丹酚酸a在制備預(yù)防和治療艾滋病腦病藥物方面的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于制藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及丹酚酸A在制備預(yù)防和治療艾滋病腦病及HIV-1Tat蛋白所致神經(jīng)損傷藥物方面的應(yīng)用。本發(fā)明用HIV-1Tat蛋白損傷類神經(jīng)細胞系PC12和小鼠腦片上的神經(jīng)細胞，用不同濃度的丹酚酸A進行保護，分別用MTT實驗、LDH檢測和Tunel實驗檢測丹酚酸A減少Tat蛋白所致神經(jīng)細胞死亡的效果；用Dil金顆粒散射標(biāo)記樹突棘，檢測丹酚酸A減少Tat蛋白損傷神經(jīng)突觸連接功能的效果。通過實驗結(jié)果的統(tǒng)計學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)丹酚酸A對Tat蛋白所致的神經(jīng)細胞損傷具有很好的保護效果，可用于制備預(yù)防和治療Tat蛋白所致神經(jīng)損傷及艾滋病腦病的藥物。
【專利說明】丹酚酸A在制備預(yù)防和治療艾滋病腦病藥物方面的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于制藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及傳統(tǒng)中藥丹參的水溶性成分丹酚酸A的一個新用途，即丹酚酸A在制備預(yù)防和治療艾滋病腦病藥物方面的應(yīng)用，尤其是在預(yù)防和治療HIV-1Tat蛋白所致神經(jīng)損傷藥物方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]艾滋病腦病，現(xiàn)又稱為HIV相關(guān)神經(jīng)認知功能紊亂(HAND，HIV-assotiatedneurocognitive disorders),以運動、行為和認知障礙為特征，近期根據(jù)病情嚴重程度被分為三種形式:無癥狀神經(jīng)認知功能損傷(Asymptomatic neurocognitiveimpairment, ANI),輕度神經(jīng)認知功能紊亂(mild neurocognitive disorder, MND)和HIV相關(guān)癡呆(HIV associated dementia, HAD)。
[0003]HIV-1造成神經(jīng)損傷的詳細機制有待深入研究，但可以肯定的是HIV-1具有神經(jīng)毒性的蛋白通過直接或間接的形式損傷神經(jīng)元，是HAND發(fā)病的根本原因。HIV在感染15天后就可進入CNS (central nervous system, CNS),穿越血腦屏障的單核細胞釋放病毒顆粒，然后感染腦內(nèi)的小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞。與CNS病毒載量相比，HAD癥狀與神經(jīng)兀丟失、損傷關(guān)系更緊密(Kaul M, HIV-1 infection and AIDS: consequencesfor the central nervous system.[J].Cell Death Differ 2005; 12 (Suppl I))，其損傷可分為直接損傷和間接損傷。直接損傷指HIV蛋白可以直接誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，減少神經(jīng)樹突和樹突棘數(shù)量、損傷突觸連接；間接損傷指由HIV感染的小膠質(zhì)細胞或星形膠質(zhì)細胞損傷神經(jīng)兀功 能和神經(jīng)再生(Kathryn A.HIV-Associated NeurocognitiveDisorder: Pathogenesis and Therapeutic Opportunities.J neurimmune pharamac,2010,5:294-309; Hazleton JE.Novel mechanisms of central nervous systemdamage in HIV infection.HIV AIDS (Auckl).2010，2:39-49)。神經(jīng)再生與 HAND 發(fā)生也有關(guān)系；宿主因素對HAND發(fā)生也有影響。
[0004]Tat是HIV-1基因組編碼的蛋白，具有神經(jīng)毒性，是誘導(dǎo)HAND發(fā)生的重要因素。Tat可以通過N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡(Eugenin EA.HIV-tatinduces formation of an LRP-PSD-95-NMDAR-nN0S complex that promotes apoptosisin neurons and astrocytes.Proc Natl Acad Sc1.2007,104(9):3438 - 3443) ;Tat 還可以誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞凋亡，而星形膠質(zhì)細胞對神經(jīng)元有支持、營養(yǎng)和保護作用，其丟失和無能對神經(jīng)損傷有重要作用；另外，Tat和HIV編碼的Gpl20蛋白還能夠刺激小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞釋放TNF-a、IL-1 β破壞血腦屏障使更多的病毒或感染細胞進入腦內(nèi)。Gpl20且能通過神經(jīng)元表面的CXCR4和CCR5直接誘導(dǎo)其凋亡；HIV的LTR、Nef、Vpr都有神經(jīng)毒性，但現(xiàn)有研究結(jié)果表明其神經(jīng)毒性可能遠小于Tat和Gpl20 (Jayadev S.Host and viral factors influencing the pathogenesis of HIV-associatedneurocognitive disorders.J Neuroimmune Pharmacol.2009,4(2):175-89)。
[0005]在高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療(highlyactive antiretroviral therapy, HAART)推廣前，15%HIV晚期感染者發(fā)生HAD，50%以上感染者發(fā)生某種形式HANDt5HARRT治療被廣泛應(yīng)用后，仍有50%感染者發(fā)生HAND。2010年針對1555名HIV感染者的調(diào)查表明，排除嚴重復(fù)合病例，ANI 發(fā)病率為 33%, MND 12%, HAD 2%(Heaton RK.HIV-associated neurocognitivedisorders persist in the era of potent antiretroviral therapy: CHARTERStudy.Neurology.2010，75 (23): 2087-2096)。HAART 治療降低了 HAD 發(fā)生率，但確診后其死亡率很高(Lescure FX.1ncidence and impact on mortality of severeneurocognitive disorders in persons with and without HIV infection: aDanish nationwide cohort study.Clin Infect Dis.2011，52 (2): 235-43),是艾滋病死亡一個獨立的重要危險因素。在澳大利亞的調(diào)查表明，1993-1995年，HAD確診后患者的平均生存期為11.9個月，中國患者HAD確診后，平均生存期僅為4.7個月。
[0006]HARRT治療延長了 HIV感染者的生命，但感染者生命的延長以及數(shù)量的增加也使HAND患者數(shù)量逐步增加。目前，HAND仍沒有特異、有效的治療藥物。為了延長HIV感染者生命、改善HIV感染者生活質(zhì)量,必須針對感染所致神經(jīng)損傷研發(fā)特異性藥物。許多學(xué)者認為雖然有效HARRT治療是必需的，但應(yīng)輔以針對神經(jīng)功能紊亂的治療(KathrynA.HIV-Associated Neurocognitive Disorder: Pathogenesis and TherapeuticOpportunities.J neurimmune pharamac,2010,5:294-309)。雖然已有新藥用于HAND臨床試驗，有的效果令人失望，有的仍在實驗進行(Kathryn A.HIV-AssociatedNeurocognitive Disorder: Pathogenesis and Therapeutic Opportunities.Jneurimmune pharamac,2010,5:294-309)。
[0007]PC12細胞是大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞株，是一種類神經(jīng)元細胞系，具有與神經(jīng)元類似的生長特性，常用于神經(jīng)退行性疾病的藥物篩選、效果評價及機制研究。
[0008]丹酚酸A是傳統(tǒng)中藥丹參的主要水溶性成分，能夠顯著清除氧自由基活性。中藥丹參(JMvia mi It 1rrhiza )為唇形科鼠尾草屬植物干燥的根及根莖，性微苦微寒，主要具有組織再生，活氣化瘀、保肝消痛、安神寧心等功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明:丹參具有清除氧自由基，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，發(fā)揮抗氧化作用。丹參的活性成分包括脂溶性的丹參酮1、丹參酮II A、丹 參酮II B、紅根草鄰醌及丹參二醇和水溶性成分丹酚酸A、丹酚酸B、原兒茶醛
坐寸ο
[0009]目前，雖有丹參和丹酚酸C抗HIV效果的報道，但未見丹酚酸A抗HIV的文獻。另外，抗HIV是指控制HIV在細胞內(nèi)的復(fù)制以及在細胞間傳播，這和本發(fā)明專利申請防治HIV所編碼蛋白的神經(jīng)毒性有根本不同。HIV是一種反轉(zhuǎn)錄病毒，可以整合到宿主細胞的基因組上，即使在病毒不復(fù)制時，甚至不存在具有感染能力的病毒顆粒時，其整合到宿主細胞基因組上的基因依然可以表達具有神經(jīng)毒性的病毒蛋白，導(dǎo)致不同形式的HAND，而至今人們還沒有找到能夠清除整合有HIV基因組細胞的藥物。由以上分析可以看出，HIV感染和HAND雖然有聯(lián)系，但HAND有其獨立的致病因素和發(fā)病機制，是一相對獨立的神經(jīng)識別與記憶障礙疾病，減少HIV Tat蛋白的神經(jīng)毒性將能夠在一定程度上治療HAND。有關(guān)丹參或丹酚酸A對HIV-1 Tat蛋白所致神經(jīng)損傷的保護或在HAND治療中的應(yīng)用至今國內(nèi)外并無相關(guān)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0010]本發(fā)明目的在于提供一種丹酚酸A在制備預(yù)防和治療艾滋病腦病藥物方面的應(yīng)用，尤其是在預(yù)防和治療HIV-1Tat蛋白所致神經(jīng)損傷藥物方面的應(yīng)用。
[0011]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
丹酚酸A在制備預(yù)防和治療艾滋病腦病藥物方面的應(yīng)用。
[0012]進一步優(yōu)選的，所述丹酚酸A在制備預(yù)防和治療HIV-1Tat蛋白所致神經(jīng)損傷藥物方面的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明的創(chuàng)新點在于發(fā)現(xiàn)了傳統(tǒng)中藥丹參水溶性成分丹酚酸A的一種新用途，其對HIV-1編碼Tat蛋白所致神經(jīng)損傷具有保護作用，可用于制備預(yù)防和治療HAND的藥物和保健品。
[0014]本發(fā)明用HIV-1Tat蛋白損傷類神經(jīng)細胞系PC12和小鼠腦片上的神經(jīng)細胞，用不同濃度的丹酚酸A進行保護，分別用MTT實驗、LDH檢測和Tunel標(biāo)記實驗檢測丹酚酸A減少Tat蛋白所致神經(jīng)元死亡的效果；用Dil金顆粒散射標(biāo)記樹突棘，檢測丹酚酸A減少Tat蛋白損傷神經(jīng)突觸連接功能的效果。通過對對照組、Tat蛋白損傷組和丹酚酸A藥物保護組實驗結(jié)果的統(tǒng)計學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)丹酚酸A對Tat蛋白所致的神經(jīng)細胞損傷具有很好的保護效果，而丹參酮II A卻沒有該保護效果。
[0015]中國專利“丹酚酸A凍干粉針用于制備抑制腦組織神經(jīng)元損傷或死亡藥物的用途”(申請?zhí)?01210488012.4)中提到:丹參的水溶性成分丹酚酸A能夠?qū)δX血栓或腦血栓再灌注所致神經(jīng)元的凋亡具有保護功能，然而該專利主要以人為制造腦血栓及腦血栓再灌注為模型，其所致神經(jīng)損傷的機制在于腦血栓所致缺血、缺氧和出血。本專利申請與其不同在于:I) Tat蛋白所致神經(jīng)損傷機制及HAND發(fā)病機制與腦血栓所致神經(jīng)損傷機制不同。腦血栓的誘因很多，形成栓塞的機制復(fù)雜，但其損傷神經(jīng)的機制卻較為明確，如同其申請書所述在于缺血、缺氧與出血；而Tat蛋白神經(jīng)損傷及HAND發(fā)病機制非常復(fù)雜，至今未明，但顯然和缺血缺氧所致神經(jīng)損傷不同，如HAND發(fā)病與HIV蛋白影響神經(jīng)元再生有關(guān)，與誘導(dǎo)膠質(zhì)細胞凋亡也有關(guān)系。2)中國專利申請201210488012.4針對的是多因素導(dǎo)致的一種共同病理現(xiàn)象；本專利申請所述丹酚酸A的新用途具有明確的作用靶點和疾病種類。3)至今沒有證據(jù)證明，HIV Tat蛋白或其他HIV蛋白能夠?qū)е履X血栓并進而損傷腦神經(jīng)。4)本專利申請發(fā)現(xiàn)丹酚酸A可以增加被Tat蛋白減少的樹突棘數(shù)量，保護突觸連接功能；而中國專利申請201210488012.4僅僅以腦血栓缺血和再灌注所致神經(jīng)損傷為模型，檢測對其所致神經(jīng)元凋亡的保護，沒有對增加樹突棘數(shù)量和保護突觸連接功能進行分析?；谝陨戏治?，可以發(fā)現(xiàn)雖然本發(fā)明專利申請與中國專利申請書201210488012.4均與丹酚酸A有關(guān)，但本申請卻是丹酚酸A另外一個完全不同的新藥用功能。
[0016]艾滋病腦病(HAND)是世界公認的一個重大醫(yī)學(xué)課題，其發(fā)病機制、診斷和治療的研究都具有重要意義。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)我國傳統(tǒng)中藥丹參的水溶性成份丹酚酸A對該病具有較好的治療效果，將有可能在一定程度上解決這一重大問題，具有國際意義。如能公開并授權(quán)，將再次顯示我國傳統(tǒng)中藥的優(yōu)勢和獨特之處。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為丹酚酸A、丹參酮II A對PC12細胞存活的影響(無士S，/?=3);
圖2為不同濃度丹酚酸A、丹參酮II A對Tat蛋白所致PC12細胞損傷的保護作用；圖中:##P<0.01與對照組相比;*P〈0.05 ;* *Ρ〈0.01與Tat蛋白損傷組相比(文士 S，/?=3)；
圖3為PC12細胞培養(yǎng)上清中的乳酸脫氫酶活性檢測(Z±S，/?=3);圖中01與對照組相比;* */^<0.01與Tat蛋白損傷組相比；
圖4為Tunel檢測丹酚酸A對Tat蛋白損傷腦片神經(jīng)細胞的保護；圖中A為對照組，B為Tat蛋白損傷組，C為藥物保護組；標(biāo)尺=100 μ m ；
圖5為Tunel檢測丹酚酸A對Tat蛋白損傷腦片神經(jīng)細胞的保護(f±S,n=3);圖中:##P<0.01與對照組相比;* *P〈0.01與Tat蛋白損傷組相比；
圖6為DiI金顆粒散射標(biāo)記樹突棘的數(shù)量；圖中:A為對照組；Β為Tat蛋白損傷組；C為藥物保護組；標(biāo)尺=4 μ m ;
圖7為DiI金顆粒散射標(biāo)記樹突棘單的數(shù)量(S，/?=3);圖中:##P<0.01與對照組相比;* */^<0.01與Tat蛋白損傷組相比。
【具體實施方式】
[0018]以下通過實施例對本發(fā)明做進一步的說明，但本發(fā)明的保護范圍不限于此。
[0019]實施例1
(一)主要試劑、細胞和儀器
HIV-1Tat蛋白購自深圳柏萬森生物貿(mào)易有限公司(美國Prospec公司生產(chǎn)，批號:212PCLADEB28)。丹酚酸A (批號:96574-01-5)、丹參酮II A (批號:568-72-9)購自鄭州豐耀農(nóng)業(yè)有限公司。大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞株(PC12)購自中國科學(xué)院上海細胞所。MTT購自Sigma公司(批號:MTBF7873V);LDH (乳酸脫氫酶)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；Tunel檢測試劑盒購于美國promega公司(批號:0000073091 )。滅活胎牛血清(批號:111023)購于杭州四季青生物工程材料有限公司；馬血清(批號:841843)和DMEM培養(yǎng)基(批號:823186)及MEM培養(yǎng)基(批號:793870)均購自購于Gibco公司；其它試劑均為分析純。酶標(biāo)儀(美國BIOTEK公司)；奧林巴斯顯微成像系統(tǒng)(Olympus，F(xiàn)VI O) ;Mcllwain組織自動切片機(CAMPDEN，220-240);震蕩切片機(LR59590，USA)。
[0020](二)實驗方法
1、實驗設(shè)計與分組
實驗共分為對照組、Tat蛋白損傷組、藥物作用組、藥物保護組四個組，具體見表1。
[0021]表1、實驗分組與設(shè)計
【權(quán)利要求】
1.丹酚酸A在制備預(yù)防和治療艾滋病腦病藥物方面的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述丹酚酸A在制備預(yù)防和治療HIV-1Tat蛋白所致神經(jīng)損傷藥物方面的應(yīng)用。`
【文檔編號】A61P25/00GK103860537SQ201410068605
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年2月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月27日
【發(fā)明者】劉紅亮, 王靖凱, 史朝暉, 胡磊, 劉彬, 鄧錦波, 徐括喜 申請人:河南大學(xué)