訶子鞣質(zhì)類化合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及訶子的可水解鞣質(zhì)，特別是新天然產(chǎn)物：(1-沒食子酸酰)葡萄糖基6′→12-訶子裂酸酯[(1-galloyl)glucopyranosyl-6′-yl]-12-chebulate,化合物 1 ]和(1-沒食子酸酰)葡萄糖基4′→12-訶子裂酸酯[(1-galloyl)glucopyranosyl-4′-yl]-12-chebulate,化合物 2 ]的結(jié)構(gòu)、分離純化方法、抗氧化活性、抗丙肝病毒蛋白酶活性及其用途。這些成分本身或以其為組分的混合物可作為抗氧化劑、保肝或防治肝炎制劑在食品、化妝品和藥品中應(yīng)用。
【專利說明】訶子鞣質(zhì)類化合物及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于天然藥物化學(xué)及食品化學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及2種訶子鞣質(zhì)類新化合物及 其有效部位及其制備方法和在防治肝炎和作為抗氧化劑在食品、化妝品和藥品中的用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 訶子為使君子科訶子cAe/w/a Retz.)或絨毛訶子 cAe/w/a Retz. Var. J7a Kurt)的干燥果實(shí)，有潘腸止瀉，斂肺止咳，降火利咽功 能。中醫(yī)藥用于久瀉久痢，肺虛咳喘好，咽痛音啞等疾病（國家藥典委員會(huì)編中華人民共 和國藥典2010年版第一部，中國醫(yī)藥科技出版社，2010年印刷，第173-174頁)。訶子是 蒙醫(yī)藥和藏醫(yī)藥中最常用的藥材，被稱為"眾藥之王"，蒙藏醫(yī)臨床用于風(fēng)熱疹起、咽喉干 痛、爆發(fā)火眼、濕熱黃疸、肝區(qū)刺痛等(趙麗娟，杜遵義，訶子在藏蒙藥中應(yīng)用研究的概述， 滬房思襲菩'Jn吉，2007，31-32。）。已知訶子中含有多種可水解鞣質(zhì)類成分（Han，Q.， Song, J. , Wong, L，Xuj Η. , 2006. Preparative Isolation of hydrolysable tannins chebulagic acid and chebulinic acid from Terminalia chebula by high-speed counter-current chromatography·/ 5^/7 29，1653-1657·)，其中訶黎勒縣花酸 (chebulagic acid)有廣譜抗病毒活性，可抑制病毒進(jìn)入寄主細(xì)胞（Lin，L T.，Chen，T. Υ. , Linj S. C. , Chun, C. Υ. , Linj Τ. C. , Wang, G. Η. , Anderson, R., Linj C. C. , Richardson, C. D., 2013. Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminglycans for entry. BMC Microbiol. 13, 187.) 〇
[0003] 丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus，HCV)在全世界的感染率高達(dá)3%，造成全球 約一億七千萬，中國內(nèi)地約三千八百萬的病毒攜帶者。HCV攜帶者雖然沒有明顯臨床癥狀， 但其中很大一部分人會(huì)逐漸發(fā)展為肝硬化和肝癌，同時(shí)還會(huì)作為傳染源感染給別人。對于 HCV感染，目前尚無特效藥物，而且該病毒屬于RNA病毒，經(jīng)常發(fā)生變異使丙肝疫苗的研發(fā) 異常困難，也使HCV容易對藥物產(chǎn)生耐藥性，所以尋找多種結(jié)構(gòu)類型和多種作用機(jī)理的防 治丙肝藥物是藥學(xué)研究者的緊迫任務(wù)（Francesco RD，Migliaccio G. Challenges and successes in developing new therapies for hepatitis C. Nature. 436: 953-960， 2005.)。在HCV病毒繁殖的成熟階段先合成一種聚合蛋白，該蛋白必須經(jīng)過病毒蛋白酶 的加工才能成熟為有感染力的病毒，因此抑制HCV蛋白酶是尋找抗丙肝藥物的有效手 段（Clercq ED. The design of drugs for HIV and HCV. Tfei TfeF 價(jià)嘆 iT/scoF 6: 1001-1018. 2007. )〇
[0004] 本發(fā)明以尋找多種結(jié)構(gòu)類型和多種作用機(jī)理的防治丙肝藥物為目的發(fā)現(xiàn)了具 有抗HCV蛋白酶的訶子可水解鞣質(zhì)(化合物1-10)。經(jīng)解析核磁共振和質(zhì)譜數(shù)據(jù)，鑒定 為（卜沒食子酸酰）葡萄糖基6' - 12-訶子裂酸酯[(ΙιαΙΙογΙ^Ιικ^οργΓαΓκ^Ι-θ' -yl]-12-ChebUlate， 化合物 1] 和 （1-沒食子酸酰） 葡萄糖基 4' - 12-訶子裂 酸酯[(l_galloyl) glucopyranosyl-4 ' -yl]-12-chebulate,化合物 2],木麻黃革柔 寧（casuarinin,化合物3)，訶子裂酸（chebulic acid,化合物4)，5-0-沒食子?；?莽草酸（5-0-galloyl-shikimic acid,化合物5)，五沒食子酰葡萄糖（pentagalloyl glucose,化合物6)，柯里拉京（corrilagin,化合物7)，縣花酸（ellagic acid,化合 物8)，訶黎勒革柔花酸（chebulagic acid,化合物9)，沒食子酸（gallic acid,化合物10) (附圖16從訶子中分離鑒定出的化合物1-10的化學(xué)結(jié)構(gòu)）； 其中化合物1和2為新化合物，結(jié)構(gòu)為訶子裂酸基和沒食子酸基與葡萄糖形成的酯，與 其他縮合鞣質(zhì)的結(jié)構(gòu)有很大差別。
[0005] 本發(fā)明的目的在于提供2種訶子鞣質(zhì)類新化合物及其有效部位及其制備方法和 在防治肝炎和作為抗氧化劑在食品、化妝品和藥品中的應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明涉及訶子裂酸衍生物：（1_沒食子酸酰）葡萄糖基6' - 12-訶子裂酸酯 (1)和（1-沒食子酸酰）葡萄糖基4' -12-訶子裂酸酯（2)的結(jié)構(gòu)及訶子可水解鞣質(zhì)的 提取分離純化方法和抗丙肝病毒蛋白酶活性。
[0007] 訶子的甲醇提取物經(jīng)多種色譜分離得到10個(gè)純品化合物，經(jīng)解析多種核磁共振 圖譜和質(zhì)譜數(shù)據(jù)確定出化合物的結(jié)構(gòu)為：（1_沒食子酸酰）葡萄糖基6' - 12-訶子裂酸 酯（1)、（1-沒食子酸酰）葡萄糖基4' -12-訶子裂酸酯（2)、木麻黃鞣寧（3)，訶子裂酸 (4)、5-0_沒食子?；Р菟幔?)、五沒食子酰葡萄糖￠)、柯里拉京（7)、鞣花酸（8)、訶黎 勒鞣花酸（9)和沒食子酸（10);其中（1-沒食子酸酰）葡萄糖基6' - 12-訶子裂酸酯（1) 和（1-沒食子酸酰）葡萄糖基4' - 12-訶子裂酸酯（2)為新化合物；這些可水解鞣質(zhì)類 化合物均有較強(qiáng)的抗丙肝病毒蛋白酶活性和抗氧化活性。
[0008] 其具體技術(shù)方案為： 訶子可水解鞣質(zhì)的提取分離純化方法： 訶子粉碎后用甲醇迴流提取，提取物濃縮后直接用葡聚糖凝膠LH-20色譜分離，或者 用乙酸乙酯和甲醇依次捏溶，或?qū)饪s物懸浮水中用乙酸乙酯萃取。各部分經(jīng)ODS色譜分 離，用甲醇/水梯度洗脫，經(jīng)葡聚糖凝膠LH-20色譜，甲醇/水系統(tǒng)洗脫，ODS色譜包括制 備液相色譜純化得到訶子鞣質(zhì)類化合物。 上述化合物（3-10)經(jīng)解析多種核磁共振圖譜和質(zhì)譜數(shù)據(jù)及和文獻(xiàn)值對照確定出結(jié)構(gòu) 為：木麻黃鞣寧（3)，訶子裂酸（4)，5-0-沒食子酰基莽草酸（5)，五沒食子酰葡萄糖（6)， 柯里拉京（7)，鞣花酸（8)，訶黎勒鞣花酸（9)和沒食子酸（10)。 化合物1和2為新化合物，結(jié)構(gòu)測定過程如下： 化合物1和2的結(jié)構(gòu)測定 化合物1和2的負(fù)離子電噴霧質(zhì)譜均給出669. 0的[Μ-ΗΓ峰。它們的負(fù)離子高分 辨率電噴霧質(zhì)譜分別給出m/z 669. 0934和m/z 669. 0943的精密分子量，結(jié)合核磁共振 譜確定這兩個(gè)化合物的分子式均為C27H26O 2tl(理論值：669. 0939)。雖然因?yàn)榛衔?和 2的溶解度稍有差異因此在不同的氘代溶劑中測定了核磁共振譜，但它們的氫譜和碳譜 在核磁信號(hào)的個(gè)數(shù)和偶合模式方面均很相似（表1)。這些現(xiàn)象說明化合物1和2是異構(gòu) 體，因此通過同時(shí)分析比較這2個(gè)化合物的圖譜確定了它們的結(jié)構(gòu)?；衔?和2的氫 譜顯示出可水解鞣質(zhì)常有的芳香氫單峰和葡萄糖的信號(hào)。這些芳香氫單峰在多鍵碳?xì)潢P(guān) 系（HMBC)譜中與酚性碳及羰基碳相關(guān)，說明存在沒食子酰基。在每個(gè)化合物氫譜中均有 2個(gè)這樣的芳香單峰，1個(gè)積分值為2個(gè)氫，另一個(gè)積分值為1個(gè)氫，說明每個(gè)化合物均含 有2個(gè)沒食子?；渲?個(gè)為單取代的沒食子?；；衔?和2的碳譜各顯示5個(gè)羧 / 醋撰基信號(hào)（1: δ c 179. 5ppm, 175. 4ppm, 175. 3ppm, 167. 6ppm, 166. 2ppm ;2: δ c174. 3ppm ,173. 8ppm, 167. 6ppm, 165. 7ppm, 165. 5ppm).其中 3 個(gè)（I: 175. 4ppm, 167. 6ppm, 166. 2ppm ; 2:173. 8ppm, 165. 7ppm, 165. 5ppm)的信號(hào)強(qiáng)度較大推測為酯羰基。 化合物1的碳譜顯示4個(gè)連氧的芳香碳信號(hào)（144. 5ppm, 142. Oppm, 140. Oppm, 139. Opp m)，其中144. 5ppm的信號(hào)非常強(qiáng)，為3個(gè)碳信號(hào)重疊所致?；衔?的碳譜顯示5個(gè)連氧 的芳香碳信號(hào)（145. 3ppm, 145. Ippm, 142. 7ppm, 139. Ippm, 138. 3ppm)，其中 145. Ippm 的信 號(hào)明顯強(qiáng)于其他信號(hào)，為結(jié)構(gòu)對稱的C-3"和5"信號(hào)重疊所致。在較高場的芳香/烯碳區(qū) 域有 5 個(gè)信號(hào)（1:119. 3ppm, 119. Ippm, 115. Oppm, 110. 3ppm, 109. 3ppm ;2:120. Oppm, 119. 2p pm, 116. 7ppm, 114. 8ppm, 109. lppm),其中 I 個(gè)信號(hào)（I: 110. 3ppm ;2:109. lppm)強(qiáng)度明顯大 于其他信號(hào)歸屬于沒食子酸的C-2"和C-6"(附圖17化合物I和2的結(jié)構(gòu)及其2維核磁 共振譜中觀察到的重要關(guān)聯(lián)）. 化合物1和2分別在δ。94. Ippm和94. 3ppm出現(xiàn)的13C信號(hào)歸屬于糖的 端基碳。從異核單量子關(guān)系（HSQC)光譜可以找到糖的端基氫信號(hào)分別出現(xiàn)在 5. 57(d，7.0)和5.74((1,8.2).?-? COSY光譜揭示以端基氫為起點(diǎn)，化合物1出現(xiàn)了 3. 46ppm_3· 65ppm_2· 51ppm/2. 35ppm ;5. 57ppm_3· 51ppm 的相鄰質(zhì)子相關(guān)峰；化合物 2 出現(xiàn) 了 5. 74ppm_3. 56ppm_3. 78ppm_5. 03ppm_3. 75ppm_3. 79ppm/3. 62ppm 的相鄰質(zhì)子相關(guān)峰， 提示化合物I和2的結(jié)構(gòu)中各有I個(gè)葡萄糖基。另外，1H-1H COSY光譜揭示了另I組相關(guān) (1:5. 56ppm-3. 75ppm-3. 01ppm-2. 58ppm/2. 39ppm ；2:5. 51ppm-3. 89ppm-3. 09ppm-2. 99ppm/ 2, 30ppm)揭示了這2個(gè)化合物中的C3 - C4 - C9 - CIO的連接部分（附圖17). H-3信號(hào)（I: 5. 56ppm，2:5. 51ppm)的化學(xué)位移值及其在HMBC譜中出現(xiàn)的與C-I和C-12 羰基的相關(guān)峰揭示該H-3信號(hào)夾在這2個(gè)羰基之間（附圖17).另外，H-4(l:3.75ppm，d，J =6. 0 ;2:3. 89ppm, d, J = 5. 7)在 HMBC 譜中與芳香性 C-5(l:144. 5ppm ;2:145. 3ppm)明顯 相關(guān)，揭示C3-C4-C9-C10部分通過C-4與單取代的沒食子酸部分相連.在HMBC譜中還顯 示了下述遠(yuǎn)程相關(guān)：H-10/C-11/C-13 ;H-9/C-13 和 H-4/C-12/C-13,說明在 C3-C4-C9-C10 部分有3個(gè)羧基取代。這些特征和相關(guān)峰說明化合物1和2中各有一個(gè)訶子裂酸的結(jié)構(gòu)部 分。通過上述分析可知化合物1和2中各有3部分結(jié)構(gòu)：1個(gè)沒食子酸基，1個(gè)吡喃葡萄糖 基及一個(gè)訶子裂酸的結(jié)構(gòu)部分. 在 HMBC 譜中，糖的端基氫（l:5.57ppm，d，J = 7.0;2:5.74ppm，d，J = 8.2)與沒食子 酸的C-7"羰基（l:166.2ppm;2:165.5ppm)有遠(yuǎn)程相關(guān)，說明沒食子酸基與葡萄糖基相 連。訶子裂酸的C-12羰基信號(hào)（175.4ppm)在化合物1中與糖基H-6'的兩個(gè)亞甲基質(zhì)子 (2. 51ppm，m/2. 35ppm，m)相關(guān)，說明訶子裂酸連接在C-6'位。在化合物2中，訶子裂酸 的C-12羰基信號(hào)（173. 8ppm)與糖基H-4' (5. 03ppm，m)相關(guān)，說明訶子裂酸連接在C-4' 位。化合物1和2的端基氫的偶合常數(shù)分別為7. OHz和8. 2Hz，說明糖的1位以β鍵與沒 食子酸相連。因此，化合物1和2的結(jié)構(gòu)分別為（1-沒食子酸酰）葡萄糖基6' - 12-訶 子裂酸酯
[(l-galloyl)glucopyranosyl_6' -yl]-12_chebulate,化合物 1]和（1-沒食子酸 酰）葡萄糖基4' - 12-訶子裂酸酯[(l-galloyl)glucopyranosyl-f -yl]-12_chebula te，化合物2]。 表 1 化合物 I(D2O)和 2 (CD3OD)的1H (500MHz)和 13C (125MHz) NMR 數(shù)據(jù)

【權(quán)利要求】
1. 2種可水解鞣質(zhì)新化合物及其有效部位，其結(jié)構(gòu)式如式（I)所示：
式（I)。
2. 以含有可水解鞣質(zhì)新化合物1和/或2及其有效部位為活性成分與一種或多種輔料 組成的藥物制劑。
3. 如權(quán)利1所述化合物及其有效部位的制備方法，所述方法特征包括化合物及其有效 部位的提取，化合物的分離與純化。
4. 如權(quán)利3所述制備方法，其特征是訶子果肉或果核或其混合物粉碎后用水、醇、 水-醇混合物、或水-丙酮混合物迴流或室溫提取。
5. 如權(quán)利3所述制備方法，其特征是采用色譜法分離純化，特別是填料用cosmosil 75C18僅用水洗脫得化合物1，以及Cosmosil 140 C18，Primes印P為分離柱的制備液相 分離。
6. 訶子鞣質(zhì)，特別是所述新化合物及其有效部位或以其為組分的混合物作為抗氧化劑 在食品、化妝品和藥品中的應(yīng)用。
7. 訶子鞣質(zhì)，特別是所述新化合物及其有效部位或以其為組分的混合物在制備防治丙 型肝炎或保肝藥品及保健、功能食品中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K8/97GK104292278SQ201410231458
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年5月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月29日
【發(fā)明者】馬超美, 阿賈拉奧盧塞貢, 阿扎吉雅 申請人:內(nèi)蒙古大學(xué)