和。
[0049] "延長存活（extendingsurvival) "或"提高存活可能性"意味著使接受治療的患 者的PFS和/或0S相對于未接受治療的患者（即相對于未用VEGF抗體治療的患者）或 相對于對照治療方案（諸如只用化療劑的治療，諸如成膠質(zhì)細胞瘤的醫(yī)護標(biāo)準中使用的那 些，如例如替莫唑胺且有或無放療）有延長或提高。存活在治療啟動之后或在初始診斷之 后監(jiān)測至少約1個月、約2個月、約4個月、約6個月、約9個月、或至少約1年、或至少約2 年、或至少約3年、或至少約4年、或至少約5年、或至少約10年、等。
[0050]危害比（HR)是事件比率的統(tǒng)計定義。為了本發(fā)明的目的，危害比定義為代表任何 特定時間點時實驗臂中的事件概率除以對照臂中的事件概率。無進展存活分析中的"危害 比"是兩條無進展存活曲線之間的差異的匯總，代表隨訪期里與對照相比治療的死亡風(fēng)險 降低。
[0051] 如本文中使用的，"治療/處理"（及其語法變體）指試圖改變治療個體中的自然 進程，并且可以是為了預(yù)防或在臨床病理學(xué)的過程期間實施的臨床干預(yù)。治療的期望效果 包括但不限于預(yù)防疾病的發(fā)生或復(fù)發(fā)、緩解癥狀、降低疾病的任何直接或間接病理學(xué)后果、 預(yù)防轉(zhuǎn)移、減緩疾病進展率、改善或減輕疾病狀態(tài)、及消退或改善的預(yù)后。在一些實施方案 中，本發(fā)明的抗體用于延遲疾病的形成或延緩病癥的進展。
[0052] 術(shù)語"可變區(qū)"或"可變域"指抗體重或輕鏈中牽涉抗體結(jié)合抗原的域。天然抗體的 重鏈和輕鏈可變域（分別為VH和VL) -般具有類似的結(jié)構(gòu)，其中每個域包含4個保守的框 架區(qū)（FR)和 3 個高變區(qū)（HVR)。（見例如Kindt等KubyImmunology,第 6 版，W.H.Freeman andCo.，第91頁（2007))。單個VH或VL域可以足以賦予抗原結(jié)合特異性。此外，可以分 別使用來自結(jié)合抗原的抗體的VH或VL域篩選互補VL或VH域的文庫來分離結(jié)合特定抗 原的抗體。見例如，Portolano等，J.Immunol. 150:880-887 (1993);Clarkson等，Nature 352:624-628(1991)。
[0053] 術(shù)語"VEGF"或"VEGF-A"用于指165個氨基酸的人血管內(nèi)皮細胞生長因子及相 關(guān)的121個、145個、189個和206個氨基酸的人血管內(nèi)皮細胞生長因子，如例如Leung等 Science, 246:1306(1989);及Houck等Mol.Endocrin.，5:1806(1991)所述，及其天然存 在的等位基因形式和加工形式。VEGF-A是包括VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F 和P1GF在內(nèi)的基因家族的一部分。VEGF-A主要結(jié)合兩種高親和力受體酪氨酸激酶，即 VEGFR-1 (Flt-1)和VEGFR-2 (Flk-1/KDR)，后者是VEGF-A血管內(nèi)皮細胞促有絲分裂信號的 主要遞質(zhì)。另外，神經(jīng)氈蛋白-1已經(jīng)被鑒定為肝素結(jié)合VEGF-A同等型（isoform)的受體， 而且可在血管發(fā)育中發(fā)揮作用。術(shù)語"VEGF"或"VEGF-A"還指來自非人物種諸如小鼠、大 鼠或靈長類動物的VEGF。有時，來自特定物種的VEGF以諸如表示人VEGF的hVEGF或表示 鼠VEGF的mVEGF等術(shù)語表示。通常，VEGF指人VEGF。術(shù)語"VEGF"還用于指包含165個氨 基酸的人血管內(nèi)皮細胞生長因子的氨基酸第8-109位或第1-109位的多肽的截短形式或片 段。本申請中可通過例如"VEGF(8-109) "、"VEGF(1-109) "或"VEGF165"來鑒別任何此類形 式VEGF。"截短的"天然VEGF的氨基酸位置如天然VEGF序列中所示編號。例如，截短的天 然VEGF中的第17位氨基酸（甲硫氨酸）也是天然VEGF中的第17位（甲硫氨酸）。截短 的天然VEGF具有與天然VEGF相當(dāng)?shù)膶DR和Flt-1受體的結(jié)合親和力。
[0054] "抗VEGF抗體"指以足夠親和力和特異性結(jié)合VEGF的抗體。所選擇的抗體通 常會具有對VEGF的結(jié)合親和力，例如，該抗體可以以介于100nM-lpM之間的Kd值結(jié)合 hVEGF?？贵w親和力可通過例如基于表面等離振子共振的測定法（諸如PCT申請公開文本 NO.W02005/012359中所記載的BIAcore測定法）；酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA);和競爭測 定法（例如RIA)來測定。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗VEGF抗體可用作治療劑，用于 靶向和干擾其中涉及VEGF活性的疾病或疾患。還有，可對該抗體進行其它生物學(xué)活性測 定法，例如以評估其作為治療劑的有效性。此類測定法是本領(lǐng)域已知的，而且取決于靶抗 原和抗體的預(yù)定用途。例子包括HUVEC抑制測定法；腫瘤細胞生長抑制測定法（如例如W0 89/06692中所記載的）；抗體依賴性細胞的細胞毒性（ADCC)和補體介導(dǎo)的細胞毒性（CDC) 測定法（美國專利5, 500, 362);及激動活性或造血測定法（參見W0 95/27062)?？筕EGF 抗體通常不會結(jié)合其它VEGF同源物，諸如VEGF-B或VEGF-C，也不會結(jié)合其它生長因子，諸 如P1GF、PDGF或bFGF。
[0055] "VEGF拮抗劑"指能夠中和、阻斷、抑制、消除、降低或干擾VEGF活性（包括其與一 種或多種VEGF受體的結(jié)合）的分子。VEGF拮抗劑包括抗VEGF抗體及其抗原結(jié)合片段、特 異性結(jié)合VEGF由此隔絕其與一種或多種受體結(jié)合的受體分子及衍生物、抗VEGF受體抗體 和VEGF受體拮抗劑諸如VEGFR酪氨酸激酶的小分子抑制劑。
[0056] "嵌合VEGF受體蛋白"指具有衍生自至少兩種不同蛋白質(zhì)（其中至少一種是VEGF 受體蛋白）的氨基酸序列的VEGF受體分子。在某些實施方案中，嵌合VEGF受體蛋白能夠 結(jié)合VEGF并抑制VEGF的生物學(xué)活性。
[0057] 嵌合的和人源化的抗體
[0058] 在某些實施方案中，本文中提供的抗體是嵌合抗體。某些嵌合抗體記載于例如美 國專利No. 4, 816, 567;及Morrison等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))。 在一個例子中，嵌合抗體包含非人可變區(qū)（例如，自小鼠、大鼠、倉鼠、家兔、或非人靈長類， 諸如猴衍生的可變區(qū)）和人恒定區(qū)。在又一個例子中，嵌合抗體是"類轉(zhuǎn)換的"抗體，其中 類或亞類已經(jīng)自親本抗體的類或亞類改變。嵌合抗體包括其抗原結(jié)合片段。
[0059] 在某些實施方案中，嵌合抗體是人源化抗體。通常，將非人抗體人源化以降低對人 的免疫原性，同時保留親本非人抗體的特異性和親和力。一般地，人源化抗體包含一個或多 個可變域，其中HVR，例如CDR(或其部分）自非人抗體衍生，而FR(或其部分）自人抗體序 列衍生。任選地，人源化抗體還會至少包含人恒定區(qū)的一部分。在一些實施方案中，將人源 化抗體中的一些FR殘基用來自非人抗體（例如衍生HVR殘基的抗體）的相應(yīng)殘基替代，例 如以恢復(fù)或改善抗體特異性或親和力。
[0060] 人源化抗體及其生成方法綜述于例如Almagro*Fransson，F(xiàn)ront. Biosci. 13:1619-1633 (2008)，并且進一步記載于例如Riechmann等，Nature 332:323-329(1988);Queen等，Proc.Nat' 1Acad.Sci.USA86:10029-10033(1989); 美國專利No. 5, 821，337, 7, 527, 791，6, 982, 321 和 7, 087, 409;Kashmiri等，Methods 36:25-34(2005)(描述了SDR(a-CDR)嫁接）；Padlan,Mol.Immunol. 28:489-498(1991)(描 述了"重修表面"）；Dall'Acqua等，Methods36:43-60(2005)(描述了"FR改組"）；及 Osbourn等，Methods36:61-68(2005)和Klimka等，Br.J.Cancer, 83:252-260(2000)(描 述了FR改組的"引導(dǎo)選擇"方法）。
[0061] 可以用于人源化的人框架區(qū)包括但不限于：使用"最佳擬合（best-fit)"方 法選擇的框架區(qū)（見例如Sims等J.Immunol. 151:2296 (1993));自輕或重鏈可變 區(qū)的特定亞組的人抗體的共有序列衍生的框架區(qū)（見例如Carter等Proc.Natl. Acad.Sci.USA, 89:4285 (1992);及Presta等J.Immunol. ,151:2623 (1993));人成熟 的（體細胞突變的）框架區(qū)或人種系框架區(qū)（見例如Almagro和Fransson,Front. Biosci. 13:1619-1633(2008));和通過篩選FR文庫衍生的框架區(qū)（見例如Baca等，J. Biol.Chem. 272:10678-10684 (1997)及Rosok等，J.Biol.Chem. 271:22611-22618 (1996))。
[0062] 人抗體
[0063] 在某些實施方案中，本文中提供的抗體是人抗體。可以使用本領(lǐng)域中已知的多 種技術(shù)來生成人抗體。一般地，人抗體記載于vanDijk和vandeWinkel,Curr.Opin. Pharmacol. 5:368-74(2001)及Lonberg，Curr.Opin.Immunol. 20:450-459(2008)〇
[0064] 可以通過對轉(zhuǎn)基因動物施用免疫原來制備人抗體，所述轉(zhuǎn)基因動物已經(jīng)修飾為響 應(yīng)抗原性攻擊而生成完整人抗體或具有人可變區(qū)的完整抗體。此類動物通常含有所有或部 分人免疫球蛋白基因座，其替換內(nèi)源免疫球蛋白基因座，或者其在染色體外存在或隨機整 合入動物的染色體中。在此類轉(zhuǎn)基因小鼠中，一般已經(jīng)將內(nèi)源免疫球蛋白基因座滅活。關(guān)于 自轉(zhuǎn)基因動物獲得人抗體的方法的綜述，見Lonberg，Nat.Biotech. 23:1117-1125(2005)。 還可見例如美國專利No. 6, 075, 181和6, 150, 584,其描述了XEN0M0USE?技術(shù)；美 國專利No. 5, 770, 429,其描述了HUMAB?技術(shù)；美國專利No. 7, 041，870,其描述 了K-MMOUSE?技術(shù)，和美國專利申請公開文本No.US2007/0061900,其描述了 VELOCIMOUSE?技術(shù)）?？梢岳缤ㄟ^與不同人恒定區(qū)組合進一步修飾來自由此類動 物生成的完整抗體的人可變區(qū)。
[0065] 也可以通過基于雜交瘤的方法生成人抗體。已經(jīng)描述了用于生成人單克隆抗體 的人骨髓瘤和小鼠-人異骨髓瘤細胞系（見例如KozborJ.Immunol. ,133:3001 (1984); Brodeur等,MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications, 第 51-63 頁（MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987);及Boerner等，了. Immunol. , 147:86 (1991))。經(jīng)由人B細胞雜交瘤技術(shù)生成的人抗體也記載于Li 等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 103:3557-3562 (2006)。其它方法包括那些例如記載 于美國專利No. 7, 189, 826(其描述了自雜交瘤細胞系生成單克隆人IgM抗體）和 Ni，XiandaiMianyixue，26(4):265-268(2006)(其描述了人-人雜交瘤）的。人雜交 瘤技術(shù)（Trioma技術(shù)）也記載于Vollmers和Brandlein,HistologyandHistopath ology, 20(3):927-937 (2005)及Vollmers和Brandlein,MethodsandFindingsin ExperimentalandClinicalPharmacology, 27(3):185-91 (2005)〇
[0066] 也可以通過分離自人衍生的噬菌體展示文庫選擇的Fv克隆可變域序列生成人抗 體。然后，可以將此類可變域序列與期望的人恒定域組合。下文描述了自抗體文庫選擇人 抗體的技術(shù)。
[0067] f庫衍牛的抗體
[0068] 可以通過對組合文庫篩選具有期望的一種或多種活性的抗體來分離本發(fā)明的抗 體。例如，用于生成噬菌體展示文庫并對此類文庫篩選擁有期望結(jié)合特征的抗體的多種 方法是本領(lǐng)域中已知的。此類方法綜述于例如Hoogenboom等于MethodsinMolecular Biology178:1-37(0'Brien等編，HumanPress,Totowa,NJ, 2001)，并且進一步記載于 例如McCafferty等，Nature348:552-554;Clackson等，Nature352:624-628(1991); Marks等，J.Mol.Biol.222:581-597 (1992);Marks和Bradbury,于Methodsin MolecularBiology248:161-175(Lo編，HumanPress,Totowa,NJ, 2003);Sidhu等，J. Mol.Biol. 338(2) :299-310(2004);Lee等，J.Mol.Biol. 340(5): 1073-1093(2004); Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101 (34) : 12467-12472 (2004);及Lee等，了.1臟1111〇1. Methods284(1-2):119-132(2004)。
[0069] 在某些噬菌體展示方法中，將VH和VL基因的全集分別通過聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR) 克隆，并在噬菌體文庫中隨機重組，然后可以對所述噬菌體文庫篩選抗原結(jié)合噬菌體，如記 載于Winter等，Ann.Rev.Immunol.，12:433-455 (1994)的。菌體通常以單鏈Fv(scFv) 片段或以Fab片段展示抗體片段。來自經(jīng)免疫的來源的文庫提供針對免疫原的高親和力抗 體，而不需要構(gòu)建雜交瘤。或者，可以（例如自人）克隆天然全集以在沒有任何免疫的情 況中提供針對一大批非自身和還有自身抗原的抗體的單一來源，如由Griffiths等，EMBO J，12:725-734(1993)描述的。最后，也可以通過自干細胞克隆未重排的V基因區(qū)段，并使用 含有隨機序列的PCR引物編碼高度可變的CDR3區(qū)并在體外實現(xiàn)重排來合成生成未免疫文 庫，如由Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.，227:381-388(1992)所描述的。描述人抗體 噬菌體文庫的專利公開文本包括例如：美國專利No. 5, 750, 373、和美國專利公開文本No. 2 005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764， 2007/0292936 和 2009/0002360。
[0070] 認為自人抗體文庫分離的抗體或抗體片段是本文中的人抗體或人抗體片段。
[0071] 抗VEGF抗體和拮抗劑
[0072] 要用于生成VEGF抗體的VEGF抗原可以是例如VEGF165分子以及VEGF的其它同等 型或其含有期望表位的片段。在一個實施方案中，期望的表位是由貝伐單抗識別的表位，貝 伐單抗與由雜交瘤ATCCHB10709產(chǎn)生的單克隆抗VEGF抗體A4. 6.1結(jié)合相同的表位（稱 為本文中定義的"表位A. 4. 6. 1"）?？捎糜谏杀景l(fā)明的抗VEGF抗體的其它形式的VEGF 對于本領(lǐng)域技術(shù)人員會是顯而易見的。
[0073] 人VEGF首先是使用牛VEGFcDNA作為雜交探針篩選自人細胞制備的cDNA文庫而 獲得的。Leung等（1989)Science，246:1306。一種由此鑒定出的cDNA編碼一種165個氨 基酸的蛋白質(zhì)，其與牛VEGF具有超過95%的同源性；此165個氨基酸的蛋白質(zhì)通常稱作人 VEGF(hVEGF)或VEGF165。人VEGF的促有絲分裂活性通過在哺乳動物宿主細胞中表達人 VEGF得到了驗證。由經(jīng)人VEGFcDNA轉(zhuǎn)染的細胞條件化的培養(yǎng)基促進毛細血管內(nèi)皮細胞增 殖，而對照細胞不然。Leung等（1989)Science，見上文。進行進一步努力來經(jīng)重組DNA技 術(shù)克隆和表達VEGF。（參見例如Ferrara，LaboratoryInvestigation72:615-618(1995) 及其中引用的參考文獻）。
[0074] 源自可變RNA剪接，VEGF在多種組織中作為多種同二聚體形式（每個單體121、 145、165、189、和206個氨基酸）表達。VEGF121是一種可溶性絲裂原，不結(jié)合肝素；更長 形式的VEGF以越來越高的親和力結(jié)合肝素。肝素結(jié)合形式的VEGF可以在羧基末端被纖 溶酶切割以釋放可擴散形式的VEGF。纖溶酶切割后鑒定出的羧基末端肽的氨基酸測序是 Arg11Q-Alam。作為同二聚體分離到的氨基末端"核心"蛋白VEGF(l-llO)以與完整VEGF165 同二聚體相比相似的親和力結(jié)合中和性單克隆抗體（諸如稱作4. 6. 1和3. 2E3. 1. 1的抗 體）和可溶性形式的VEGF受體。
[0075] 最近還鑒定出數(shù)種在結(jié)構(gòu)上與VEGF有關(guān)的分子，包括胎盤生長因子（PIGF)、 VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和VEGF-E。Ferrara和Davis-Smyth(1987)Endocr.Rev.，見 上文；Ogawa等J.BiologicalChem. 273:31273-31281 (1998);Meyer等EMBOJ.，18: 363-374(1999)。受體酪氨酸激酶Flt-4(VEGFR-3)鑒定為VEGF-C和VEGF-D的受體。Joukov 等已]\?0.了.15:1751(1996);1^6等？1'〇。.恥七1.六。&(1.5(^.舊六93:1988-1992(1996)洫。11611 等（1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:548-553。VEGF-C顯示出涉及對淋巴管發(fā)生的調(diào) 節(jié)。Jeltsch等Science276:1423-1425(1997)。
[0076] 已經(jīng)鑒定出兩種VEGF受體，即Flt-1 (也稱作VEGFR-1)和KDR(也稱作VEGFR-2)。 Shibuya等（1990)Oncogene8:519-527;deVries等（1992)Science255:989-991;Terman等（1992)Biochem.Biophys.Res.Commun. 187 :1579_1586。神經(jīng)毯蛋白 _1 顯不為選 擇性VEGF受體，能夠結(jié)合肝素結(jié)合性VEGF同等型（Soker等（1998)Cell92 :735-45)。
[0077] 在本發(fā)明的方法中有用的抗VEGF抗體包括任何抗體或其抗原結(jié)合片段，它們以 足夠親和力和特異性結(jié)合VEGF且能降低或抑制VEGF的生物學(xué)活性。抗VEGF抗體通常不會 結(jié)合其它VEGF同源物，諸如VEGF-B或VEGF-C，也不會結(jié)合其它生長因子，諸如P1GF、PDGF、 或bFGF。
[0078] 在本發(fā)明的某些實施方案中，抗VEGF抗體包括但不限于與由雜交瘤ATCCHB 10709生成的單克隆抗VEGF抗體A4. 6. 1結(jié)合相同表位的單克隆抗體；依照Presta等 (1997)CancerRes. 57 :4593-4599生成的重組人源化抗VEGF單克隆抗體。在一個實施方案 中，抗VEGF抗體是"貝伐單抗（BV) "，也稱作"rhuMAbVEGF"或"AVASTIN?"。它包含經(jīng)過 突變的人IgGl框架區(qū)和來自阻斷人VEGF結(jié)合其受體的小鼠抗hVEGF單克隆抗體A. 4. 6. 1 的抗原結(jié)合互補決定區(qū)。貝伐單抗的大約93%的氨基酸序列（包括大部分框架區(qū)）是自人 IgGl衍生，而且約7%的序列是自小鼠抗體A4. 6. 1衍生的。
[0079]貝伐單抗(AVASTIN?)是第一種得到FDA批準的抗血管發(fā)生療法，而且被批準用 于治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌（與靜脈內(nèi)基于5-FU的化療組合的一線和二線治療），晚期非鱗 狀、非小細胞肺癌（NSCLC)(與卡鉑和帕利他賽組合對不能切除的、局部晚期、復(fù)發(fā)性或轉(zhuǎn) 移性NSCLC的一線治療）和轉(zhuǎn)移性HER2陰性乳腺癌（先前未治療過的轉(zhuǎn)移性HER2陰性乳 腺癌，與帕利他賽組合）。
[0080] 貝伐單抗和其它人源化抗VEGF抗體進一步記載于2005年2月26日公告的美國 專利No. 6, 884, 879。別的抗體包括G6或B20系列抗體（例如G6-31、B20-4. 1)，如記載于 PCT
【發(fā)明者】A.達斯, A.M.A.吉賈羅, L.阿布里, J.加西亞, M.希爾頓, Y.克洛岡, N.穆爾 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司