肝癌干細(xì)胞疫苗及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種腫瘤干細(xì)胞疫苗及其制備和應(yīng)用。本發(fā)明所述的肝癌干細(xì)胞疫苗包括：按體積比為3:1:1混合的滅活的肝癌干細(xì)胞、甘露聚糖肽和脂肪乳。本發(fā)明所述的肝癌干細(xì)胞疫苗的制備方法，包括以下步驟：獲得肝癌干細(xì)胞；將所述肝癌干細(xì)胞滅活；以及將滅活的肝癌干細(xì)胞凍融在生理鹽水里，與佐劑甘露聚糖肽、脂肪乳混勻，從而獲得所述的肝癌干細(xì)胞疫苗。本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明所述的制備方法獲得的肝癌干細(xì)胞疫苗用于制備治療肝癌的藥物中的用途。本發(fā)明為肝癌的治療及其疫苗的制備提供了一種新的途徑，對(duì)肝癌患者具有積極地治療效果，可增強(qiáng)患者的免疫功能，對(duì)延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間具有積極作用。
【專利說(shuō)明】肝癌干細(xì)胞疫苗及其制備方法與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥工程技術(shù)，涉及一種腫瘤干細(xì)胞疫苗及其制備和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 惡性腫瘤是一種全身性的慢性疾病。在中晚期患者體內(nèi)，不僅臟器中有影像學(xué)檢 查時(shí)明顯的團(tuán)塊腫瘤,在外周血中更有大量看不見(jiàn)的循環(huán)腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞（Cancer stem cell，CSC)，隨時(shí)準(zhǔn)備定居在機(jī)體易感部位，發(fā)育成新的轉(zhuǎn)移灶，這也是腫瘤無(wú)法根治 的原因。傳統(tǒng)的腫瘤治療包括4種主要療法，即手術(shù)、化療、放療和免疫治療。通常前三種療 法治療3-5年后，腫瘤都會(huì)發(fā)生周邊臟器或遠(yuǎn)端臟器的轉(zhuǎn)移。隨著對(duì)CSC研究的深入，人們 已經(jīng)明確復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的原因不是手術(shù)做得不徹底，而是由于缺乏有效的控制、甚至消滅CSC 的方法。
[0003] CSC來(lái)自人類自體干細(xì)胞的惡變，具有低分化度和高擴(kuò)增性等特點(diǎn)。這些干細(xì)胞可 抵抗幾乎全部的傳統(tǒng)化療藥物及放療，可在傳統(tǒng)治療的同時(shí)即引起腫瘤肝復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。這 種現(xiàn)象對(duì)于很多免疫治療也不例外，原因是過(guò)去一直使用成熟腫瘤細(xì)胞作為抗原供免疫細(xì) 胞識(shí)別，而CSC不表達(dá)這些抗原，可逃避免疫攻擊。所以，腫瘤的免疫治療急需更新觀念，將 治療的主攻方向從成熟腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)镃SC。
[0004] 目前國(guó)際公認(rèn)的成熟的尋找CSC的方法是利用ALDEFLUOR/ALDH在人類腫瘤中尋 找。ALDH是所有干細(xì)胞中共有的一種酶，在腫瘤干細(xì)胞中高或強(qiáng)表達(dá)，而在普通干細(xì)胞中弱 或無(wú)表達(dá)。
[0005] 目前，為了獲得腫瘤干細(xì)胞（CSC)，人們常通過(guò)大量培養(yǎng)普通的腫瘤細(xì)胞系，由單 瓶消化擴(kuò)增至多瓶，再提取出其內(nèi)的腫瘤干細(xì)胞。采用這種方法，其存在很多弊端：獲取的 腫瘤干細(xì)胞數(shù)量有限，普通腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)花費(fèi)的人力與財(cái)力頗大，長(zhǎng)期大量培養(yǎng)各種腫瘤 細(xì)胞會(huì)需要很多培養(yǎng)試劑、配置專人、容易污染致死，甚至出錯(cuò)；腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)存活率低； 培養(yǎng)普通腫瘤細(xì)胞因培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)箱空間有限，獲得的細(xì)胞數(shù)量也就不多，從中再抽取腫 瘤干細(xì)胞，得到的腫瘤干細(xì)胞量就更少，遠(yuǎn)無(wú)法滿足需求。因此，開(kāi)發(fā)一種操作簡(jiǎn)單、快捷的 有助于獲取高產(chǎn)量的腫瘤干細(xì)胞（CSC)的制備方法也是非常有必要的。
[0006] 近年來(lái)，已經(jīng)有關(guān)于腫瘤干細(xì)胞疫苗具有抗腫瘤療效的報(bào)道，理論上滅活的腫瘤 干細(xì)胞可被直接作為疫苗，但是臨床上的療效很不理想，因此有必要研究和開(kāi)發(fā)適合于臨 床應(yīng)用的腫瘤干細(xì)胞疫苗。
[0007] 原發(fā)性肝癌（primary carcinoma of liver,以下簡(jiǎn)稱肝癌）是我國(guó)常見(jiàn)的惡性 腫瘤之一。據(jù)20世紀(jì)90年代統(tǒng)計(jì)，我國(guó)肝癌的年死亡率為20. 37/10萬(wàn)，在惡性腫瘤死亡 順位中占第2位，在城市中僅次于肝癌；農(nóng)村中僅次于胃癌。由于血清甲胎蛋白（AFP)的 臨床應(yīng)用和各種影像學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，特別是AFP和超聲顯像用于肝癌高危人群的監(jiān)測(cè)，使 肝癌能夠在無(wú)癥狀和體征的亞臨床期作出診斷，加之外科手術(shù)技術(shù)的成熟，以及各種局部 治療等非手術(shù)治療方法的發(fā)展，使肝癌的預(yù)后較過(guò)去有了明顯提高。傳統(tǒng)的治療肝癌的方 法是首選手術(shù)切除，但不是所有的肝癌患者都適合手術(shù)。只有心肝功能較好，肝臟腫瘤較局 限，沒(méi)有轉(zhuǎn)移條件的患者才適宜手術(shù)。加上我國(guó)肝癌患者多數(shù)有肝炎、肝硬化的病史，臨床 有80%左右的患者因各種原因不能手術(shù)。肝癌具有侵襲性和難治愈的特點(diǎn)，治療后仍有可 能復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。而其起源、復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的真正原因可能是存在于肝癌內(nèi)極少數(shù)具有干細(xì)胞 的自我更新能力和多向分化潛能的細(xì)胞群，即肝癌干細(xì)胞，這些細(xì)胞具有化療、放療及缺氧 抵抗性，同時(shí)具有高致瘤性、高侵襲轉(zhuǎn)移性，在肝癌的發(fā)生、發(fā)展乃至轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)中起著極 其重要作用。然而，放療和化療對(duì)存在于腫瘤中數(shù)量較少的干細(xì)胞樣細(xì)胞群療效甚微，經(jīng)過(guò) 治療后殘存的肝癌干細(xì)胞的增殖足以促使肝癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移之一。目前尚缺乏有效的肝癌干 細(xì)胞疫苗，本領(lǐng)域技術(shù)人員在這方面亟待取得突破。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的第一個(gè)方面是提供一種肝癌干細(xì)胞疫苗，對(duì)肝癌患者具有積極地治療效 果，可增強(qiáng)患者的免疫功能。
[0009] 本發(fā)明所述的肝癌干細(xì)胞疫苗包括：按體積比為3:1:1混合的滅活的肝癌干細(xì) 胞、甘露聚糖肽和脂肪乳。
[0010] 本發(fā)明的第二個(gè)方面提供一種肝癌干細(xì)胞疫苗的制備方法，可實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單、快捷地 獲取高產(chǎn)量、易于質(zhì)量控制的肝癌干細(xì)胞，并制備出臨床上有效的肝癌干細(xì)胞疫苗。
[0011] 本發(fā)明所述的肝癌干細(xì)胞疫苗的制備方法，包括以下步驟：獲得肝癌干細(xì)胞；將 所述肝癌干細(xì)胞滅活；將滅活的肝癌干細(xì)胞凍融在生理鹽水里，與佐劑甘露聚糖肽、脂肪乳 混勻，從而獲得所述的肝癌干細(xì)胞疫苗。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明所述的肝癌干細(xì)胞疫苗的制備方法的進(jìn)一步特征，所述滅活包括：將 肝癌干細(xì)胞由-80°c至20°C反復(fù)凍融五次致死。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明所述的肝癌干細(xì)胞疫苗的制備方法的進(jìn)一步特征，所述肝癌干細(xì)胞、 甘露聚糖肽和脂肪乳的混合比例為3:1:1 (體積比）。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明所述的肝癌干細(xì)胞疫苗的制備方法的進(jìn)一步特征，所述的肝癌干細(xì)胞 是⑶133陽(yáng)性肝癌干細(xì)胞。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明所述的肝癌干細(xì)胞疫苗的制備方法的進(jìn)一步特征，所述的CD133陽(yáng)性 肝癌干細(xì)胞是通過(guò)以下步驟制備的：
[0016] A.將液氮或_80°C保存的肝癌細(xì)胞于37°C水浴，快速溶化；
[0017] B.用8. Oml的含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基混勻已融化的肝癌細(xì)胞懸液，于1500 轉(zhuǎn)/分，離心8分鐘；
[0018] C.棄上清，再吸取8. Oml培養(yǎng)基質(zhì)混勻細(xì)胞沉淀，再1500轉(zhuǎn)/分，離心8分鐘，棄 上清，細(xì)胞沉淀用I. Oml培養(yǎng)基混勻，備用；
[0019] D.另取一個(gè)75cm2方瓶，加入14. Oml培養(yǎng)基質(zhì)，將I. Oml上述制備的含肝癌細(xì)胞 懸液加入此方瓶中，于37°C，5% CO2孵育箱中培養(yǎng)；
[0020] E.肝癌細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)3-4天，肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)至80%-95%單層時(shí)，棄上清， 用0. 5mM的EDTA，處理肝癌細(xì)胞大約3-5分鐘，用倒置顯微鏡觀察，當(dāng)90%的肝癌細(xì)胞變圓 時(shí)，即可用彎管吹打并將消化的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，于1500轉(zhuǎn)/分下，離心8分鐘， 棄上清，計(jì)數(shù)，若細(xì)胞數(shù)不足，擴(kuò)增至三個(gè)培養(yǎng)瓶，繼續(xù)消化離心；
[0021] F.加入緩沖液重懸細(xì)胞，采用⑶133免疫磁珠分選系統(tǒng)從細(xì)胞液中分選出⑶133 陽(yáng)性肝癌干細(xì)胞；
[0022] G.將前一步驟獲得的⑶133陽(yáng)性肝癌干細(xì)胞在DMEM/F12培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)；
[0023] H. 37°C、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)5-7天，從而獲得足夠用于制備肝癌干細(xì)胞疫苗的 ⑶133陽(yáng)性肝癌干細(xì)胞。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明所述的肝癌干細(xì)胞疫苗的制備方法的進(jìn)一步特征，所述步驟E中，在 加入EDTA的同時(shí)加入0. 25%胰酶I. Oml以消化腫瘤細(xì)胞。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明所述的肝癌干細(xì)胞疫苗的制備方法的進(jìn)一步特征，所述步驟G中，在 DMEM/F12培養(yǎng)液中添加：生長(zhǎng)因子rhEGF15?25ng/ml、rhbFGF5?15ng/ml、硫酸肝素2? 6ug/ml、胎牛血清0· 1?0· 2% (質(zhì)量百分比）和青霉素-鏈霉素雙抗0· 5?L 5% (質(zhì)量 百分比）。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明所述的肝癌干細(xì)胞疫苗的制備方法的進(jìn)一步特征，所述步驟H中， 所述足夠用于制備肝癌干細(xì)胞疫苗的CD133陽(yáng)性肝癌干細(xì)胞是培養(yǎng)至細(xì)胞個(gè)數(shù)達(dá)到 IXlO5?5X105/ml的CD133陽(yáng)性肝癌干細(xì)胞。
[0027] 本發(fā)明的第三個(gè)方面提供了根據(jù)本發(fā)明所述的制備方法獲得的肝癌干細(xì)胞疫苗 用于制備治療肝癌的藥物中的用途。
[0028] 本發(fā)明所述的肝癌干細(xì)胞疫苗劑及其制備方法具有以下特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)：
[0029] (1)本發(fā)明所述的肝癌干細(xì)胞疫苗中含有藥學(xué)上可接受的佐劑甘露聚糖肽，能誘 導(dǎo)體內(nèi)潛在的DC，進(jìn)而增強(qiáng)攝取抗原能力，提升機(jī)體免疫功能；提升機(jī)體外周白細(xì)胞，增強(qiáng) 機(jī)體防御能力。
[0030] (2)本發(fā)明所述的肝癌干細(xì)胞疫苗中含有藥學(xué)上可接受的佐劑脂肪乳，起到緩釋 作用，讓疫苗緩慢被吸收，延長(zhǎng)疫苗作用的時(shí)間，增強(qiáng)療效。
[0031] (3)本發(fā)明所述的肝癌干細(xì)胞疫苗中，肝癌干細(xì)胞與佐劑甘露聚糖肽和脂肪乳的 比例關(guān)系是優(yōu)選的結(jié)果，例如，當(dāng)臨床皮下注射需求量為0. 5ml時(shí)，取肝癌干細(xì)胞0. 3ml、甘 露聚糖肽和脂肪乳各〇. lml，然后混勻。這樣的比例能保證腫瘤干細(xì)胞濃度適中，過(guò)濃會(huì)影 響吸收，過(guò)稀則影響藥效；同時(shí)0. 5ml的皮下注射量也在循證醫(yī)學(xué)允許的皮下注射范圍內(nèi) (皮下注射量小于Iml)。
[0032] (4)本發(fā)明將未老化的腫瘤細(xì)胞經(jīng)過(guò)消化復(fù)蘇培養(yǎng)、免疫磁珠分選來(lái)獲得單個(gè)的 CD133陽(yáng)性腫瘤干細(xì)胞CSC，具有操作簡(jiǎn)便、易于質(zhì)控、獲得的肝癌干細(xì)胞陽(yáng)性率高的特點(diǎn)。
[0033] (5)本發(fā)明為肝癌的治療及其疫苗的制備提供了一種新的途徑，本發(fā)明所述的疫 苗對(duì)肝癌患者具有積極地治療效果，可增強(qiáng)患者的免疫功能，對(duì)延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間具有 積極作用。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0034] 圖IA為本發(fā)明所述方法得到的肝癌干細(xì)胞陽(yáng)性率檢測(cè)結(jié)果。
[0035] 圖IB為采用現(xiàn)有方法制備肝癌干細(xì)胞的陽(yáng)性率檢測(cè)結(jié)果。
[0036] 圖2是采用本發(fā)明所述方法制備得到的肝癌干細(xì)胞疫苗的治療組和對(duì)照組的生 存時(shí)間曲線圖。
[0037] 圖3為注射肝癌干細(xì)胞疫苗后體液免疫應(yīng)答的結(jié)果比較。

【具體實(shí)施方式】
[0038] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0039] 本文中，所述的腫瘤細(xì)胞是指?jìng)鞔?-3次的未老化腫瘤細(xì)胞。
[0040] 本文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)若未做特別說(shuō)明，均與本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟 悉的意義相同。本文中涉及的甘露聚糖肽及脂肪乳其獲得是通過(guò)正規(guī)醫(yī)院購(gòu)買得到的， CD133免疫磁珠分選系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞分選的技術(shù)也是本【技術(shù)領(lǐng)域】的現(xiàn)有技術(shù)，具體可以采用 CD 133免疫磁珠分離試劑盒進(jìn)行分選。
[0041] 實(shí)施例1 :肝癌干細(xì)胞疫苗的制備
[0042] 本實(shí)施例是以液氮中儲(chǔ)存的肝癌細(xì)胞為原料來(lái)制備肝癌干細(xì)胞疫苗。
[0043] 1.將液氮或-80°C保存的肝癌細(xì)胞QGY-7701于37°C水浴，快速溶化；
[0044] 2.用8. Oml培養(yǎng)基（RPMI1640+10 % FBS)混勻已融化的腫瘤細(xì)胞懸液，于1500轉(zhuǎn) /分，離心8分鐘；
[0045] 3.棄上清，再吸取8. Oml培養(yǎng)基質(zhì)混勻細(xì)胞沉淀，再1500轉(zhuǎn)/分，離心8分鐘，棄 上清，細(xì)胞沉淀用I. Oml培養(yǎng)基混勻，備用；
[0046] 4.另取一個(gè)75cm2方瓶，加入14.0ml培養(yǎng)基質(zhì)，將上述制備的含腫瘤細(xì)胞懸液 (LOml)加入此方瓶中，于37°C，5% CO2孵育箱中培養(yǎng)；
[0047] 5.腫瘤細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)3-4天，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)至80%-95%單層時(shí)，棄上清， 用0. 5mM的EDTA (難消化的腫瘤細(xì)胞用0. 25 %胰酶I. Oml)，處理腫瘤細(xì)胞大約3-5分鐘，用 倒置顯微鏡觀察，當(dāng)90%的腫瘤細(xì)胞變圓時(shí)，即可用彎管吹打并將消化的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15ml 離心管中，于1500轉(zhuǎn)/分下，離心8分鐘，棄上清；
[0048] 6.向步驟（5)加入緩沖液重懸細(xì)胞，采用⑶133免疫磁珠分選系統(tǒng)從細(xì)胞液中分 選出CD133陽(yáng)性腫瘤干細(xì)胞，按照每IO 7個(gè)細(xì)胞加入60ul緩沖液的量向其中加入緩沖液重 懸形成細(xì)胞液。所用緩沖液為PBS緩沖液，其中含有0. 5% BSA，2mM EDTA，pH為7. 2(文中 出現(xiàn)的緩沖液，若為特別說(shuō)明，均采用該緩沖液）。
[0049] 7.采用CD133免疫磁珠分選系統(tǒng)從細(xì)胞液中分選出CD133陽(yáng)性干細(xì)胞，免疫磁珠 分選系統(tǒng)是本【技術(shù)領(lǐng)域】的現(xiàn)有技術(shù)，采用CD133免疫磁珠分離試劑盒進(jìn)行分選，可按照試 劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行，具體可參照如下步驟進(jìn)行：
[0050] 7. 1向步驟（6)獲得的細(xì)胞液中加入20ul受體阻斷劑FcR/107細(xì)胞，再向其中加 入20ul CD133磁珠/IO7細(xì)胞；
[0051] 7. 2混勻后，在2-8°C冰箱內(nèi)孵育15分鐘，期間不停輕搖；
[0052] 7. 3 按每 IO7 個(gè)細(xì)胞加入 l-2ml PBS 緩沖液（含 0· 5% BSA，2mM EDTA，ρΗ7· 2)進(jìn) 行清洗，以IOOOrpm離心5min，棄上清；
[0053] 7. 4離心后，向其中加入500ul Buffer重懸細(xì)胞，備用，以便進(jìn)入分離階段；
[0054] 7. 5預(yù)先將LS分離柱與分選器（分選磁鐵）相匹配連接好；
[0055] 7. 6準(zhǔn)備好沖洗的buffer液，其中MS柱：500ul，LS柱3ml ;
[0056] 7. 7加細(xì)胞懸液入LS柱，非標(biāo)記的細(xì)胞（⑶133陰性細(xì)胞）自動(dòng)流下；
[0057] 7. 8清洗柱子后，移去柱子，并將柱子固定在適合的收集管上；
[0058] 7. 9向柱子中加入buffer液進(jìn)行洗柱，以沖去標(biāo)記的細(xì)胞，收集洗液即得⑶133陽(yáng) 性干細(xì)胞。
[0059] 8.⑶133陽(yáng)性干細(xì)胞（CSC)培養(yǎng)：將步驟（7)獲得的⑶133陽(yáng)性干細(xì)胞在DMEM/ F12培養(yǎng)液中進(jìn)行成團(tuán)培養(yǎng)，其中，所述DMEM/F12培養(yǎng)液中添加有生長(zhǎng)因子rhEGF20ng/ml、 rhbFGF10ng/ml、硫酸肝素4ug/ml、胎牛血清0.15% (質(zhì)量）、青霉素-鏈霉素雙抗1% (質(zhì) 量）；
[0060] 9.步驟（8)中的干細(xì)胞培養(yǎng)至一定數(shù)目（IXlO5?5X105)后反復(fù)凍融，按照陽(yáng) 性干細(xì)胞、甘露聚糖肽及脂肪乳按體積比為3:1:1的量混勻，得到腫瘤干細(xì)胞疫苗。
[0061] 經(jīng)步驟（1)?（7)后獲得的肝癌干細(xì)胞，將其培養(yǎng)至一定數(shù)量后，取IO6個(gè)細(xì)胞上 樣，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)其干細(xì)胞的陽(yáng)性率，結(jié)果如圖IA所示。而采用傳統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞培 養(yǎng)，其獲得的結(jié)果如圖IB所示。
[0062] 圖IB的結(jié)果具體是這樣獲得的：肝癌細(xì)胞QGY_7701 (含CSC)，經(jīng)復(fù)蘇后，力口 RPMI1640液與10% FBS培養(yǎng)擴(kuò)增，至一定數(shù)量后，抽提出CSC，取IO6個(gè)細(xì)胞上樣，得到流式 圖1B。
[0063] 由圖1A、圖IB可以看出，本實(shí)施例的方法獲得的腫瘤干細(xì)胞產(chǎn)量更高，而且陽(yáng)性 率更高，達(dá)到90%。
[0064] 實(shí)施例2 :注射肝癌干細(xì)胞疫苗后的療效觀察
[0065] 將實(shí)施例1制得肝癌干細(xì)胞疫苗應(yīng)用于肝癌患者的治療，其詳細(xì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下： 隨機(jī)抽取30名肝癌患者，分為兩組，其中15名接受實(shí)施例1制得的疫苗注射治療，作為治 療組；另15人不做疫苗處理，作為對(duì)照組。注射患者前抽取每個(gè)患者5ml血，檢測(cè)外周血 淋巴細(xì)胞數(shù)目（T BNK檢測(cè)試劑盒）和淋巴細(xì)胞功能（6colour T BNK With Trucount檢測(cè) 試劑盒），經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)得出報(bào)告單。治療組的患者，通過(guò)皮下向肝癌患者體內(nèi)輸入疫 苗劑量500ul，間隔一周后，再次注射一次，即每個(gè)療程周期是14天，隔周注射一次；治療組 的患者不進(jìn)行化療、放療及其他免疫治療。對(duì)照組的患者進(jìn)行常規(guī)化療、放療及其他免疫治 療。在15天時(shí)，再次抽取每位患者5ml血，再次檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞數(shù)目，與兩周前對(duì)比， 結(jié)果如下表1所示。表1為治療組在未注射疫苗與注射疫苗后淋巴細(xì)胞檢測(cè)和淋巴細(xì)胞功 能檢測(cè)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)。
[0066] 表1 :為未注射疫苗與注射疫苗后（14天）免疫檢測(cè)比較
[0067]

【權(quán)利要求】
1. 一種肝癌干細(xì)胞疫苗，其特征在于，包括：按體積比為3:1:1混合的滅活的肝癌干細(xì) 胞、甘露聚糖肽和脂肪乳。
2. -種肝癌干細(xì)胞疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 獲得肝癌干細(xì)胞； 將所述肝癌干細(xì)胞滅活；以及 將滅活的肝癌干細(xì)胞凍融在生理鹽水里，與佐劑甘露聚糖肽、脂肪乳混勻，從而獲得所 述的肝癌干細(xì)胞疫苗。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的肝癌干細(xì)胞疫苗的制備方法，其特征在于，所述滅活包括：將 肝癌干細(xì)胞由-80°C至20°C反復(fù)凍融五次致死。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的肝癌干細(xì)胞疫苗的制備方法，其特征在于：所述肝癌干細(xì)胞、 甘露聚糖肽和脂肪乳的混合比例為3:1:1 (體積比）。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的肝癌干細(xì)胞疫苗的制備方法，其特征在于：所述的肝癌干細(xì) 胞是⑶133陽(yáng)性肝癌干細(xì)胞。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的肝癌干細(xì)胞疫苗的制備方法，其特征在于，所述的CD133陽(yáng)性 肝癌干細(xì)胞是通過(guò)以下步驟制備的： A. 將液氮或_80°C保存的肝癌細(xì)胞于37°C水浴，快速溶化； B. 用8. Oml的含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基混勻已融化的肝癌細(xì)胞懸液，于1500轉(zhuǎn) /分，離心8分鐘； C. 棄上清，再吸取8. 0ml培養(yǎng)基質(zhì)混勻細(xì)胞沉淀，再1500轉(zhuǎn)/分，離心8分鐘，棄上清， 細(xì)胞沉淀用1. 〇ml培養(yǎng)基混勻，備用； D. 另取一個(gè)75cm2方瓶，加入14. 0ml培養(yǎng)基質(zhì)，將1. 0ml上述制備的含肝癌細(xì)胞懸液 加入此方瓶中，于37°C，5% 0)2孵育箱中培養(yǎng)； E. 肝癌細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)3-4天，肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)至80% -95%單層時(shí)，棄上清，用 0. 5mM的EDTA，處理肝癌細(xì)胞大約3-5分鐘，用倒置顯微鏡觀察，當(dāng)90%的肝癌細(xì)胞變圓時(shí)， 即可用彎管吹打并將消化的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，于1500轉(zhuǎn)/分下，離心8分鐘，棄 上清，計(jì)數(shù)，若細(xì)胞數(shù)不足，擴(kuò)增至三個(gè)培養(yǎng)瓶，繼續(xù)消化離心； F. 加入緩沖液重懸細(xì)胞，采用CD133免疫磁珠分選系統(tǒng)從細(xì)胞液中分選出CD133陽(yáng)性 肝癌干細(xì)胞； G. 將前一步驟獲得的CD133陽(yáng)性肝癌干細(xì)胞在DMEM/F12培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)； H. 37°C、5% C02孵育箱中培養(yǎng)5-7天，從而獲得足夠用于制備肝癌干細(xì)胞疫苗的⑶133 陽(yáng)性肝癌干細(xì)胞。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的肝癌干細(xì)胞疫苗的制備方法，其特征在于，所述步驟E中，在 加入EDTA的同時(shí)加入0. 25%胰酶1. 0ml以消化腫瘤細(xì)胞。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的肝癌干細(xì)胞疫苗的制備方法，其特征在于，所述步驟G中，在 DMEM/F12培養(yǎng)液中添加：生長(zhǎng)因子rhEGF15?25ng/ml、rhbFGF5?15ng/ml、硫酸肝素2? 6ug/ml、胎牛血清0· 1?0· 2% (質(zhì)量百分比）和青霉素-鏈霉素雙抗0· 5?1. 5% (質(zhì)量 百分比）。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的肝癌干細(xì)胞疫苗的制備方法，其特征在于，所述步驟Η中， 所述足夠用于制備肝癌干細(xì)胞疫苗的CD133陽(yáng)性肝癌干細(xì)胞是培養(yǎng)至細(xì)胞個(gè)數(shù)達(dá)到 1X105?5X105/ml的CD133陽(yáng)性肝癌干細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求2至9之一所述的制備方法獲得的肝癌干細(xì)胞疫苗用于制備治療肝 癌的藥物中的用途。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK104258383SQ201410503127
【公開(kāi)日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年9月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月26日
【發(fā)明者】陳繼冰, 林茂, 左建生, 劉建國(guó), 徐克成, 牛立志 申請(qǐng)人:廣州復(fù)大醫(yī)療股份有限公司復(fù)大腫瘤醫(yī)院