一種聚己內(nèi)酯-角蛋白復(fù)合多孔支架的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種聚己內(nèi)酯-角蛋白復(fù)合多孔支架的制備方法，包括：將聚己內(nèi)酯溶于溶劑中，攪拌溶解，得到聚己內(nèi)酯溶液；將角蛋白溶于溶劑中，攪拌溶解，得到角蛋白溶液；將聚己內(nèi)酯溶液與角蛋白溶液按質(zhì)量比95：5-5：95混合，攪拌混勻，得到聚己內(nèi)酯/角蛋白溶液，然后澆鑄到模具中，冷凍，得到冷凍固體物；將上述冷凍固體物進行冷凍干燥，即得。本發(fā)明采用冷凍干燥技術(shù)制備聚己內(nèi)酯/角蛋白復(fù)合多孔支架材料。該多孔支架材料具有孔隙率高且孔連通、生物相容性好、可降解性等優(yōu)點，可用于皮膚、骨等組織工程支架、細胞培養(yǎng)和藥物輸送等領(lǐng)域。
【專利說明】一種聚己內(nèi)酯-角蛋白復(fù)合多孔支架的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于復(fù)合多孔支架的制備領(lǐng)域，特別涉及一種聚己內(nèi)酯-角蛋白復(fù)合多孔支架的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]角蛋白是一種不溶性的纖維狀動物蛋白質(zhì)，是外胚層細胞的結(jié)構(gòu)蛋白，廣泛存在于動物皮膚及皮膚附屬物中，如毛發(fā)、蹄、殼、爪、角、鱗片等。近幾年的大量研究表明，角蛋白是一種生物相容性好且不被機體免疫排斥的優(yōu)質(zhì)生物醫(yī)用材料，具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，國內(nèi)外已開展大量關(guān)于角蛋白生物材料的基礎(chǔ)研究及動物實驗研究，在創(chuàng)傷敷料[Wound Repair and Regeneration, 2012, 20:236-242]、人造骨[Journal of Bioactive and Compatible Polymers, 2013, 28:141-153]以及神經(jīng)修復(fù)[Biomaterials34 (2013) 5907-5914]等方面都取得了良好效果，并有部分產(chǎn)品應(yīng)用于臨床。
[0003]但現(xiàn)有研究證明，由于角蛋白的分子量較低，單一的角蛋白材料制成的膜材料通常較脆，且力學(xué)強度不高，使其應(yīng)用性受到限制。因此，目前，大多數(shù)的角蛋白基生物材料往往采用角蛋白與天然高分子或人工高分子復(fù)合，這樣既可以保持以改善單一角蛋白力學(xué)性能較差的不足，如絲素蛋白[Biomacromo I ecu Ie S，2008, 9, 1299 - 1305]、PVA[Advances in Materials Science and Engineering, 2014，Article ID163678]、PLGA[Journal of Bioactive and Compatible Polymers, 2013, 28:141-153]、PLLA[Biomed.Mater.2013,8:1-9]等。聚己內(nèi)酯(PCL)是一種商業(yè)化的；醫(yī)用高分子材料，具有良好的生物相容性和可降解性，已通過美國藥監(jiān)局的批準，被廣泛應(yīng)用于藥物載體、軟組織修復(fù)、組織工程材料等生物醫(yī)用領(lǐng)域。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種聚己內(nèi)酯-角蛋白復(fù)合多孔支架的制備方法，本發(fā)明通過冷凍干燥的方法，將天然生物大分子材料角蛋白與聚己內(nèi)酯復(fù)合制備成多孔支架，使得該多孔支架在具備高孔隙率的同時，顯示出良好的力學(xué)及生物學(xué)性能。
[0005]本發(fā)明的一種聚己內(nèi)酯-角蛋白復(fù)合多孔支架的制備方法，包括:
[0006](I)將聚己內(nèi)酯溶于溶劑中，攪拌溶解，得到聚己內(nèi)酯溶液；
[0007](2)將角蛋白溶于溶劑中，攪拌溶解，得到角蛋白溶液；
[0008](3)將聚己內(nèi)酯溶液與角蛋白溶液按質(zhì)量比95:5-5:95混合，攪拌混勻，得到聚己內(nèi)酯/角蛋白溶液，然后澆鑄到模具中，冷凍，得到冷凍固體物；
[0009](4)將上述冷凍固體物進行冷凍干燥，即得聚己內(nèi)酯-角蛋白復(fù)合多孔支架。
[0010]所述步驟(1)中溶劑為乙酸或乙酸/甲酸混合液；其中乙酸的質(zhì)量體積百分濃度大于或等于80%，乙酸/甲酸混合液中乙酸和甲酸的體積比為1:9-9:1。
[0011] 所述步驟(1)中聚己內(nèi)酯的平均分子量范圍為70，000-90，000 ;聚己內(nèi)酯溶液的濃度為 50-100mg/ml。[0012]所述步驟⑵中溶劑為甲酸或乙酸/甲酸混合液；甲酸的質(zhì)量體積百分濃度大于或等于80%，乙酸/甲酸混合液中乙酸和甲酸的體積比為1:9-9:1。
[0013]所述步驟(2)中角蛋白的分子量為3_300kDa ;角蛋白溶液濃度為10_20mg/ml。
[0014]所述步驟(2)中角蛋白為還原法、氧化法或水解法等提取制備的角蛋白。
[0015]所述步驟(2)中角蛋白動物毛發(fā)或動物體提取制得。
[0016]所述的角蛋白可以從人發(fā)、羊毛、家禽羽毛、牛毛等人或動物毛發(fā)提取而得，也可以是來源于其他已報道的動物體。
[0017]所述步驟(3)中冷凍為-10~_80°C下冷凍處理1-48小時，或者通過液氮速凍。
[0018]所述步驟(4)中冷凍干燥用冷凍干燥機，-20~_60°C條件下冷凍干燥24-36小時。
[0019]所述步驟(4)所得的聚己內(nèi)酯-角蛋白復(fù)合多孔支架用于皮膚、骨組織工程支架、細胞培養(yǎng)、藥物輸送。
[0020]有益.效果
[0021]本發(fā)明開發(fā)了一種基于聚己內(nèi)酯和角蛋白兩種材料的復(fù)合材料，同時，為了獲得較高孔隙率，本發(fā)明采用冷凍干燥技術(shù)制備聚己內(nèi)酯/角蛋白復(fù)合多孔支架材料，該多孔支架材料具有孔隙率高且孔連通、生物相容性好、可降解性等優(yōu)點，可用于皮膚、骨等組織工程支架、細胞培養(yǎng)和藥物輸送等領(lǐng)域。
【具體實施方式】
[0022]下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0023]實施例1
[0024]以羊毛為原料采用還原法提取角蛋白，具體方法為:稱取5g羊毛，以石油醚為溶劑采用索氏抽提法去除羊毛表面油脂，然后用乙醇清洗羊毛，風(fēng)干。將上述羊毛加入100ml、lmol/1的巰基乙醇中，用NaOH調(diào)節(jié)pH約10.0，然后在40°C條件反應(yīng)12h。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液收集(記為濾液I)，同時將反應(yīng)剩余的羊毛固體過濾收集，繼續(xù)用100ml、0.lmol/1的Tris堿液在40°C條件下處理2h，然后過濾除去固體，收集濾液(記為濾液2)。.將濾液I和2合并，于6000rpm離心5分鐘，然后用截留分子量40，000的透析袋透析36h，最后將透析液加入液氮進行速凍處理，然后置入冷凍干燥機干燥得到干態(tài)的角蛋白粉末。
[0025]聚己內(nèi)酯/角蛋白復(fù)合多孔支架的制備:將質(zhì)量為0.8g，分子量范圍為70，000-90, 000的聚己內(nèi)酯溶于10ml、體積比為30/70的乙酸/甲酸混合液中，室溫下進行磁力攪拌至完全溶解，得到濃度為80mg/ml的聚己內(nèi)酯溶液。將0.2g角蛋白固體溶于IOml甲酸，室溫下進行磁力攪拌至完全溶解，得到濃度為20mg/ml的角蛋白溶液。將上述聚己內(nèi)酯與角蛋白溶液按照質(zhì)量比60:40的比例進行混合，磁力攪拌至混合均勻。將上述所得聚己內(nèi)酯/角蛋白溶液注入到直徑10厘米的塑料圓形塑料培養(yǎng)皿中，加入液氮進行速凍處理，然后置入冷凍干 燥機中于_60°C條件下進行真空冷凍干燥24h，得到膜狀聚己內(nèi)酯-角蛋白復(fù)合多孔支架。[0026]實施例2
[0027]以人發(fā)為原料采用還原法提取角蛋白，具體方法為:稱取5g人發(fā)，以石油醚為溶劑采用索氏抽提法去除人發(fā)表面油脂，然后用乙醇清洗人發(fā)，風(fēng)干。將上述人發(fā)加入200ml水與5g焦亞硫酸鈉混合的溶液中，用NaOH調(diào)節(jié)pH約10.0，然后在60°C條件反應(yīng)5h。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液收集(記為濾液I)，同時將反應(yīng)剩余的人發(fā)固體過濾收集，繼續(xù)用100ml、
0.lmol/1的Tris堿液在40°C條件下處理2h，然后過濾除去固體，收集濾液(記為濾液2)。.將濾液I和2合并，于6000rpm離心5分鐘，然后用截留分子量8，000的透析袋透析36h，最后將透析液加入液氮進行速凍處理，然后置入冷凍干燥機干燥得到干態(tài)的角蛋白粉末。
[0028]聚己內(nèi)酯/角蛋白復(fù)合多孔支架的制備:將質(zhì)量為l.0g，分子量范圍為70, 000-90, 000的聚己內(nèi)酯溶于IOml乙酸中，室溫下進行磁力攪拌至完全溶解，得到濃度為100mg/ml的聚己內(nèi)酯溶液。將0.15g角蛋白固體溶于純甲酸中，室溫下進行磁力攪拌至完全溶解，得到濃度為15mg/ml的角蛋白溶液。將上述聚己內(nèi)酯與角蛋白溶液按照質(zhì)量比50:50的比例進行混合，磁力攪拌至混合均勻。將上述所得聚己內(nèi)酯/角蛋白溶液注入到直徑I厘米的平底圓柱形塑料器皿中，于_80°C條件下進行冷凍處理2小時，然后置入冷凍干燥機中于_40°C條件下進行真空冷凍干燥24h，得到直徑約I厘米的圓柱形的聚己內(nèi)酯-角蛋白復(fù)合多孔支架。
[0029]實施例3
[0030] 以羊毛為原料采用氧化法提取角蛋白，具體方法為:稱取5g羊毛，以石油醚為溶劑采用索氏抽提法去除羊毛表面油脂，然后用乙醇清洗羊毛，風(fēng)干。向上述羊毛中加入100mL去離子水和5ml、30%的雙氧水，然后在100°C條件反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液收集(記為濾液I)，同時將反應(yīng)剩余的羊毛固體過濾收集，繼續(xù)用100ml、0.lmol/1的Tris堿液在40°C條件下處理2h，然后過濾除去固體，收集濾液(記為濾液2)。.將濾液I和2合并,于6000rpm離心5分鐘,然后用截留分子量8,000的透析袋透析36h,最后將透析液加入液氮進行速凍處理，然后置入冷凍干燥機干燥得到干態(tài)的角蛋白粉末。
[0031]聚己內(nèi)酯/角蛋白復(fù)合多孔支架的制備:將質(zhì)量為l.0g，分子量范圍為70，000-90, 000的聚己內(nèi)酯溶于10ml、體積比為10/90的乙酸/甲酸混合液中，室溫下進行磁力攪拌至完全溶解，得到濃度為100mg/ml的聚己內(nèi)酯溶液。將0.15g角蛋白固體溶于10ml、體積比為10/90的乙酸/甲酸混合液中，室溫下進行磁力攪拌至完全溶解，得到濃度為15mg/ml的角蛋白溶液。將上述聚己內(nèi)酯與角蛋白溶液按照質(zhì)量比95:5的比例進行混合，磁力攪拌至混合均勻。將上述所得聚己內(nèi)酯/角蛋白溶液注入到直徑10厘米的圓形塑料培養(yǎng)皿中，于-10°C條件下進行冷凍處理48小時，然后置入冷凍干燥機中于_20°C條件下進行真空冷凍干燥36h，得到膜狀聚己內(nèi)酯-角蛋白復(fù)合多孔支架。
[0032]實施例4
[0033]以羊毛為原料采用氧化法提取角蛋白，具體方法為:稱取5g羊毛，以石油醚為溶劑采用索氏抽提法去除羊毛表面油脂，然后用乙醇清洗羊毛，風(fēng)干。向上述羊毛中加入100ml、4%的過氧乙酸，然后在60°C條件反應(yīng)5h。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液收集(記為濾液1)，同時將反應(yīng)剩余的羊毛固體過濾收集，繼續(xù)用100ml、0.lmol/1的Tris堿液在40°C條件下處理2h，然后過濾除去固體，收集濾液(記為濾液2)。.將濾液I和2合并，于6000rpm離心5分鐘，然后用截留分子量8，000的透析袋透析36h，最后將透析液加入液氮進行速凍處理，然后置入冷凍干燥機干燥得到干態(tài)的角蛋白粉末。
[0034]聚己內(nèi)酯/角蛋白復(fù)合多孔支架的制備:將質(zhì)量為0.8g,分子量范圍為70, 000-90, 000的聚己內(nèi)酯溶于10ml、體積比為90/10的乙酸/甲酸混合液中，室溫下進行磁力攪拌至完全溶解，得到濃度為80mg/ml的聚己內(nèi)酯溶液。將0.2g角蛋白固體溶于10ml、體積比為90/10的乙酸/甲酸混合液中，室溫下進行磁力攪拌至完全溶解，得到濃度為20mg/ml的角蛋白溶液。將上述聚己內(nèi)酯與角蛋白溶液按照質(zhì)量比5:95的比例進行混合，磁力攪拌至混合均勻。將上述所得聚己內(nèi)酯/角蛋白溶液注入到直徑5厘米的圓形塑料培養(yǎng)皿中，加入 液氮進行速凍處理，然后置入冷凍干燥機中于-60°C條件下進行真空冷凍干燥24h，得到膜狀聚己內(nèi)酯-角蛋白復(fù)合多孔支架。
[0035]實施例5
[0036]將質(zhì)量為0.8g，分子量范圍為70，000-90, 000的聚己內(nèi)酯溶于IOml乙酸，室溫下
進行磁力攪拌至完全溶解，得到濃度為80mg/ml的聚己內(nèi)酯溶液。將0.15g角蛋白固體溶于IOml乙酸，室溫下進行磁力攪拌至完全溶解，得到濃度為15mg/ml的角蛋白溶液。將上述聚己內(nèi)酯與角蛋白溶液按照質(zhì)量比95:5的比例進行混合，磁力攪拌至混合均勻。將上述所得聚己內(nèi)酯/角蛋白溶液注入到直徑2厘米的平底圓柱形塑料器皿中，于-80°C條件下進行冷凍處理2小時，然后置入冷凍干燥機中于_60°C條件下進行真空冷凍干燥24h，得到圓柱形聚己內(nèi)酯-角蛋白復(fù)合多孔支架。
[0037]實施例6
[0038]將質(zhì)量為1.0g，分子量范圍為70，000-90，000的聚己內(nèi)酯溶于10ml、體積比為30/70的乙酸/甲酸混合液，室溫下進行磁力攪拌至完全溶解，得到濃度為質(zhì)量100mg/ml的聚己內(nèi)酯溶液。將0.2g角蛋白固體溶于IOml乙酸，室溫下進行磁力攪拌至完全溶解，得到濃度為20mg/ml的角蛋白溶液。將上述聚己內(nèi)酯與角蛋白溶液按照質(zhì)量比90:10的比例進行混合，磁力攪拌至混合均勻。將上述所得聚己內(nèi)酯/角蛋白溶液注入到直徑5厘米的圓形塑料培養(yǎng)皿中，于_80°C條件下進行冷凍處理2小時，然后置入冷凍干燥機中于_60°C條件下進行真空冷凍干燥24h，得到膜狀聚己內(nèi)酯-角蛋白復(fù)合多孔支架。
[0039]實施例7
[0040]按照實施例1中所述的制備方法制備聚己內(nèi)酯-角蛋白復(fù)合多孔支架材料，經(jīng)掃描電鏡分析觀察，復(fù)合多孔支架材料的孔徑達100 μ m以上。以大鼠成纖維細胞L929及血管內(nèi)皮細胞為細胞模型，采用掃描電子顯微鏡觀察細胞在材料上的黏附形態(tài)，并通過MTT法對細胞的增殖行為進行評價，結(jié)果表明，成纖維細胞及內(nèi)皮細胞在聚己內(nèi)酯-角蛋白復(fù)合多孔支架材料上均表現(xiàn)出良好的黏附形態(tài)和增殖行為，與單一的聚己內(nèi)酯制備的多孔支架相比具有顯著性差異。
【權(quán)利要求】
1.一種聚己內(nèi)酯-角蛋白復(fù)合多孔支架的制備方法，包括: (1)將聚己內(nèi)酯溶于溶劑中，攪拌溶解，得到聚己內(nèi)酯溶液； (2)將角蛋白溶于溶劑中，攪拌溶解，得到角蛋白溶液； (3)將聚己內(nèi)酯溶液與角蛋白溶液按質(zhì)量比95:5-5:95混合，攪拌混勻，得到聚己內(nèi)酯/角蛋白溶液，然后澆鑄到模具中，冷凍，得到冷凍固體物； (4)將上述冷凍固體物進行冷凍干燥，即得聚己內(nèi)酯-角蛋白復(fù)合多孔支架。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種聚己內(nèi)酯-角蛋白復(fù)合多孔支架的制備方法，其特征在于:所述步驟(1)中溶劑為乙酸或乙酸/甲酸混合液；其中乙酸的質(zhì)量體積百分濃度大于或等于80%，乙酸/甲酸混合液中乙酸和甲酸的體積比為1:9-9:1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種聚己內(nèi)酯-角蛋白復(fù)合多孔支架的制備方法，其特征在于:所述步驟(1)中聚己內(nèi)酯的平均分子量范圍為70，000-90，000 ;聚己內(nèi)酯溶液的濃度為50_100mg/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種聚己內(nèi)酯-角蛋白復(fù)合多孔支架的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中溶劑為甲酸或乙酸/甲酸混合液；甲酸的質(zhì)量體積百分濃度大于或等于80%，乙酸/甲酸混合液中乙酸和甲酸的體積比為1:9-9:1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種聚己內(nèi)酯-角蛋白復(fù)合多孔支架的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中角蛋白的分 子量為3-300kDa ;角蛋白溶液濃度為10-20mg/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種聚己內(nèi)酯-角蛋白復(fù)合多孔支架的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中角蛋白為還原法、氧化法或水解法提取制備的角蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種聚己內(nèi)酯-角蛋白復(fù)合多孔支架的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中角蛋白為動物毛發(fā)或動物體提取制得。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種聚己內(nèi)酯-角蛋白復(fù)合多孔支架的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中冷凍為-10~_80°C下冷凍處理1-48小時，或者通過液氮速凍。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種聚己內(nèi)酯-角蛋白復(fù)合多孔支架的制備方法，其特征在于:所述步驟(4)中冷凍干燥用冷凍干燥機，-20~_60°C條件下冷凍干燥24-36小時。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種聚己內(nèi)酯-角蛋白復(fù)合多孔支架的制備方法，其特征在于:所述步驟(4)所得的聚己內(nèi)酯-角蛋白復(fù)合多孔支架用于皮膚、骨組織工程支架、細胞培養(yǎng)、藥物輸送。
【文檔編號】A61K47/34GK104004221SQ201410263685
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月13日
【發(fā)明者】楊光 申請人:東華大學(xué)