一種基于不對稱膜的人體黑素細胞的培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于不對稱膜的人體黑素細胞的培養(yǎng)方法，本發(fā)明利用組織工程技術(shù)構(gòu)建具有良好生物相容性的不對稱膜，進行了黑素細胞或其與成纖維細胞、角質(zhì)形成細胞的（共）培養(yǎng)和轉(zhuǎn)移，適用于色素脫失癥（如白癜風(fēng)）和皮膚顏色的調(diào)節(jié)。本發(fā)明涉及不對稱膜的制備、細胞-不對稱膜復(fù)合材料的構(gòu)建。由于膜材料中引入不對稱結(jié)構(gòu)，促進了細胞培養(yǎng)及活性的保持。
【專利說明】一種基于不對稱膜的人體黑素細胞的培養(yǎng)方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于不對稱的生物膜材料的黑素細胞培養(yǎng)方法。
[0002]發(fā)明背景
白癜風(fēng)是一種常見的皮膚色素脫失性皮疾病，在人群中發(fā)病率達0.5-2%，病因是人體皮膚中黑素細胞的功能喪失。白癜風(fēng)表現(xiàn)為局部或泛發(fā)型白斑，白斑處因缺乏黑色素，容易被陽光灼傷甚至引發(fā)癌變，同時也會給患者帶來社交憂慮引起心理疾病。
[0003]目前治療白癜風(fēng)主要有三類療法:藥物療法、光化學(xué)療法、外科手術(shù)療法。藥物療法和光化學(xué)療法療效一般且副作用大，因此人們更多的關(guān)注外科手術(shù)療法。外科手術(shù)療法利用組織工程技術(shù)，將人 體黑素細胞體外培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時間后轉(zhuǎn)移至患處，達到治療疾病的效果。常用的黑素細胞懸液移植療法，因其流動性強在關(guān)節(jié)處治愈率低。構(gòu)建生物相容性支架，將黑素細胞培養(yǎng)在支架上形成細胞皮片達到培養(yǎng)和轉(zhuǎn)移一體化，能有效改善懸液移植療法的不足之處。
[0004]利用組織工程技術(shù)、通過細胞負載與轉(zhuǎn)移，為治療白癜風(fēng)提供新的途徑。CN102648987A公開了一種將透明質(zhì)酸鈉-殼聚糖類復(fù)合材料制備成具有光滑面和海綿面的不對稱面材料，促進上皮細胞、內(nèi)皮細胞生長，但該材料未用于黑素細胞的培養(yǎng)。CN1785444A公開了一種膠原-殼聚糖和硅橡膠雙層皮膚再生支架材料，能誘導(dǎo)缺損處細胞遷移、增殖和分化，但該材料不支持黑素細胞、成纖維細胞的生長。CN 1422668A公開了一種醫(yī)用微孔殼聚糖不對稱膜材料，能防止術(shù)后傷口粘連，但僅僅起到傷口敷料作用。CN103007364公開了一種脂肪族聚酯雙層不對稱引導(dǎo)組織再生膜材料，其制備過程存在有機溶劑的殘留?，F(xiàn)有不對稱膜的相關(guān)公開專利主要用于傷口敷料，未涉及在黑素細胞培養(yǎng)中的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于不對稱的生物膜材料的黑素細胞的培養(yǎng)方法。
[0006]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的:一種基于不對稱膜材料的黑素細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟:
Cl)制備不對稱的生物膜材料:將一種或兩種生物相容性材料按1:50-50:1的重量比例混合后，配成質(zhì)量濃度為1-10%的水溶液；將水溶液注入細胞培養(yǎng)板，鼓風(fēng)條件下于30-70°C下烘0.1-5小時，使溶液表面水分揮發(fā)，形成1-10微米的致密膜；然后加入氫氧化鈉-碳酸鈉水溶液，浸泡24小時，使致密膜下層溶液發(fā)生相分離，形成多孔結(jié)構(gòu)，所述氫氧化鈉-碳酸鈉水溶液中，氫氧化鈉和碳酸鈉的總質(zhì)量與水的質(zhì)量配比為1-10:90-99混合組成，且氫氧化鈉與碳酸鈉的質(zhì)量配比為1:3-3:1 ;用去離子水清洗至溶液pH為中性，-6(T-40°C冷凍干燥8-24小時，得到不對稱膜；然后用交聯(lián)劑對不對稱膜在20-50°C交聯(lián)處理0.5-24小時，交聯(lián)處理后用純凈水沖洗除凈殘留的交聯(lián)劑，再在鼓風(fēng)條件下于30-120°C 下烘 2-48 小時。
[0007](2)構(gòu)建細胞-不對稱膜復(fù)合材料:不對稱膜用于接種細胞前，用體積濃度為75%的酒精浸泡12小時，隨后再用PBS洗凈殘留酒精，并置于紫外燈下照射3-24小時。完成消毒滅菌后，在細胞培養(yǎng)板里注入細胞培養(yǎng)液，置于細胞培養(yǎng)箱中于37° C、體積濃度為5%的C02、飽和濕度條件進行孵化。將按1-40:0-200: 0-100的細胞個數(shù)比例共培養(yǎng)的黑素細胞、成纖維細胞和角質(zhì)形成細胞以5x103 - 5x105個細胞/cm2的密度接種在孵化過的不對稱膜上，同時加入1_10毫升的細胞培養(yǎng)液，置于細胞培養(yǎng)箱于37°C、體積濃度為5%的CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，每兩天更換一次細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)時間為ι-?ο天，即獲得細胞-不對稱膜的復(fù)合材料。
[0008]一種基于不對稱膜的黑素細胞的培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
(O制備不對稱的生物膜材料:1:50-50:1的重量比例混合后，配成質(zhì)量濃度為1-10%的水溶液；將溶液注入細胞培養(yǎng)板，-60- _40°C冷凍干燥8-24小時，得到多孔支架；再將上述溶液注入細胞培養(yǎng)板，將多孔支架完全鋪展置于溶液上，鼓風(fēng)條件下于30-70° C烘0.1-5小時，使水分完全揮發(fā)，形成不對稱膜；然后用交聯(lián)劑對不對稱膜在20-50°C交聯(lián)處理0.5-24小時，交聯(lián)處理后用純凈水沖洗除凈殘留的交聯(lián)劑；然后0.01-0.3摩爾/升的氫氧化鈉、碳酸鈉或重量比例為3:1-1:3的氫氧化鈉-碳酸鈉水溶液浸泡24小時，用去離子水清洗至溶液PH為中性；再在鼓風(fēng)條件下于30-120°C下烘2-48小時。
[0009](2)構(gòu)建細胞-不對稱膜復(fù)合材料:不對稱膜用于接種細胞前，用體積濃度為75%的酒精浸泡12小時，隨后再用PBS洗凈殘留酒精，并置于紫外燈下照射3-24小時。完成消毒滅菌后，在細胞培養(yǎng)板里注入細胞培養(yǎng)液，置于細胞培養(yǎng)箱中于37°C、體積濃度為5%C02、飽和濕度條件進行孵化。將按1-40: 0-200: 0-100的細胞個數(shù)比例共培養(yǎng)的黑素細胞、成纖維細胞和角質(zhì)形成細胞以5x103 - 5x105個細胞/cm2的密度接種在孵化過的不對稱膜上，同時加入1-10毫升的細胞培養(yǎng)液，置于細胞培養(yǎng)箱于37°C、體積濃度為5%C02、飽和濕度條件下培養(yǎng)，每兩天更換一次細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)時間為ι-?ο天，即獲得細胞-不對稱膜的復(fù)合材料。
[0010]3、根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的基于不對稱膜的人體黑素細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的生物相容性材料包括殼聚糖、明膠、膠原蛋白、纖維蛋白、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、
聚乙二醇等。
[0011]所述的生物相容性材料包括殼聚糖、明膠、膠原蛋白、纖維蛋白、透明質(zhì)酸、硫酸軟
骨素、聚乙二醇等。
[0012]所述的交聯(lián)劑包括用于物理交聯(lián)的硫酸鈉、檸檬酸鈉或三聚磷酸鈉及用于化學(xué)交聯(lián)的戊二醛、乙二醛、水楊醛或香草醛等。
[0013]所述細胞培養(yǎng)液含100毫升F12培養(yǎng)基、0.1-100毫升FBS、10-50000納克CT、10-50000 微克 ΙΒΜΧ、0.1-100 毫升 Glutamine 和 100-500000 微克 Gentamicin 等成分。
[0014]本發(fā)明的有益效果是:通過對所得的生物相容性不對稱膜進行表征，膜表面平整(圖1)，適合細胞生長；多孔結(jié)構(gòu)(圖2)有益于細胞培養(yǎng)過程中的營養(yǎng)液儲存與更新，促進了細胞的生長及活性的保持。載體材料的具有良好的機械性能，包括抗拉強度、抗撕強度、斷裂伸長率和彈性模量等，在制備、負載、轉(zhuǎn)移和移植過程不發(fā)生破碎和斷裂，符合轉(zhuǎn)移和移植的要求。細胞-不對稱膜復(fù)合材料的構(gòu)建過程中，細胞在生物相容性不對稱膜材料上的形態(tài)良好，增殖趨勢明顯且保持良好活性(圖4)。本發(fā)明中生物相容性不對稱膜材料制備方法簡單、操作容易、抗破損、撕裂和轉(zhuǎn)移等性能優(yōu)良，通過調(diào)節(jié)細胞的接種密度、培養(yǎng)時間和方法，保持細胞活性，同時滿足不同個體對皮膚顏色的需求，適合色素脫失癥和皮膚顏色的調(diào)節(jié)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1不對稱膜致密層SEM掃描電鏡照片；
圖2不對稱膜疏松多孔層SEM掃描電鏡照片；
圖3不對稱膜截面SEM掃描電鏡照片；
圖4用不對稱膜培養(yǎng)的黑素細胞照片。
【具體實施方式】
[0016]本發(fā)明屬生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，利用組織工程技術(shù)構(gòu)建具有良好生物相容性不對稱膜材料，用于黑素細胞或其與成纖維細胞、角質(zhì)形成細胞的(共)培養(yǎng)，實現(xiàn)細胞的體外培養(yǎng)。具體涉及具有生物相容性不對稱膜材料的制備、細胞-不對稱膜復(fù)合材料的構(gòu)建及其應(yīng)用，滿足色素脫失癥(如白癜風(fēng))和皮膚顏色調(diào)節(jié)的要求。
[0017]本發(fā)明選用生物相容性良好的不對稱膜材料，負載材料制備條件溫和，易于細胞的培養(yǎng)及細胞活性的保持，生物安全。同時,本發(fā)明可在細胞培養(yǎng)板上直接構(gòu)建載體材料，避免對載體材料再打孔、剪裁等繁瑣的后處理及二次污染問題。經(jīng)交聯(lián)處理的載體材料，具有優(yōu)越的機械性能，滿足可直接從細胞培養(yǎng)板中取出用于細胞轉(zhuǎn)移和移植的要求。此外，本發(fā)明通過調(diào)節(jié)細胞的接種密度、培養(yǎng)時間和培養(yǎng)方法，保持細胞活性，實現(xiàn)對不同個體皮膚顏色的調(diào)控，使黑素細胞的功效性在移植中得到成功的表達，具有實際的可操作性，為大面積色素脫失癥和皮膚顏色的調(diào)節(jié)提供了極大的便利。
[0018]本發(fā)明的基于組織工程材料的細胞培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
Cl)制備不對稱的生物膜材料:將一種或兩種生物相容性材料按1:50-50:1的重量比例混合后，配成質(zhì)量濃度為1-10%的水溶液；將水溶液注入細胞培養(yǎng)板，鼓風(fēng)條件下于30-70° C下烘0.1-5小時，使溶液表面水分揮發(fā)，形成1-10微米的致密膜；然后加入氫氧化鈉-碳酸鈉水溶液，浸泡24小時，使致密膜下層溶液發(fā)生相分離，形成多孔結(jié)構(gòu)，所述氫氧化鈉-碳酸鈉水溶液中，氫氧化鈉和碳酸鈉的總質(zhì)量與水的質(zhì)量配比為1-10:90-99混合組成，且氫氧化鈉與碳酸鈉的質(zhì)量配比為1:3-3:1 ;用去離子水清洗至溶液pH為中性，-6(T-40°C冷凍干燥8-24小時，得到不對稱膜；然后用交聯(lián)劑對不對稱膜在20-50°C交聯(lián)處理0.5-24小時，交聯(lián)處理后用純凈水沖洗除凈殘留的交聯(lián)劑，再在鼓風(fēng)條件下于30-120°C 下烘 2-48 小時。
[0019](2)構(gòu)建細胞-不對稱膜復(fù)合材料:不對稱膜用于接種細胞前，用體積濃度為75%的酒精浸泡12小時，隨后再用PBS洗凈殘留酒精，并置于紫外燈下照射3-24小時。完成消毒滅菌后，在細胞培養(yǎng)板里注入細胞培養(yǎng)液，置于細胞培養(yǎng)箱中于37°C、體積濃度為5%的CO2、飽和濕度條件進行孵化。將按1-40: 0-200: 0-100的細胞個數(shù)比例共培養(yǎng)的黑素細
胞、 成纖維細胞和角質(zhì)形成細胞以SxUf-SxWi個細胞/cm2的密度接種在孵化過的不對稱膜上，同時加入1-10毫升的細胞培養(yǎng)液，置于細胞培養(yǎng)箱于37°c、體積濃度為5%的C02、飽和濕度條件下培養(yǎng)，每兩天更換一次細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)時間為1-10天，即獲得細胞-不對稱膜的復(fù)合材料。
[0020]本發(fā)明還提供了另一種基于不對稱膜的黑素細胞的培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
(O制備不對稱的生物膜材料:1:50-50:1的重量比例混合后，配成質(zhì)量濃度為1-10%
的水溶液；將溶液注入細胞培養(yǎng)板，-60- _40°C冷凍干燥8-24小時，得到多孔支架；再將上述溶液注入細胞培養(yǎng)板，將多孔支架完全鋪展置于溶液上，鼓風(fēng)條件下于30-70° C烘
0.1-5小時，使水分完全揮發(fā)，形成不對稱膜；然后用交聯(lián)劑對不對稱膜在20-50°C交聯(lián)處理0.5-24小時，交聯(lián)處理后用純凈水沖洗除凈殘留的交聯(lián)劑；然后0.01-0.3摩爾/升的氫氧化鈉、碳酸鈉或重量比例為3:1-1:3的氫氧化鈉-碳酸鈉水溶液浸泡24小時，用去離子水清洗至溶液PH為中性；再在鼓風(fēng)條件下于30-120°C下烘2-48小時。
[0021](2)構(gòu)建細胞-不對稱膜復(fù)合材料:不對稱膜用于接種細胞前，用體積濃度為75%的酒精浸泡12小時，隨后再用PBS洗凈殘留酒精，并置于紫外燈下照射3-24小時。完成消毒滅菌后，在細胞培養(yǎng)板里注入細胞培養(yǎng)液，置于細胞培養(yǎng)箱中于37°C、體積濃度為5%的CO2、飽和濕度條件進行孵化。將按1-40: 0-200: 0-100的細胞個數(shù)比例共培養(yǎng)的黑素細
胞、成纖維細胞和角質(zhì)形成細胞以5xl0s-5x〗05個細胞/cm2的密度接種在孵化過的不對稱膜上，同時加入1-10毫升的細胞培養(yǎng)液，置于細胞培養(yǎng)箱于37°c、體積濃度為5%的C02、飽和濕度條件下培養(yǎng)，每兩天更換一次細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)時間為1-10天，即獲得細胞-不對稱膜的復(fù)合材料。
[0022]所述的生物相容性材料包括殼聚糖、明膠、膠原蛋白、纖維蛋白、透明質(zhì)酸、硫酸軟
骨素、聚乙二醇等。
[0023]生物相容性材料包括殼聚糖、明膠、膠原蛋白、纖維蛋白、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、
聚乙二醇等。
[0024]交聯(lián)劑包括用于物理交聯(lián)的硫酸鈉、檸檬酸鈉或三聚磷酸鈉及用于化學(xué)交聯(lián)的戊
二醛、乙二醛、水楊醛或香草醛等。
[0025]細胞培養(yǎng)液含100毫升F12培養(yǎng)基、0.1-100毫升FBS (胎牛血清)、10-50000納克CT (霍亂毒素)、 10-50000微克IBMX (異丁酰甲基黃嘌呤)、0.1-100毫升Glutamine (谷氨酰胺)和100-500000微克Gentamicin (慶大霉素)等成分。
[0026]下面根據(jù)實施例詳細描述本發(fā)明，本發(fā)明的目的和效果將變得更加明顯。
[0027]實施例1.殼聚糖不對稱膜材料的制備
a、將殼聚糖用IM的乙酸溶液溶解，配成濃度為1.5 %的殼聚糖溶液；
b、將2.5ml殼聚糖溶液注入細胞培養(yǎng)板，將細胞培養(yǎng)板置于鼓風(fēng)烘箱中，于65° C下干燥0.5小時；
C、加入氫氧化鈉、碳酸鈉和水以重量比例為2:1:47的氫氧化鈉-碳酸鈉水溶液,浸泡24小時，使致密膜下層溶液發(fā)生相分離，形成多孔結(jié)構(gòu)；
d、用去離子水清洗至溶液pH為中性；
e、-55°C冷凍干燥12小時，得到不對稱膜；
f、將干燥的殼聚糖不對稱膜置于0.5M的Na2SO4溶液中浸泡30min，隨后用大量純凈水沖洗；
g、將覆蓋殼聚不對稱膜的細胞培養(yǎng)板置于鼓風(fēng)烘箱中，37°C條件下干燥24小時；h、得到可用于細胞培養(yǎng)的不對稱膜材料。
[0028]實施例2.殼聚糖-明膠基復(fù)合不對稱膜材料的制備
a、將殼聚糖用IM的乙酸溶液溶解，配成濃度為1.5 %的殼聚糖溶液；
b、將明膠用純凈水溶解,配成濃度為1%的明膠溶液；
C、將殼聚糖與明膠以20:1的重量比例混合，攪拌均勻，得到殼聚糖-明膠混合溶液；
d、將2.5 ml混合溶液注入細胞培養(yǎng)板，將細胞培養(yǎng)板置于鼓風(fēng)烘箱中，于35° C條件下干燥4小時；
e、加入氫氧化鈉、碳酸鈉和水以重量比例為2:1:47的氫氧化鈉-碳酸鈉水溶液,浸泡24小時，使致密膜下層溶液發(fā)生相分離，形成多孔結(jié)構(gòu)；
f、用去離子水清洗至溶液PH為中性；
g、-45°C冷凍干燥24小時，得到不對稱膜；
h、將干燥的殼聚糖-明膠不對稱膜置于0.5M的檸檬酸鈉溶液中浸泡2h，隨后用大量純凈水沖洗；
1、將覆蓋殼聚糖-明膠不對稱膜的細胞培養(yǎng)板置于鼓風(fēng)烘箱中，80°C條件下干燥24小時；
j、得到可用于細胞培養(yǎng)的不對稱膜材料。
[0029]實施例3.殼聚糖-聚乙二醇基復(fù)合不對稱膜材料的制備
a、將殼聚糖用IM的乙酸溶液溶解，配成濃度為1.5 %的殼聚糖溶液；
b、將聚乙二醇用純凈水溶解，配成濃度為1%的聚乙二醇溶液；
C、將殼聚糖與聚乙二醇以20:1的重量比例混合，攪拌均勻，得到殼聚糖-聚乙二醇混合溶液；
d、將2.5 ml混合溶液注入細胞培養(yǎng)板，將細胞培養(yǎng)板置于鼓風(fēng)烘箱中，于35° C條件下干燥4小時；
e、加入氫氧化鈉、碳酸鈉和水以重量比例為2:1:47的氫氧化鈉-碳酸鈉水溶液,浸泡24小時，使致密膜下層溶液發(fā)生相分離，形成多孔結(jié)構(gòu)；
f、用去離子水清洗至溶液pH為中性；
g、-45°C冷凍干燥24小時，得到不對稱膜；
h、將干燥的殼聚糖-聚乙二醇不對稱膜置于0.5M的檸檬酸鈉溶液中浸泡2h，隨后用大量純凈水沖洗；
1、將覆蓋殼聚糖-聚乙二醇不對稱膜的細胞培養(yǎng)板置于鼓風(fēng)烘箱中，80°C條件下干燥24小時；
j、得到可用于細胞培養(yǎng)的不對稱膜材料。
[0030]實施例4.殼聚糖不對稱膜材料的制備
a、將殼聚糖用IM的乙酸溶液溶解，配成濃度為1.5 %的殼聚糖溶液；
b、將2.5ml溶液注入細胞培養(yǎng)板，-45° C冷凍干燥18小時，得到多孔支架；
C、將上述溶液注入細胞培養(yǎng)板，將多孔支架完全鋪展置于溶液上，鼓風(fēng)條件下于60°C烘0.5小時，使水分完全揮發(fā)，形成不對稱膜；
d、將干燥的殼聚糖不對稱膜置于0.5M的Na2SO4溶液中浸泡30 min,隨后用大量純凈水沖洗；e、用0.1 M的NaOH溶液浸泡殼聚糖不對稱膜30 min以除去膜上殘留的乙酸，再用大量純凈水沖至PH=7.2-7.4 ；
f、將覆蓋殼聚糖不對稱膜的細胞培養(yǎng)板置于鼓風(fēng)烘箱中，50°C干燥36小時；
g、得到可用于細胞培養(yǎng)的不對稱膜材料。
[0031]實施例5.殼聚糖-明膠不對稱膜材料的制備
a、將殼聚糖用IM的乙酸溶液溶解，配成濃度為1.5 %的殼聚糖溶液；
b、將明膠用IM的乙酸溶液溶解，配成濃度為I%的明膠溶液；
C、將殼聚糖與明膠以5:1的重量比例混合，攪拌均勻，得到殼聚糖-明膠混合溶液；
e、將2.5ml溶液注入細胞培養(yǎng)板，-45° C冷凍干燥18小時，得到多孔支架；
f、將上述溶液注入細胞培養(yǎng)板，將多孔支架完全鋪展置于溶液上，鼓風(fēng)條件下于60°C烘0.5小時 ，使水分完全揮發(fā)，形成不對稱膜；
g、將干燥的殼聚糖-明膠不對稱膜置于0.5M的Na2SO4溶液中浸泡2小時，隨后用大量純凈水沖洗；
h、用0.1 M的Na2CO3溶液浸泡殼聚糖-明膠不對稱膜30 min以除去膜上殘留的乙酸，再用大量純凈水沖至PH=7.2-7.4 ；
1、將覆蓋殼聚糖-明膠不對稱膜的細胞培養(yǎng)板置于鼓風(fēng)烘箱中，50°C干燥36小時； j、得到可用于細胞培養(yǎng)的不對稱膜材料。
[0032]實施例6.殼聚糖-聚乙二醇不對稱膜材料的制備
a、將殼聚糖用IM的乙酸溶液溶解，配成濃度為1.5 %的殼聚糖溶液；
b、將聚乙二醇用IM的乙酸溶液溶解，配成濃度為I%的聚乙二醇溶液；
C、將殼聚糖與明膠以10:1的重量比例混合，攪拌均勻，得到殼聚糖-聚乙二醇混合溶
液；
d、將2.5ml溶液注入細胞培養(yǎng)板，-45° C冷凍干燥18小時，得到多孔支架；
e、將上述溶液注入細胞培養(yǎng)板，將多孔支架完全鋪展置于溶液上，鼓風(fēng)條件下于60°C烘0.5小時，使水分完全揮發(fā)，形成不對稱膜；
f、將干燥的殼聚糖-聚乙二醇不對稱膜置于0.5M的Na2SO4溶液中浸泡30 min,隨后用大量純凈水沖洗；
g、用0.1 M的Na2CO3溶液浸泡殼聚糖-聚乙二醇不對稱膜30 min以除去膜上殘留的乙酸，再用大量純凈水沖至PH=7.2-7.4 ；
h、將覆蓋殼聚糖-聚乙二醇不對稱膜的細胞培養(yǎng)板置于鼓風(fēng)烘箱中，50°C干燥36小
時；
1、得到可用于細胞培養(yǎng)的不對稱膜材料。
[0033]實施例7.黑素細胞-殼聚糖不對稱膜復(fù)合材料的構(gòu)建
a、將實例I所述的殼聚糖不對稱膜置于75%的醫(yī)用消毒酒精中浸泡12小時后用PBS沖洗干凈；
b、將覆蓋殼聚糖不對稱膜的細胞培養(yǎng)板置于紫外燈下照射6小時；
C、在細胞培養(yǎng)板里注入3毫升細胞培養(yǎng)液，置于細胞培養(yǎng)箱于37°C、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、飽和濕度下孵化4小時；
d、將黑素細胞以5x103-5x103個細胞/cm2的密度接種在殼聚糖不對稱膜上，置于細胞培養(yǎng)箱于37°C、5% (體積)CO2、飽和濕度下培養(yǎng)；
e、每兩天換一次細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)時間為6天；
f、得到黑素細胞-殼聚糖不對稱復(fù)合材料，可進一步用于的移植。
[0034]實施例8.黑素細胞/成纖維細胞-殼聚糖-明膠不對稱膜復(fù)合材料的構(gòu)建
a、將實例2所述的殼聚糖-明膠復(fù)合不對稱膜置于75%的醫(yī)用消毒酒精中浸泡12小時后用PBS沖洗干凈；
b、將覆蓋殼聚糖-透明質(zhì)酸復(fù)合膜的細胞培養(yǎng)板置于紫外燈下照射10小時；
C、在細胞培養(yǎng)板里注入3毫升細胞培養(yǎng)液，置于細胞培養(yǎng)箱于37°C、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、飽和濕度下孵化4小時；
d、將黑素細胞和成纖維細胞以比例為1:2，密度為5xIO3- 5XlO5個細胞/cm2接種在殼聚糖-明膠不對稱膜上，置于細胞培養(yǎng)箱于37°C、5% (體積)CO2、飽和濕度下培養(yǎng)； e、每兩天換一次細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)時間為5天；
f、得到黑素細胞-殼聚糖-明膠不對稱膜復(fù)合材料，可進一步用于的移植。
[0035]實施例9.黑素細胞/成纖維細胞/角質(zhì)形成細胞-殼聚糖-聚乙二醇不對稱膜復(fù)合材料的構(gòu)建
a、將實例3所述的殼聚糖-聚乙二醇不對稱膜置于體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精中浸泡12小時后，用PBS沖洗干凈；
b、將覆蓋殼聚糖-聚乙二醇不對稱膜的細胞培養(yǎng)板置于紫外燈下照射12小時；
C、在細胞培養(yǎng)板里注入3毫升細胞培養(yǎng)液，置于細胞培養(yǎng)箱于37°C、5% (體積)CO2、飽和濕度下孵化4小時；
d、將黑素細胞、成纖維細胞、角質(zhì)形成細胞比例以1:2:1，密度為5乂103-5乂105個細胞/cm2接種在殼聚糖-聚乙二醇不對稱膜上，置于細胞培養(yǎng)箱于37°C、體積分?jǐn)?shù)為5%的C02、飽和濕度下培養(yǎng)；
e、每兩天換一次細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)時間為8天；
f、得到黑素細胞-殼聚糖-聚乙二醇不對稱膜復(fù)合材料，可進一步用于的移植。
【權(quán)利要求】
1.一種基于不對稱膜的黑素細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)制備不對稱的生物膜材料:將一種或兩種生物相容性材料按1:50-50:1的重量比例混合后，配成質(zhì)量濃度為1-10%的水溶液；將水溶液注入細胞培養(yǎng)板，鼓風(fēng)條件下于30-70° C下烘0.1-5小時，使溶液表面水分揮發(fā)，形成1-10微米的致密膜；然后加入氫氧化鈉-碳酸鈉水溶液，浸泡24小時，使致密膜下層溶液發(fā)生相分離，形成多孔結(jié)構(gòu)，所述氫氧化鈉-碳酸鈉水溶液中，氫氧化鈉和碳酸鈉的總質(zhì)量與水的質(zhì)量配比為1-10:90-99混合組成，且氫氧化鈉與碳酸鈉的質(zhì)量配比為1:3-3:1 ;用去離子水清洗至溶液pH為中性，-6(T-40°C冷凍干燥8-24小時，得到不對稱膜；然后用交聯(lián)劑對不對稱膜在20-50°C交聯(lián)處理0.5-24小時，交聯(lián)處理后用純凈水沖洗除凈殘留的交聯(lián)劑，再在鼓風(fēng)條件下于30-120°C 下烘 2-48 小時； (2)構(gòu)建細胞-不對稱膜復(fù)合材料:不對稱膜用于接種細胞前，用體積濃度為75%的酒精浸泡12小時，隨后再用PBS洗凈殘留酒精，并置于紫外燈下照射3-24小時；完成消毒滅菌后，在細胞培養(yǎng)板里注入細胞培養(yǎng)液，置于細胞培養(yǎng)箱中于37°C、體積濃度為5%的C02、飽和濕度條件進行孵化；將按1-40:0-200: 0-100的細胞個數(shù)比例共培養(yǎng)的黑素細胞、成纖維細胞和角質(zhì)形成細胞以5xl0s-5xl05個細胞/cm2的密度接種在孵化過的不對稱膜上，同時加入1_10毫升的細胞培養(yǎng)液，置于細胞培養(yǎng)箱于37°C、體積濃度為5%的CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，每兩天更換一次細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)時間為1-10天，即獲得細胞-不對稱膜的復(fù)合材料。
2.一種基于不對稱膜的黑素細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟: (O制備不對稱的生物膜材料:1:50-50:1的重量比例混合后，配成質(zhì)量濃度為1-10%的水溶液；將溶液注入細胞培養(yǎng)板，-60- _40°C冷凍干燥8-24小時，得到多孔支架；再將上述溶液注入細胞培養(yǎng)板，將多孔支架完全鋪展置于溶液上，鼓風(fēng)條件下于30-70° C烘0.1-5小時，使水分完全揮發(fā)，形成不對稱膜；然后用交聯(lián)劑對不對稱膜在20-50° C交聯(lián)處理0.5-24小時，交聯(lián)處理后用純凈水沖洗除凈殘留的交聯(lián)劑；然后0.01-0.3摩爾/升的氫氧化鈉、碳酸鈉或重量比例為3:1-1:3的氫氧化鈉-碳酸鈉水溶液浸泡24小時，用去離子水清洗至溶液PH為中性；再在鼓風(fēng)條件下于30-120° C下烘2-48小時； (2)構(gòu)建細胞-不對稱膜復(fù)合材料:不對稱膜用于接種細胞前，用體積濃度為75%的酒精浸泡12小時，隨后再用PBS洗凈殘留酒精，并置于紫外燈下照射3-24小時；完成消毒滅菌后，在細胞培養(yǎng)板里注入細胞培養(yǎng)液，置于細胞培養(yǎng)箱中于37°C、體積濃度為5%C02、飽和濕度條件進行孵化；將按1-40: 0-200: 0-100的細胞個數(shù)比例共培養(yǎng)的黑素細胞、成纖維細胞和角質(zhì)形成細胞以5x IO3-5 XlO5個細胞/cm2的密度接種在孵化過的不對稱膜上，同時加入1-10毫升的細胞培養(yǎng)液，置于細胞培養(yǎng)箱于37°C、體積濃度為5%C02、飽和濕度條件下培養(yǎng)，每兩天更換一次細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)時間為ι-?ο天，即獲得細胞-不對稱膜的復(fù)合材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的基于不對稱膜的人體黑素細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的生物相容性材料包括殼聚糖、明膠、膠原蛋白、纖維蛋白、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、聚乙二醇等。
4.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的基于不對稱膜的人體黑素細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的交聯(lián)劑包括用于物理交聯(lián)的硫酸鈉、檸檬酸鈉或三聚磷酸鈉及用于化學(xué)交聯(lián)的戊二醛、乙二醛、水楊醛或香草醛等。
5.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的基于不對稱膜的人體黑素細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述細胞培養(yǎng)液由100毫升F12培養(yǎng)基、0.1-100毫升FBS、10-50000納克CT、10-50000微克ΙΒΜΧ、0.1-100 毫升 Glutamine 和 100-500000 微克 Gentamicin 等成分混合組成。
【文檔編號】A61L27/24GK103908701SQ201410118279
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年3月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月27日
【發(fā)明者】許愛娥, 王文俊, 鄒潔輝, 蔣森陽, 尉曉冬 申請人:杭州市第三人民醫(yī)院, 浙江大學(xué)