狂犬病毒snk-ctn株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物及生物制藥領(lǐng)域，具體地說，涉及一種狂犬病毒株CTN-1V株在二倍體細(xì)胞MRC-5株的適應(yīng)株。本發(fā)明所述病毒株，通過以下方法制備得到：1)取細(xì)胞庫中的MRC-5細(xì)胞進行復(fù)蘇，培養(yǎng)3天成單層細(xì)胞后，將MRC-5細(xì)胞培養(yǎng)瓶中細(xì)胞培養(yǎng)液倒掉，用0.25％胰蛋白酶消化液進行消化，分散成均勻的細(xì)胞，按照0.01～1.0MOI劑量進行接種狂犬病毒CTN-1V5株懸液，37℃培養(yǎng)2～3天，換成含有2～4％牛血清的維持液，33～35℃培養(yǎng)3～5天后收獲病毒液，凍存于-70℃，制備成病毒懸液；2)以上述的方法，連續(xù)在MRC-5細(xì)胞上傳30～32代。該狂犬病疫苗毒種(SNK-CTN株)，其保藏號為CGCC No8887。CGMCC88872014.06.16
【專利說明】狂犬病毒SNK-CTN株及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物及生物制藥領(lǐng)域，具體地說，涉及一種狂犬病毒株CTN-IV株在 二倍體細(xì)胞MRC-5株的適應(yīng)株。

【背景技術(shù)】
[0002] 狂犬病是由狂犬病病毒引起的一種疾病，一旦發(fā)病，100%死亡。我國近年來狂犬 病疫情持續(xù)上升，發(fā)病率現(xiàn)居世界第二位，僅次于印度，狂犬病病死人數(shù)居37種法定報告 傳染病之首。狂犬病至今無法治愈但可有效預(yù)防，因此我國狂犬病的預(yù)防工作就顯得尤為 重要。
[0003] 目前世界上用于生產(chǎn)狂犬病疫苗的培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞主要有原代地鼠腎細(xì)胞、原代雞 胚細(xì)胞和非洲綠猴腎傳代細(xì)胞（Vero)細(xì)胞）等動物源性細(xì)胞。動物源性原代細(xì)胞不能排 除細(xì)菌、病毒、寄生蟲等外源致病因子的污染，且有生產(chǎn)規(guī)模不易擴大、環(huán)保難解決等缺點； 而Vero細(xì)胞由于是傳代細(xì)胞系，有一定的致瘤性，疫苗中細(xì)胞殘余DNA必須達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。人 二倍體細(xì)胞為人源性正常核型細(xì)胞，無致癌性，無異種DNA，其安全性受到一致認(rèn)可。目前我 國使用的狂犬病疫苗種類雖多，但質(zhì)量良莽不齊，至今尚無被WHO、FDA等組織肯定和推薦 的人二倍體細(xì)胞培養(yǎng)疫苗，而基本是用地鼠腎細(xì)胞、Vero細(xì)胞和雞胚細(xì)胞等動物源性細(xì)胞 培養(yǎng)的疫苗。
[0004] 國外生產(chǎn)的人二倍體細(xì)胞狂犬病疫苗，如美國Wyeth廠、法國Merieux研究所和德 國Be虹ing廠生產(chǎn)的二倍體疫苗，已證實其具有良好的免疫原性和安全性。疫苗經(jīng)不同單 位人體觀察后證實接種后副反應(yīng)很輕，免疫效果好，可W減針注射用于暴露后治療，目前公 認(rèn)可W作為一種新發(fā)展疫苗的標(biāo)準(zhǔn)對照疫苗。
[0005] 現(xiàn)有技術(shù)中有關(guān)二倍體細(xì)胞狂犬病疫苗的報道包括：
[0006]

【權(quán)利要求】
1. 一種人二倍體細(xì)胞狂犬病毒株，其特征在于，通過以下方法制備得到： 1) 取細(xì)胞庫中的MRC-5細(xì)胞進行復(fù)蘇，培養(yǎng)3天成單層細(xì)胞后，將MRC-5細(xì)胞培養(yǎng)瓶 中細(xì)胞培養(yǎng)液倒掉，用〇. 25%胰蛋白酶消化液進行消化，分散成均勻的細(xì)胞，按照0. 01? 1. 0M0I劑量進行接種狂犬病毒CTN-1V5株懸液，37°C培養(yǎng)2?3天，換成含有2?4%牛血 清的維持液，33?35°C培養(yǎng)3?5天后收獲病毒液，凍存于-70°C，制備成病毒懸液； 2) 以上述的方法，連續(xù)在MRC-5細(xì)胞上傳30?32代。該狂犬病疫苗毒種（SNK-CTN 株），其保藏號為CGCC No8887。
2. 權(quán)利要求1所述的病毒株，其特征在于，所述維持液為MEM系列或199系列培養(yǎng)基加 2?4%小牛血清。
3. 權(quán)利要求1所述的病毒株，其特征在于，狂犬病毒CTN-1V5株在人二倍體細(xì)胞 MRC-5上連續(xù)傳代適應(yīng)；所獲得的人二倍體細(xì)胞狂犬病毒株病毒在第6代以后即可達(dá)到 6. 51gLD50/ml的感染滴度。
4. 權(quán)利要求1所述的病毒株，其特征在于，所獲得的病毒狂犬病毒抗原含量經(jīng)酶標(biāo)法 測定可達(dá)到大于〇. 4IU/ml。
5. 權(quán)利要求1所述的病毒株，其特征在于，所獲得的病毒株在第6代以后即可達(dá)到對狂 犬病毒CVS株的保護中和指數(shù)大于100。
6. -種狂犬病毒適應(yīng)株（SNK-CTN)的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 取細(xì)胞庫中的MRC-5細(xì)胞進行復(fù)蘇，培養(yǎng)3天成單層細(xì)胞后，將MRC-5細(xì)胞培養(yǎng)瓶 中細(xì)胞培養(yǎng)液倒掉，用〇. 25%胰蛋白酶消化液進行消化，分散成均勻的細(xì)胞，按照0. 01? 1. 0M0I劑量進行接種狂犬病毒CTN-1V5株懸液，37°C培養(yǎng)2?3天，換成含有2?4%牛血 清的維持液，33?35°C培養(yǎng)3?5天后收獲病毒液，凍存于-70°C，制備成病毒懸液； 2) 以上述的方法，連續(xù)在MRC-5細(xì)胞上傳30?32代。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 取裝有MRC-5細(xì)胞的凍存管，迅速放入40°C水浴中融化，然后加入到預(yù)溫至37°C的MEM 細(xì)胞培養(yǎng)液中，置于37°C培養(yǎng)，經(jīng)3?4天長成單層后經(jīng)0. 25胰蛋白酶消化后按照0. 01? 1. 0M0I劑量接種CTN-1V5株懸液，37°C培養(yǎng)2?3天，換成2?4%牛血清的維持液，33? 35°C培養(yǎng)3?5天后收獲病毒液，凍存于-70°C，制備成病毒懸液；按以上方法，將收獲的病 毒懸液連續(xù)在MRC-5細(xì)胞上傳30代次，得到狂犬病毒SNK-CTN株。
8. 權(quán)利要求1所述的病毒株在制備狂犬病疫苗中的應(yīng)用，其中所述制備狂犬病疫苗方 法如下： 步驟1，二倍體細(xì)胞加載SNK-CTN病毒 取長滿單層的細(xì)胞瓶培養(yǎng)的人胚肺二倍體細(xì)胞（MRC-5)，經(jīng)0. 25 %胰蛋白酶消化細(xì) 胞，擴增細(xì)胞到細(xì)胞工廠或生物反應(yīng)器上，加入MEM細(xì)胞培養(yǎng)液，細(xì)胞液按0. 05-0. MOI接 種SNK-CTN狂犬病毒； 步驟2,培養(yǎng)及收獲 置37°C培養(yǎng)3天后，棄掉培養(yǎng)液換入維持液。置35°C靜置培養(yǎng)3?15天；收獲病毒 液，收獲方法是：細(xì)胞工廠收獲根據(jù)細(xì)胞的病變收獲2?3次；生物反應(yīng)器收獲根據(jù)反應(yīng) 器監(jiān)測的指標(biāo)和細(xì)胞的病變進行多次收獲病毒為病毒收獲液；收獲液在無菌條件下加入 1:4000的￠-丙內(nèi)酯滅活24小時； 步驟3,提取和純化方法如下： 經(jīng)截留分子量為300KD的超濾膜超濾濃縮40-80倍后，用超速離心機進行純化，得到純 化的狂犬病毒原液。 其中用超速離心機進行純化，方法如下： 蔗糖密度梯度離心法用1〇%、20%、30%、40%、50% (W/V)蔗糖溶液作密度梯度， 34000rpm超速離心4小時后，經(jīng)過對紫外吸收峰的抗原含量，蛋白濃度的分析，確定病毒抗 原所在位置。
9. 權(quán)利要求1所述的病毒株在制備狂犬病診斷試劑中的應(yīng)用。
10. -種狂犬病診斷試劑盒，含有權(quán)利要求1所述的病毒株。
【文檔編號】A61P31/14GK104357406SQ201410521534
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月30日
【發(fā)明者】崔棟, 卜海兵, 趙榮輝 申請人:施耐克江蘇生物制藥有限公司