含C-肽的用于預(yù)防或治療糖尿病性血管滲漏誘導(dǎo)的疾病的組合物技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及使用C-肽預(yù)防或治療糖尿病相關(guān)疾病。更具體的，本發(fā)明涉及使用C-肽預(yù)防或治療糖尿病性血管滲漏誘導(dǎo)的疾病的方法，使用C-肽預(yù)防或治療糖尿病性視網(wǎng)膜病變的方法，和包括C-肽的用于預(yù)防或治療上述疾病的組合物。

背景技術(shù)：
本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，糖尿病是一組具有多種病因的代謝性疾病，特征在于由胰島素活性的完全缺乏或功能性缺乏引起的慢性高血糖。維持很長時間的高血糖水平會引起慢性代謝性障礙并且引起血管的損傷，并伴隨各種并發(fā)癥的隨后發(fā)病。這些疾病典型地在糖尿病發(fā)病10年之后顯現(xiàn)出來，因為幾乎身體所有的器官都已經(jīng)受到了損傷。具體的，在糖尿病患者中觀察到異常的血管滲漏，并且糖尿病性血管滲漏誘導(dǎo)各種并發(fā)癥，包括糖尿病性視網(wǎng)膜病變、糖尿病性神經(jīng)病、糖尿病性腎病、糖尿病性血管功能障礙、糖尿病性炎癥等。這些糖尿病并發(fā)癥與VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)的過表達(dá)相關(guān)。VEGF可能誘導(dǎo)血管滲漏，并且已知在糖尿病患者的視網(wǎng)膜中VEGF的水平升高會誘導(dǎo)血管生成和肌肉水腫。進(jìn)一步的，最近的研究已經(jīng)表明ROS生成和應(yīng)力纖維的形成中斷了在粘著連接處的基于VE-鈣粘著蛋白的細(xì)胞-細(xì)胞粘附。此外，已知VE-鈣粘著蛋白是防止血管壁的解體及協(xié)調(diào)大分子穿過內(nèi)皮的必要組分。人類的C-肽是從胰島素原中切下的短肽，并且以與胰島素等摩爾濃度地被胰腺β細(xì)胞分泌到循環(huán)中。伴隨胰島素的C-肽的缺乏是I型糖尿病和II型糖尿病晚期的典型的特征。視網(wǎng)膜病變是糖尿病誘導(dǎo)的主要并發(fā)癥之一，并且是成人中導(dǎo)致失明的首要原因。C-肽用于診斷糖尿病，但是還沒有報道C-肽在治療糖尿病性血管滲漏或由糖尿病性血管滲漏誘導(dǎo)的間接疾病中的應(yīng)用。在此背景下，本發(fā)明人對治療糖尿病性血管滲漏進(jìn)行了深入且徹底的研究，并且發(fā)現(xiàn)C-肽可以用于在糖尿病性視網(wǎng)膜病變中保護(hù)VEGF誘導(dǎo)的血管滲漏，從而得到了本發(fā)明。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
因此，本發(fā)明的主要目的是提供一種使用C-肽預(yù)防或治療糖尿病性血管滲漏誘導(dǎo)的疾病的方法或組合物。本發(fā)明的另一目的是提供一種使用C-肽預(yù)防或治療糖尿病性視網(wǎng)膜病變的方法或組合物。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種預(yù)防或治療糖尿病性血管滲漏誘導(dǎo)的疾病的方法，該方法包括給予有需要的動物有效量的C-肽。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了一種預(yù)防或治療糖尿病性血管滲漏誘導(dǎo)的疾病的藥物組合物，該藥物組合物包括作為活性成分的C-肽。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了一種預(yù)防或治療糖尿病性視網(wǎng)膜病變的方法，該方法包括給予有需要的動物有效量的C-肽。根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明提供了一種預(yù)防或治療糖尿病性視網(wǎng)膜病變的藥物組合物，該藥物組合物包括作為活性成分的C-肽。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了，通過抑制VE-鈣粘著蛋白的VEGF誘導(dǎo)的解體防止血管滲漏，以及根據(jù)本發(fā)明的包括C-肽的藥物組合物對伴隨有血管滲漏的廣譜的糖尿病并發(fā)癥具有預(yù)防性或治療性應(yīng)用。附圖說明圖1示出了如在鏈脲霉素糖尿病小鼠和正常小鼠的視網(wǎng)膜中測量的，C-肽對糖尿病誘導(dǎo)的血管滲漏的抑制活性，其中將2μlC-肽(糖尿病+C-pep)玻璃體內(nèi)注射到鏈脲霉素糖尿病小鼠的一只眼睛中，并且將等體積的PBS玻璃體內(nèi)注射到該鏈脲霉素糖尿病小鼠的對側(cè)眼睛中(糖尿??；n＝6/組)，并且還將2μlPBS玻璃體內(nèi)注射到正常(非糖尿病)小鼠的眼睛中(正常；n＝6/組)。通過共聚焦顯微鏡可視化視網(wǎng)膜。圖1A示出視網(wǎng)膜的熒光圖像，其中上圖的方形區(qū)域在各圖片的下圖中以放大圖像給出。圖1B是柱狀圖，其中視網(wǎng)膜通透性通過測量整個視網(wǎng)膜組織(n＝6)的熒光強(qiáng)度進(jìn)行了量化，并且表示為來自六次獨立實驗的平均值±S.D.。*p<0.05。圖2示出C-肽抑制VEGF誘導(dǎo)的ROS生成，但對細(xì)胞內(nèi)的鈣離子沒有作用。圖2A是在HUVEC與1mMNAC、0.5mMTrolox或5μMBAPTA-AM預(yù)孵育30min，并且經(jīng)10ng/mlVEGF刺激10min之后，使用共聚焦顯微鏡確定的細(xì)胞內(nèi)ROS的水平的柱狀圖，其中數(shù)據(jù)表示為來自三次獨立實驗的平均值±S.D.。圖2B是曲線圖，其中在HUVEC經(jīng)各種濃度的C-肽預(yù)處理30min，然后經(jīng)10ng/mlVEGF刺激之后，依據(jù)C-肽濃度繪制的ROS水平，示出了C-肽以劑量依賴的方式抑制VEGF誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS的生成。圖2C是如在單個細(xì)胞水平(n＝3)上通過共聚焦顯微鏡隨著時間監(jiān)測的，在經(jīng)1μMFluo-4AM標(biāo)記的HUVEC中的細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平的曲線圖。圖3示出了HUVEC的熒光照片，證明了C-肽抑制VEGF誘導(dǎo)的應(yīng)力纖維的形成和VEGF誘導(dǎo)的粘著連接的解體。在HUVEC與單獨的10ng/mlVEGF或0.5nMC-肽，或在0.5nMC-肽、1mMNAC或0.5mMTrolox的存在下與10ng/mlVEGF孵育1h之后，觀察到如圖1中所示的C-肽對VEGF誘導(dǎo)的應(yīng)力纖維形成的抑制活性。顯微細(xì)絲經(jīng)羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色，并且通過共聚焦顯微鏡觀察(n＝3)。比例尺代表30μm。圖4A和4B示出，如在HUVEC與單獨的10ng/mlVEGF或0.5nMC-肽，或在0.5nMC-肽、1mMNAC或0.5mMTrolox的存在下與10ng/mlVEGF孵育90min之后(n＝3)測定的，C-肽對VEGF誘導(dǎo)的粘著連接破裂的抑制活性。圖4A示出，在對VE-鈣粘著蛋白進(jìn)行染色和使用共聚焦顯微鏡可視化之后的VE-鈣粘著蛋白的熒光圖像(n＝3)。比例尺代表20μm。圖4B示出VE-鈣粘著蛋白的柱狀圖，其中粘著連接由虛線所示。圖4C示出，C-肽恢復(fù)了糖尿病小鼠的視網(wǎng)膜中高血糖癥誘導(dǎo)的粘著連接的破裂。將2μlC-肽玻璃體內(nèi)注射到糖尿病小鼠的一只眼睛中(糖尿病+C-pep)，并且將等體積的PBS注射到對側(cè)眼睛中(糖尿??；n＝3)。將2μlPBS玻璃體內(nèi)注射到非糖尿病小鼠的眼睛中(正常；n＝3)。對視網(wǎng)膜中的VE-鈣粘著蛋白進(jìn)行染色，并且使用共聚焦顯微鏡可視化VE-鈣粘著蛋白(n＝3)。尺，30μm。圖5示出抗VEGF和ROS清除劑防止了糖尿病小鼠視網(wǎng)膜中的血管滲漏。在這一方面，將2μlC-肽(糖尿病+C-Pep)、抗-VEGF(糖尿病+抗-VEGF)、N-乙?；?半胱氨酸(糖尿病+NAC)和Trolox(糖尿病+Trolox)玻璃體內(nèi)注射到糖尿病小鼠的一只眼睛中，并且將等體積的PBS玻璃體內(nèi)注射到對側(cè)眼睛中(糖尿??；n＝6/組)。還將2μlPBS玻璃體內(nèi)注射到正常(非糖尿病)小鼠的眼睛中(正常；n＝6/組)。通過共聚焦顯微鏡可視化視網(wǎng)膜。圖5A示出視網(wǎng)膜的熒光圖像(尺，100μm)。圖5B是視網(wǎng)膜通透性的柱狀圖，該視網(wǎng)膜通透性通過測量整個視網(wǎng)膜組織(n＝6)的熒光強(qiáng)度進(jìn)行了量化分析。*p<0.01；圖6A示出了在通過滲透泵注入小鼠中之后，剩余的血清C-肽的水平。圖6B和6C示出，當(dāng)通過皮內(nèi)注射給予時，C-肽防止了糖尿病小鼠的外周血管中VEGF誘導(dǎo)的血管滲漏。圖6D是曲線圖，其中依據(jù)玻璃體內(nèi)注射之后的時間繪制血清C-肽的水平。以及圖7是參與C-肽介導(dǎo)的防止VEGF誘導(dǎo)的血管通透性的可能的信號傳導(dǎo)途徑的示意圖，示出了C-肽通過抑制VEGF誘導(dǎo)的ROS生成防止了VEGF誘導(dǎo)的血管滲漏。具體實施方式得到本發(fā)明的，對預(yù)防和治療糖尿病患者中的糖尿病誘導(dǎo)的血管滲漏的深入且徹底的研究得到以下發(fā)現(xiàn)：C-肽抑制VEGF誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，并且對VEGF誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子升高沒有影響，這與VEGF完全相反，其中VEGF通過使進(jìn)入細(xì)胞的鈣離子流升高而生成細(xì)胞內(nèi)的ROS；C-肽抑制內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF誘導(dǎo)的應(yīng)力纖維的形成，以及VEGF誘導(dǎo)的VE-鈣粘著蛋白的破裂；以及，C-肽通過抑制VEGF誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，防止糖尿病小鼠的視網(wǎng)膜中的微血管的滲漏，從而產(chǎn)生微血管的通透性，其中VEGF誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS的生成刺激應(yīng)力纖維的形成和粘著連接的解體。C-肽抑制糖尿病誘導(dǎo)的血管滲漏的機(jī)制例示在圖7中。因此，本發(fā)明涉及使用C-肽預(yù)防或治療糖尿病性血管滲漏誘導(dǎo)的疾病的方法和組合物；以及預(yù)防或治療糖尿病性視網(wǎng)膜病變的方法和組合物。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明解決了一種使用C-肽預(yù)防或治療糖尿病性血管滲漏的方法和組合物。更具體的，本發(fā)明提供了一種預(yù)防或治療血管滲漏誘導(dǎo)的疾病的方法，該方法包括給予有需要的動物有效量的C-肽。另外，本發(fā)明還提供了預(yù)防或治療糖尿病性血管滲漏誘導(dǎo)的疾病的藥物組合物，該藥物組合物包括作為活性成分的C-肽。如本文所使用的，術(shù)語“C-肽”指在哺乳動物和鳥中發(fā)現(xiàn)的胰島素原的短的蛋白成分，該胰島素原由胰島的胰腺β細(xì)胞生成。它的長度依賴于它的來源在21個氨基酸至31個氨基酸之間變化。來自各種哺乳動物(包括狗、貓、大鼠、黑猩猩、小鼠、母牛等)的哺乳動物的C-肽，以及人類的C-肽，和來自例如鶇的鳥類的C-肽，都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，來源于人類(Homosapiens，SEQIDNO:1)、大鼠(Rattusnorvegicus，SEQIDNO:2)和黑猩猩(Pantroglodytes，SEQIDNO:3)的所有C-肽都由31個氨基酸構(gòu)成，同時發(fā)現(xiàn)C-肽在小鼠(Musmusculus，SEQIDNO:4)中為29-mer肽，在牛(BosTaurus，SEQIDNO:5)中為26-mer肽，在鶇(Turdusmerula，SEQIDNO:6)和紅腳鰹鳥(Sulasula，SEQIDNO:7)中為21-mer肽。本發(fā)明的C-肽可以具有選自由SEQIDNO:1至SEQIDNO:7組成的組中的氨基酸序列。為了本發(fā)明的目的，C-肽在本發(fā)明提供的方法或組合物中用作活性成分。所述方法或組合物可以應(yīng)用于可能受糖尿病性血管滲漏誘導(dǎo)的疾病影響的任何動物，以及人類。在此上下文中，C-肽優(yōu)選應(yīng)用于它的來源的動物。例如，如果它應(yīng)用于人類，則本發(fā)明的方法或組合物優(yōu)選包括人來源的C-肽(SEQIDNO:1)。在本發(fā)明的一個實施方式中，發(fā)現(xiàn)C-肽在糖尿病的模型小鼠中阻止血管外的滲漏，從而C-肽或包括C-肽的組合物可應(yīng)用于預(yù)防或治療糖尿病性血管滲漏。詳細(xì)來說，本發(fā)明的方法或組合物對糖尿病性血管滲漏誘導(dǎo)的疾病的預(yù)防性或治療性效果可以歸因于：C肽對細(xì)胞內(nèi)ROS生成的抑制活性，不升高細(xì)胞內(nèi)鈣離子(Ca2+)的水平；對防止應(yīng)力纖維的形成的抑制活性；和/或?qū)Ψ乐拐持B接的解體的抑制活性。C-肽對糖尿病性血管滲漏的預(yù)防性或治療效果可以應(yīng)用于人類，以及會受到糖尿病影響的任何動物。此外，抑制VEGF誘導(dǎo)的VE-鈣粘著蛋白的解體所產(chǎn)生的效果，不僅可以應(yīng)用于視網(wǎng)膜(如在下面的實施例部分中所證明的)，而且還可以應(yīng)用于其它組織的外周血管。也就是說，糖尿病性血管滲漏可以是視網(wǎng)膜滲漏或其它組織的外周血管中的微血管滲漏。相應(yīng)的，在任何糖尿病患者(動物或人類)中出現(xiàn)各種糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病之后，本發(fā)明的方法或組合物可以應(yīng)用于血管滲漏的預(yù)防或治療；其中各種糖尿病并發(fā)癥包括糖尿病性視網(wǎng)膜病變、糖尿病性神經(jīng)病、糖尿病性腎病、糖尿病性血管功能障礙、糖尿病性炎癥等。本發(fā)明的組合物是藥物組合物，該藥物組合物可進(jìn)一步包括藥學(xué)上可接受的遞送劑、賦形劑或稀釋劑。如本文所使用的，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的遞送劑、賦形劑或稀釋劑”旨于包括任何和所有的溶劑，分散介質(zhì)，包衣劑，佐劑，穩(wěn)定劑，防腐劑，抗菌劑和抗真菌劑，等滲劑，和吸收延遲劑。在本發(fā)明中有用的遞送劑、賦形劑或稀釋劑的實例包括乳糖、右旋葡萄糖(dextrose)、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、麥芽糖醇、葡萄糖、甘油、阿拉伯膠、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、甲基羥基苯甲酸鹽、丙基羥基苯甲酸鹽、滑石、硬脂酸鎂、礦物油等。使用常規(guī)方法，可以將本發(fā)明的藥物組合物配制成口服劑型(諸如粉劑、顆粒劑、片劑、膠囊、懸浮液、乳液、糖漿和噴霧劑)，或配制成無菌的注射劑。對于根據(jù)本發(fā)明的組合物的制劑，通常使用稀釋劑或賦形劑，諸如填充劑、增稠劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑和表面活性劑。用于口服劑量的固體制劑包括片劑、丸劑、粉劑、顆粒劑和膠囊。使用卵磷脂樣的乳化劑與諸如淀粉、碳酸鈣、蔗糖、乳糖或明膠的至少一種賦形劑的組合，制備這些固體制劑。除了賦形劑之外，可以使用潤滑劑，諸如鎂、硬脂酸鹽、滑石等。用于口服給藥的液體制劑包括懸浮液、內(nèi)部溶液、乳液和糖漿。在這些液體制劑中，可以含有各種賦形劑(諸如濕潤劑、甜味劑和防腐劑)，以及簡單的稀釋劑(諸如水和液體石蠟)。用于非口服劑量的制劑的代表可以是無菌水溶液、非水溶液、懸浮液、乳液、凍干劑和栓劑。對于非水溶液和懸浮液，可以使用植物油(諸如丙二醇、聚乙二醇和橄欖油)，或可注射的酯(諸如油酸乙酯)。只要導(dǎo)向靶組織，則根據(jù)本發(fā)明的使用C-肽的方法或組合物可采用任何口服或非口服的給藥途徑。優(yōu)選的是使用滲透泵的皮下注射，皮內(nèi)注射，靜脈注射，腹膜內(nèi)注射或玻璃體內(nèi)注射。在本發(fā)明中，C-肽可以以“有效量”或“藥學(xué)上的有效量”給予。如本文所使用的，術(shù)語“有效量”或“藥學(xué)上的有效量”指在不誘導(dǎo)顯著或過度的免疫應(yīng)答的情況下，足以提供預(yù)防或治療效果的量。它是依賴于藥學(xué)或藥物領(lǐng)域中已知的各種因素確定的；該已知的各種因素包括疾病的種類和嚴(yán)重程度，藥物活性，給藥途徑，排出速率，給藥時間段，共給予的藥物，和其它，患者的年齡、體重和性別，飲食習(xí)慣，健康狀態(tài)等。在確定“有效量”或“藥學(xué)上的有效量”時考慮到的各種因素對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的，并且例如在Gilman等人編輯的GoodmanAndGilman's:ThePharmacologicalBasesofTherapeutics(第8版，培格曼出版社(PergamonPress),1990)和Remington'sPharmaceuticalSciences(第17版，馬克出版有限公司(MackPublishingCo.),Easton,Pa.,1990)中進(jìn)行了解釋。本發(fā)明的組合物可以單獨給予，或者與其它療法組合給予。本發(fā)明的組合物和其它療法的共給予可以同時進(jìn)行或順序進(jìn)行?？梢杂袉我粍┝炕蚨喾N劑量。重要的是，以盡可能少的量，但在沒有導(dǎo)致副作用的情況下足以獲得最大治療效果的量，使用上述組合物。此外，可以使用裝置進(jìn)行上述組合物的給予，該裝置幫助活性成分導(dǎo)向靶細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明解決了一種使用C-肽預(yù)防或治療糖尿病性視網(wǎng)膜病變的方法和組合物。更具體的，本發(fā)明提供了一種預(yù)防或治療糖尿病性視網(wǎng)膜病變的方法，該方法包括給予有需要的動物有效量的C-肽。另外，本發(fā)明還提供了一種預(yù)防或治療糖尿病性視網(wǎng)膜病變的藥物組合物，該藥物組合物包括作為活性成分的C-肽。如上所述，發(fā)現(xiàn)了C-肽在糖尿病的模型小鼠中阻止血管外的滲漏，這樣C-肽或包括C-肽的組合物可應(yīng)用于預(yù)防或治療糖尿病性視網(wǎng)膜病變。C-肽對糖尿病性視網(wǎng)膜病變的預(yù)防性或治療性效果可以應(yīng)用于人類，以及會受到糖尿病影響的任何動物。在糖尿病性視網(wǎng)膜病變的預(yù)防或治療的背景中使用的術(shù)語“C-肽”、“劑量”、“給藥”和“有效量(藥學(xué)上的有效量)”如在本發(fā)明的前述方面中所述。具體的，對于糖尿病性視網(wǎng)膜病變的預(yù)防或治療，可以經(jīng)由玻璃體內(nèi)或皮內(nèi)途徑以2.4μg至60μg的單次劑量，并且優(yōu)選以18μg的單次劑量給予本發(fā)明的組合物，或C-肽，或者使用微型滲透泵以1.45pmol/kg/min至36.5pmol/kg/min的速率給予本發(fā)明的組合物，或C-肽。但是，這一量并不受限于這些范圍，而是可以依賴于患者的年齡、體重、性別、健康狀態(tài)和飲食、給藥時間、給藥途徑、排泄率以及疾病的嚴(yán)重程度，在總?cè)談┝績?nèi)進(jìn)行改變。通過以下實施例可以獲得對本發(fā)明的更好的理解，其中給出以下實施例以例示本發(fā)明，但不應(yīng)理解為限制本發(fā)明。實例1：實驗的準(zhǔn)備實例1-1：實驗動物六周齡的雄性C57BL/6小鼠購自奈良生物科技(首爾，韓國)。這些小鼠飼養(yǎng)在溫度受控的清潔的架子上，該架子具有12-h的光/暗周期。所有實驗都依據(jù)國立江原大學(xué)的實驗動物管理與使用委員會的指導(dǎo)進(jìn)行。實例1-2：細(xì)胞培養(yǎng)根據(jù)公知的方法從人類的臍帶靜脈中分離HUVEC，并且在以下的實驗中使用來自傳代3至6次的細(xì)胞。將細(xì)胞接種在2％明膠包被的蓋玻片、盤或板中的M199培養(yǎng)基(補(bǔ)充有20％FBS，3ng/mlbFGF，5U/ml肝素，100U/ml青霉素，和100μg/ml鏈霉素)中，并且在37℃潮濕的5％CO2的恒溫箱中生長。對于實驗，通過將細(xì)胞在低血清的培養(yǎng)基(如上補(bǔ)充的M199，但僅具有1％FBS)中培養(yǎng)6h，并且在存在或不存在各種濃度的C-肽的情況下使用10ng/mlVEGF處理適當(dāng)?shù)臅r間。實例1-3：統(tǒng)計學(xué)分析使用Origin6.1(OriginLab,北安普敦(Northampton),MA,USA)對在每一實例中獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并用圖表表示出來。使用t-檢驗和ANOVA確定統(tǒng)計學(xué)的顯著性。認(rèn)為小于0.05的p-值是有統(tǒng)計學(xué)顯著性的。實例2：在糖尿病模型動物中，C-肽對微血管滲漏的防護(hù)效果VEGF水平在糖尿病動物和糖尿病患者的視網(wǎng)膜中升高了。在患有糖尿病性視網(wǎng)膜病變的鏈脲霉素糖尿病小鼠中，研究了C-肽對視網(wǎng)膜血管滲漏的效果。通過鏈脲霉素(150mg/kg體重)的單次腹膜內(nèi)注射產(chǎn)生糖尿病小鼠，其中鏈脲霉素新鮮制備在100mM檸檬酸鹽的緩沖液(pH4.5)中。所有小鼠均過夜供應(yīng)10％的蔗糖。如通過Accu-Check活力血糖監(jiān)測儀(羅氏診斷(RocheDiagnostics)，德國)測量的，在注射之后2天觀察到足夠的高血糖癥。在鏈脲霉素注射之后1周，將具有高于16mM的非空腹血糖水平、多尿和糖尿的小鼠定義為糖尿病，并且用于實驗中。將在PBS中的2μlC-肽(3.7μg/ml)玻璃體內(nèi)注射到糖尿病小鼠的一只眼睛中，并且將等體積的PBS注射到對側(cè)眼睛中(n＝6/組)。還將2μlPBS玻璃體內(nèi)注射到正常(非糖尿病)小鼠的眼睛中(正常；n＝6/組)。在玻璃體內(nèi)注射之后，使玻璃體房中的C-肽濃度維持在生理范圍內(nèi)(0.9nM至2.0nM)12h。在注射之后24h，使用熒光素血管造影術(shù)量化視網(wǎng)膜滲漏。在這一方面，將1.25mg500-kDa的FITC-右旋糖苷(西格瑪奧德里奇(Sigma-Aldrich))注射到小鼠的左心室中，并且使染料循環(huán)5min。摘除眼睛，并且立即使用4％多聚甲醛固定45min。解剖視網(wǎng)膜，在馬爾它十字構(gòu)造中切割，并且平坦地放置在載玻片上。使用共聚焦顯微鏡觀察視網(wǎng)膜。通過使用FV-300軟件，確定從整個視網(wǎng)膜組織(n＝6/組)中溢出的FITC-右旋糖苷的強(qiáng)度，定量分析視網(wǎng)膜滲漏。結(jié)果示于圖1中。在照片(a)和柱形圖(b)中，圖1證明了C-肽對糖尿病誘導(dǎo)的血管滲漏的抑制活性。將2μlC-肽(糖尿病+C-pep，n＝6)玻璃體內(nèi)注射到糖尿病小鼠的一只眼睛中，并且將等體積的PBS注射到對側(cè)眼睛中(糖尿?。籲＝6/組)。還將2μlPBS玻璃體內(nèi)注射到正常(非糖尿病)小鼠的眼睛中(正常；n＝6/組)。通過共聚焦顯微鏡可視化視網(wǎng)膜。圖1A示出視網(wǎng)膜的代表性熒光圖像。上圖中的方形區(qū)域在各圖片的下圖中以放大圖像給出。參考圖1A，在糖尿病小鼠(n＝6)的視網(wǎng)膜中觀察到了顯著高水平的FITC-右旋糖苷的溢出，而該滲漏在C-肽注射的對側(cè)眼睛的視網(wǎng)膜中被阻斷了(n＝6；圖1A)。圖1B是柱狀圖，其中通過測量整個視網(wǎng)膜組織(n＝6)的熒光強(qiáng)度，量化了視網(wǎng)膜通透性。結(jié)果表示為來自六次獨立實驗的平均值±S.D.。*p<0.05。參考圖1B，如通過確定整個視網(wǎng)膜組織(n＝6，p<0.05；圖1B)中的FITC-右旋糖苷的熒光強(qiáng)度進(jìn)行的定量分析，證明了在糖尿病小鼠的視網(wǎng)膜中C-肽防止血管滲漏。實例3：C-肽對細(xì)胞內(nèi)ROS(活性氧類)生成和鈣離子水平的作用(1)C-肽對VEGF誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS生成的作用在糖尿病中，視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中升高的VEGF表達(dá)通過細(xì)胞內(nèi)ROS的生成參與了視網(wǎng)膜血管滲漏。在此上下文中，使用HUVEC對C-肽對VEGF誘導(dǎo)的ROS生成的保護(hù)效果，以及從而防止了血管滲漏進(jìn)行了檢驗。詳細(xì)來說，接種在蓋玻片上的HUVEC經(jīng)VEGF和C-肽進(jìn)行處理，并且與在無酚紅的培養(yǎng)基中的10μM2',7'-二氯熒光素二乙酸酯(分子探針(MolecularProbes)，尤金市(Eugene),OR)一起孵育最后的10min。將蓋玻片封固在灌注室中，并且使用共聚焦顯微鏡快速掃描經(jīng)標(biāo)記的細(xì)胞。通過對比經(jīng)處理的細(xì)胞與對照細(xì)胞的熒光強(qiáng)度來確定細(xì)胞內(nèi)ROS的水平，并且將確定的細(xì)胞內(nèi)ROS的水平表示為倍數(shù)差異。結(jié)果示于圖2中。圖2示出C-肽抑制VEGF誘導(dǎo)的ROS生成，但對細(xì)胞內(nèi)的鈣離子沒有作用。圖2A是細(xì)胞內(nèi)ROS水平的柱狀圖，該細(xì)胞內(nèi)ROS水平是在HUVEC與1mMNAC、0.5mMTrolox(水溶性維生素E)，或5μMBAPTA-AM(1,2-雙(2-氨基苯氧基)-乙烷-N,N,N',N'-四乙酸四(乙酰氧基甲酯))預(yù)孵育30min，并且用10ng/mlVEGF刺激10min之后，使用共聚焦纖維鏡確定的。數(shù)據(jù)表示為來自三次獨立實驗的平均值±S.D.。如之前報道的，VEGF生成了細(xì)胞內(nèi)ROS(p<0.01)，并且通過ROS清除劑Trolox和NAC(N-乙酰基-L-半胱氨酸)的處理，完全破壞了該ROS的生成(圖2A)。同時，Ca2+螯合劑BAPTA-AM也阻斷了VEGF誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，表明VEGF通過升高細(xì)胞內(nèi)的Ca2+產(chǎn)生了細(xì)胞內(nèi)ROS。圖2B是曲線圖，其中在HUVEC經(jīng)各種濃度的C-肽預(yù)處理30min，然后經(jīng)10ng/mlVEGF刺激之后，依據(jù)C-肽濃度繪制ROS水平。從圖2B的數(shù)據(jù)中可以看出，C-肽以劑量依賴的方式抑制了細(xì)胞內(nèi)ROS的VEGF誘導(dǎo)的生成，并且在0.5nM時觀察到ROS完全的預(yù)防。(2)C-肽對VEGF誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高的作用為了監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)Ca2+的水平，使接種在蓋玻片上的細(xì)胞與1μMFluo-4AM孵育30min。將蓋玻片封固在灌注室上，并且通過共聚焦顯微鏡(FV-300)每10秒掃描一次。處理來自上述掃描的系列圖像，以分析單個細(xì)胞水平上的細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的變化。數(shù)據(jù)表示為相對熒光強(qiáng)度(RFI)。結(jié)果示于圖2C中。圖2C是如在單個細(xì)胞水平(n＝3)上通過共聚焦顯微鏡隨著時間監(jiān)測的，在經(jīng)1μMFluo-4AM標(biāo)記的HUVEC中的細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平的曲線圖。如從圖2C的數(shù)據(jù)理解的，VEGF誘導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)Ca2+的快速增加，并且升高的細(xì)胞內(nèi)的Ca2+水平維持直至600sec。如預(yù)期的，BAPTA-AM阻斷了響應(yīng)于VEGF的細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的變化。相對比的，C-肽不增加細(xì)胞內(nèi)的Ca2+(圖2C)，并且對VEGF誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+的變化沒有作用。從這些數(shù)據(jù)，應(yīng)理解到，VEGF通過升高細(xì)胞內(nèi)Ca2+的水平生成細(xì)胞內(nèi)的ROS，而C-肽抑制了VEGF誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS的升高，且對細(xì)胞內(nèi)的Ca2+水平?jīng)]有作用。實例4：C-肽對VEGF誘導(dǎo)的應(yīng)力纖維形成的作用VEGF激活應(yīng)力纖維的形成，以及基于VE-鈣粘著蛋白的粘著連接完整性的破壞，從而導(dǎo)致血管滲漏。在這一方面，檢驗了C-肽對VEGF誘導(dǎo)的應(yīng)力纖維形成和VEGF誘導(dǎo)的粘著連接的解體的作用。視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中的VEGF水平的升高可以通過增加的ROS生成誘導(dǎo)應(yīng)力纖維的形成。為了研究C-肽在VEGF誘導(dǎo)的應(yīng)力纖維形成中的保護(hù)作用，通過使用羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色可視化HUVEC中的肌動蛋白細(xì)絲。使HUVEC生長在12孔培養(yǎng)板中經(jīng)明膠包被的圓蓋玻片上，并且在37℃，與10ng/mlC-肽或0.5mMVEGF單獨或組合的孵育1h，或在ROS清除劑(即1mMNAC或0.5mMTrolox)的存在下與10ng/mlVEGF孵育1h。細(xì)胞經(jīng)PBS快速清洗，并且經(jīng)在PBS中的3.7％甲醛固定30min。然后，細(xì)胞經(jīng)在PBS中的0.2％TritonX-100通透化，并且經(jīng)在PBS中的羅丹明-鬼筆環(huán)肽(MolecularProbes)染色1h。使用封固溶液(mountingsolution)將得到的染色細(xì)胞封固在載玻片上，然后通過共聚焦顯微鏡使肌動蛋白細(xì)絲可視化。結(jié)果示于圖3中。圖3示出了HUVEC的熒光照片，證明了C-肽抑制VEGF誘導(dǎo)的應(yīng)力纖維的形成和VEGF誘導(dǎo)的粘著連接的解體。圖3示出了C-肽對VEGF誘導(dǎo)的應(yīng)力纖維形成的抑制活性。HUVEC與單獨的10ng/mlVEGF或0.5nMC-肽，或在0.5nMC-肽、1mMNAC或0.5mMTrolox的存在下與10ng/mlVEGF孵育1h。顯微細(xì)絲經(jīng)羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色，并且通過共聚焦顯微鏡觀察(n＝3)。比例尺代表30μm。參考圖3，VEGF激活了應(yīng)力纖維的形成，而通過C-肽的處理充分阻止了該應(yīng)力纖維的形成。通過ROS清除劑NAC和Trolox的處理也抑制了VEGF激活的應(yīng)力纖維的形成，表明細(xì)胞內(nèi)ROS對于VEGF誘導(dǎo)的應(yīng)力纖維的形成是必要的。當(dāng)考慮到在實例2中獲得的數(shù)據(jù)(即C-肽抑制VEGF刺激的ROS生成)時，這些結(jié)果證明C-肽通過防止細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，抑制了VEGF誘導(dǎo)的應(yīng)力纖維的形成。實例5：C-肽對粘著連接解體的作用(1)HUVEC中C-肽對粘著連接解體的作用為了揭示參與C-肽對糖尿病誘導(dǎo)的血管滲漏的保護(hù)機(jī)制，在HUVEC中，檢驗了C-肽對VEGF誘導(dǎo)粘著連接蛋白VE-鈣粘著蛋白的變化的作用。在六孔板中的融合的細(xì)胞層(HUVEC)與C-肽或ROS清除劑孵育30min，然后在37℃經(jīng)VEGF處理90min。經(jīng)處理的細(xì)胞經(jīng)PBS清洗，并且經(jīng)在PBS中的3.7％甲醛固定30min。細(xì)胞經(jīng)在PBS中的0.2％TritonX-100通透化30min，并且在4℃經(jīng)在PBS中的VE-鈣粘著蛋白的單克隆抗體(SantaCruzBiotechnology,圣克魯茲(SantaCruz),CA)染色過夜。之后，使用山羊抗小鼠FITC的抗體(異硫氰酸熒光素；Sigma,圣路易斯(St.Louis),MO)探測細(xì)胞，然后通過共聚焦顯微鏡使VE-鈣粘著蛋白可視化。結(jié)果示于圖4中。圖4A和圖4B示出C-肽對VEGF誘導(dǎo)的粘著連接的破壞的抑制活性。HUVEC與單獨的10ng/mlVEGF或0.5nMC-肽，或在0.5nMC-肽、1mMNAC或0.5mMTrolox的存在下與10ng/mlVEGF孵育90min(n＝3)，然后對VE-鈣粘著蛋白進(jìn)行染色，并且使用共聚焦顯微鏡可視化(n＝3)。比例尺代表20μm。參考圖4A，VEGF刺激VE-鈣粘著蛋白的解體，而C-肽抑制了該解體。NAC和Trolox也防止了VEGF誘導(dǎo)的VE-鈣粘著蛋白的解體，這表明細(xì)胞內(nèi)ROS介導(dǎo)了VEGF誘導(dǎo)的VE-鈣粘著蛋白的解體。參考圖4B，其中示出直方圖，在該直方圖中，由VE-鈣粘著蛋白的解體產(chǎn)生的通透性的變化由相對熒光強(qiáng)度(RFI)表示。如在圖4B中可以看出的，通過C-肽和ROS清除劑的處理，恢復(fù)了VEGF誘導(dǎo)的粘著連接熒光強(qiáng)度的降低。因此，通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，C-肽對抗了在細(xì)胞連接處的VEGF誘導(dǎo)的VE-鈣粘著蛋白的解體。(2)C-肽對視網(wǎng)膜中粘著連接解體的作用將2μlC-肽玻璃體內(nèi)注射到糖尿病小鼠的一只眼睛中(糖尿病+C-pep)，并且將等體積的PBS注射到對側(cè)眼睛中(糖尿病；n＝3)。還將2μlPBS玻璃體內(nèi)注射到正常(非糖尿病)小鼠的眼睛中(正常；n＝3)。如下所述，對視網(wǎng)膜中的VE-鈣粘著蛋白進(jìn)行染色，并且使用共聚焦顯微鏡可視化VE-鈣粘著蛋白。在整裝視網(wǎng)膜中，對微血管中的VE-鈣粘著蛋白進(jìn)行染色。詳細(xì)來說，分離的視網(wǎng)膜在100％乙醇中固定30min，在100％冰冷的丙酮中去脂10min，并且經(jīng)0.3％TritonX-100通透化1h。視網(wǎng)膜與抗VE-鈣粘著蛋白的抗體(EnzoLifeSciences,法明代爾(Farmingdale),NY,USA)在4℃孵育24h，并且用山羊抗小鼠FITC的抗體(Sigma)在4℃探測24h，然后用共聚焦顯微鏡(FV-300,奧林帕斯(Olympus))使VE-鈣粘著蛋白可視化。結(jié)果示于圖4C中。如圖4C中所示，與HUVEC中C-肽對VEGF誘導(dǎo)的VE-鈣粘著蛋白解體的防護(hù)性作用一致，C-肽的玻璃體內(nèi)注射在糖尿病小鼠視網(wǎng)膜的微血管中抑制了糖尿病誘導(dǎo)的粘著連接的解體。因此，通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，C-肽對抗了在細(xì)胞連接處的VEGF誘導(dǎo)的VE-鈣粘著蛋白的解體。實例6：在糖尿病小鼠的視網(wǎng)膜中C-肽對微血管滲漏的抑制活性從培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞的體外發(fā)現(xiàn)，證明了C-肽通過抑制細(xì)胞內(nèi)ROS的生成以及應(yīng)力纖維的形成，對抗VEGF誘導(dǎo)的粘著連接的解體。還報道了，VEGF水平在糖尿病動物和糖尿病患者的視網(wǎng)膜中是升高的。為了證實該體外發(fā)現(xiàn)，在鏈脲霉素糖尿病小鼠中，對抗VEGF的抗體和ROS清除劑對視網(wǎng)膜血管滲漏的作用進(jìn)行了研究。將VEGF的單克隆抗體(100μg/ml)、N-乙?；?半胱氨酸(81.5mg/ml)或Trolox(125μg/ml)玻璃體內(nèi)注射到糖尿病小鼠的一只眼睛中，并且將等體積的PBS注射到對側(cè)眼睛中(n＝6/組)。在注射之后24h，使用熒光素血管造影術(shù)量化視網(wǎng)膜的血管滲漏。對于該實驗，將1.25mg500-kDa的FITC-右旋糖苷(Sigma)注射到小鼠的左心室中，并且使染料循環(huán)5min。摘除眼睛，并且立即使用4％多聚甲醛固定45min。解剖視網(wǎng)膜，在馬爾它十字構(gòu)造中切割，并且平坦地放置在載玻片上，然后使用共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。通過使用共聚焦顯微鏡(FV-300,Olympus,東京,日本)確定來自整個視網(wǎng)膜組織(n＝6/組)的溢出的FITC-右旋糖苷的強(qiáng)度，并且將該強(qiáng)度數(shù)據(jù)應(yīng)用至FV-300軟件，定量分析視網(wǎng)膜的血管滲漏。結(jié)果示于圖5中。如圖5A中所示，抗VEGF的單克隆抗體的玻璃體內(nèi)注射顯著抑制了糖尿病小鼠視網(wǎng)膜中的微血管滲漏，證明了VEGF參與糖尿病小鼠中的視網(wǎng)膜的血管滲漏。ROS清除劑NAC和Trolox的玻璃體內(nèi)注射也防止了糖尿病小鼠中的視網(wǎng)膜的血管滲漏。如預(yù)期的，C-肽的注射也阻斷了糖尿病小鼠視網(wǎng)膜中的FITC-右旋糖苷的溢出。通過確定整個視網(wǎng)膜組織中的FITC-右旋糖苷的熒光強(qiáng)度(n＝6,p<0.01；圖5B)，定量分析糖尿病小鼠中C-肽對視網(wǎng)膜的血管滲漏的預(yù)防，并且將結(jié)果以柱形圖的方式示于圖5B中。如根據(jù)圖5B的數(shù)據(jù)所理解的，C-肽通過抑制視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，對抗VEGF誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜的血管滲漏。實例7：C-肽根據(jù)注射途徑的作用(1)使用滲透泵的皮下注射在植入遞送C-肽的微型滲透泵之后，測量血液C-肽的水平。一組糖尿病小鼠(n＝7)經(jīng)皮下植入遞送速率為35pmol/min/kg的Alzet微型滲透泵2004(DURECT,庫比蒂諾(Cupertino),CA)，該Alzet微型滲透泵2004含有在PBS中的C-肽。對其它糖尿病組(n＝7)和對照組(n＝7)進(jìn)行假手術(shù)。在持續(xù)進(jìn)行皮下C-肽灌注的過程中，使用C-肽酶免疫測定試劑盒(RayBiotech,諾克斯(Norcross),GA)測量血清C-肽的水平。結(jié)果示于圖6A中。圖6A示出了在通過滲透泵注入小鼠中之后，血清C-肽的水平。如根據(jù)圖6A的數(shù)據(jù)所理解的，血清C-肽水平升高至正常值。因此，微型滲透泵使得可能以1.45pmol/kg/min至36.5pmol/kg/min的遞送速率進(jìn)行皮下注射。(2)皮內(nèi)注射C-肽對微血管滲漏的防護(hù)性作用得到了在鏈脲霉素糖尿病小鼠的皮膚中的體內(nèi)邁爾斯(Miles)血管通透性測定的支持。如下在糖尿病小鼠中進(jìn)行Miles血管通透性測定。在剃毛之后2至3天，麻醉小鼠，并且靜脈內(nèi)注射150μl1％的伊文思藍(lán)(Evansblue)溶液。15min之后，將含有0、7.5ng或15ngC-肽的15μlVEGF(10ng)溶液皮內(nèi)注射到小鼠被剃毛的皮膚中(n＝12/組)。對照組注射PBS(n＝12)。解剖皮膚中包括由于染料滲漏產(chǎn)生的藍(lán)色斑點的區(qū)域，并且通過在56℃與甲酰胺孵育2天從解剖的皮膚中洗脫出伊文思藍(lán)染料。通過620nm處的分光光度法量化染料的量。結(jié)果示于圖6B和圖6C中。圖6B示出經(jīng)VEGF單獨處理或經(jīng)VEGF與各種量的C-肽組合處理的小鼠組，或未經(jīng)處理的小鼠組的代表圖像。圖6C是與對照(n＝12)相比，量化的從解剖的皮膚中洗脫出來的伊文思藍(lán)染料含量的柱狀圖。*p<0.01。從圖6B的數(shù)據(jù)能夠明顯看出，VEGF的皮內(nèi)注射在糖尿病小鼠中顯著誘導(dǎo)了血管通透性，而C-肽以劑量依賴的方式阻止了該血管通透性。但是，C-肽單獨不會引起血管通透性的顯著變化。通過染料提取和分光光度吸收測量，量化皮膚中心活檢中的VEGF誘導(dǎo)的伊文思藍(lán)染料從血漿進(jìn)入胞間隙的血管滲漏(n＝12,p<0.01；圖6C)。這些結(jié)果證明，C-肽防止鏈脲霉素糖尿病小鼠的外周血管中的微血管滲漏?？傊厦娅@得的數(shù)據(jù)表明，C-肽通過抑制VEGF誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，防止糖尿病小鼠的視網(wǎng)膜中的微血管滲漏，其中抑制VEGF誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS的生成刺激應(yīng)力纖維的形成和粘著連接的解體，從而導(dǎo)致微血管的通透性。(3)玻璃體內(nèi)注射在玻璃體內(nèi)注射之后，隨著時間監(jiān)測玻璃體液中的C-肽的水平。在這一方面，以7.5ng的劑量玻璃體內(nèi)注射C-肽，之后使用人類C-肽ELISA試劑盒(MilliporeCo.比爾里卡(Billerica),MA)量化玻璃體房中的C-肽(n＝4)。結(jié)果示于圖6D中。之前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了，C-肽的玻璃體內(nèi)注射在注射后24h防止視網(wǎng)膜的滲漏。如在圖6D中所示，直至玻璃體內(nèi)注射之后12h，玻璃體房都維持正常水平的C-肽。也就是說，根據(jù)圖6D的數(shù)據(jù)理解的是，在玻璃體內(nèi)注射期間維持了正常的玻璃體內(nèi)的C-肽水平，從而阻止VEGF誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜滲漏。綜合以上數(shù)據(jù)，得出結(jié)論：C-肽通過抑制VEGF誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，防止糖尿病小鼠的視網(wǎng)膜中的微血管滲漏，其中VEGF誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS的生成刺激應(yīng)力纖維的形成和粘著連接的解體，從而導(dǎo)致微血管的通透性。工業(yè)實用性本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了，通過抑制VE-鈣粘著蛋白的VEGF誘導(dǎo)的解體防止血管滲漏，以及根據(jù)本發(fā)明的包括C-肽的藥物組合物對伴隨有血管滲漏的廣譜的糖尿病并發(fā)癥具有預(yù)防性或治療性應(yīng)用。