一種組織工程化牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種組織工程化牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體，所述組織工程化牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體由PDGF-BB基因修飾的牙髓干細(xì)胞構(gòu)建，通過以下方法制備獲得：(1)PDGF-BB基因轉(zhuǎn)染體外分離培養(yǎng)的牙髓干細(xì)胞；(2)將步驟(1)得到的產(chǎn)物負(fù)載于生物支架材料構(gòu)建組織工程化牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：PDGF-BB不僅可以促進(jìn)牙髓干細(xì)胞的增殖、成牙分化以及成血管誘導(dǎo)因子的分泌，還可以促進(jìn)干細(xì)胞的募集以加速牙再生，在裸鼠皮下異位成牙模型中，PDGF-BB修飾牙髓干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組中新生的牙本質(zhì)量明顯增多。本發(fā)明驗(yàn)證了PDGF-BB修飾牙髓干細(xì)胞在牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體再生的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，為牙再生這一難題提供了新的治療方法。
【專利說明】一種組織工程化牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及牙再生領(lǐng)域，具體地說，涉及一種roGF-BB基因修飾的牙髓干細(xì)胞構(gòu)建組織工程化牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體。
【背景技術(shù)】
[0002]不可復(fù)性牙髓炎是臨床上的常見病和多發(fā)病，目前根管治療是該疾病的常規(guī)治療方法，但是牙髓組織的徹底清除將嚴(yán)重影響牙齒的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和正常的代謝活動(dòng)，牙齒脆性加大而容易折裂。幸運(yùn)的是，以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的牙髓-牙本質(zhì)再生技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。從脫落乳牙、正畸拔牙和阻生智齒等牙齒中分離的牙髓干細(xì)胞為牙髓-牙本質(zhì)再生提供了理想的種子細(xì)胞。然而，牙髓腔主要通過狹窄的根管-根尖孔與自體組織相連通，這也是牙髓腔營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)的主要通道，該生理解剖特點(diǎn)給牙髓-牙本質(zhì)再生帶來了極大困難，另外，牙髓干細(xì)胞本身的成牙本質(zhì)能力還有待提高，有報(bào)道通過基因修飾的手段有望改善牙髓-牙本質(zhì)再生效果，但尚未尋得理想的修飾基因。
[0003]TOGF-BB作為強(qiáng)有力的促有絲分裂因子，是傷口愈合和組織修復(fù)過程中的主要調(diào)控蛋白是一個(gè)多功能誘導(dǎo)因子，除了促增殖作用外，它還具有明顯的血管化誘導(dǎo)作用、促進(jìn)牙周組織和骨再生的作用以及強(qiáng)大的干細(xì)胞募集能力。為此，通過TOGF-BB基因修飾的途徑提高牙髓干細(xì)胞的增殖、成牙分化、成血管誘導(dǎo)以及干細(xì)胞募集等能力將有助于提高牙再生效果。該 方面研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種TOGF-BB基因修飾的牙髓干細(xì)胞構(gòu)建組織工程化牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體。
[0005]本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種I3DGF-BB基因修飾的牙髓干細(xì)胞構(gòu)建組織工程化牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體的制備方法。
[0006]本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供TOGF-BB基因修飾牙髓干細(xì)胞在構(gòu)建組織工程化牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體中的應(yīng)用。
[0007]為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明第一個(gè)目的，本發(fā)明公開以下技術(shù)方案:一種組織工程化牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體，其特征在于，所述組織工程化牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體由TOGF-BB基因修飾的牙髓干細(xì)胞構(gòu)建，通過以下方法制備獲得:
[0008](I) PDGF-BB基因轉(zhuǎn)染體外分離培養(yǎng)的牙髓干細(xì)胞；
[0009](2)將步驟(1)得到的產(chǎn)物負(fù)載于生物支架材料構(gòu)建組織工程化牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體。
[0010]作為一個(gè)優(yōu)選方案，步驟(1)中使用慢病毒介導(dǎo)roGF-BB基因的轉(zhuǎn)染。使用慢病毒介導(dǎo)TOGF-BB的轉(zhuǎn)染，可以維持TOGF-BB的長(zhǎng)期高效表達(dá)，也規(guī)避了蛋白使用所遇到的價(jià)格昂貴、無法維持長(zhǎng)期作用效果等弊端。
[0011]為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明第二個(gè)目的，本發(fā)明公開以下技術(shù)方案:一種組織工程化牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0012](I)PDGF-BB基因轉(zhuǎn)染體外分離培養(yǎng)的牙髓干細(xì)胞；
[0013](2)將步驟(1)得到的產(chǎn)物負(fù)載于生物支架材料構(gòu)建組織工程化牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體。
[0014]作為一個(gè)優(yōu)選方案，步驟(1)中使用慢病毒介導(dǎo)I3DGF-BB基因的轉(zhuǎn)染。
[0015]為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明第三個(gè)目的，本發(fā)明公開以下技術(shù)方案:H)GF-BB基因修飾牙髓干細(xì)胞在構(gòu)建組織工程化牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體中的應(yīng)用。
[0016]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:使用TOGF-BB轉(zhuǎn)染牙髓干細(xì)胞，不僅明顯促進(jìn)了細(xì)胞的增殖，使得在更短的時(shí)間內(nèi)獲得足夠數(shù)量的種子細(xì)胞，PDGF-BB還促進(jìn)了牙髓干細(xì)胞的成牙分化，增強(qiáng)了細(xì)胞的成牙能力，PDGF-BB轉(zhuǎn)染的牙髓干細(xì)胞可以分泌更多的成血管誘導(dǎo)因子，對(duì)于快速恢復(fù)牙髓腔內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)至關(guān)重要，同時(shí)TOGF-BB還可以募集更多的干細(xì)胞以更好更快地促進(jìn)牙再生。另外，使用慢病毒介導(dǎo)I3DGF-BB的轉(zhuǎn)染，可以維持I3DGF-BB的長(zhǎng)期高效表達(dá)，也規(guī)避了蛋白使用所遇到的價(jià)格昂貴、無法維持長(zhǎng)期作用效果等弊端。本發(fā)明驗(yàn)證了PDGF-BB修飾牙髓干細(xì)胞在牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體再生中的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，為牙再生這一難題提供了新的治療方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為人牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定。(A-D)牙髓組織的取出以及長(zhǎng)梭形的牙髓干細(xì)胞從組織塊中爬出 ；(E)流式細(xì)胞儀鑒定人牙髓干細(xì)胞表面干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)情況；(F)人牙髓干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化，油紅O染色；(G)人牙髓干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化，阿利新藍(lán)染色；(H)人牙髓干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化，茜素紅染色。
[0018]圖2為L(zhǎng)ent1-PDGF對(duì)人牙髓干細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況。(A)轉(zhuǎn)染后3天，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達(dá)；(B)流式細(xì)胞儀檢測(cè)Lent1-PDGF的轉(zhuǎn)染效率；(C)細(xì)胞轉(zhuǎn)染Lent1-PDGF后的增殖情況；(D)免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)TOGF的表達(dá)情況；(E)RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染Lent1-PDGF后PDGF-BB基因表達(dá)情況；(F)Western Blot檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染Lent1-PDGF后PDGF-BB蛋白表達(dá)情況；(G) EI i sa檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染Lent 1-PDGF后分泌TOGF-BB蛋白情況(**ρ〈0.01)。
[0019]圖3為L(zhǎng)ent1-PDGF促進(jìn)人牙髓干細(xì)胞的成牙分化情況。(A)細(xì)胞在轉(zhuǎn)染Lent1-PDGF后3、7、14和21天時(shí)的VEGF、OCN、DMP-1和DSPP基因表達(dá)情況；(B)細(xì)胞在轉(zhuǎn)染Lent1-PDGF后3、7、14和21天時(shí)的VEGF和DSPP蛋白表達(dá)水平；(C)Western Blot檢測(cè)的半定量結(jié)果；(D)細(xì)胞在轉(zhuǎn)染Lent1-PDGF后7和14時(shí)的ALP染色和半定量結(jié)果(**ρ〈0.01)。
[0020]圖4為TOGF的體外募集能力檢測(cè)。㈧I3DGF-BB激活P13K/Akt信號(hào)通路；(B)LY294002可以抑制TOGF-BB激活PI3K/Akt信號(hào)通路；(C) Transwell小室細(xì)胞遷移情況；(D)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果(**ρ〈0.01)。
[0021]圖5為人牙髓干細(xì)胞體內(nèi)募集實(shí)驗(yàn)?！癉API”所示經(jīng)DAPI染料標(biāo)記的細(xì)胞核；“Dil”所示經(jīng)CM-Dil染料標(biāo)記的人牙髓干細(xì)胞，即所募集的細(xì)胞。
[0022]圖6為異位成牙的組織學(xué)和免疫組化檢測(cè)結(jié)果。(A-D)HE染色結(jié)果；(E)新生礦化組織百分比；(F-H)新生礦化組織免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果?！揪唧w實(shí)施方式】
[0023]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0024]實(shí)施例1.PDGF-BB對(duì)人牙髓干細(xì)胞(hDPSCs)體外生物活性的影響
[0025]步驟一、人牙髓干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定
[0026]臨床收集正畸需求或阻生齒拔除牙齒，用無菌生理鹽水將離體牙齒表面的血沖洗干凈；用牙科裂鉆在牙齒頸部切割一圈，便于牙髓腔的暴露；用拔髓針輕輕將牙髓組織取出，操作輕柔，盡量避免損傷組織；將取出的牙髓組織用PBS沖洗兩次，用無菌眼科剪將其剪至約IXlmm大小的組 織塊，用消毒蓋玻片將組織塊覆蓋，防止組織塊漂浮。然后加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。每三天半量換液。待hDPSCs從組織塊爬出至60% -80%融合時(shí)，胰蛋白酶消化，1:1傳代培養(yǎng)。傳代后，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)P3代hDPSCs表面抗原⑶31，⑶34，⑶90，⑶105分子。紅色熒光(PE)標(biāo)記⑶31，⑶105，及⑶34，綠色熒光(FITC)標(biāo)記⑶90。并進(jìn)一步進(jìn)行成骨、成軟骨和成脂三向分化鑒定。
[0027]實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1，牙髓組織塊培養(yǎng)約7天左右，成功從牙髓組織爬出，原代牙髓干細(xì)胞形態(tài)類似成纖維細(xì)胞，呈長(zhǎng)梭形(圖1D)。P3代收集后進(jìn)行流式檢測(cè)，結(jié)果顯示hDPSCs幾乎不表達(dá)造血系統(tǒng)所特有的標(biāo)記物⑶31，⑶34，表達(dá)率分別僅為3.6%，3.1%。而間充質(zhì)干細(xì)胞所特有的表面標(biāo)記物⑶90及⑶105表達(dá)率分別高達(dá)71.9%,96.4% (圖1E)。在不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，hDPSCs可以向脂肪細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞方向分化(圖1F-H)。
[0028]步驟二、人牙髓干細(xì)胞轉(zhuǎn)染I3DGF-BB慢病毒顆粒(Lent1-PDGF)
[0029](I)利用 Gateway 技術(shù)構(gòu)建 pLV.EX3d.P/puro_EFlA>PDGFB>IRES/eGFP 及 pLV.EX3d.P/puro-EFlA>Lacz>IRES/eGFP慢病毒載體，轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞制取病毒液。轉(zhuǎn)染后24h換液，48h后收集培養(yǎng)上清進(jìn)行濃縮。換液后繼續(xù)培養(yǎng)，72h后再次收集濃縮。將收集的病毒分裝置于_80°C保存、備用。
[0030](2)P2代hDPSCs接種在IOcm培養(yǎng)皿或六孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)候后，融合度達(dá)70% -80%細(xì)胞狀態(tài)良好。將病毒液(5X107TU/ml)加入培養(yǎng)液中，37°C，5% CO2條件下培養(yǎng)培養(yǎng)過夜。第二天吸去原有培養(yǎng)液，加入新鮮10% FBS的DMEM培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染第三天后，熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)，收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。
[0031](3)免疫熒光檢測(cè)I3DGF-BB基因的表達(dá)。病毒轉(zhuǎn)染72h后，4 %多聚甲醛固定15min，Triton X-1OO處理細(xì)胞30min，10 %山羊血清封閉I小時(shí)，PBS清洗3次。PDGF-BB (1:200) 一抗孵育4°C過夜，然后孵育紅色熒光二抗，37°C，lh。DAPI處理細(xì)胞核5分鐘，PBS洗3次。熒光顯微鏡下觀察。
[0032](4) Real-time PCR檢測(cè) PDGF-BB 的表達(dá)。病毒轉(zhuǎn)染后，在 3，7，14，21 天利用 Trizol試劑分別收集各組樣品的總RNA，檢測(cè)TOGF-BB基因的表達(dá)情況。
[0033](5) Western Blot檢測(cè)TOGF-BB的表達(dá)。病毒轉(zhuǎn)染后，在3，7，14，21天不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞總蛋白，檢測(cè)I3DGF-BB蛋白的表達(dá)情況。
[0034](6)酶聯(lián)免疫法(Elisa)檢測(cè)細(xì)胞外分泌的TOGF-BB。病毒轉(zhuǎn)染后，于3，7，14，21天收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，采用酶聯(lián)免疫法(Elisa)檢測(cè)上清中I3DGF-BB蛋白的含量。[0035]實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2，Lent1-PDGF和Lent1-LacZ (對(duì)照組)病毒轉(zhuǎn)染hDPSCs后，第三天熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光表達(dá)(圖2A);流式細(xì)胞儀檢測(cè)病毒轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染效率高達(dá)80%以上(圖2B)。免疫熒光觀察結(jié)果提示Lent1-PDGF組TOGF-BB表達(dá)上升明顯(圖2D)。病毒轉(zhuǎn)染后，Real-time PCR檢測(cè)hDPSCs中TOGF-BB基因的表達(dá)，病毒轉(zhuǎn)染后，于3，7，14，21天不同時(shí)間點(diǎn)，提取細(xì)胞RNA檢測(cè)TOGF-BB的表達(dá)，結(jié)果顯示病毒轉(zhuǎn)染后，PDGF-BB能夠持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)(圖2E)。為了進(jìn)一步在蛋白表達(dá)水平驗(yàn)證I3DGF-BB的表達(dá)，于轉(zhuǎn)染后3，7，14，21天提取細(xì)胞蛋白質(zhì)檢測(cè)其表達(dá)，結(jié)果證明病毒轉(zhuǎn)染后，PDGF-BB蛋白水平也呈現(xiàn)穩(wěn)定高表達(dá)(圖2F)。Elisa檢測(cè)細(xì)胞上清中I3DGF-BB的含量，證明TOGF-BB基因轉(zhuǎn)染牙髓干細(xì)胞后，牙髓干細(xì)胞能夠持續(xù)分泌PDGF-BB蛋白因子(圖2G)。
[0036]步驟三、PDGF-BB促進(jìn)人牙髓干細(xì)胞的增殖
[0037]Lent1-PDGF轉(zhuǎn)染的hDPSCs以5X IO3/孔的細(xì)胞密度接種于96孔板中，于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。接種后1、3、5、7天不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。檢測(cè)時(shí)，每孔加入20 μ I MTT液，孵育4小時(shí)后吸去板內(nèi)原有液體，每孔加入200 μ I 二甲基亞砜(DMSO)，振蕩15min,使結(jié)晶充分溶解。酶標(biāo)儀0D490nm檢測(cè)吸光度值，分析細(xì)胞增殖情況。
[0038]結(jié)果顯示hDPSCs過表達(dá)TOGF-BB能夠促進(jìn)其增殖活性(圖2b)。第I天，三組吸光度沒有明顯差異，在第3、5、7天時(shí)，Lent1-PDGF組吸光度值明顯高于Lent1-LacZ與Control (即未轉(zhuǎn)染病毒的hDH)Cs)兩對(duì)照組。說明Lent1-PDGF病毒轉(zhuǎn)染后，能夠促進(jìn)hDPSCs的增殖。
[0039]步驟四、PDGF-BB促進(jìn)人牙髓干細(xì)胞的分化
[0040](I) Real-time PCR檢測(cè)成血管/成牙相關(guān)基因的表達(dá)
[0041]病毒轉(zhuǎn)染后，在3、7、14、21天利用Trizol試劑分別收集各組樣品的總RNA，檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)。紫外分光光度計(jì)260nm和280nm下測(cè)定提取RNA的濃度及純度，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，合成cDNA。之后進(jìn)行PCR檢測(cè)牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白(dentin matrixprotein-1, DMP-1)、牙本質(zhì)誕憐蛋白(dentin sialophosphoprotein, DSPP)、骨鈣素(osteocalcin, 0CN)及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)相關(guān)基因的表達(dá)。以管家基因磷酸甘油醒脫氫酶(glyceraldehyde phosphatedehydrogenase, GAPDH)作為內(nèi)參。引物序列見下表,CT值代表Real-time PCR結(jié)果。最后根據(jù)公式:2- Λ Λ CT計(jì)算出基因的相對(duì)表達(dá)量。
[0042]
【權(quán)利要求】
1.一種組織工程化牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體，其特征在于，所述組織工程化牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體由roGF-ΒΒ基因修飾的牙髓干細(xì)胞構(gòu)建，通過以下方法制備獲得: (1)PDGF-BB基因轉(zhuǎn)染體外分離培養(yǎng)的牙髓干細(xì)胞； (2)將步驟(1)得到的產(chǎn)物負(fù)載于生物支架材料構(gòu)建組織工程化牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種組織工程化牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體，其特征在于，步驟(1)中使用慢病毒介導(dǎo)I3DGF-BB基因的轉(zhuǎn)染。
3.權(quán)利要求1所述的組織工程化牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)PDGF-BB基因轉(zhuǎn)染體外分離培養(yǎng)的牙髓干細(xì)胞； (2)將步驟(1)得到的產(chǎn)物負(fù)載于生物支架材料構(gòu)建組織工程化牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟⑴中使用慢病毒介導(dǎo)TOGF-BB基因的轉(zhuǎn)染。
5.PDGF-BB基因修飾牙髓干細(xì)胞在構(gòu)建組織工程化牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K6/02GK104000737SQ201410255589
【公開日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年6月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月10日
【發(fā)明者】張文杰, 張茂林, 蔣欣泉, 張志愿 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院