骨骼肌全器官脫細(xì)胞基質(zhì)、制備方法及其衍生出的醫(yī)療產(chǎn)品的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了骨骼肌全器官脫細(xì)胞基質(zhì)及其衍生出的醫(yī)療產(chǎn)品，以及它們的制備和使用方法。骨骼肌全器官脫細(xì)胞基質(zhì)完整的保留了骨骼肌三維的、平行排列的骨骼肌基底膜超微結(jié)構(gòu)，保留了血管基質(zhì)網(wǎng)絡(luò)和肌肉-肌腱接頭，保留了大量生長因子、透明質(zhì)酸、氨基葡聚糖、層連蛋白等生物活性成分，高度親和肌源性干細(xì)胞，具有一定的機(jī)械強(qiáng)度和韌性，脫細(xì)胞徹底、無明顯免疫排斥，無倫理道德問題，是迄今為止報(bào)道最多優(yōu)點(diǎn)的骨骼肌再生支架和平臺。所制備的骨骼肌全器官脫細(xì)胞基質(zhì)，以及其各種衍生出的醫(yī)療產(chǎn)品，可用作體外體內(nèi)構(gòu)建和再生骨骼肌，適用于修復(fù)各個(gè)部位、各種范圍的骨骼肌缺損，有望解決目前臨床上仍十分棘手的、大范圍骨骼肌缺損修復(fù)和肌肉再生難題。
【專利說明】骨骼肌全器官脫細(xì)胞基質(zhì)、制備方法及其衍生出的醫(yī)療產(chǎn)品
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明描述了骨骼肌全器官脫細(xì)胞基質(zhì)((Whole organ acellularmatrix, WOACM))及其衍生出的醫(yī)療產(chǎn)品如微粒、流體化組合物、凝膠和活性肽等的制備方法及其用途。涉及領(lǐng)域包括組織工程與再生醫(yī)學(xué)、外科學(xué)、生物材料學(xué)。
【背景技術(shù)】
[0002]骨骼肌缺損的治療，特別是大范圍肌肉缺損的功能重建，到目前為止仍是臨床難題。骨骼肌占人體重量的40-50%。骨骼肌系統(tǒng)創(chuàng)傷也是人體最常見的創(chuàng)傷之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)30-55%的運(yùn)動損傷、50-70%的戰(zhàn)傷均涉及到骨骼肌。輕微骨骼肌損傷，如各種挫傷或拉傷，骨骼肌組織能依靠成肌細(xì)胞(衛(wèi)星細(xì)胞)再生肌纖維實(shí)現(xiàn)自我修復(fù)。然而，缺損量超過20%的骨骼肌創(chuàng)傷難以實(shí)現(xiàn)功能性修復(fù)而伴有疤痕形成、遠(yuǎn)心端肌肉失神經(jīng)支配萎縮、功能障礙。針對這些患者，目前臨床的標(biāo)準(zhǔn)治療是自體取材修復(fù)，包括各種肌皮瓣移植，雖能部分恢復(fù)損傷區(qū)功能，但存在可利用的肌肉來源有限、組織解剖結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)改變、供區(qū)損傷等不足；以“創(chuàng)傷修復(fù)創(chuàng)傷”也不符合外科微創(chuàng)化的發(fā)展方向。總之，骨骼肌缺損的治療，特別是大范圍肌肉缺損的功能重建，到目前為止仍是臨床難題。通過誘導(dǎo)組織再生實(shí)現(xiàn)大范圍骨骼肌缺損的功能重建符合醫(yī)學(xué)需要，該項(xiàng)技術(shù)具有廣闊的前景。
[0003]細(xì)胞外基質(zhì)具有迄今最好的體內(nèi)骨骼肌誘導(dǎo)再生效果，但仍有改進(jìn)需要。骨骼肌是單一功能器官，理論上來說較肝臟、肺等臟器更容易通過組織工程和再生醫(yī)學(xué)技術(shù)實(shí)現(xiàn)其功能性再生。事實(shí)上，目前組織工程骨骼肌的進(jìn)展已落后于肝臟和肺等領(lǐng)域，原因是骨骼肌具有復(fù)雜的超微結(jié)構(gòu)，包括平行排列的、周期性的三維骨骼肌基底膜管結(jié)構(gòu)，肌肉-肌腱接頭等，這些結(jié)構(gòu)都非常難于人工模仿。此外骨骼肌具備功能的前提是受神經(jīng)支配以及足夠的血管網(wǎng)絡(luò)提供營養(yǎng)和氧分(肌細(xì)胞是物質(zhì)代謝非常旺盛、高耗氧細(xì)胞)，而目前各種體外構(gòu)建環(huán)境，包括生物反應(yīng)器在內(nèi)，均難以提供骨骼肌細(xì)胞生長發(fā)育所需的氧分和營養(yǎng)支持。此外有研究發(fā)現(xiàn)，酶消化獲得的骨骼肌成肌細(xì)胞(Myoblast)在分離和擴(kuò)增過程中會喪失再生骨骼肌纖維的能力。直接將肌源性干細(xì)胞接種到受損部位至今未有接種的干細(xì)胞存活率達(dá)到1%的報(bào)道。上述困難驅(qū)使人們研究可否在體內(nèi)誘導(dǎo)骨骼肌組織再生，如僅提供生物化學(xué)信號調(diào)節(jié)局部微環(huán)境加速骨骼肌再生、減少疤痕形成。這方面國外學(xué)者已取得令人矚目的突破，即應(yīng)用脫細(xì)胞基質(zhì)(Acellular matrix, ACM)支架材料，如豬小腸粘膜下層(Small intestinal submucosa, SIS)基質(zhì)、膀胱基質(zhì)(Urinarybladder matrix，UBM)，在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)骨骼肌功能性再生。這些ACM的成分為細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix, ECM),主要由I型和III型膠原纖維組成,含少量V型和VI型膠原纖維，有一定孔隙率，其余部分主要為糖蛋白、纖維粘蛋白、氨基葡聚糖(硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸、肝素等)，易于細(xì)胞粘附并能促進(jìn)粘附的細(xì)胞生長增殖；含有多種細(xì)胞因子，包括成纖維細(xì)胞生成因子(FGF)-2、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等；還有良好的可降解性和降解速率可控性，無抗原作用。ECM修復(fù)骨骼肌缺損的機(jī)理是“內(nèi)源性組織再生”:植入后ECM能夠?qū)崿F(xiàn)快速再血管化，其中的生物活性信號蛋白和生長因子吸引干細(xì)胞遷移進(jìn)入支架材料，并誘導(dǎo)干細(xì)胞分化形成位置特異性主質(zhì)細(xì)胞如骨骼肌成肌細(xì)胞、血管前體細(xì)胞；隨著持續(xù)的ECM材料的降解和持續(xù)的宿主細(xì)胞新生基質(zhì)沉積，功能性骨骼肌組織開始形成，恢復(fù)成它的起源結(jié)構(gòu)、功能性和生理性狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)動物骨骼肌缺損區(qū)使用ECM填充修復(fù)，雖然未接種干細(xì)胞，但也能夠再生出功能性骨骼肌。Valentin等使用SIS修復(fù)大鼠腹壁缺損，6個(gè)月后在修復(fù)區(qū)看到島嶼狀功能性骨骼肌組織，其產(chǎn)生的收縮力可達(dá)到正常腹肌的80 %。同樣，Turner等在犬8 X 4cm大小部分肌肉缺失模型中，6個(gè)月后同樣觀察到SIS修復(fù)區(qū)有血供良好、受神經(jīng)支配、有收縮功能的骨骼肌新生，幾乎與修復(fù)區(qū)周圍正常肌肉組織難以區(qū)分。當(dāng)然，預(yù)接種干細(xì)胞會進(jìn)一步加快組織再生速度；ConConi等發(fā)現(xiàn)大鼠腹肌ECM體外接種成肌細(xì)胞后重新植入修復(fù)大鼠腹壁缺損，僅9天即可形成具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)、可收縮、血管化的骨骼肌組織。上述研究結(jié)果國外已轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用，即植入ECM材料促進(jìn)遭受中等范圍骨骼肌損失的患者實(shí)現(xiàn)肌肉功能重建，改善肢體殘疾。已有的報(bào)道均來自于美國軍方。第I例臨床應(yīng)用是采用UBM為一名自阿富汗戰(zhàn)場返回的右下肢腓腸肌部分被炸飛的士兵實(shí)現(xiàn)了肌肉再生，受傷部位的骨骼肌肌力恢復(fù)到對側(cè)的70%。我國的報(bào)紙《參考消息》也轉(zhuǎn)載了這一成果(第19120期，2011年6月21日)。第2例是一名右大腿根部部分骨骼肌缺失的士兵，他接受多層SIS植入治療時(shí)距他受傷已有3年。在這3年中，他的受傷區(qū)是疤痕修復(fù)，雖經(jīng)多年康復(fù)治療，他仍一直有明顯的右膝伸直困難。接受SIS植入后4月，他的這一癥狀明顯改善，受傷區(qū)肌力提高了 30%。不過值得注意的是，這一方法目前仍存在一些局限性，包括①操作繁瑣，上述研究中所用的ECM材料是UBM和SIS，雖然來源方便，但因?yàn)閁BM和SIS的平均厚度不到100 μ m，要達(dá)到缺損骨骼肌的體積需要層疊數(shù)百層的材料；②再生骨骼肌并不是真正意義上具有全部收縮功能的骨骼肌:骨骼肌物質(zhì)代謝非常旺盛，骨骼肌劇烈運(yùn)動時(shí)其內(nèi)的血流量能達(dá)到平靜狀態(tài)時(shí)的20-80倍，故正常人體骨骼肌均有較粗直徑的支配血管且每平方毫米肌肉中有1350-3000條毛細(xì)血管；而UBM和SIS植入?yún)^(qū)再生骨骼肌的血供均由周圍組織侵入的毛細(xì)血管提供，無明顯支配血管、毛細(xì)血管密度也不足，無法提供劇 烈收縮時(shí)需要的血流量；③UBM和SIS未能反映出天然骨骼肌基質(zhì)的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，再生骨骼肌的肌纖維排列不理想?？傊瓻CM誘導(dǎo)骨骼肌功能性再生是一項(xiàng)非常有前景的技術(shù)，但目前仍有值得深入研究改進(jìn)措施的地方。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的特征在于獲得了骨骼肌全器官脫細(xì)胞基質(zhì)(W0ACM)，具有高組織相容性，保留了骨骼肌三維超微結(jié)構(gòu)和血管基質(zhì)網(wǎng)絡(luò)以及肌肉-肌腱接頭結(jié)構(gòu)等，保留有骨骼肌特異性細(xì)胞外基質(zhì)成分，較迄今已有的各種支架材料更好的模擬了天然骨骼肌細(xì)胞外基質(zhì)的物理和生物特性。
[0005]在舉例的一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明詳細(xì)的敘述了骨骼肌WOACM這種生物活性骨骼肌再生支架材料的制備方法，包括取材對象的選擇、原料骨骼肌組織的獲取和準(zhǔn)備、前置處理、脫細(xì)胞、消毒保存、體外評估等。
[0006]本發(fā)明制備的骨骼肌WOACM起始原料是異體異種骨骼肌，如人體，豬，狗等的骨骼肌，優(yōu)選的骨骼肌是血供明顯的骨骼肌，最優(yōu)的是帶獨(dú)立支配血管的骨骼肌。取材范圍優(yōu)選的包括骨骼肌支配血管的上級血管，最優(yōu)的是來自于供體軀體的主干血管，以期相應(yīng)血管脫細(xì)胞后能方便用于外科縫合。供體的年齡以年輕為佳，因?yàn)槟贻p供體骨骼肌的細(xì)胞外基質(zhì)中各種促干細(xì)胞粘附成分、生長因子等較豐富，所含脂肪組織較少。取材時(shí)間應(yīng)于供體死亡后30分鐘內(nèi)，優(yōu)選方案是在取材部位骨骼肌仍具備有效血液循環(huán)時(shí)取材。
[0007]本發(fā)明涉及的原材料準(zhǔn)備指骨骼肌在獲取時(shí)應(yīng)有較好的保存液灌注，其標(biāo)準(zhǔn)是確保骨骼肌內(nèi)動靜脈系統(tǒng)均得到充分灌注、血液成分被排出而不會在骨骼肌小血管中凝結(jié)致微循環(huán)阻塞，此外灌注未導(dǎo)致骨骼肌內(nèi)血管網(wǎng)絡(luò)破壞；優(yōu)選的方案是供體有預(yù)先全身肝素化，最佳的是供體預(yù)先全身肝素化聯(lián)合局部保存液充分灌注，充分灌注的標(biāo)準(zhǔn)是經(jīng)支配動脈灌入保存液，支配動脈伴行的靜脈中無粘稠血性液流出。經(jīng)充分灌注后，原材料可反復(fù)冷凍、復(fù)溫。[008]本發(fā)明涉及的前置處理指明確所插管動脈支配的骨骼肌范圍、支配動脈有無解剖學(xué)變異，插管支配動脈的伴行靜脈，清除原材料骨骼肌表面的筋膜、脂肪組織；
[0009]本發(fā)明涉及的脫細(xì)胞方法包括將插管血管接入生物反應(yīng)器，經(jīng)支配血管按序列分批灌注不同處理液，所述處理液可包括酶處理液和化學(xué)藥物處理液，所述酶處理液可選自如胰蛋白酶(Trypsin)、核酸外切酶或核酸內(nèi)切酶如脫氧核糖核酸酶(Deoxyribonuclease, DNase)、α -半乳糖苷酶等的一種或幾種,所述化學(xué)藥物處理液可選自離子型、非離子型和兩性表面活性劑、螯合劑、高低滲溶液的一種或幾種，例如乙二胺四乙酸(Ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)、乙二酉享雙四乙酸(Ethylene glycoltetraacetic acid, EGTA)、十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate, SDS)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-X)、脫氧膽酸(Deoxycholic acid)等,上述酶處理液和化學(xué)藥物處理液可選擇匹配組成多種方案用于骨骼肌脫細(xì)胞，不同方案間可在藥物選用、藥物使用順序、藥物濃度和藥物作用時(shí)間上有差異，但目標(biāo)一致，即以最溫和的方式實(shí)現(xiàn)徹底脫細(xì)胞并同時(shí)最大限度保留骨骼肌細(xì)胞外基質(zhì)中的生物活性成分，至少需保留骨骼肌細(xì)胞外基質(zhì)中80%以上的生物活性成分。
[0010]脫細(xì)胞方案所用胰蛋白酶的終濃度為0.01~0.25%，EDTA或EGTA的終濃度為
0.02~0.5%, DNase的終濃度為30_50U/ml，α -半乳糖苷酶的終濃度為10_25U/ml，SDS的終濃度為0.01~0.1%、Triton-X的終濃度為0.1~1%、Deoxycholate acid的終濃度為
0.5 ~2%。
[0011]脫細(xì)胞方案中，所述分批灌注的處理液可選自胰蛋白酶/乙二胺四乙酸或胰蛋白酶/乙二醇雙四乙酸、脫氧核糖核酸酶/ α -半乳糖苷酶、十二烷基硫酸鈉、聚乙二醇辛基苯基醚和脫氧膽酸的幾種，其中所用胰蛋白酶/EDTA或EGTA的作用時(shí)間1_3小時(shí)，DNase和α -半乳糖苷酶的作用時(shí)間0.4-1小時(shí)，SDS的作用時(shí)間4-24小時(shí)、Triton-X的作用時(shí)間8-24小時(shí)、Deoxycholate的作用時(shí)間4-24小時(shí)。
[0012]本發(fā)明涉及的消毒技術(shù)可選自全灌注系統(tǒng)預(yù)滅菌、全程使用滅菌液體灌注、制備后消毒液灌注，或輻射滅菌，具體可包括經(jīng)支配血管灌注過氧乙酸(Peroxyaceticacid，PAA)/乙醇(ETOH)混合液或Y射線輻射滅菌等。其中PAA的終濃度(V/V)為
0.1-0.5%,乙醇的終濃度(V/V)為2-10%，PAA/乙醇混合液的作用時(shí)間2_3小時(shí)。制備的骨骼肌WOACM可選擇水化保存，或經(jīng)真空冷凍干燥形成干燥體保存。
[0013]在舉例的一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明詳細(xì)的敘述了骨骼肌WOACM這種生物活性骨骼肌再生支架材料體外生物活性的檢測方法和結(jié)果，包括檢測骨骼肌WOACM的組織學(xué)、超微結(jié)構(gòu)，檢測脫細(xì)胞的徹底性(包括殘留核酸、內(nèi)毒素含量和生物負(fù)載如真菌、病毒含量，殘留核酸鏈的大小，殘留脫細(xì)胞化合物含量)，檢測骨骼肌基底膜特異成分的存在如IV型膠原、層連蛋白、纖連蛋白等，測定促干細(xì)胞粘附、增殖和分化成分的含量如透明質(zhì)酸、糖胺聚糖(Glycosaminoglycan, GAGs)、硫酸類肝素、各種生長因子如血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(Basic fibroblast growthfactor, bFGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-β (transforming growthfactor- β , TGF- β )等。
[0014]在舉例的一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明詳細(xì)的敘述了骨骼肌WOACM較其他支架材料在促血管和肌源性干細(xì)胞趨化、促血管和肌源性干細(xì)胞增殖、促肌源性干細(xì)胞成肌分化和肌管生成方面的優(yōu)勢。
[0015]本發(fā)明所制備的骨骼肌WOACM可衍生出微粒、流體化組合物、凝膠和活性肽等醫(yī)療產(chǎn)品。微粒產(chǎn)品為將骨骼肌WOACM真空冷凍干燥后的干燥體經(jīng)高速旋轉(zhuǎn)粉碎所得，包括多個(gè)產(chǎn)品等級(≤38 μ m，38-100 μ m, 100-250 μ m)，可用作骨骼肌創(chuàng)面覆蓋、骨骼肌缺損充填材料等。流體化組合物為將骨骼肌WOACM微粒在酸性環(huán)境中使用胃蛋白酶消化所得。凝膠產(chǎn)品為均勻流體化組合物再濃縮、中性化處理所得，包括不同濃度等級，可用作骨骼肌創(chuàng)面覆蓋、注射用充填骨骼肌缺損、治療肌營養(yǎng)不良等。制備上述衍生產(chǎn)品的技術(shù)均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
[0016]本發(fā)明涉及的骨骼肌WOACM活性肽的制備:將骨骼肌WOACM流體化組合物經(jīng)超高速離心13000rpm)后，上清液真空冷凍干燥，所得干燥體即為骨骼肌WOACM的活性肽，體外測試證實(shí)其促骨骼肌成肌細(xì)胞趨化、增殖和分化的能力遠(yuǎn)較骨骼肌WOACM流體化組合物更高效。
[0017]由本文的描述，本發(fā)明的另外的方面以及特征和優(yōu)點(diǎn)對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言是顯而易見的。
【專利附圖】

【附圖說明】
圖1為豬下腹直肌的支配血管解剖和取材范圍示例圖；
圖2為原始骨骼肌以及由該塊肌肉制備的骨骼肌示意圖；
圖3為骨骼肌WOACM結(jié)構(gòu)完整，保留有血管網(wǎng)絡(luò)的示例圖；
圖4為天然骨骼肌和骨骼肌WOACM的橫斷面、沿長軸面的掃描電鏡圖；
圖5為骨骼肌WOACM的可見保留的毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)的橫斷面掃描電鏡圖；
圖6為天然骨骼肌和骨骼肌WOACM橫斷面的HE染色、基底膜蛋白免疫組化染色(200X)示例圖；
圖7為天然骨骼肌和骨骼肌WOACM沿長軸面的HE染色、基底膜蛋白免疫組化染色(200X)示例圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌ECM更利于骨骼肌再生，其中骨骼肌WOACM具有最佳的理論優(yōu)勢。近年來越來越多的研究顯示，特定組織的ECM均擁有該組織獨(dú)特的成分和結(jié)構(gòu)，同樣骨骼肌ECM也具備骨骼肌特異性的成分和結(jié)構(gòu)①高IV型膠原含量，主要存在于骨骼肌基底膜中，利于成肌細(xì)胞粘附、遷移和激活復(fù)雜的、具有啟動功能的三維超微結(jié)構(gòu)，包括平行排列的肌內(nèi)膜管結(jié)構(gòu)、殘存的神經(jīng)和血管通路，可促進(jìn)成肌細(xì)胞的調(diào)整和融合，并刺激神經(jīng)血管生長；③富含生長因子、透明質(zhì)酸、層粘連蛋白、硫酸肝素、硫酸蛋白聚糖等，生物相容性極佳；④降解產(chǎn)物具有強(qiáng)有力的促肌肉干細(xì)胞的有絲分裂和趨化作用，且這些降解產(chǎn)物形成的微環(huán)境，對維持肌細(xì)胞和衛(wèi)星細(xì)胞的活力非常重要。因此，骨骼肌ECM應(yīng)較其他材料更適合于重建骨骼肌，骨骼肌ECM修復(fù)骨骼肌缺損時(shí)也應(yīng)具有更好的誘導(dǎo)再生效果。
[0019]制備骨骼肌ECM—直是組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的難題。通常認(rèn)為骨骼肌結(jié)構(gòu)致密，組織間有多重結(jié)締組織分隔，脫細(xì)胞液體于其中難以彌散，故迄今僅有大鼠四肢小塊骨骼肌ECM和豬骨骼肌薄片的ECM制備成功的報(bào)道，但這些骨骼肌ECM不能用于修復(fù)臨床上的大范圍骨骼肌缺損。2008年國際頂級醫(yī)學(xué)期刊《Nature Medicine》首先報(bào)道了一項(xiàng)革命性技術(shù)，灌注法脫細(xì)胞制備整器官的細(xì)胞外基質(zhì)用于構(gòu)建相應(yīng)的組織工程器官。美國學(xué)者Ott HC等應(yīng)用此法制備出大鼠心臟的全器官脫細(xì)胞基質(zhì)，接種干細(xì)胞體外構(gòu)建8天后成功獲得一人工心臟，其泵血功能達(dá)到正常成年大鼠心臟的2%，16周胎鼠心臟的25%。受到此項(xiàng)技術(shù)啟發(fā)，人們先后獲得了肝、腎、肺等臟器的全器官脫細(xì)胞基質(zhì)，相關(guān)文章均發(fā)表在《Science》、《!fepatology》等頂級期刊。與此同時(shí)，國際知名的組織工程中心也一直在開展骨骼肌WOACM的制備工作，因?yàn)閺睦碚撋蟻碚f，骨骼肌WOACM較目前國內(nèi)外已報(bào)道的各種骨骼肌再生平臺，包括無機(jī)生物材料如可溶性磷酸鹽玻璃纖維支架等、生物可降解合成高分子材料如聚羥基乙酸、聚乳酸以及和各類酯單體共聚物如聚乳酸-乙醇酸等，天然可降解生物材料如殼聚糖、膠原、SIS和UBM等，具有許多無可比擬的優(yōu)勢:
A.骨骼肌WOACM保留了骨骼肌復(fù)雜的、具有啟動功能的三維平行排列、周期性的肌內(nèi)膜(基底膜)管結(jié)構(gòu)，這樣的超微結(jié)構(gòu)目前尚不能人工模仿，特別利于肌源性干細(xì)胞定向遷移、延伸和融合，也 能引導(dǎo)新生肌管的方向；
B.骨骼肌WOACM保留有生物活性成分(維持肌源性干細(xì)胞活性的生物信號):包括骨骼肌基底膜特異成分(IV型膠原、層連蛋白、纖連蛋白)、促干細(xì)胞粘附、增殖和分化成分(透明質(zhì)酸、糖胺聚糖、硫酸類肝素和生長因子如bFGF、TGF-β 1、IGF、VEGF等)；
C.骨骼肌WOACM保留了骨骼肌完整的血管基質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，包括終末動脈、靜脈和毛細(xì)血管系統(tǒng)；用于系統(tǒng)性接種干細(xì)胞可確保干細(xì)胞均勻分布到整個(gè)基質(zhì)內(nèi)并且所有接種的細(xì)胞在血管周圍150-200 μ m內(nèi)，能良好存活；此外,血管基質(zhì)網(wǎng)絡(luò)若能連通至受體的循環(huán)系統(tǒng)則可為干細(xì)胞持續(xù)提供營養(yǎng)；
D.骨骼肌WOACM保留了主要供應(yīng)血管的基質(zhì)，有機(jī)會再生出新的大直徑供應(yīng)血管來支配新生骨骼肌成為全功能骨骼??；
E.骨骼肌WOACM保留了肌肉-肌腱接頭結(jié)構(gòu)，可直接傳導(dǎo)力學(xué)；
F.骨骼肌WOACM具有一定的機(jī)械強(qiáng)度和韌性；
G.骨骼肌ECM較其他材料更容易實(shí)現(xiàn)新生骨骼肌的再神經(jīng)化。研究顯示，輕度骨骼肌損傷機(jī)體實(shí)現(xiàn)自我修復(fù)時(shí)，超過95%的神經(jīng)-肌肉接頭還是再生于基底膜和肌內(nèi)膜上的原位(衛(wèi)星細(xì)胞龕)，而骨骼肌WOACM保留了肌衛(wèi)星細(xì)胞龕的成分和結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的骨骼肌WOACM的制備方法適用于制備所有生物、各個(gè)部位的骨骼肌W0ACM，如人體、豬、狗的腹直肌、背闊肌。以下將以豬腹壁下腹直肌為例進(jìn)行詳細(xì)說明。以下實(shí)施例中所提到的所有具體參數(shù)，僅用于舉例說明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由下述公開的內(nèi)容得到多種簡單變化的方案，這些簡單變換的方案也在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0020]原材料(豬腹壁下腹直肌)的獲取和準(zhǔn)備:選擇供體為16-20周齡雌性Yorkshaire豬，體重25-30kg，預(yù)先經(jīng)外周靜脈全身肝素化(10000U/只)，采用從劍突直至下腹近肛門的腹正中切口，切開腹白線至腹膜前間隙，向頭部方向推開腹膜，暴露腹膜后結(jié)構(gòu)，包括腹主動靜脈、髂總血管、髂外血管。切開髂外動脈，置入14-20G套管至腹壁下動脈，灌注泵驅(qū)動向腹壁下動脈內(nèi)注入肝素化(l_5U/ml)的生理鹽水，保持動脈內(nèi)壓力在活體正常血壓水平(100-120mmHg)。充分灌注直至腹壁下靜脈中無濃稠血性液流出。繼續(xù)沿髂外血管暴露陰部腹壁血管干(該血管干由三條血管組成:腹壁下動脈，上腹尾淺動脈和陰部外動脈)和股動脈(圖1左)。沿腹直肌前表面剝離腹直肌前鞘，沿后表面剝離腹橫筋膜(弓狀線下方)和腹直肌后鞘(弓狀線上方)，直至臍水平(第3或第4腱劃)，特征是可見腹壁下深動脈穿支(Deep inferior epigastric perforator, DIEP)。沿恥骨弓表面切斷腹直肌腱和恥骨接頭，切斷髂外動靜脈、股動靜脈、陰部外動靜脈和上腹尾淺動靜脈，沿臍水平切斷腹直肌，完成下腹直肌的獲取和準(zhǔn)備(圖1右)。 [0021]前置處理:獲取的豬下腹直肌置于灌注反應(yīng)器中，髂外動脈插管連通灌注泵，低壓(約60mmHg)灌注IX的磷酸鹽緩沖液(PBS)。使用染料明確腹壁下動脈支配范圍，檢查有無供應(yīng)下腹直肌的異常血管，若有，則需置管入該血管用于灌注(圖2左)。進(jìn)一步清除肌組織表面的脂肪組織，結(jié)扎髂外動脈除腹壁下動脈以外的所有分支，包括上腹尾淺動脈、陰部外動脈和股動脈，確保經(jīng)髂外動脈灌注液完全流入腹壁下動脈。結(jié)扎髂外靜脈除腹壁下靜脈(有2支)以外的所有分支，包括上腹尾淺靜脈(2支)、陰部外靜脈和股靜脈，髂外靜脈內(nèi)置入套管。
[0022]脫細(xì)胞處理:將髂外動靜脈套管接入生物反應(yīng)器，灌注時(shí)注意標(biāo)本須同時(shí)浸沒于與灌注液同樣的液體中。附表1和表2示出了常用的2種優(yōu)化的脫細(xì)胞方案，其中方案I操作時(shí)間長于方案2，但更容易實(shí)現(xiàn)超大體積(如大于50 X 40 X 5cm)的原材料骨骼肌的脫細(xì)胞。骨骼肌脫細(xì)胞后呈透明狀，可清晰顯示其內(nèi)的血管、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(圖2右)，染色灌注確認(rèn)其結(jié)構(gòu)完整、無液體滲漏(圖3)。除表1和表2所示脫細(xì)胞方案外，本發(fā)明還可使用其它任何使用上述描述的試劑及不同處理時(shí)間的合適的脫細(xì)胞方案。
[0023]消毒和保存:自0.1%PAA/4%ET0H灌注后,所有灌注的液體,包括去離子水,均為已滅菌液體。最終獲得骨骼肌WOACM保存于組織保存液中，Y射線輻射滅菌。組織保存液成分為:乳糖醒酸IOOmmol,磷酸氫鉀25mmol,硫酸鎂5mmol,氫氧化鈉(5mmol/L) 5ml,氫氧化鉀(5mmol/L) 20ml,鹿糖 60mmol, pH 7.45±0.10,滲透壓(310±10) m0sm/L。
[0024]骨骼肌WOACM的超微結(jié)構(gòu):HE染色和掃描電鏡確認(rèn)骨骼肌WOACM保留了天然骨骼肌細(xì)胞外基質(zhì)三維平行排列、周期性的肌外膜、肌束膜和肌內(nèi)膜超微結(jié)構(gòu)，骨骼肌基底膜成分貼附于肌內(nèi)膜內(nèi)面(圖4)，這樣的結(jié)構(gòu)最利于肌源性干細(xì)胞的粘附、遷移、增殖、分化和融合?？梢娗逦谋Ａ舻拿?xì)血管網(wǎng)絡(luò)(終末動脈和伴行的2條終末靜脈，圖5)。
[0025]脫細(xì)胞徹底性測定:組織學(xué)染色未見細(xì)胞核結(jié)構(gòu)，DAPI染色陰性。提取骨骼肌WOACM中的全部DNA，使用Picogreen法測定骨骼肌WOACM干重中殘留DNA的含量低于50ng/mg。殘留DNA鏈的長度200-500bp。
[0026]生物活性測定:經(jīng)ELISA法測定，骨骼肌WOACM干重中GAGs含量是645土 40ng/mg、VEGF 含量是 186 ±22ng/mg，bFGF 含量是 1375 ±230ng/mg，TGF-β 含量是 293±8ng/mg。骨骼肌基底膜主要成分蛋白免疫組化染色證實(shí)骨骼肌WOACM中含有IV型膠原、層連蛋白、纖連蛋白(圖6和圖7)。
[0027]骨骼肌WOACM較其他ECM和合成高分子材料更趨化血管和肌源性干細(xì)胞:所制備的骨骼肌WOACM流體化組合物經(jīng)中性化后，以不同濃度(1000 μ g/ml、500 μ g/ml、250 μ g/ml UOO μ g/ml,50 μ g/ml,25 μ g/ml UOy g/ml,5 μ g/ml)比較與 SIS、UBM、PLGA 對骨骼肌成肌細(xì)胞、MJK/PJK的趨化作用(Boyden chamber法)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)骨骼肌WOACM具有最佳的促干細(xì)胞趨化作用，且在濃度25 μ g/ml時(shí)即達(dá)到最佳作用。
[0028]骨骼肌WOACM較其他ECM和合成高分子材料更促進(jìn)血管和肌源性干細(xì)胞增殖:使用 BrdU 法檢測不同濃度(1000 μ g/ml>500 μ g/ml、250 μ g/ml、100 μ g/ml、50 μ g/ml、25 μ g/ml、10 μ g/ml、5 μ g/ml)的骨骼肌 WOACM、SIS、UBM、PLGA 對骨骼肌成肌細(xì)胞、MJK/PJK的促增殖作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)骨骼肌WOACM具有最佳的促干細(xì)胞增殖作用，且在濃度50 μ g/ml時(shí)即達(dá)到最佳作用。
[0029]骨骼肌WOACM較其他ECM和合成高分子材料更促進(jìn)血管和肌源性干細(xì)胞分化:接種5X IO5骨骼肌成肌細(xì)胞至I X Icm骨骼肌WOACM薄片、SIS、UBM、PLGA支架表面，使用全培養(yǎng)液(DMEM+10%胎牛血清)培養(yǎng)7天后改用誘導(dǎo)培養(yǎng)液(DMEM+10%馬血清)培養(yǎng)3天，比較骨骼肌成肌細(xì)胞的分化和肌生成，檢測骨骼肌調(diào)節(jié)因子的表達(dá)(MyoD，Myogenin, MRF4, Myf5),激光共聚焦顯微鏡檢測新生肌管的量、尺寸和有序性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在骨骼肌WOACM表面成肌細(xì)胞最容易形成新生肌管，且新生肌管排列最為有序。
[0030]殘留化學(xué)物測定:脫細(xì)胞方案I制備的骨骼肌WOACM采用亞甲藍(lán)結(jié)合殘留物中的十二烷基硫酸鈉，Picogre en法測定吸光度,測定骨骼肌WOACM干重中殘留十二烷基硫酸鈉的含量低于100ng/mg，未檢測到Triton-X殘留；脫細(xì)胞方案2制備的骨骼肌WOACM中未檢測到Triton-X和脫氧膽酸殘留。
[0031]生物負(fù)載測定:經(jīng)常規(guī)方法測定，脫細(xì)胞方案I和脫細(xì)胞方案I制備的骨骼肌WOACM均不攜帶真菌、病毒在內(nèi)的生物負(fù)載。
[0032]滅菌測定:經(jīng)常規(guī)方法測定，脫細(xì)胞方案I和脫細(xì)胞方案I制備的骨骼肌WOACM均滅菌徹底，內(nèi)毒素含量<15Eu/mg干重。
[0033]機(jī)械強(qiáng)度和韌性、彈性測定:經(jīng)常規(guī)方法測定，脫細(xì)胞方案I和脫細(xì)胞方案I制備的骨骼肌W0ACM，保留有其來源骨骼肌30%以上的機(jī)械強(qiáng)度，以及90%以上的韌性和彈性。
應(yīng)用領(lǐng)域
本發(fā)明制備的骨骼肌WOACM及其衍生醫(yī)療產(chǎn)品的應(yīng)用領(lǐng)域包括用于組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域體外構(gòu)建、體內(nèi)再生骨骼肌，可修復(fù)各種范圍的骨骼肌缺損包括覆蓋骨骼肌創(chuàng)面、填充肌缺損、注射治療肌營養(yǎng)不良、解剖修復(fù)大范圍缺損，也可用于心肌梗死的治療。
以上公開的僅為本申請的一個(gè)具體實(shí)施例,但本申請并非局限于此,任何本領(lǐng)域的技術(shù)人員能思之的變化，都應(yīng)落在本申請的保護(hù)范圍內(nèi)。
附表、【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]表1.脫細(xì)胞方案1:
【權(quán)利要求】
1.一種骨骼肌全器官脫細(xì)胞基質(zhì)的制備方法，其特征在于，主要包括以下步驟:取材對象的選擇、原材料的獲取和準(zhǔn)備、前置處理、脫細(xì)胞、消毒保存、體外評估。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的骨骼肌全器官脫細(xì)胞基質(zhì)的制備方法，其特征在于，所述取材對象的選擇為，選擇血供明顯的異種異體骨骼??；取材范圍包括骨骼肌支配血管的上級血管；取材時(shí)間為取材部位骨骼肌仍具備有效血液循環(huán)時(shí)取材。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的骨骼肌全器官脫細(xì)胞基質(zhì)的制備方法，其特征在于，所述原材料的獲取和準(zhǔn)備，其標(biāo)準(zhǔn)是確保骨骼肌內(nèi)動靜脈系統(tǒng)均得到充分灌注、血液成分被排出而不會在骨骼肌小血管中凝結(jié)致微循環(huán)阻塞，此外灌注未導(dǎo)致骨骼肌內(nèi)血管網(wǎng)絡(luò)破壞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的骨骼肌全器官脫細(xì)胞基質(zhì)的制備方法，其特征在于，所述前置處理指明確所插管動脈支配的骨骼肌范圍、支配動脈有無解剖學(xué)變異，插管支配動脈的伴行靜脈，清除原材料骨骼肌表面的筋膜、脂肪組織。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的骨骼肌全器官脫細(xì)胞基質(zhì)的制備方法，其特征在于，所述脫細(xì)胞步驟包括:將插管血管接入生物反應(yīng)器，經(jīng)支配血管按序列分批灌注不同處理液，標(biāo)準(zhǔn)是達(dá)到脫細(xì)胞要求、保留骨骼肌細(xì)胞外基質(zhì)中80%以上的生物活性成分；其中，所述處理液包括酶處理液和化學(xué)藥物處理液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的骨骼肌全器官脫細(xì)胞基質(zhì)的制備方法，其特征在于，所述酶處理液選自胰蛋白酶、α-半乳糖苷酶或核酸外切酶/核酸內(nèi)切酶中的一種或幾種；所述化學(xué)藥物處理液選自離子型、非離子型和兩性表面活性劑、螯合劑、高低滲溶液的一種或幾種。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的骨骼肌全器官脫細(xì)胞基質(zhì)的制備方法，其特征在于，所述核酸外切酶/核酸內(nèi)切酶為脫氧核糖核酸酶，所述脫氧核糖核酸酶的終濃度為30-50U/ml ;所述胰蛋白酶的終濃度為0.01~0.25% ； α -半乳糖苷酶的終濃度為10-25U/ml ； 所述化學(xué)藥物處理液選自乙二胺四乙酸、乙二醇雙四乙酸、十二烷基硫酸鈉、聚乙二醇辛基苯基醚、脫氧膽酸的一種或幾種，其中所述乙二胺四乙酸或乙二醇雙四乙酸的終濃度為0.02~0.5%，所述十二烷基硫酸鈉的終濃度為0.01~0.1%，所述聚乙二醇辛基苯基醚的終濃度為0.1~1%，所述脫氧膽酸的終濃度為0.5~2%。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的骨骼肌全器官脫細(xì)胞基質(zhì)的制備方法，其特征在于，所述分批灌注的處理液選自胰蛋白酶/乙二胺四乙酸或胰蛋白酶/乙二醇雙四乙酸、脫氧核糖核酸酶/ α -半乳糖苷酶、十二烷基硫酸鈉、聚乙二醇辛基苯基醚和脫氧膽酸的幾種，其中所述胰蛋白酶/乙二胺四乙酸或胰蛋白酶/乙二醇雙四乙酸的作用時(shí)間為1-3小時(shí)，脫氧核糖核酸酶/α-半乳糖苷酶的作用時(shí)間為0.4-1小時(shí)，十二烷基硫酸鈉的作用時(shí)間為4-24小時(shí)、聚乙二醇辛基苯基醚的作用時(shí)間為8-24小時(shí)、脫氧膽酸的作用時(shí)間4-24小時(shí)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的骨骼肌全器官脫細(xì)胞基質(zhì)的制備方法，其特征在于，所述消毒保存中的消毒方法選自全灌注系統(tǒng)預(yù)滅菌、全程使用滅菌液體灌注、制備后消毒液灌注，或輻射滅菌的一種或幾種；所述消毒保存中的保存技術(shù)選自水化保存或干燥體保存。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的骨骼肌全器官脫細(xì)胞基質(zhì)的制備方法，其特征在于，所述體外評估包括:檢測骨骼肌全器官脫細(xì)胞基質(zhì)的組織學(xué)、超微結(jié)構(gòu)，檢測殘留核酸、內(nèi)毒素含量和殘留核酸鏈的長度，測定生物負(fù)載以及殘留脫細(xì)胞化合物含量，檢測骨骼肌基底膜特異性成分的存在，測定促干細(xì)胞粘附、增殖和分化成分的含量。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的骨骼肌全器官脫細(xì)胞基質(zhì)的制備方法，其特征在于，所述骨骼肌基底膜特異成分包括IV型膠原、層連蛋白、纖連蛋白，所述促干細(xì)胞粘附、增殖和分化成分包括透明質(zhì)酸、糖胺聚糖、硫酸類肝素和生長因子。
12.一種骨骼肌全器官脫細(xì)胞基質(zhì)，是一種骨骼肌再生支架，其特征在于， A.所述骨骼肌全器官脫細(xì)胞基質(zhì)保留了骨骼肌復(fù)雜的、具有啟動功能的三維平行排列、周期性的肌內(nèi)膜管超微結(jié)構(gòu)，該超微結(jié)構(gòu)特別利于肌源性干細(xì)胞定向遷移、延伸和融合，也能引導(dǎo)新生肌管的方向；和 B.所述骨骼肌全器官脫細(xì)胞基質(zhì)保留了骨骼肌完整的血管基質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，包括終末動脈、靜脈和毛細(xì)血管系統(tǒng)；和 C.所述骨骼肌全器官脫細(xì)胞基質(zhì)保留有用于維持肌源性干細(xì)胞活性的生物信號的生物活性成分，所述生物活性成分包括骨骼肌基底膜特異成分，以及促干細(xì)胞粘附、增殖和分化成分；和 D.所述骨骼肌全器官脫細(xì)胞基質(zhì)保留有肌肉-肌腱接頭結(jié)構(gòu)，以直接傳導(dǎo)力學(xué)；和 E.所述骨骼肌全器官脫細(xì)胞基質(zhì)保留有其來源骨骼肌30%以上的機(jī)械強(qiáng)度，以及90%以上的韌性和彈性；和 F.所述骨骼肌全器官脫細(xì)胞基質(zhì)保留有神經(jīng)通路，以達(dá)到較其他材料更容易實(shí)現(xiàn)新生骨骼肌的再神經(jīng)化；和 G.所述骨骼肌全器官脫細(xì)胞基質(zhì)脫細(xì)胞徹底，其DNA含量低于50ng/mg干重，殘留DNA鏈長度為200-500bp，不攜帶真菌、病毒在內(nèi)的生物負(fù)載；滅菌徹底，內(nèi)毒素含量<15Eu/mg干重，植入后無免疫排斥反應(yīng)、不傳播疾病，可異體異種移植。
13.由權(quán)利要求12所 述的骨骼肌全器官脫細(xì)胞基質(zhì)或權(quán)利要求1-11中任一所述的制備方法制備的骨骼肌全器官脫細(xì)胞基質(zhì)制備的衍生醫(yī)療產(chǎn)品。
【文檔編號】A61P21/00GK103805555SQ201410067736
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年2月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月26日
【發(fā)明者】張劍, 斯蒂芬·巴迪拉克, 胡志前, 王強(qiáng), 職康康, 王妍妍, 周海洋 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)