一種番鴨細小病毒及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供一種番鴨細小病毒,為YBMDV株,已于2013年11月08日保藏于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏編號為CGMCCNo.8504。本發(fā)明篩選的番鴨細小病毒具有毒性小,且免疫原性高的特點,用番鴨細小病毒YBMDP株接種番鴨胚,分別收獲死亡胚胚體和胚液,經(jīng)研磨、凍融后收取病毒液,經(jīng)超濾濃縮、甲醛溶液滅活后,加油佐劑混合乳化制成疫苗。能提高種番鴨的抗體,保證其子代母源抗體水平,預(yù)防番鴨細小病毒引起的雛鴨細小病毒感染,此疫苗具有高效、安全性好的優(yōu)點。
【專利說明】一種番鴨細小病毒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于家禽病源微生物篩選【技術(shù)領(lǐng)域】,具體涉及一種番鴨細小病毒及其在制備疫苗、抗體中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]番鴨細小病毒病是侵害雛番鴨的一種急性或亞急性傳染病,是以喘氣、腹瀉及胰臟壞死和出血為主要特征的傳染?。痪哂懈叨葌魅拘?,且發(fā)病率和死亡率都很高,常造成嚴重的經(jīng)濟損失。該病主要發(fā)生于1~3周齡的雛番鴨,尤其是10日齡左右的雛番鴨,而當(dāng)達到3周齡以上就基本不發(fā)病了。本病最早于20世紀(jì)80年代中后期出現(xiàn)于中國福建和法國西部Brittany地區(qū),20世紀(jì)90年代初才認識到它是不同于小鵝瘟的獨立疾病。如果對死亡的番鴨處理不當(dāng),往往造成病毒的蔓延,產(chǎn)生更大的危害。因此,就需要篩選出效價高、免疫原性好的番鴨細小病毒來制備疫苗。而且,由于病毒變異導(dǎo)致使用的疫苗效價降低,也需要篩選出變異的病毒株來制備療效更高的疫苗。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0003]本發(fā)明的目的是提供一種篩選出的番鴨細小病毒,及其在制備疫苗中的應(yīng)用;用該病毒制備的疫苗具有高效、安全性好、保護率高的優(yōu)點,從而彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0004]本發(fā)明首先提供一種番鴨細小病毒,為YBMDV株,已于2013年11月08日保藏于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏編號為CGMCCN0.8504。
[0005]本發(fā)明的番鴨細小病毒用于制備滅活疫苗;
[0006]本發(fā)明的番鴨細小病毒還用于制備免疫抗體。
[0007]本發(fā)明篩選的番鴨細小病毒具有毒性小,且免疫原性高的特點,用番鴨細小病毒YBMDP株接種番鴨胚,分別收獲死亡胚胚體和胚液,經(jīng)研磨、凍融后收取病毒液,經(jīng)超濾濃縮、甲醛溶液滅活后,加油佐劑混合乳化制成疫苗。能提高種番鴨的抗體,保證其子代母源抗體水平,預(yù)防番鴨細小病毒引起的雛鴨細小病毒感染,此疫苗具有高效、安全性好的優(yōu)點。
【具體實施方式】
[0008]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細的描述。
[0009]一、YBMDV 株的篩選
[0010]2011年浙江省某鴨場爆發(fā)了急性的番鴨細小病毒病,取病死鴨的胰臟及腸道,將胰臟及腸道組織用無生理鹽水勻漿制成20%懸液,3000r/min離心15min,取上清除菌后經(jīng)尿囊腔分別接種13日齡番鴨胚,孵化120小時,收集尿囊液及胚體組織,經(jīng)勻漿后,反復(fù)凍融3次,取上清液凍存。收獲的病毒液經(jīng)純化后進行了病毒含量、免疫原性、特異性及純凈性等方面的病毒特性的分析檢測,結(jié)果表明該毒株病毒含量為105_7ELD5(l/0.2ml,最小免疫劑量為102_°ELD5(i/0.2ml,該病毒僅與番鴨細小病毒發(fā)生特異性反應(yīng),無細菌、支原體及外源病毒污染,適合作為制苗用毒株。將篩選YBMDV株于2013年11月08日保藏于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏編號為CGMCC N0.8504。
[0011]對于本發(fā)明篩選的毒株的性狀進行檢測,結(jié)果表明,該株病毒屬細小病毒,圓形無囊膜,直徑在20μ m左右、對乙醚、胰蛋白酶、酸不敏感,對紅細胞無凝集現(xiàn)象。該病毒可引起雛番鴨發(fā)生以出血性腸炎為特征的急性敗血性傳染病。該毒株制備的疫苗免疫成年番鴨后,能保護免疫4個月內(nèi)番鴨所產(chǎn)子代免受流行毒株的攻擊。該毒株作100倍稀釋后,與等量雛番鴨細小病毒病抗血清中和,接種13日齡番鴨胚,結(jié)果表明,中和組番鴨胚全部健活,而病毒對照組番鴨胚全部死亡。
[0012]對篩選的YBMDV株的結(jié)構(gòu)基因VP進行測序,結(jié)果VP全長為2199bp,編碼732個氨基酸;NCBI的blast序列分析表明,YBMDV株的結(jié)構(gòu)基因VP與已公開的番鴨細小病毒的VP存在差異位點,同源性為97.7%~98.3% (即存在著9_16個氨基酸的差異)。
[0013]為了檢測上述氨基酸的差異對YBMDV株抗原性的影響,用YBMDV株來制備抗原來檢測其免疫原性。
[0014]二、制苗用抗原的制備
[0015]1.制苗用病毒液的制備將生產(chǎn)用毒種YBMDV株,尿囊腔接種12~14日齡易感番鴨胚,每胚0.2ml,36~37°C孵育,每日2次照胚檢查。選擇接種后48~120小時內(nèi)死亡,且胚體有廣泛出血,毛囊出血,肝臟變性和壞死,絨毛尿膜有輕度水腫的胚,取其尿囊液及胚體放入組織搗碎機中粉碎,取粉碎后的組織按1:2加入生理鹽水混合;置2~8°C 4~12小時,收取尿囊 液、羊水及胚體(去掉頭和四肢)。用胚液勻漿、凍融3次,4000r/min離心30min,取上清混合于無菌容器中,置2~8°C保存。
[0016]2.滅活將YBMDV株病毒液置于滅活瓶內(nèi),計量加入10%甲醛溶液,隨加隨搖,使其充分混合,甲醛溶液的最終濃度為0.2%。加甲醛溶液后倒入另一滅活瓶中,以避免瓶口附近粘附的病毒未能接觸滅活劑。37°C滅活16小時后取出,置2~8°C保存。
[0017]3.半成品檢驗
[0018](I)無菌檢驗取滅活的胚液,按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行無菌檢驗。
[0019](2)病毒含量測定將病毒液用滅菌生理鹽水作10倍系列稀釋,取10_2、10_3、10_4、10_54個稀釋度,分別尿囊腔接種12~14日齡易感番鴨胚,每胚0.2ml,同時設(shè)接種生理鹽水對照5枚,每胚0.2ml。置36~37°C繼續(xù)孵育,每日照胚2次,觀察168小時。以雞胚死亡并出現(xiàn)尿囊膜水腫增厚,頭、頸、背部等全身出血性病變判為感染,計算ELD5Q。
[0020](3)滅活檢驗將YBMDV株滅活后的病毒液尿囊腔接種12~14日齡易感番鴨胚10枚,每胚0.2ml,置36~37°C繼續(xù)孵育,連續(xù)觀察168小時。
[0021]三、滅活疫苗的制備:經(jīng)過檢驗合格后的半成品抗原進行疫苗制備(以下配制中各液體成分按體積比計)。
[0022](I)油相制備取獸用白油95份,硬脂酸鋁1份,置于油相制備罐中加熱至80°C后,再加司本一 805份,至溫度達到115°C時,維持30min,冷卻后備用。
[0023](2)水相制備將滅活檢驗合格的YBMDV株病毒液適當(dāng)比例混合,使每0.2ml水相中含YBMDV株病毒含量不低于104_°ELD5(i。取滅菌后的吐溫-805份,加入配液罐中,同時加混合抗原液95份,開動攪拌電機攪拌20~30min,使吐溫-80完全溶解。
[0024](3)乳化取油相2份放于高速剪切機內(nèi),開動電機慢速轉(zhuǎn)動攪拌,同時徐徐加入水相1份,以10000r/min,乳化5分鐘。乳化后,取IOml,以3000r/min離心15分鐘,管底析出的水相應(yīng)不超過0.5ml。
[0025]四、疫苗成品檢驗
[0026]( I)性狀
[0027]外觀疫苗應(yīng)為乳白色乳劑,無雜質(zhì)并且外包裝應(yīng)合格。
[0028]劑型為油包水型。取一清潔吸管,吸取少量疫苗滴入冷水中,除第I滴外,均應(yīng)不擴散。
[0029]穩(wěn)定性吸取疫苗IOml加入離心管中,以3000r/min離心15分鐘,管底析出的水相應(yīng)不超過0.5ml。
[0030]黏度按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行,應(yīng)符合規(guī)定。
[0031](2)裝量檢查按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行,應(yīng)符合規(guī)定。
[0032](3)無菌檢驗按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行,應(yīng)符合規(guī)定。
[0033](4)安全檢驗用21日齡番鴨10只,每只頸部皮下注射疫苗2.0ml,同時設(shè)對照5只,在相同的條件下飼養(yǎng),連續(xù)觀察14日,記錄試驗雞采食、飲水及臨床情況。應(yīng)不出現(xiàn)由疫苗引起的任何局部和全身不良反應(yīng)。
[0034](5)效力檢驗
[0035]①血清學(xué)方法用21~35日齡SPF雞10只,每只頸部皮下注射疫苗,0.5ml/只,另取5只同日齡雞不免疫作對照,免后21日,采血分離血清,分別測定番鴨細小病毒瓊擴抗體。免疫組AGP抗體效價,應(yīng)不低于1:4,對照組應(yīng)均為陰性。
[0036]②子代母源抗體與攻毒保護的關(guān)系90日齡種番鴨20只,每只頸部皮下注射疫苗,2ml/只,另取10只同日齡種番鴨不免疫作對照。于免疫后15日相同途徑相同劑量再免疫一次,收集開產(chǎn)后4月時所產(chǎn)種蛋孵化出雛,于雛番鴨7日齡時,免疫組子代取10只,對照組子代取10只,攻毒YBMDP株,每只肌肉注射0.5ml。免疫組子代保護率應(yīng)不低于8只,對照組發(fā)病率應(yīng)不低于9只。
[0037]③對地方流行毒株的攻毒保護(毒株的篩選)將各地方流行毒株分別制備滅活疫苗,取90日齡種番鴨20只,每只頸部皮下注射疫苗,2ml/只,另取10只同日齡種番鴨不免疫作對照。于免疫后15日相同途徑相同劑量再免疫一次,收集開產(chǎn)I個月內(nèi)所產(chǎn)種蛋孵化出雛,于雛番鴨7日齡時,免疫組子代取10只,對照組子代取10只,攻毒6株各地方分離株,每只肌肉注射0.5ml。觀察攻毒保護情況。
[0038]實施例1
[0039]一、制苗用抗原的制備
[0040]1.制苗用病毒液的制備將生產(chǎn)用毒種YBMDV株,尿囊腔接種12~14日齡易感番鴨胚,每胚0.2ml,36~37°C孵育,每日2次照胚檢查。選擇接種后48~120小時內(nèi)死亡,且胚體有廣泛出血,毛囊出血,肝臟變性和壞死,絨毛尿囊膜有輕度水腫的番鴨胚,取其尿囊液及番鴨胚體放入組織搗碎機中粉碎,取粉碎后的組織按I: 2加入生理鹽水混合;置2~80C 4~12小時,收取尿囊液 、羊水及胚體(去掉頭和四肢)。用胚液勻漿、凍融3次,4000r/min離心30min,取上清混合于無菌容器中,置2~8°C保存。(參見表1)。[0041]表1毒液的制備
[0042]
【權(quán)利要求】
1.一種番鴨細小病毒,其特征在于,所述的番鴨細小病毒為YBMDV株。
2.如權(quán)利要求1所述的番鴨細小病毒,其特征在于,所述的番鴨細小病毒于2013年11月08日保藏于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏編號為CGMCC N0.8504。
3.如權(quán)利要求1所述的番鴨細小病毒,其特征在于,所述的番鴨細小病毒為圓形無囊膜,直徑為20μ m左右、對乙醚、胰蛋白酶、酸不敏感,對紅細胞無凝集現(xiàn)象。
4.權(quán)利要求1所述的番鴨細小病毒用于制備滅活疫苗。
5.權(quán)利要求 1所述的番鴨細小病毒用于制備免疫抗體。
【文檔編號】A61K39/23GK103820397SQ201410082767
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年3月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月7日
【發(fā)明者】宮曉, 鄒敏, 朱艷梅, 徐保娟, 李陸梅, 郭偉偉 申請人:青島易邦生物工程有限公司