一種包含吲哚青綠的多聚體白蛋白納米球及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種多聚體白蛋白納米球，所述多聚體白蛋白納米球包括含巰基和/或二硫鍵的白蛋白分子，所述白蛋白分子之間通過二硫鍵相互連接，所述多聚體白蛋白納米球中包載有目標(biāo)投遞物；所述目標(biāo)投遞物包括抗癌藥物和造影劑；所述多聚體白蛋白納米球的粒徑為10～1000nm。該多聚體白蛋白納米球是一種安全、穩(wěn)定的生物相容性納米載體，可以包載藥物或者造影劑等目標(biāo)投遞物，且其儲(chǔ)存穩(wěn)定性高，有利于長時(shí)間有效、穩(wěn)定地釋放目標(biāo)投遞物；此外，該多聚體白蛋白納米球的粒徑小，且尺寸均一，分散性好；本發(fā)明還提供了該多聚體白蛋白納米球的制備方法及應(yīng)用。
【專利說明】一種包含吲哚青綠的多聚體白蛋白納米球及其制備方法和應(yīng)用
[0001]本申請要求于2013年9月27日提交中國專利局的申請?zhí)枮?01310449770.X，其發(fā)明名稱為“一種多聚體白蛋白納米球及其制備方法和應(yīng)用”的中國專利申請的優(yōu)先權(quán)，其部分內(nèi)容通過引用結(jié)合在本申請中。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥材料領(lǐng)域，具體涉及一種多聚體白蛋白納米球及其制備方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0003]納米技術(shù)的興起使得基于高分子納米微粒的藥物輸送得到了廣泛的關(guān)注，白蛋白具有可生物降解、無毒、無抗原性等諸多特點(diǎn)，被認(rèn)為是一個(gè)理想的藥物載體。而通常單個(gè)白蛋白分子的尺寸在幾個(gè)納米以內(nèi)，不適合直接用于載藥，超聲乳化法和去溶劑法可制得粒徑小于Iym的白蛋白納米球，可用于運(yùn)載藥物，但由于白蛋白分子的水溶性高，該類方法制得的白蛋白納米球載體的釋藥性能不易于控制，如何使白蛋白納米顆粒在水中有良好的穩(wěn)定性，且在稀釋條件下不溶解是目前制備技術(shù)上的難點(diǎn)。
[0004]戊二醛等交聯(lián)劑常被用來穩(wěn)定得到的納米球，但戊二醛會(huì)非選擇性的結(jié)合白蛋白表面的氨基位點(diǎn)，在生物體內(nèi)會(huì)釋放出醛類殘基，對生物體有著顯著毒副作用。因此，有必要提供一種制備安全、穩(wěn)定性高的白蛋白納米球的方法。
[0005]光學(xué)治療是近年來發(fā)展起來的一種微創(chuàng)腫瘤治療技術(shù)，受到了研究者的廣泛關(guān)注。目前，光學(xué)試劑根據(jù)材質(zhì)的不同可分為無機(jī)和有機(jī)光學(xué)試劑兩大類。無機(jī)光學(xué)治療試齊U存在難降解、體內(nèi)有殘留的局限。有機(jī)光學(xué)試劑因具有良好的生物相容性、體內(nèi)易降解而受到研究者的廣泛關(guān)注。
[0006]常見的有機(jī)光學(xué)試劑有二氫B卜吩和Π引哚菁綠,二氫P卜吩e6 (chlorin e6, Ce6)作為第二代聲敏劑具有無毒、腫瘤組織高選擇性及非腫瘤組織清除率高等優(yōu)點(diǎn)，在光照和氧存在下能夠產(chǎn)生單線態(tài)氧和/或自由基而用于腫瘤的光動(dòng)力學(xué)治療。但是，二氫卟吩e6不溶于水，穩(wěn)定性差，無法制成水溶液體系，即使先用有機(jī)溶劑溶解，然后分散在水溶液中，也是以懸濁液形式存在，很難被細(xì)胞有效地?cái)z?。欢?，有機(jī)溶劑本身對細(xì)胞也存在一定的毒性。吲哚菁綠(ICG)是一種具有近紅外特征吸收峰的三碳花菁染料，在光照和氧存在下能夠產(chǎn)生單線態(tài)氧和/或自由基而用于腫瘤的光動(dòng)力學(xué)治療，同時(shí)可將吸收的光能部分轉(zhuǎn)化為熱能而用于腫瘤的光熱治療。ICG也是目前唯一被美國食品藥品管理局(FDA)和中國食品藥品監(jiān)督管理總局(SFDA)批準(zhǔn)臨床使用的近紅外染料，具有生物相容性好，代謝途徑明確等優(yōu)點(diǎn)。但作為一種有機(jī)小分子，ICG在光學(xué)治療過程中也存在不穩(wěn)定、易分解、缺乏腫瘤主動(dòng)靶向性等不足。因此，如何提高Ce6的親水性和穩(wěn)定性以及ICG的穩(wěn)定性和靶向性，使Ce6和ICG快速、有效地進(jìn)入細(xì)胞以提高光學(xué)治療的療效是目前研究的熱點(diǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種多聚體白蛋白納米球，該多聚體白蛋白納米球包括含巰基和/或二硫鍵的白蛋白分子，所述白蛋白分子之間通過二硫鍵相互連接，在稀釋條件下有較高的穩(wěn)定性；此外，該多聚體白蛋白納米球的粒徑為10?lOOOnm，且其尺寸均一，分散性好，是運(yùn)載藥物或造影劑等目標(biāo)投遞物的良好載體，有利于在患者體內(nèi)長時(shí)間有效、安全、穩(wěn)定地釋放投遞物；本發(fā)明還提供了一種多聚體白蛋白納米球的制備方法和應(yīng)用。
[0008]第一方面，本發(fā)明提供了一種多聚體白蛋白納米球，所述多聚體白蛋白納米球包括含巰基和/或二硫鍵的白蛋白分子，所述白蛋白分子之間通過二硫鍵相互連接，所述多聚體白蛋白納米球的粒徑為10?lOOOnm。
[0009]優(yōu)選地，所述含巰基和/或二硫鍵的白蛋白分子為人血清白蛋白、牛血清白蛋白、豬血清白蛋白、重組血清白蛋白和血紅蛋白中的至少一種。
[0010]優(yōu)選地，所述多聚體白蛋白納米球中包載有目標(biāo)投遞物。
[0011]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述目標(biāo)投遞物為抗癌藥物和造影劑中的至少一種。
[0012]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述抗癌藥物為鉬及鉬的配合物、5 β，20-環(huán)氧-1，2α，4，7β，10β，13α-六羥基紫杉烷-11-烯-9-酮-4，10-二乙酸酯_2_苯甲酸酯-13 [ (2’ R，3’ S) -N-苯甲酰-3-苯基異絲氨酸酯](紫杉醇)、(7S:9S) -9-羥乙?；?4-甲氧基 _7，8, 9, 10-四氧-6，7, 9, 11-四輕基-7-0-(2’，3’，6’，- 二去氧 _3’ -氣基-a-Ι-來蘇已吡喃基)-5，12-萘二酮(阿霉素)、伍，幻-1，7-雙(4-羥基-3-甲氧基苯基)-1，6_庚二烯-3，5-二酮(姜黃素)、1，3，5，8-四甲基-2，4-二(a_羥乙基)卟酚-6，7-二丙酸(血卟啉)、4_ 乙基-4，12-二氧-4-羥-1H-吡喃(3，，4，，6，7)吡吲哚(I，2-6)喹啉-3，14-二酮(喜樹堿)、(2S-反式)-18-羧基-20-(羧甲基)-13-乙基-2，3- 二氫3，7，12，17-四甲基-8-乙烯基-21H，23H-卟吩-2-丙酸(二氫卟吩e6)、IR700碘化物和11-氯-1，I’ - 二正丙基-3，3，3’，3’-四甲基-10，12-三亞甲基吲哚三碳花青碘鹽(IR780)中的至少一種。
[0013]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述造影劑為2，7-雙[1，3-二氫-1，1-二甲基-3-(4-磺丁基)-1，3，5-庚三烯單鈉鹽(吲哚青綠)、對-[(2，4-二氨基喋啶-6)-N-甲基甲氨基]苯甲酰谷氨酸(甲氨蝶呤)、3，7-雙(二甲氨基)吩噻嗪-5-翁氯化物(美藍(lán))、6，6’ - [ [3，3’ - 二甲基(1，I’ - 二苯基)_4，4’ - 二基]雙(偶氮基)]雙(4-氨基-5-羥基-1，3-萘二磺酸)四鈉鹽(伊文思藍(lán))、2_((4_ 二乙氨基)苯)(4_( 二乙氨基)環(huán)己燒_2，5- 二烯)甲燒)苯基-1，4-二磺酸鹽(異硫藍(lán))、4，4’-雙(二乙氨基)三苯脫水甲醇-2’’，4’’-二磺酸單鈉(專利藍(lán))和金屬納米粒子中的至少一種。
[0014]由于白蛋白單體分子易溶性，物理方法團(tuán)聚的白蛋白納米球容易解體，納米球中包載的藥物很容易被過早地釋放，不利于藥物等目標(biāo)投遞物在人體循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的運(yùn)輸，即物理方法團(tuán)聚的白蛋白納米球載體的釋藥性能的可控性不高，而本發(fā)明提供的多聚體白蛋白納米球由多個(gè)白蛋白單體分子通過分子間的二硫鍵相互連接，這種化學(xué)鍵穩(wěn)定的多聚體結(jié)構(gòu)比通過物理方法聚集的蛋白納米球更穩(wěn)定，不易被人體體液稀釋、溶解而解體，有助于保證靶向部位足夠的給藥濃度。
[0015]在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中，納米粒子藥物的粒徑比較重要，不同的粒徑代謝路徑也不一樣，小粒徑通過腎代謝，大粒徑通過肝代謝；其中，20?200nm的粒子對腫瘤有被動(dòng)靶向作用，在此粒徑范圍內(nèi)的納米粒子藥物可以降低藥物本身的毒副作用，同時(shí)也增加了療效。
[0016]此外，納米粒子藥物的分散性是比較重要的，分散性不好，粒子容易團(tuán)聚，甚至沉淀，導(dǎo)致應(yīng)用較為困難，特別是其生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用，分散性尤其重要。
[0017]本發(fā)明提供的多聚體白蛋白納米球粒徑小且尺寸均一，分散性好，用該納米球包括投遞藥物在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用有較大優(yōu)勢，有利于納米球通過EPR效應(yīng)進(jìn)入腫瘤內(nèi)部并通過gp60通路靶向到腫瘤細(xì)胞。
[0018]另外，一般自由蛋白質(zhì)分子的分子量大都小于60KDa，本發(fā)明提供的多聚體白蛋白納米球由多個(gè)白蛋白單體分子聚集而成，分子量高于60KDa，不易被腎小球?yàn)V過(由于腎小球的濾過作用下，一般分子量小于60KDa的蛋白質(zhì)分子會(huì)在代謝的過程中被清除掉，而不能達(dá)到靶向位置)，能提高藥物等目標(biāo)投遞物的投遞效率。
[0019]第二方面，本發(fā)明提供了一種多聚體白蛋白納米球的制備方法，包括以下步驟:
[0020](I)制備體積質(zhì)量濃度為0.01?300mg/mL的含巰基和/或二硫鍵的白蛋白水溶液，并調(diào)節(jié)所述白蛋白水溶液的pH值為7?12 ;
[0021](2)向步驟⑴所得的所述pH值為7?12的白蛋白水溶液中加入帶巰基的還原劑得反應(yīng)液，然后在O?60°C下輕輕搖動(dòng)反應(yīng)0.05?12小時(shí)，在所述反應(yīng)液中，所述帶巰基的還原劑的摩爾數(shù)為白蛋白摩爾數(shù)的10?5000倍；
[0022](3)將步驟(2)反應(yīng)后的溶液在O?60°C的條件下進(jìn)行超聲，所述超聲的功率范圍為I?100KW，同時(shí)在攪拌的條件下在所述進(jìn)行超聲的溶液中以0.01?1000ml/s的速度加入有機(jī)溶劑得到微乳溶液，所述微乳溶液在O?60°C的條件下反應(yīng)5?240min后，靜置分層，然后去除有機(jī)相，得到含多聚體白蛋白納米球的懸濁液，其中，所述有機(jī)溶劑加入的體積為所述步驟(2)反應(yīng)后的溶液的I?100倍；
[0023](4)將步驟(3)所得的含多聚體白蛋白納米球的懸濁液在O?60°C以及pH值為7?12的條件下進(jìn)行透析，得到多聚體白蛋白納米球溶液；
[0024](5)將步驟(4)所得的多聚體白蛋白納米球溶液進(jìn)行干燥脫水處理，得到多聚體白蛋白納米球，所述多聚體白蛋白納米球包括含巰基和/或二硫鍵的白蛋白分子，所述白蛋白分子之間通過二硫鍵相互連接，所述多聚體白蛋白納米球的粒徑為10?lOOOnm。
[0025]優(yōu)選地，所述步驟(I)中，所述含巰基和/或二硫鍵的白蛋白分子為人血清白蛋白、牛血清白蛋白、豬血清白蛋白、重組血清白蛋白和血紅蛋白中的至少一種。
[0026]優(yōu)選地，所述步驟(I)中，所述白蛋白水溶液中含有體積分?jǐn)?shù)為0%?20%的二甲基亞砜、甲醇、乙醇、丙醇和叔丁醇中的至少一種。
[0027]本發(fā)明采用的二甲基亞砜、甲醇、乙醇、丙醇或叔丁醇能提高藥物或造影劑在溶液中的溶解度，使藥物或造影劑充分溶解均勻。
[0028]優(yōu)選地，所述步驟⑴中，所述白蛋白水溶液中含有目標(biāo)投遞物，所述目標(biāo)投遞物的質(zhì)量為所述白蛋白質(zhì)量的0.0002?0.5倍。
[0029]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述目標(biāo)投遞物為抗癌藥物和造影劑中的至少一種。
[0030]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述抗癌藥物為鉬及鉬的類似物、紫杉醇、阿霉素、姜黃素、血卟啉、喜樹堿、二氫卟吩e6、IR700碘化物和IR780中的至少一種。
[0031]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述造影劑為吲哚青綠、甲氨蝶呤、美藍(lán)、伊文思藍(lán)、異硫藍(lán)、專利藍(lán)和金屬納米粒子中的至少一種。
[0032]本發(fā)明采用的二甲基亞砜、甲醇、乙醇、丙醇或叔丁醇還能提高目標(biāo)投遞物(如藥物或造影劑)在溶液中的溶解度，使目標(biāo)投遞物與蛋白質(zhì)充分溶解并混合均勻，且目標(biāo)投遞物與白蛋白分子可以充分接觸，為下一步超聲過程中白蛋白包載目標(biāo)投遞物做準(zhǔn)備。
[0033]優(yōu)選地，所述步驟(2)中，所述帶巰基的還原劑為谷胱甘肽、半胱氨酸、巰基乙醇或二硫蘇糖醇。
[0034]優(yōu)選地，所述步驟(3)中，所述有機(jī)溶劑為甲醇、乙醇、丙醇和叔丁醇中的至少一種。
[0035]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述有機(jī)溶劑中還含有二甲基亞砜、三氯甲烷、二氯甲烷和正己烷中的至少一種。
[0036]優(yōu)選地，步驟(2)所述反應(yīng)液在4?60°C下輕輕搖動(dòng)反應(yīng)，步驟(3)中步驟(2)反應(yīng)后的溶液在4?60°C的條件下進(jìn)行超聲，所述微乳溶液在4?60°C的條件下反應(yīng)5?240min,步驟(4)所述含多聚體白蛋白納米球的懸池液在4?60°C下進(jìn)行透析。
[0037]優(yōu)選地，所述步驟(3)中，所述有機(jī)溶劑加入的體積為所述步驟(2)反應(yīng)后的溶液的2?50倍。
[0038]更優(yōu)選地，所述步驟(3)中，所述有機(jī)溶劑加入的體積為所述步驟(2)反應(yīng)后的溶液的2?20倍。
[0039]優(yōu)選地，所述步驟(4)中，所述進(jìn)行透析的方法為:先將步驟(3)所得的含多聚體白蛋白納米球的懸濁液置于PH值為7?12的PBS緩沖液中透析10?300小時(shí)，然后在雙蒸水內(nèi)透析12小時(shí)，得到含多聚體白蛋白納米球的溶液。
[0040]本發(fā)明采用pH值為7?12的PBS緩沖液進(jìn)行透析，一方面可以去除多聚體白蛋白納米球的懸濁液中的無機(jī)小分子等雜質(zhì)，另一方面，在堿性條件下，某些存在于多聚體白蛋白納米球之間的二硫鍵斷開，然后和各自納米球中的蛋白質(zhì)分子形成新的二硫鍵，從而使得聚集的多聚體白蛋白納米球分離，達(dá)到分散多聚體白蛋白納米球的目的，進(jìn)而形成單個(gè)的分散的多聚體白蛋白納米球。
[0041]如本文所述的，所述單個(gè)的分散的多聚體白蛋白納米球?yàn)榱椒秶?0?100nm之間的多聚體白蛋白納米球。堿性條件下透析處理之前，有些多聚體白蛋白納米球之間會(huì)團(tuán)聚，導(dǎo)致團(tuán)聚后的納米球的粒徑偏大，經(jīng)過堿性條件下透析處理后，團(tuán)聚的納米球得到分散，形成粒徑更小的納米球。
[0042]本發(fā)明采用pH值為7?12的緩沖液進(jìn)行透析，一方面可以去除納米探針的懸濁液中的無機(jī)小分子等雜質(zhì)，更重要的是，團(tuán)聚的納米探針在堿性條件下能分散為粒徑更小的納米球，從而獲得分散、粒徑均勻的多聚體白蛋白納米球。
[0043]優(yōu)選地，所述步驟(5)中，所述多聚體白蛋白納米球中包載有目標(biāo)投遞物。
[0044]優(yōu)選地，所述對步驟(4)所得的多聚體白蛋白納米球溶液進(jìn)行干燥脫水處理的方式為:將步驟(4)所得的多聚體白蛋白納米球溶液置于O?-20°C下預(yù)凍I?48小時(shí)后轉(zhuǎn)移至-20?-80°C下冷凍2?48小時(shí)，然后在冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥12?120小時(shí)。
[0045]本發(fā)明提供的多聚體白蛋白納米球的制備方法，采用了邊超聲邊將有機(jī)溶劑(乙醇或含氯仿等非極性溶劑的乙醇)注入白蛋白溶液的超聲乳化-去溶劑法的方式制備納米球，一方面，乙醇等有機(jī)溶劑注入白蛋白溶液時(shí)能將蛋白質(zhì)分子析出，與此同時(shí)，白蛋白分子間因二硫鍵的形成而聚集形成多聚體白蛋白納米球。另一方面，控制好超聲功率的大小和乙醇等有機(jī)溶劑的注入速度，可以控制所制備的多聚體白蛋白納米球的粒徑。這是因?yàn)?，?dāng)超聲功率大，乙醇等有機(jī)溶劑的注入速度大，所得的多聚體白蛋白納米球的粒徑就?。环粗?，當(dāng)超聲功率小，乙醇等有機(jī)溶劑的注入速度小，所得的多聚體白蛋白納米球的粒徑就大。因此，本發(fā)明提供的多聚體白蛋白納米球的制備方法不但能獲得多聚體白蛋白納米球，而且能得到粒徑可控的多聚體白蛋白納米球，本發(fā)明提供的方法可以制備出粒徑在10?100nm之間的多聚體白蛋白納米球。
[0046]此外，本發(fā)明提供的多聚體白蛋白納米球的制備方法，將白蛋白水溶液和目標(biāo)投遞物先充分混合，使得白蛋白在包載目標(biāo)投遞物之前就與目標(biāo)投遞物充分接觸，能提高白蛋白包載目標(biāo)投遞物的效率。
[0047]第三方面，本發(fā)明提供了如第一方面所述的多聚體白蛋白納米球或如第二方面所述的多聚體白蛋白納米球的制備方法在制備預(yù)防、治療或診斷癌癥的藥物中的應(yīng)用。
[0048]如本文所用的，“癌癥”包括腫瘤。
[0049]本發(fā)明提供了的多聚體白蛋白納米球及其制備方法和應(yīng)用具有如下有益效果:
[0050](I)本發(fā)明提供的多聚體白蛋白納米球由不同的白蛋白分子通過分子之間二硫鍵相互連接形成納米球團(tuán)，在水、磷酸鹽緩沖液、乙醇、血清或培養(yǎng)基等溶劑稀釋條件下，比物理結(jié)合的白蛋白載體具有更高的穩(wěn)定性；
[0051](2)與使用化學(xué)交聯(lián)劑如戊二醛等穩(wěn)定的白蛋白載體相比，本發(fā)明提供的白蛋白納米球采用了蛋白質(zhì)分子本身的二硫鍵來獲得穩(wěn)定的納米球，因此本發(fā)明提供的白蛋白納米球更加安全；
[0052](3)本發(fā)明提供的多聚體白蛋白納米球的粒徑為10?lOOOnm，且其尺寸均一，分散性好，是運(yùn)載藥物或造影劑等目標(biāo)投遞物的良好載體，有利于在患者體內(nèi)長時(shí)間有效、安全、穩(wěn)定地釋放投遞物；
[0053](4)本發(fā)明提供的多聚體白蛋白納米球可用于制備預(yù)防、治療或診斷癌癥的藥物。
[0054]第四方面，本發(fā)明提供了一種多聚體白蛋白納米球，所述多聚體白蛋白納米球包括含巰基和/或二硫鍵的白蛋白分子，所述白蛋白分子之間通過二硫鍵相互連接，
[0055]所述多聚體白蛋白納米球中包載有目標(biāo)投遞物；
[0056]所述目標(biāo)投遞物包括抗癌藥物和造影劑；
[0057]所述抗癌藥物包括(2S-反式)-18-羧基-20-(羧甲基)-13-乙基_2，3_ 二氫3，7，12，17-四甲基-8-乙烯基-21H, 23H-卟吩-2-丙酸(二氫卟吩e6)；
[0058]所述造影劑包括2，7-雙[1，3-二氫-1，1-二甲基_3_ (4_磺丁基)_1，3，5_庚三烯單鈉鹽(吲哚青綠)；
[0059]所述多聚體白蛋白納米球的粒徑為10?lOOOnm。
[0060]如本文所用的，“吲哚青綠”又稱吲哚菁綠。
[0061]優(yōu)選地，本發(fā)明所采用的ICG優(yōu)選為醫(yī)用等級(jí)的無殘留碘的ICG。
[0062]如本發(fā)明所述的，“多聚體白蛋白納米球”由白蛋白分子之間通過二硫鍵相互連接，由于單體白蛋白分子中含有至少一個(gè)巰基或二硫鍵，若該白蛋白單體分子中的巰基或二硫鍵在形成多聚體白蛋白納米球時(shí)沒有發(fā)生反應(yīng)，則有可能保留在了多聚體白蛋白球中，因此，本發(fā)明提供的多聚體白蛋白納米球可含有疏基、_■硫鍵、或者同時(shí)含有疏基和_■硫鍵，即本發(fā)明提供的多聚體白蛋白納米球可含有巰基和/或二硫鍵。
[0063]優(yōu)選地,所述多聚體白蛋白納米球的粒徑為60?200nm。
[0064]優(yōu)選地,所述多聚體白蛋白納米球的粒徑為400?500nm。
[0065]優(yōu)選地，所述多聚體白蛋白納米球的粒徑為200?300nm。
[0066]優(yōu)選地，所述多聚體白蛋白納米球的粒徑為300?400nm。
[0067]優(yōu)選地，所述多聚體白蛋白納米球的粒徑為500?700nm。
[0068]優(yōu)選地，所述多聚體白蛋白納米球的粒徑為700?lOOOnm。
[0069]如本文所述的，所述多聚體白蛋白納米球中包裹目標(biāo)投遞物指所述多聚體白蛋白作為載體，包載所述目標(biāo)投遞物。
[0070]優(yōu)選地，所述多聚體白蛋白包載目標(biāo)投遞物的方式為:部分目標(biāo)投遞物被所述白蛋白分子包裹，剩余部分的目標(biāo)投遞物鑲嵌在所述白蛋白分子間。
[0071]更優(yōu)選地，所述二氫卟吩e6被所述白蛋白分子包裹，所述吲哚菁綠部分被所述白蛋白分子包裹，剩余部分鑲嵌在所述白蛋白分子間。
[0072]優(yōu)選地，所述含巰基和/或二硫鍵的白蛋白分子為人血清白蛋白、牛血清白蛋白、豬血清白蛋白、重組血清白蛋白和血紅蛋白中的至少一種。
[0073]優(yōu)選地，所述目標(biāo)投遞物的質(zhì)量為所述含巰基和/或二硫鍵的白蛋白質(zhì)量的0.0002 ?0.5 倍。
[0074]優(yōu)選地，所述目標(biāo)投遞物的質(zhì)量為所述含巰基和/或二硫鍵的白蛋白質(zhì)量的0.0008 ?0.5 倍。
[0075]優(yōu)選地，所述目標(biāo)投遞物的質(zhì)量為所述含巰基和/或二硫鍵的白蛋白質(zhì)量的0.008 ?0.5 倍。
[0076]白蛋白是一種生物內(nèi)源性蛋白，具有可生物降解、無毒等優(yōu)點(diǎn)，但是白蛋白在稀釋條件下會(huì)溶解，在生物體內(nèi)不穩(wěn)定，不能有效負(fù)載藥物分子進(jìn)入靶器官。
[0077]本發(fā)明多聚體白蛋白包括含巰基和/或二硫鍵的白蛋白分子，所述白蛋白分子之間通過二硫鍵相互連接，多聚體白蛋白穩(wěn)定性良好，可以在水溶液中穩(wěn)定存在，可以作為良好的藥物載體。
[0078]本發(fā)明將疏水性二氫卟吩e6包載在親水性的多聚體白蛋白中，可以提高二氫卟吩e6(Ce6)的水溶性，有助于二氫卟吩e6快速、有效地進(jìn)入細(xì)胞以提高光動(dòng)力學(xué)治療的療效。本發(fā)明多聚體白蛋白納米球可以穩(wěn)定存在于生物體內(nèi)血液循環(huán)系統(tǒng)中，從而避免二氫卟吩e6在血液循環(huán)系統(tǒng)傳輸過程中的無效釋放；同時(shí)，由于腫瘤組織的生長失控增加了大分子類物質(zhì)和脂質(zhì)粒子的選擇性、高通透性和滯留性(EPR效應(yīng))，為多聚體白蛋白納米球提供了一種被動(dòng)祀向腫瘤組織的能力；腫瘤組織細(xì)胞膜表面富含gp60、gp30和gp 18等白蛋白受體，為多聚體白蛋白納米球提供了一種主動(dòng)靶向腫瘤組織的能力，從而提高了多聚體白蛋白納米球的靶向性。
[0079]吲哚菁綠(ICG)是目前唯一被美國食品藥品管理局(FDA)和中國食品藥品監(jiān)督管理總局(SFDA)批準(zhǔn)臨床使用的近紅外染料，本發(fā)明提供的多聚體白蛋白納米球中含有ICG，因此，本發(fā)明提供的多聚體白蛋白納米球能作為熒光活體成像以及光聲成像探針，具有生物相容性好，代謝途徑明確等優(yōu)點(diǎn)。
[0080]然而,作為一種有機(jī)小分子,ICG在臨床應(yīng)用過程中也存在不穩(wěn)定、易分解、缺乏腫瘤主動(dòng)靶向性等不足。
[0081]本發(fā)明采用二硫鍵穩(wěn)定的多聚體白蛋白納米球包載ICG，可以避免ICG在血液循環(huán)系統(tǒng)傳輸過程中的無效釋放和分解，提高ICG在生物體內(nèi)血液循環(huán)系統(tǒng)中的穩(wěn)定性。
[0082]此外，ICG是一種具有近紅外特征吸收峰的三碳花菁染料，在光照和氧存在下能夠產(chǎn)生單線態(tài)氧和/或自由基而用于腫瘤的光動(dòng)力學(xué)治療，同時(shí)可將吸收的光能部分轉(zhuǎn)化為熱能而用于腫瘤的光熱治療，因此，本發(fā)明提供的多聚體白蛋白納米球還可用于癌癥、腫瘤的光動(dòng)力學(xué)、光熱治療。
[0083]所述多聚體白蛋白納米球還具有良好的近紅外熒光和光聲成像能力，可用于實(shí)時(shí)、無創(chuàng)地監(jiān)測治療前納米粒子在體內(nèi)的輸送行為，光動(dòng)力治療后可通過成像對療效進(jìn)行實(shí)時(shí)評(píng)估，實(shí)現(xiàn)成像引導(dǎo)的光動(dòng)力學(xué)治療。
[0084]本發(fā)明多聚體白蛋白納米球粒徑較小，粒子分散性良好。
[0085]第五方面，本發(fā)明提供了一種多聚體白蛋白納米球的制備方法，包括以下步驟:
[0086](I)制備體積質(zhì)量濃度為0.01?300mg/mL的含巰基和/或二硫鍵的白蛋白水溶液，并調(diào)節(jié)所述白蛋白水溶液的pH值為7?12 ;
[0087]其中，所述白蛋白水溶液中含有目標(biāo)投遞物；
[0088]所述目標(biāo)投遞物包括抗癌藥物和造影劑；
[0089]所述抗癌藥物包括(2S-反式)-18-羧基-20-(羧甲基)-13-乙基_2，3_ 二氫3，7，12，17-四甲基-8-乙烯基-21H, 23H-卟吩-2-丙酸；
[0090]所述造影劑包括2，7-雙[1，3-二氫-1，1-二甲基-3-(4-磺丁基)_1，3，5-庚三烯單鈉鹽；
[0091](2)向步驟⑴所得的所述pH值為7?12的白蛋白水溶液中加入帶巰基的還原劑得反應(yīng)液，然后在O?60°C下輕輕搖動(dòng)反應(yīng)0.05?12小時(shí)，在所述反應(yīng)液中，所述帶巰基的還原劑的摩爾數(shù)為白蛋白摩爾數(shù)的10?5000倍；
[0092](3)將步驟(2)反應(yīng)后的溶液在O?60°C的條件下進(jìn)行超聲，所述超聲的功率范圍為I?100KW，同時(shí)在攪拌的條件下在所述進(jìn)行超聲的溶液中以0.01?1000ml/s的速度加入有機(jī)溶劑得到微乳溶液，所述微乳溶液在O?60°C的條件下反應(yīng)5?240min后，靜置分層，然后去除有機(jī)相，得到含多聚體白蛋白納米球的懸濁液，其中，所述有機(jī)溶劑加入的體積為所述步驟(2)反應(yīng)后的溶液的I?100倍；
[0093](4)將步驟(3)所得的含多聚體白蛋白納米球的懸濁液在O?60°C以及pH值為7?12的條件下進(jìn)行透析，得到多聚體白蛋白納米球溶液；
[0094](5)將步驟(4)所得的多聚體白蛋白納米球溶液進(jìn)行干燥脫水處理，得到多聚體白蛋白納米球，所述多聚體白蛋白納米球包括含巰基和/或二硫鍵的白蛋白分子，所述白蛋白分子之間通過二硫鍵相互連接，
[0095]其中，所述多聚體白蛋白納米球中包載有目標(biāo)投遞物；
[0096]所述目標(biāo)投遞物包括抗癌藥物和造影劑；
[0097]所述抗癌藥物包括(2S-反式)-18-羧基-20-(羧甲基)-13-乙基_2，3_ 二氫3，7，12，17-四甲基-8-乙烯基-21H, 23H-卟吩-2-丙酸；
[0098]所述造影劑包括2，7-雙[1，3-二氫-1，1-二甲基_3_ (4_磺丁基)_1，3，5_庚三烯單鈉鹽；
[0099]所述多聚體白蛋白納米球的粒徑為10?lOOOnm。
[0100]優(yōu)選地，所述ICG與Ce6的質(zhì)量比為1:0.02?50。
[0101]優(yōu)選地，所述步驟(I)中，所述含巰基和/或二硫鍵的白蛋白分子為人血清白蛋白、牛血清白蛋白、豬血清白蛋白、重組血清白蛋白和血紅蛋白中的至少一種。
[0102]優(yōu)選地，所述步驟(I)中，所述目標(biāo)投遞物的質(zhì)量為所述含巰基和/或二硫鍵的白蛋白質(zhì)量的0.0002?0.5倍。
[0103]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述目標(biāo)投遞物的質(zhì)量為所述含巰基和/或二硫鍵的白蛋白質(zhì)量的 0.0008 ?0.5 倍。
[0104]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟(I)中，所述目標(biāo)投遞物的質(zhì)量為所述含巰基和/或二硫鍵的白蛋白質(zhì)量的0.008?0.5倍。
[0105]優(yōu)選地，所述步驟(2)中，所述帶巰基的還原劑的摩爾數(shù)為白蛋白摩爾數(shù)的10?100 倍。
[0106]優(yōu)選地，所述步驟(2)中，所述帶巰基的還原劑的摩爾數(shù)為白蛋白摩爾數(shù)的100?2500 倍。
[0107]優(yōu)選地，所述步驟(2)中，所述帶巰基的還原劑為谷胱甘肽、半胱氨酸、巰基乙醇或二硫蘇糖醇。
[0108]優(yōu)選地,所述步驟(2)中，所述帶巰基的還原劑的濃度為0.01?2mol/L。
[0109]優(yōu)選地，所述步驟(3)中，所述超聲的功率范圍為50?100KW。
[0110]優(yōu)選地，所述步驟(3)中，所述有機(jī)溶劑為甲醇、乙醇、丙醇和叔丁醇中的至少一種。
[0111]可替代的，本發(fā)明步驟(3)中所述的對溶液進(jìn)行超聲的目的是為了增加溶液中白蛋白、目標(biāo)投遞物的分散性，并使之充分接觸，該超聲步驟可以采用行業(yè)內(nèi)其他混合方式，比如攪拌。
[0112]可替代的，所述步驟(3)中，所述反應(yīng)后的微乳溶液可以不經(jīng)過去除有機(jī)相的步驟就能得到含多聚體白蛋白納米球的懸濁液。靜置分層是當(dāng)采用的有機(jī)溶劑與水互不相溶時(shí)，才需要進(jìn)行靜置分層，并去除掉，相反，如果采用乙醇等與水互溶的有機(jī)溶劑，是不需要靜置分層，去除有機(jī)相的步驟的。
[0113]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟(3)中，所述有機(jī)溶劑中還含有二甲基亞砜、三氯甲烷、二氯甲烷和正己烷中的至少一種。
[0114]優(yōu)選地，所述步驟(3)中，所述有機(jī)溶劑中含有目標(biāo)投遞物，所述目標(biāo)投遞物為二氫卟吩e6和ICG0
[0115]本發(fā)明可在步驟⑴的白蛋白溶液中加入目標(biāo)投遞物；可替代的，還可以在步驟
(3)的有機(jī)溶劑中加入目標(biāo)投遞物；可替代的，可以同時(shí)在步驟(I)的白蛋白溶液中，以及步驟(3)的有機(jī)溶劑中加入目標(biāo)投遞物。
[0116]在步驟(I)的白蛋白溶液中和/或步驟(3)有機(jī)溶劑中加入二氫卟吩e6時(shí)，可以再加入二甲基亞砜(DMSO)、四氫呋喃和N，N- 二甲基甲酰胺中的一種或幾種，以提高二氫卟吩e6的在白蛋白溶液中和/或有機(jī)溶劑中的溶解度。
[0117]優(yōu)選地，所述步驟(3)中，所述有機(jī)溶劑加入的體積為所述步驟(2)反應(yīng)后的溶液的2?50倍。
[0118]更優(yōu)選地，所述步驟(3)中，所述有機(jī)溶劑加入的體積為所述步驟(2)反應(yīng)后的溶液的2?20倍。
[0119]優(yōu)選地，所述步驟(3)中，所述有機(jī)溶劑的速度加入為50?1000mL/s。
[0120]本發(fā)明提供的多聚體白蛋白納米球的制備方法將有機(jī)相(有機(jī)溶劑)加入水相(白蛋白溶液)中，可替代的，也可將水相加入有機(jī)相中。
[0121]優(yōu)選地，所述步驟(4)中，所述進(jìn)行透析的方法為:將步驟(3)所得的含多聚體白蛋白納米球的懸濁液置于pH值為7?12的緩沖液中透析，得到多聚體白蛋白納米球溶液。
[0122]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟(4)中，所述用于透析的緩沖液的pH為9?12。
[0123]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟(4)中，所述用于透析的緩沖液為PBS緩沖液或Tris緩沖液。
[0124]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟(4)中，所述含多聚體白蛋白納米球的懸濁液在緩沖液中的透析時(shí)間為10?300小時(shí)。
[0125]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟(4)中，含多聚體白蛋白納米球的懸濁液置于pH值為7?12的緩沖液中透析后，再置于雙蒸水內(nèi)透析。
[0126]更進(jìn)一步優(yōu)選地，置于雙蒸水內(nèi)透析的時(shí)間為I?24小時(shí)。
[0127]本發(fā)明采用pH值為7?12的PBS緩沖液進(jìn)行透析，一方面可以去除含多聚體白蛋白納米球的懸濁液中的無機(jī)小分子等雜質(zhì)，更重要的是，團(tuán)聚的含多聚體白蛋白納米球在堿性條件下能分散為粒徑更小的納米球，從而獲得分散、粒徑均勻的多聚體白蛋白納米球。
[0128]優(yōu)選地，步驟⑵所述反應(yīng)液在4?60°C下輕輕搖動(dòng)反應(yīng)，步驟(3)中步驟(2)反應(yīng)后的溶液在4?60°C的條件下進(jìn)行超聲，所述微乳溶液在4?60°C的條件下反應(yīng)5?240min,步驟(4)所述含多聚體白蛋白納米球的懸池液在4?60°C下進(jìn)行透析。
[0129]本發(fā)明提供的多聚體白蛋白納米球粒徑范圍在10?100nm之間，然而，這不是同一批次制備的納米探針的粒徑分布，相反，采用本發(fā)明提供的制備方法獲得的每個(gè)批次的納米探針的粒徑分布范圍較窄，比如在20?250nm之間，因此，本發(fā)明制備的納米探針的粒徑比較均勻，大小可控。
[0130]優(yōu)選地，所述步驟(5)中，所述對步驟(4)所得的多聚體白蛋白納米球溶液進(jìn)行干燥脫水處理的方式為冷凍干燥、噴霧干燥或減壓蒸餾。
[0131]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟(5)中，所述冷凍干燥的步驟為:將步驟(4)所得的多聚體白蛋白納米球溶液置于O?-20°C下預(yù)凍I?48小時(shí)后轉(zhuǎn)移至-20?-80°C下冷凍2?48小時(shí)，然后在冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥12?120小時(shí)。
[0132]本發(fā)明通過控制含巰基和/或二硫鍵白蛋白和帶巰基的還原劑的摩爾比，含巰基和/或二硫鍵白蛋白和目標(biāo)投遞物的摩爾比，各步驟的pH，尤其是透析緩沖液的pH，以及有機(jī)相和水相混合的速度獲得了粒徑小、粒徑分布范圍較窄、粒徑可控的多聚體白蛋白納米球。
[0133]本發(fā)明第五方面制得的多聚體白蛋白納米球具有以下有益效果:
[0134](I)無殘留:采用多聚體白蛋白為載體，ICG和Ce6為光學(xué)試劑，三者均具有安全無毒、無免疫原性、可生物降解、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)。多聚體白蛋白分子間以二硫鍵連接，該粒子可以穩(wěn)定存在于生物體內(nèi)血液循環(huán)系統(tǒng)中，從而避免ICG和Ce6在血液循環(huán)系統(tǒng)傳輸過程中的無效釋放，并在細(xì)胞中還原型谷胱甘肽(GSH)的作用下降解并釋放出單體白蛋白、ICG和Ce6，白蛋白在體內(nèi)通過自然的新陳代謝進(jìn)行降解，從而不會(huì)在體內(nèi)引入任何外源性物質(zhì)；
[0135](2)靶向性好:一方面，腫瘤組織的生長失控增加了大分子類物質(zhì)和脂質(zhì)粒子的選擇性、高通透性和滯留性(EPR效應(yīng))，為多聚體白蛋白納米球提供了一種被動(dòng)靶向腫瘤組織的能力；另一方面，腫瘤組織細(xì)胞膜表面富含gp60、gp30、gpl8等白蛋白受體,為多聚體白蛋白納米球提供了一種主動(dòng)靶向腫瘤組織的能力；另一方面，利用Ce6光動(dòng)力治療腫瘤后產(chǎn)生的急性炎癥能促使多聚體白蛋白納米球在腫瘤部位進(jìn)一步的富集。三者的結(jié)合，提高了多聚體白蛋白納米球的靶向性；
[0136](3)可視化:多聚體白蛋白納米球同時(shí)具有良好的近紅外熒光和光聲成像能力，可用于實(shí)時(shí)、無創(chuàng)地監(jiān)測光學(xué)治療前納米粒子體內(nèi)輸送行為，光學(xué)治療后可通過成像對療效進(jìn)行實(shí)時(shí)評(píng)估，實(shí)現(xiàn)成像引導(dǎo)的光學(xué)治療。
[0137]本發(fā)明制備方法簡單，反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)重現(xiàn)性良好，制得的多聚體白蛋白納米球粒徑小，分散性好。
[0138]第六方面，本發(fā)明提供了如第四方面所述的多聚體白蛋白納米球或如第五方面所述的多聚體白蛋白納米球的制備方法在制備預(yù)防、治療或診斷癌癥的藥物中的應(yīng)用。
[0139]優(yōu)選地，所述應(yīng)用為多聚體白蛋白納米球或多聚體白蛋白納米球的制備方法在制備腫瘤光動(dòng)力治療藥物、腫瘤光熱治療藥物、熒光成像探針和光聲成像探針中的應(yīng)用。
[0140]如本文所用的，“癌癥”包括腫瘤。
[0141]本發(fā)明所述多聚體白蛋白納米球的應(yīng)用具有以下有益效果:利用Ce6光動(dòng)力治療腫瘤后產(chǎn)生的急性炎癥能促使多聚體白蛋白納米球在腫瘤部位進(jìn)一步的富集，有助于ICG發(fā)揮光熱和光動(dòng)力的同時(shí)治療，大大抑制了腫瘤的生長。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0142]圖1為本發(fā)明實(shí)施例一制得的多聚體白蛋白納米球的掃描電子顯微鏡圖像；
[0143]圖2為本發(fā)明實(shí)施例一制得的多聚體白蛋白納米球的透射電鏡圖像；
[0144]圖3為本發(fā)明實(shí)施例一制得的多聚體白蛋白納米球在不同溶劑中的稀釋實(shí)驗(yàn)；
[0145]圖4為本發(fā)明實(shí)施例一制得的多聚體白蛋白納米球在還原型條件下溶解實(shí)驗(yàn)；
[0146]圖5為本發(fā)明實(shí)施例八制得的多聚體白蛋白納米球的掃描電子顯微鏡圖像；
[0147]圖6為本發(fā)明實(shí)施例八制得的多聚體白蛋白納米球注射入荷瘤裸鼠后的熒光成像圖；
[0148]圖7為本發(fā)明實(shí)施例八制得的多聚體白蛋白納米球注射入荷瘤裸鼠后的光聲成像圖；
[0149]圖8為本發(fā)明實(shí)施例九制得的多聚體白蛋白納米球用于荷瘤裸鼠光動(dòng)力實(shí)驗(yàn)的腫瘤生長曲線。

【具體實(shí)施方式】
[0150]以下所述是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0151]實(shí)施例一
[0152]一種多聚體白蛋白納米球的制備方法，包括以下步驟:
[0153](I)取ImL體積質(zhì)量濃度為0.01(w/v, mg/mL)的卩引哚青綠的二甲基亞砜溶液和ImL體積質(zhì)量濃度為0.02 (w/V,mg/mL)的牛血清白蛋白混合,得到白蛋白混合液,然后采用0.lmol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)所述白蛋白混合液的pH值到7 ；
[0154](2)向步驟⑴所得的所述pH值為7的白蛋白混合液中加入谷胱甘肽得反應(yīng)液，然后在o°c下輕輕搖動(dòng)反應(yīng)I小時(shí)，在所述反應(yīng)液中，所述谷胱甘肽的摩爾數(shù)為白蛋白摩爾數(shù)的10倍；
[0155](3)將步驟(2)反應(yīng)后的溶液在(TC的條件下進(jìn)行超聲，超聲功率為100KW，同時(shí)在所述進(jìn)行超聲的溶液中以1000mL/S的速度注入的4mL無水乙醇得到微乳溶液，所述微乳溶液在O°C的條件下反應(yīng)5min后，得到含多聚體白蛋白納米球的懸濁液；
[0156](4)將步驟(3)所得的含多聚體白蛋白納米球的懸濁液移入透析袋，保持溫度為(TC的條件下，將透析袋置于5L pH為10的PBS緩沖液內(nèi)透析10小時(shí)，期間每12個(gè)小時(shí)換液I次，每次都采用5L pH為10的PBS緩沖液，然后再將透析袋置于5L雙蒸水內(nèi)透析I小時(shí)，得到多聚體白蛋白納米球溶液；
[0157](5)將步驟(4)所得的多聚體白蛋白納米球溶液置于負(fù)20°C下預(yù)凍2小時(shí)后轉(zhuǎn)移至負(fù)80°C下冷凍12小時(shí)，然后在冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥12小時(shí)，得到多聚體白蛋白納米球，所述多聚體白蛋白納米球包括含巰基和/或二硫鍵的白蛋白分子，所述白蛋白分子之間通過二硫鍵相互連接，所述多聚體白蛋白納米球的粒徑為10?lOOnm。
[0158]為充分說明本發(fā)明實(shí)施例制備的多聚體白蛋白納米球的有益效果，本實(shí)施例還提供了該多聚體白蛋白納米球的掃描電子顯微鏡圖像，如圖1所示，圖1為本發(fā)明實(shí)施例一制得的多聚體白蛋白納米球的掃描電子顯微鏡圖像，由該圖像可知，本實(shí)施例制備的多聚體白蛋白納米球尺寸均一，顆粒較為分散。
[0159]本實(shí)施例還提供了該多聚體白蛋白納米球的透射電鏡(TEM)圖像，如圖2所示，圖2為本發(fā)明實(shí)施例一制得的多聚體白蛋白納米球的透射電鏡圖像，由該圖像可知，本實(shí)施例制備的多聚體白蛋白納米球的粒徑為10?100nm，尺寸均一，顆粒較為分散。
[0160]此外，本實(shí)施例還提供了該多聚體白蛋白納米球在不同溶劑中的稀釋實(shí)驗(yàn)，具體操作為:將該多聚體白蛋白納米球溶液分別溶解在磷酸鹽緩沖液(pH為7.4)、血清(pH為
7.4)和細(xì)胞培養(yǎng)基(pH為7.4)中，隨后在不同的時(shí)間點(diǎn)取樣觀察該多聚體白蛋白納米球的粒徑，結(jié)果如圖3所示。
[0161]圖3為本發(fā)明實(shí)施例一制得的多聚體白蛋白納米球在不同溶劑中的稀釋實(shí)驗(yàn)，由圖3可知:該多聚體白蛋白納米球在磷酸鹽緩沖液、血清和細(xì)胞培養(yǎng)基中的粒徑隨時(shí)間變化不明顯，即本發(fā)明提供的多聚體白蛋白納米球能在接近生理?xiàng)l件下的稀釋實(shí)驗(yàn)中穩(wěn)定存在，具有醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景。
[0162]其次，本實(shí)施例還提供了該多聚體白蛋白納米球在還原型條件下的溶解實(shí)驗(yàn)，具體操作為:將該多聚體白蛋白納米球溶液分別溶解在濃度為20mM的二硫蘇糖醇，2小時(shí)，8小時(shí)和24小時(shí)后，分別跑SDS-PAGE電泳，檢測該多聚體白蛋白納米球在還原型條件下的溶解規(guī)律，其中，a、b、c泳道分別對應(yīng)多聚體白蛋白納米球在還原2小時(shí)、8小時(shí)、24小時(shí)后的樣品，d泳道為白蛋白單體分子的對照，結(jié)果如圖4所示。
[0163]圖4為本發(fā)明實(shí)施例一制得的多聚體白蛋白納米球在還原型條件下溶解實(shí)驗(yàn)，由圖4可知，框I中的條帶為本實(shí)施例制備的多聚體白蛋白納米球，框2中的條帶為組成該多聚體白蛋白納米球的白蛋白低聚物的條帶，框3中的條帶為組成該多聚體白蛋白納米球的白蛋白二聚體和三聚體的條帶，框4中的條帶為組成該多聚體白蛋白納米球的白蛋白單分子的條帶；該結(jié)果顯示，即白蛋白二聚體和三聚體對應(yīng)的框3中的條帶濃度隨還原時(shí)間的延長而升高，此外，蛋白質(zhì)單體對應(yīng)的框4中的條帶濃度隨還原時(shí)間的延長也有明顯的提高；即本實(shí)施例提供的該多聚體白蛋白納米球可以在還原劑存在的條件下溶解，并隨還原時(shí)間的延長，其二硫鍵被還原的程度越高，因此，當(dāng)采用該多聚體白蛋白納米球進(jìn)行藥物投遞時(shí)，可以被細(xì)胞中的還原性谷胱甘肽等還原性物質(zhì)降解，從而釋放藥物。
[0164]實(shí)施例二
[0165]一種多聚體白蛋白納米球的制備方法，包括以下步驟:
[0166](I)取0.1mL體積質(zhì)量濃度為0.1 (w/v, mg/mL)阿霉素的二甲基亞砜溶液和2mL體積質(zhì)量濃度為300 (w/v,mg/mL)的豬血清白蛋白混合,得到白蛋白混合液,然后采用lmol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)所述白蛋白混合液的pH值到7 ；
[0167](2)向步驟⑴所得的所述pH值為7的白蛋白混合液中加入二硫蘇糖醇得反應(yīng)液，然后在60°C下輕輕搖動(dòng)反應(yīng)0.05小時(shí)，在所述反應(yīng)液中，所述二硫蘇糖醇的摩爾數(shù)為白蛋白摩爾數(shù)的5000倍；
[0168](3)將步驟(2)反應(yīng)后的溶液在60°C的條件下進(jìn)行超聲，超聲功率為1KW，同時(shí)在所述進(jìn)行超聲的溶液中以0.01ml/s的速度注入的200mL含氯仿的乙醇溶液(氯仿和乙醇的體積比為1:9)得到微乳溶液，所述微乳溶液在60°C的條件下反應(yīng)20min后，靜置待微乳溶液分層后除去有機(jī)相，得到含多聚體白蛋白納米球的懸濁液；
[0169](4)將步驟(3)所得的含多聚體白蛋白納米球的懸濁液移入透析袋，保持溫度為30°C的條件下，將透析袋置于IL pH為7的PBS緩沖液內(nèi)透析300小時(shí)，期間每12個(gè)小時(shí)換液I次，每次都采用IL pH為7的PBS緩沖液，然后再將透析袋置于5L雙蒸水內(nèi)透析24小時(shí)，得到多聚體白蛋白納米球溶液；
[0170](5)將步驟(4)所得的多聚體白蛋白納米球溶液置于0°C下預(yù)凍I小時(shí)后轉(zhuǎn)移至負(fù)20°C下冷凍2小時(shí)，然后在冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥72小時(shí)，得到多聚體白蛋白納米球，所述多聚體白蛋白納米球包括含巰基和/或二硫鍵的白蛋白分子，所述白蛋白分子之間通過二硫鍵相互連接，所述多聚體白蛋白納米球的粒徑為900?lOOOnm。
[0171]實(shí)施例三
[0172]一種多聚體白蛋白納米球的制備方法，包括以下步驟:
[0173](I)取0.5mL體積質(zhì)量濃度為0.5 (w/v, mg/mL)美籃的水溶液和1.5mL200 (w/v,mg/mL)的重組血清白蛋白混合,得到白蛋白混合液,然后采用2mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)所述白蛋白混合液的pH值到12 ；
[0174](2)向步驟⑴所得的所述pH值為12的白蛋白混合液中加入巰基乙醇得反應(yīng)液，然后在30°C下輕輕搖動(dòng)反應(yīng)12小時(shí)，在所述反應(yīng)液中，所述β -巰基乙醇的摩爾數(shù)為白蛋白摩爾數(shù)的100倍；
[0175](3)將步驟(2)反應(yīng)后的溶液在30°C的條件下進(jìn)行超聲，超聲功率為100KW，同時(shí)在所述進(jìn)行超聲的溶液中以lOOOml/s的速度注入的10mL含氯仿的乙醇溶液(氯仿和乙醇的體積比為1:9)得到微乳溶液，所述微乳溶液在30°C的條件下反應(yīng)240min后，靜置待微乳溶液分層后除去有機(jī)相，得到含多聚體白蛋白納米球的懸濁液；
[0176](4)將步驟(3)所得的含多聚體白蛋白納米球的懸濁液移入透析袋，保持溫度為60°C的條件下，將透析袋置于IL pH為12的PBS緩沖液內(nèi)透析144小時(shí)，每次都采用IL pH為12的PBS緩沖液，期間每12個(gè)小時(shí)換液I次，然后再將透析袋置于5L雙蒸水內(nèi)透析12小時(shí)，得到多聚體白蛋白納米球溶液；
[0177](5)將步驟(4)所得的多聚體白蛋白納米球溶液置于負(fù)4°C下預(yù)凍48小時(shí)后轉(zhuǎn)移至負(fù)50°C下冷凍48小時(shí)，然后在冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥96小時(shí)，得到多聚體白蛋白納米球，所述多聚體白蛋白納米球包括含巰基和/或二硫鍵的白蛋白分子，所述白蛋白分子之間通過二硫鍵相互連接，所述多聚體白蛋白納米球的粒徑為100?200nm。
[0178]實(shí)施例四
[0179]一種多聚體白蛋白納米球的制備方法，包括以下步驟:
[0180](I)取ImL體積質(zhì)量濃度為I (w/v，mg/mL) 二氫卟吩e6溶液的二甲基亞砜溶液和lmL300 (w/v, mg/mL)的血紅蛋白溶液混合,得到白蛋白混合液,然后采用0.5mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)所述白蛋白混合的PH值到9 ；
[0181](2)向步驟⑴所得的所述pH值為9的白蛋白混合液中加入谷胱甘肽得反應(yīng)液，然后在60°C下輕輕搖動(dòng)反應(yīng)0.05小時(shí)，在所述反應(yīng)液中，所述谷胱甘肽的摩爾數(shù)為白蛋白摩爾數(shù)的2500倍；
[0182](3)將步驟(2)反應(yīng)后的溶液在60°C的條件下進(jìn)行超聲，超聲功率為10KW，同時(shí)在所述進(jìn)行超聲的溶液中以50ml/s的速度注入的22mL乙醇溶液得到微乳溶液，所述微乳溶液在60°C的條件下反應(yīng)30min后，得到含多聚體白蛋白納米球的懸濁液；
[0183](4)將步驟(3)所得的含多聚體白蛋白納米球的懸濁液移入透析袋，保持溫度為60°C的條件下，將透析袋置于IL pH為9的PBS緩沖液內(nèi)透析36小時(shí)，期間每12個(gè)小時(shí)換液I次，每次都采用IL pH為9的PBS緩沖液，然后再將透析袋置于5L雙蒸水內(nèi)透析18小時(shí)，得到多聚體白蛋白納米球溶液；
[0184](5)將步驟(4)所得的多聚體白蛋白納米球溶液置于負(fù)10°C下預(yù)凍24小時(shí)后轉(zhuǎn)移至負(fù)80°C下冷凍24小時(shí)，然后在冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥120小時(shí)，得到多聚體白蛋白納米球，所述多聚體白蛋白納米球包括含巰基和/或二硫鍵的白蛋白分子，所述白蛋白分子之間通過二硫鍵相互連接，所述多聚體白蛋白納米球的粒徑為600?700nm。
[0185]實(shí)施例五
[0186]一種多聚體白蛋白納米球的制備方法，包括以下步驟:
[0187](I)取2mL體積質(zhì)量濃度為0.01(w/v，mg/mL)的豬血清白蛋白溶液，然后采用lmol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)所述白蛋白混合液的pH值到7 ；
[0188](2)向步驟⑴所得的所述pH值為7的白蛋白混合液中加入半胱氨酸得反應(yīng)液，然后在60°C下輕輕搖動(dòng)反應(yīng)0.05小時(shí)，在所述反應(yīng)液中，所述半胱氨酸的摩爾數(shù)為白蛋白摩爾數(shù)的10倍；
[0189](3)將步驟(2)反應(yīng)后的溶液在60°C的條件下進(jìn)行超聲，超聲功率為1KW，同時(shí)在所述進(jìn)行超聲的溶液中以50ml/s的速度注入的4mL乙醇溶液得到微乳溶液，所述微乳溶液在60°C的條件下反應(yīng)20min后，得到含多聚體白蛋白納米球的懸濁液；
[0190](4)將步驟(3)所得的含多聚體白蛋白納米球的懸濁液移入透析袋，保持溫度為30°C的條件下，將透析袋置于IL pH為7的PBS緩沖液內(nèi)透析10小時(shí)，期間每12個(gè)小時(shí)換液I次，每次都采用IL pH為7的PBS緩沖液，然后再將透析袋置于5L雙蒸水內(nèi)透析I小時(shí)，得到多聚體白蛋白納米球溶液；
[0191](5)將步驟(4)所得的多聚體白蛋白納米球溶液置于0°C下預(yù)凍I小時(shí)后轉(zhuǎn)移至負(fù)20°C下冷凍2小時(shí)，然后在冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥12小時(shí)，得到多聚體白蛋白納米球，所述多聚體白蛋白納米球包括含巰基和/或二硫鍵的白蛋白分子，所述白蛋白分子之間通過二硫鍵相互連接，所述多聚體白蛋白納米球的粒徑為700?800nm。
[0192]實(shí)施例六
[0193]一種多聚體白蛋白納米球的制備方法，包括以下步驟:
[0194](I)取2mL300(w/v，mg/mL)的重組血清白蛋白溶液，然后采用2mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)所述白蛋白混合液的PH值到12 ；
[0195](2)向步驟⑴所得的所述pH值為12的白蛋白混合液中加入二硫蘇糖醇得反應(yīng)液，然后在30°C下輕輕搖動(dòng)反應(yīng)12小時(shí)，在所述反應(yīng)液中，所述二硫蘇糖醇的摩爾數(shù)為白蛋白摩爾數(shù)的5000倍；
[0196](3)將步驟(2)反應(yīng)后的溶液在30°C的條件下進(jìn)行超聲，超聲功率為100KW，同時(shí)在所述進(jìn)行超聲的溶液中以lOOOml/s的速度注入的200mL乙醇溶液得到微乳溶液，所述微乳溶液在30°C的條件下反應(yīng)240min后，得到含多聚體白蛋白納米球的懸濁液；
[0197](4)將步驟(3)所得的含多聚體白蛋白納米球的懸濁液移入透析袋，保持溫度為60°C的條件下，將透析袋置于IL pH為12的PBS緩沖液內(nèi)透析300小時(shí)，每次都采用IL pH為12的PBS緩沖液，期間每12個(gè)小時(shí)換液I次，然后再將透析袋置于5L雙蒸水內(nèi)透析24小時(shí)，得到多聚體白蛋白納米球溶液；
[0198](5)將步驟(4)所得的多聚體白蛋白納米球溶液置于負(fù)4°C下預(yù)凍48小時(shí)后轉(zhuǎn)移至負(fù)80°C下冷凍36小時(shí)，然后在冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥96小時(shí)，得到多聚體白蛋白納米球，所述多聚體白蛋白納米球包括含巰基和/或二硫鍵的白蛋白分子，所述白蛋白分子之間通過二硫鍵相互連接，所述多聚體白蛋白納米球的粒徑為10?lOOnm。
[0199]實(shí)施例七
[0200]一種多聚體白蛋白納米球的制備方法，包括以下步驟:
[0201](I)取2mL150(w/v，mg/mL)的白蛋白溶液，然后采用2mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)所述白蛋白混合液的PH值到9 ；
[0202](2)向步驟⑴所得的所述pH值為9的白蛋白混合液中加入β -巰基乙醇得反應(yīng)液，然后在0°c下輕輕搖動(dòng)反應(yīng)17小時(shí)，在所述反應(yīng)液中，所述β-巰基乙醇的摩爾數(shù)為白蛋白摩爾數(shù)的2500倍；
[0203](3)將步驟⑵反應(yīng)后的溶液在O°C的條件下進(jìn)行超聲，超聲功率為10KW，同時(shí)在所述進(jìn)行超聲的溶液中以0.01ml/s的速度注入的10mL乙醇溶液得到微乳溶液，所述微乳溶液在O°C的條件下反應(yīng)5min后，得到含多聚體白蛋白納米球的懸濁液；
[0204](4)將步驟(3)所得的含多聚體白蛋白納米球的懸濁液移入透析袋，保持溫度為(TC的條件下，將透析袋置于IL pH為9的PBS緩沖液內(nèi)透析144小時(shí)，每次都采用IL pH為12的PBS緩沖液，期間每12個(gè)小時(shí)換液I次，然后再將透析袋置于5L雙蒸水內(nèi)透析12小時(shí)，得到多聚體白蛋白納米球溶液；
[0205](5)將步驟(4)所得的多聚體白蛋白納米球溶液置于負(fù)20°C下預(yù)凍24小時(shí)后轉(zhuǎn)移至負(fù)50°C下冷凍48小時(shí)，然后在冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥120小時(shí)，得到多聚體白蛋白納米球，所述多聚體白蛋白納米球包括含巰基和/或二硫鍵的白蛋白分子，所述白蛋白分子之間通過二硫鍵相互連接，所述多聚體白蛋白納米球的粒徑為700?900nm。
[0206]對比實(shí)施例一
[0207]一種多聚體白蛋白納米球的制備方法，包括以下步驟:
[0208](I)取2mL0.01 (w/v, mg/mL)的牛血清白蛋白溶液；
[0209](2)向步驟(I)所得的牛血清白蛋白水溶液中加入半胱氨酸得反應(yīng)液，然后在60°C下輕輕搖動(dòng)反應(yīng)0.05小時(shí)，在所述反應(yīng)液中，所述半胱氨酸的摩爾數(shù)為白蛋白摩爾數(shù)的10倍；
[0210](3)在所述步驟(2)所得的溶液中加入1mL無水乙醇溶液得到微乳溶液，所述微乳溶液在0°c的條件下反應(yīng)1min后，得到含多聚體白蛋白納米球的懸濁液；
[0211](4)將步驟(3)所得的含多聚體白蛋白納米球的懸濁液移入透析袋，保持溫度為25°C的條件下，將透析袋置于5L雙蒸水內(nèi)透析12小時(shí)，得到多聚體白蛋白納米球溶液；
[0212](5)將步驟(4)所得的多聚體白蛋白納米球溶液置于負(fù)20°C下預(yù)凍2小時(shí)后轉(zhuǎn)移至負(fù)80°C下冷凍24小時(shí)，然后在冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥48小時(shí)，得到多聚體白蛋白納米球，所述多聚體白蛋白納米球包括含巰基和/或二硫鍵的白蛋白分子，所述白蛋白分子之間通過二硫鍵相互連接，所述多聚體白蛋白納米球的粒徑為10?600nm。
[0213]對比實(shí)施例二
[0214]一種多聚體白蛋白納米球的制備方法，包括以下步驟:
[0215](I)取ImL體積質(zhì)量濃度為I (w/v, mg/mL)的卩引哚青綠和lmL300(w/v, mg/mL)的牛血清白蛋白混合，得到白蛋白混合液；
[0216](2)向步驟(I)所得的白蛋白混合液中加入谷胱甘肽得反應(yīng)液，然后在60°C下輕輕搖動(dòng)反應(yīng)0.05小時(shí)，在所述反應(yīng)液中，所述谷胱甘肽的摩爾數(shù)為白蛋白摩爾數(shù)的5000倍;
[0217](3)在所述步驟(2)所得的溶液中加入1mL無水乙醇溶液得到微乳溶液，所述微乳溶液在0°c的條件下反應(yīng)1min后，得到含多聚體白蛋白納米球的懸濁液；
[0218](4)將步驟(3)所得的含多聚體白蛋白納米球的懸濁液移入透析袋，保持溫度為25°C的條件下，將透析袋置于5L雙蒸水內(nèi)透析12小時(shí)，得到多聚體白蛋白納米球溶液；
[0219](5)將步驟(4)所得的多聚體白蛋白納米球溶液置于負(fù)20°C下預(yù)凍2小時(shí)后轉(zhuǎn)移至負(fù)80°C下冷凍24小時(shí)，然后在冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥48小時(shí)，得到多聚體白蛋白納米球，所述多聚體白蛋白納米球包括含巰基和/或二硫鍵的白蛋白分子，所述白蛋白分子之間通過二硫鍵相互連接，所述多聚體白蛋白納米球的粒徑為100?lOOOnm。
[0220]相對于本發(fā)明實(shí)施例提供的多聚體白蛋白納米球，對比實(shí)施例1和對比實(shí)施例2提供的多聚體白蛋白納米球粒徑分布集中度不高，不利于其在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用。
[0221]實(shí)施例八
[0222]一種多聚體白蛋白納米球的制備方法，包括以下步驟:
[0223](I)取體積質(zhì)量濃度為50mg/mL(w/v)的牛血清白蛋白水溶液，然后采用0.lmol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)所述白蛋白水溶液的pH值到7 ；
[0224](2)向步驟⑴所得的所述pH值為7的白蛋白水溶液中加入谷胱甘肽得反應(yīng)液，然后在4°C下輕輕搖動(dòng)反應(yīng)2小時(shí)，在所述反應(yīng)液中，所述谷胱甘肽的摩爾數(shù)為白蛋白摩爾數(shù)的10倍；
[0225](3)將步驟⑵反應(yīng)后的溶液在4°C的條件下進(jìn)行超聲，超聲功率為100KW，同時(shí)在所述進(jìn)行超聲的溶液中以1000mL/S的速度注入乙醇溶液，該乙醇溶液中含二甲基亞砜、濃度為lmg/mL的二氫卟吩e6和濃度為0.lmg/mL的ICG，二甲基亞砜的體積和乙醇溶液中溶劑乙醇的體積比為1:9，得到微乳溶液，該微乳溶液在4°C的條件下反應(yīng)1min后得到含多聚體白蛋白納米球的懸濁液；乙醇溶液加入的體積為所述步驟(2)反應(yīng)后的溶液體積的2倍；
[0226](4)將步驟(3)所得的含多聚體白蛋白納米球的懸濁液移入透析袋，保持溫度為40C的條件下，將透析袋置于IL pH為9的PBS緩沖液內(nèi)透析24小時(shí)，期間每8個(gè)小時(shí)換液I次，每次都采用IL pH為9的PBS緩沖液，然后再將透析袋置于IL雙蒸水內(nèi)透析12小時(shí)，得到多聚體白蛋白納米球溶液；
[0227](5)將步驟(4)所得的多聚體白蛋白納米球溶液置于負(fù)20°C下預(yù)凍2小時(shí)后轉(zhuǎn)移至負(fù)80°C下冷凍24小時(shí)，然后在冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥48小時(shí)，得到多聚體白蛋白納米球，所述多聚體白蛋白納米球中包載有目標(biāo)投遞物；所述目標(biāo)投遞物包括二氫卟吩e6和ICG，多聚體白蛋白包括含巰基和/或二硫鍵的白蛋白分子，白蛋白之間通過二硫鍵相互連接，多聚體白蛋白納米球的粒徑為60?200nm。
[0228]圖5為實(shí)施例8所得到的多聚體白蛋白納米球的掃描電鏡圖，從圖中可以看出，多聚體白蛋白納米球的粒徑范圍為60nm?200nm,粒徑較小且納米粒子分散性良好。
[0229]實(shí)施例九
[0230]一種多聚體白蛋白納米球的制備方法，包括以下步驟:
[0231](I)取濃度為200mg/mL(W/v)的豬血清白蛋白水溶液，然后采用lOmol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)所述白蛋白混合液的PH值到12 ；
[0232](2)向步驟⑴所得的所述pH值為12的白蛋白混合液中加入二硫蘇糖醇得反應(yīng)液，然后在60°C下輕輕搖動(dòng)反應(yīng)240小時(shí)，在所述反應(yīng)液中，所述二硫蘇糖醇的摩爾數(shù)為白蛋白摩爾數(shù)的5000倍；
[0233](3)將步驟⑵反應(yīng)后的溶液在60°C的條件下進(jìn)行超聲，超聲功率為1KW，同時(shí)在所述進(jìn)行超聲的溶液中以lOOOml/s的速度注入乙醇溶液，乙醇溶液中含二甲基亞砜、體積質(zhì)量濃度為2.5mg/mL的二氫卟吩e6和體積質(zhì)量濃度為5mg/mL的ICG，二甲基亞砜和乙醇溶液中的溶劑乙醇的體積比為1:9，得到微乳溶液，所述微乳溶液在60°C的條件下反應(yīng)5min后，得到含多聚體白蛋白納米球的懸濁液；乙醇溶液加入的體積為所述步驟(2)反應(yīng)后的溶液體積的2倍；
[0234](4)將步驟(3)所得的含多聚體白蛋白納米球的懸濁液移入透析袋，室溫下，將透析袋置于5L pH為12的PBS緩沖液內(nèi)透析300小時(shí)，期間每12個(gè)小時(shí)換液I次，每次都采用5L pH為12的PBS緩沖液，然后再將透析袋置于5L雙蒸水內(nèi)透析12小時(shí)，得到多聚體白蛋白納米球溶液；
[0235](5)將步驟(4)所得的多聚體白蛋白納米球溶液置于0°C下預(yù)凍I小時(shí)后轉(zhuǎn)移至負(fù)20°C下冷凍2小時(shí)，然后在冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥72小時(shí)，得到多聚體白蛋白納米球，所述多聚體白蛋白納米球中包載有目標(biāo)投遞物；所述目標(biāo)投遞物包括二氫卟吩e6和ICG,多聚體白蛋白包括含巰基和/或二硫鍵的白蛋白分子，白蛋白分子之間通過二硫鍵相互連接，多聚體白蛋白納米球的粒徑為400?500nm。
[0236]實(shí)施例十
[0237]一種多聚體白蛋白納米球的制備方法，包括以下步驟:
[0238](I)取白蛋白混合液，白蛋白混合液含有濃度為100mg/mL (w/v)的豬血清白蛋白和濃度為5mg/mL的ICG，然后采用0.lmol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)所述白蛋白水溶液的pH值到9 ；
[0239](2)向步驟⑴所得的所述pH值為9的白蛋白混合液中加入β -巰基乙醇得反應(yīng)液，然后在30°C下輕輕搖動(dòng)反應(yīng)0.05小時(shí)，在所述反應(yīng)液中，所述β-巰基乙醇的摩爾數(shù)為白蛋白摩爾數(shù)的100倍；
[0240](3)將步驟(2)反應(yīng)后的溶液在30°C的條件下進(jìn)行超聲，超聲功率為50KW，同時(shí)在所述進(jìn)行超聲的溶液中以0.01ml/s的速度注入乙醇溶液，乙醇溶液中含二甲基亞砜和體積質(zhì)量濃度為0.lmg/mL的二氫卟吩e6，二甲基亞砜和乙醇溶液中的溶劑乙醇的體積比為1: 9，得到微乳溶液，所述微乳溶液在30°C的條件下反應(yīng)240min后，得到含多聚體白蛋白納米球的懸濁液；乙醇溶液加入的體積為步驟(2)反應(yīng)后的溶液體積的50倍；
[0241](4)將步驟(3)所得的含多聚體白蛋白納米球的懸濁液移入透析袋，保持溫度為600C的條件下，將透析袋置于10mL pH為7的PBS緩沖液內(nèi)透析2小時(shí)，每次都采用10mLpH為7的PBS緩沖液，期間每I個(gè)小時(shí)換液I次，然后再將透析袋置于10mL雙蒸水內(nèi)透析12小時(shí)，得到多聚體白蛋白納米球溶液；
[0242](5)將步驟(4)所得的多聚體白蛋白納米球溶液置于負(fù)4°C下預(yù)凍48小時(shí)后轉(zhuǎn)移至負(fù)50°C下冷凍48小時(shí)，然后在冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥96小時(shí)，得到多聚體白蛋白納米球，所述多聚體白蛋白納米球中包載有目標(biāo)投遞物；所述目標(biāo)投遞物包括二氫卟吩e6和ICG，多聚體白蛋白包括含巰基和/或二硫鍵的白蛋白分子，白蛋白分子之間通過二硫鍵相互連接，多聚體白蛋白納米球的粒徑為200?300nm。
[0243]實(shí)施例^^一
[0244](I)取白蛋白混合液，白蛋白混合液含有濃度為100mg/mL(w/v)的豬血清白蛋白、濃度為0.lmg/mL的ICG、濃度為5mg/mL的二氫P卜吩和二甲基亞砜,二甲基亞砜和白蛋白混合液中溶劑水的體積比是0.1: 1，然后采用0.lmol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)混合液的pH值到9 ；
[0245](2)向步驟(I)混合液中加入谷胱甘肽得反應(yīng)液，然后在30°C下輕輕搖動(dòng)反應(yīng)I小時(shí)，在反應(yīng)液中，谷胱甘肽的摩爾數(shù)為白蛋白摩爾數(shù)的10倍；
[0246](3)將步驟(2)反應(yīng)后的溶液在4°C的條件下進(jìn)行超聲，超聲功率為100KW，同時(shí)將進(jìn)行超聲的溶液中以100mL/S的速度注入到無水乙醇中，得到微乳溶液，所述微乳溶液在4°C的條件下反應(yīng)1min后，得到含多聚體白蛋白納米球的懸濁液；無水乙醇加入的體積為步驟(2)反應(yīng)后的溶液體積的50倍；
[0247](4)將步驟(3)所得的含多聚體白蛋白納米球的懸濁液移入透析袋，保持溫度為(TC的條件下，將透析袋置于10mL pH為7的PBS緩沖液內(nèi)透析2小時(shí)，期間每I個(gè)小時(shí)換液I次，每次都采用10mL pH為7的PBS緩沖液，然后再將透析袋置于10mL雙蒸水內(nèi)透析12小時(shí)，得到多聚體白蛋白納米球溶液；
[0248](5)將步驟(4)所得的多聚體白蛋白納米球溶液置于負(fù)20°C下預(yù)凍2小時(shí)后轉(zhuǎn)移至負(fù)80°C下冷凍24小時(shí)，然后在冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥48小時(shí)，得到多聚體白蛋白納米球，所述多聚體白蛋白納米球中包載有目標(biāo)投遞物；所述目標(biāo)投遞物包括二氫卟吩e6和ICG，多聚體白蛋白包括含巰基和/或二硫鍵的白蛋白分子，白蛋白分子之間通過二硫鍵相互連接，多聚體白蛋白納米球的粒徑為100?200nm。
[0249]實(shí)施例十二
[0250](I)取白蛋白混合液，白蛋白混合液含有濃度為100mg/mL(w/v)的豬血清白蛋白、濃度為lmg/mL的二氫卟吩和二甲基亞砜，二甲基亞砜和白蛋白混合液中溶劑水的體積比是0.1: 1，然后采用0.lmol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)混合液的pH值到9 ；
[0251](2)向步驟(I)所得混合液中加入谷胱甘肽得反應(yīng)液，然后在30°C下輕輕搖動(dòng)反應(yīng)I小時(shí)，在所述反應(yīng)液中，所述谷胱甘肽的摩爾數(shù)為白蛋白摩爾數(shù)的10倍；
[0252](3)將步驟(2)反應(yīng)后的溶液在O°C的條件下進(jìn)行超聲，超聲功率為50KW，同時(shí)將進(jìn)行超聲的溶液中以0.01mL/s的速度注入到乙醇溶液中，該乙醇溶液含體積質(zhì)量濃度為lmg/mL的ICG，得到微乳溶液，所述微乳溶液在(TC的條件下反應(yīng)1min后，得到含多聚體白蛋白納米球的懸濁液；乙醇溶液加入的體積為步驟(2)反應(yīng)后的溶液體積的20倍；
[0253](4)將步驟(3)所得的含多聚體白蛋白納米球的懸濁液移入透析袋，保持溫度為(TC的條件下，將透析袋置于10mL pH為7的PBS緩沖液內(nèi)透析2小時(shí)，期間每I個(gè)小時(shí)換液I次，每次都采用10mL pH為7的PBS緩沖液，然后再將透析袋置于10mL雙蒸水內(nèi)透析12小時(shí)，得到多聚體白蛋白納米球溶液；
[0254](5)將步驟(4)所得的多聚體白蛋白納米球溶液置于負(fù)20°C下預(yù)凍2小時(shí)后轉(zhuǎn)移至負(fù)80°C下冷凍24小時(shí)，然后在冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥48小時(shí)，得到多聚體白蛋白納米球，所述多聚體白蛋白納米球中包載有目標(biāo)投遞物；所述目標(biāo)投遞物包括二氫卟吩e6和ICG，多聚體白蛋白包括含巰基和/或二硫鍵的白蛋白分子，白蛋白分子之間通過二硫鍵相互連接，多聚體白蛋白納米球的粒徑為300?400nm。
[0255]應(yīng)用實(shí)施例
[0256]為了驗(yàn)證本發(fā)明實(shí)施例提供的多聚體白蛋白納米球在制備預(yù)防、治療或診斷癌癥的藥物中的應(yīng)用效果，本應(yīng)用研究了多聚體白蛋白納米球在小鼠體內(nèi)的傳輸過程及對乳腺癌腫瘤組織識(shí)別的特異性和靈敏度，并設(shè)置不同的實(shí)驗(yàn)組驗(yàn)證實(shí)施例提供的多聚體白蛋白納米球抑制腫瘤生長的效果，結(jié)果見圖6、圖7和圖8。
[0257]以MCF-7荷瘤小鼠為模型，設(shè)置三個(gè)實(shí)驗(yàn)組，第一組不注射多聚體白蛋白納米球，第二組(小鼠的左側(cè)腫瘤部位)通過尾靜脈注射多聚體白蛋白納米球水溶液0.02mg/ml,但不進(jìn)行激光照射，第三組(小鼠的右側(cè)腫瘤部位)通過尾靜脈注射多聚體白蛋白納米球并進(jìn)行相應(yīng)的激光照射。利用熒光活體成像系統(tǒng)(型號(hào)MaeStr0TM2MaeStr0TM EX-RR0，公司為美國CRi Maestro?)和光聲成像平臺(tái)(光源為可調(diào)諧光學(xué)參量振蕩器，波長范圍從400nm-2500nm,型號(hào) Vibrant355II HE, Opotek, Carlsbad, USA,光源脈沖重復(fù)頻率 1Hz,脈寬5ns ;超聲探頭中心頻率1MHz,型號(hào)V315, Panametrics, Waltham, US)研究多聚體白蛋白納米球在小鼠體內(nèi)的傳輸過程及對乳腺癌腫瘤組織識(shí)別的特異性和靈敏度。
[0258]圖6和圖7分別為實(shí)施例8制得的多聚體白蛋白納米球用于荷瘤裸鼠和腫瘤組織的熒光和光聲成像圖，圖6中a沒有注射多聚體白蛋白納米球，圖6中b為注射多聚體白蛋白納米球Ih后采用660nm的激光照射產(chǎn)生的熒光成像圖、c為660nm的激光照射24后產(chǎn)生的熒光成像圖，d為在c的基礎(chǔ)上換用808nm的激光照射5min后產(chǎn)生的熒光成像圖，左側(cè)腫瘤部位沒有進(jìn)行激光照射，從圖6中可以看出，小鼠左側(cè)腫瘤部位熒光信號(hào)慢慢增強(qiáng)，右側(cè)腫瘤660nm光動(dòng)力治療后熒光信號(hào)比左側(cè)變得更強(qiáng)，這是因?yàn)樽⑸銲h后采用660nm的激光對右側(cè)腫瘤進(jìn)行照射，Ce6進(jìn)行光動(dòng)力治療會(huì)使腫瘤部位產(chǎn)生炎癥，照射24h后多聚體白蛋白納米球在炎癥腫瘤部位的富集量增加，再采用808nm的激光照射，ICG對炎癥腫瘤進(jìn)行光光動(dòng)力和光熱同時(shí)治療，治療5min后右側(cè)腫瘤相對于左側(cè)腫瘤的熒光明顯減弱，說明腫瘤部位的ICG在808nm光熱治療的時(shí)候由于產(chǎn)生了大量的熱量已經(jīng)基本分解。光動(dòng)力治療腫瘤后產(chǎn)生的急性炎癥能促使以白蛋白為載體的光學(xué)試劑在腫瘤部位進(jìn)一步的富集，提高了多聚體白蛋白納米球的靶向性，最終提高了多聚體白蛋白納米球的治療效果。
[0259]圖7中左圖為注射實(shí)施例8制得的多聚體白蛋白納米球前的腫瘤組織的光聲成像圖，右圖為注射多聚體白蛋白納米球24h時(shí)的光聲成像圖，從圖中可以看出，左圖基本上沒有光聲信號(hào)，而右圖在腫瘤部位光聲信號(hào)較強(qiáng)。說明多聚體白蛋白納米球?qū)δ[瘤組織具有很強(qiáng)的靶向性。
[0260]圖8為實(shí)施例9制得的多聚體白蛋白納米球用于荷瘤裸鼠光動(dòng)力實(shí)驗(yàn)的腫瘤生長曲線。在腫瘤模型長至10mm3后，將多聚體白蛋白納米球溶液通過尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)，具體實(shí)驗(yàn)方案為:將54只6?8周的裸鼠(Balb/c)，6只一組共分9個(gè)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，包括:1、PBS緩沖液組(對照組)；2.注射僅包含Ce6的多聚體白蛋白納米球(Ce6的注射量為0.5mg/kg,即每Ikg小鼠注射含有0.5mg Ce6的多聚體白蛋白納米球)，注射Ih后采用660nm激光照射5min ;僅包含Ce6的多聚體白蛋白納米球的制備可參照本發(fā)明多聚體白蛋白納米球的制備方法；3注射游離Ce6(Ce6的注射量為0.5mg/kg,即每Ikg小鼠注射含有0.5mg的Ce6)，注射Ih后采用660nm激光照射；4.注射僅包含ICG的多聚體白蛋白納米球(ICG的注射量為lmg/kg，即每Ikg小鼠注射含有Img ICG的多聚體白蛋白納米球)，注射24h后采用808nm激光照射；僅包含ICG的多聚體白蛋白納米球的制備可參照本發(fā)明多聚體白蛋白納米球的制備方法；5.注射游離ICG(ICG的注射量為lmg/kg)，注射24h后采用808nm激光照射；6.注射游離Ce6 (Ce6的注射量為0.5mg/kg)和游離ICG (ICG的注射量為lmg/kg)，在注射Ce6和ICGlh后，采用660nm激光照射5min，24h后，再換用808nm激光進(jìn)行照射5min ；7.注射實(shí)施例9制得的包含有Ce6和ICG的多聚體白蛋白納米球(ICG的注射量為1.0mg/kg, Ce6的注射量為0.5mg/kg,即每Ikg小鼠注射含有1.0mg ICG和
0.5mg Ce6的多聚體白蛋白納米球)；在注射多聚體白蛋白納米球Ih后,采用660nm激光照射5min, 24h后，換用808nm激光進(jìn)行照射5min ；8.游離Ce6 (Ce6的注射量為0.25mg/kg) +游離ICG(ICG的注射量為0.5mg/kg);在注射Ce6和ICGlh后，采用660nm激光照射5min，24h后，換用808nm激光進(jìn)行照射5min ；9.實(shí)施例9制得的包含有Ce6和ICG的多聚體白蛋白納米球(Ce6的注射量為0.25mg/kg, ICG的注射量為0.5mg/kg)，在注射多聚體白蛋白納米球Ih后,采用660nm激光照射5min, 24h后，換用808nm激光進(jìn)行照射5min。
[0261]從圖8中可以看出，對照組中腫瘤的體積增長速度快，游離的ICG、游離的Ce6、僅包含ICG的多聚體白蛋白納米球和僅包含Ce6的多聚體白蛋白納米球雖然對腫瘤的生長有一定的抑制效果，但效果沒有本發(fā)明實(shí)施例9制得的包含有ICG和Ce6的多聚體白蛋白納米球效果好，且隨著包含有ICG和Ce6的多聚體白蛋白納米球中目標(biāo)投遞物注入量的增力口，抑制腫瘤效果越好，相對于對照組，實(shí)驗(yàn)組7最終使腫瘤完全消失，可以看出，本發(fā)明先用Ce6的光動(dòng)力治療在腫瘤部位產(chǎn)生炎癥，能促使以ICG在腫瘤部位進(jìn)一步的富集，再采用ICG光動(dòng)力和光熱同時(shí)治療，可以大大抑制了腫瘤的生長。
[0262]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種多聚體白蛋白納米球，其特征在于，所述多聚體白蛋白納米球包括含巰基和/或二硫鍵的白蛋白分子，所述白蛋白分子之間通過二硫鍵相互連接， 所述多聚體白蛋白納米球中包載有目標(biāo)投遞物； 所述目標(biāo)投遞物包括抗癌藥物和造影劑； 所述抗癌藥物包括(2S-反式)-18-羧基-20-(羧甲基)-13-乙基-2，3-二氫3，7，12，17-四甲基-8-乙烯基-21H, 23H-卟吩-2-丙酸； 所述造影劑包括2，7-雙[1，3- 二氫-1，1- 二甲基-3- (4-磺丁基)-1, 3，5-庚三烯單鈉鹽； 所述多聚體白蛋白納米球的粒徑為10?lOOOnm。
2.如權(quán)利要求1所述的一種多聚體白蛋白納米球，其特征在于，所述含巰基和/或二硫鍵的白蛋白分子為人血清白蛋白、牛血清白蛋白、豬血清白蛋白、重組血清白蛋白和血紅蛋白中的至少一種。
3.一種多聚體白蛋白納米球的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)制備體積質(zhì)量濃度為0.01?300mg/mL的含巰基和/或二硫鍵的白蛋白水溶液，并調(diào)節(jié)所述白蛋白水溶液的PH值為7?12 ; 其中，所述白蛋白水溶液中含有目標(biāo)投遞物； 所述目標(biāo)投遞物包括抗癌藥物和造影劑； 所述抗癌藥物包括(2S-反式)-18-羧基-20-(羧甲基)-13-乙基-2，3-二氫3，7，12，17-四甲基-8-乙烯基-21H, 23H-卟吩-2-丙酸； 所述造影劑包括2，7-雙[1，3- 二氫-1，1- 二甲基-3-(4-磺丁基)-1，3，5-庚三烯單鈉鹽； (2)向步驟(I)所得的所述pH值為7?12的白蛋白水溶液中加入帶巰基的還原劑得反應(yīng)液，然后在O?60°C下輕輕搖動(dòng)反應(yīng)0.05?12小時(shí)，在所述反應(yīng)液中，所述帶巰基的還原劑的摩爾數(shù)為白蛋白摩爾數(shù)的10?5000倍； (3)將步驟(2)反應(yīng)后的溶液在O?60°C的條件下進(jìn)行超聲，所述超聲的功率范圍為I?100KW，同時(shí)在攪拌的條件下在所述進(jìn)行超聲的溶液中以0.01?1000ml/s的速度加入有機(jī)溶劑得到微乳溶液，所述微乳溶液在O?60°C的條件下反應(yīng)5?240min后，靜置分層，然后去除有機(jī)相，得到含多聚體白蛋白納米球的懸濁液，其中，所述有機(jī)溶劑加入的體積為所述步驟⑵反應(yīng)后的溶液的I?100倍； (4)將步驟(3)所得的含多聚體白蛋白納米球的懸濁液在O?60°C以及pH值為7?12的條件下進(jìn)行透析，得到多聚體白蛋白納米球溶液； (5)將步驟(4)所得的多聚體白蛋白納米球溶液進(jìn)行干燥脫水處理，得到多聚體白蛋白納米球，所述多聚體白蛋白納米球包括含巰基和/或二硫鍵的白蛋白分子，所述白蛋白分子之間通過二硫鍵相互連接， 其中，所述多聚體白蛋白納米球中包載有目標(biāo)投遞物； 所述目標(biāo)投遞物包括抗癌藥物和造影劑； 所述抗癌藥物包括(2S-反式)-18-羧基-20-(羧甲基)-13-乙基-2，3-二氫3，7，12，17-四甲基-8-乙烯基-21H, 23H-卟吩-2-丙酸； 所述造影劑包括2，7-雙[1，3- 二氫-1，1- 二甲基-3- (4-磺丁基)-1, 3，5-庚三烯單鈉鹽； 所述多聚體白蛋白納米球的粒徑為10?lOOOnm。
4.如權(quán)利要求3所述的一種多聚體白蛋白納米球的制備方法，其特征在于，所述步驟(I)中，所述含巰基和/或二硫鍵的白蛋白分子為人血清白蛋白、牛血清白蛋白、豬血清白蛋白、重組血清白蛋白和血紅蛋白中的至少一種。
5.如權(quán)利要求3所述的一種多聚體白蛋白納米球的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中，所述目標(biāo)投遞物的質(zhì)量為所述含疏基和/或~■硫鍵的白蛋白質(zhì)量的0.0002?0.5倍。
6.如權(quán)利要求3所述的一種多聚體白蛋白納米球的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中，所述帶巰基的還原劑為谷胱甘肽、半胱氨酸、巰基乙醇或二硫蘇糖醇。
7.如權(quán)利要求3所述的一種多聚體白蛋白納米球的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中，在攪拌的條件下在所述進(jìn)行超聲的溶液中以50?1000mL/S的速度加入有機(jī)溶劑得到微乳溶液。
8.如權(quán)利要求3所述的一種多聚體白蛋白納米球的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述反應(yīng)液在4?60°C下輕輕搖動(dòng)反應(yīng)，步驟(3)中步驟(2)反應(yīng)后的溶液在4?60°C的條件下進(jìn)行超聲，所述微乳溶液在4?60°C的條件下反應(yīng)5?240min，步驟(4)所述含多聚體白蛋白納米球的懸濁液在4?60°C下進(jìn)行透析。
9.如權(quán)利要求3所述的一種多聚體白蛋白納米球的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中，所述有機(jī)溶劑為甲醇、乙醇、丙醇和叔丁醇中的至少一種。
10.如權(quán)利要求1或2所述的多聚體白蛋白納米球在制備預(yù)防、治療或診斷癌癥的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK104162164SQ201410337773
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年7月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月27日
【發(fā)明者】蔡林濤, 盛宗海, 胡德紅 申請人:深圳先進(jìn)技術(shù)研究院