一種抗MRSA群體感應(yīng)agr系統(tǒng)反義脫氧核酶的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種反義抗菌脫氧核酶——DNAzyme23。本發(fā)明的反義抗菌脫氧核酶以金黃色葡萄球菌群體感應(yīng)agr系統(tǒng)效應(yīng)分子RNAIII為靶點(diǎn)，不影響細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)，能夠有效阻斷agr信號(hào)通路、顯著減弱細(xì)菌毒力，尤其可以顯著減弱耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的致病力。具有高特異性、低毒、安全、不易誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥性的增加等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】-種抗MRSA群體感應(yīng)agr系統(tǒng)反義脫氧核酶的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種抑制MRSA群體感應(yīng)agr系統(tǒng)的反義抗 菌脫氧核酶及其制備方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 金黃色葡萄球菌與多種人類感染性疾病密切相關(guān)，如皮膚感染、呼吸道感染、甚至 包括威脅生命的壞死性肌膜炎、壞死性肺炎等。目前治療MRSA最有效的藥物是萬(wàn)古霉素， 然而隨著耐萬(wàn)古霉素 MRSA的出現(xiàn)，人們即將面臨無(wú)藥可用的境地，因此尋找新的特異性抗 MRSA感染的新靶點(diǎn)及新策略成為細(xì)菌感染治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。
[0003] 人類濫用抗生素是導(dǎo)致細(xì)菌發(fā)生耐藥的最主要原因之一，在持續(xù)的抗生素選擇性 壓力作用下，細(xì)菌耐藥是一個(gè)必然發(fā)生的事件，每一種新的抗生素一經(jīng)問世，很快便會(huì)產(chǎn)生 耐藥。探索和研制不易誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥的抗菌新策略和新藥物是當(dāng)今世界各國(guó)科學(xué)家必 須面對(duì)的緊迫研究課題。群體感應(yīng)系統(tǒng)是廣泛存在于細(xì)菌內(nèi)的一種群體行為調(diào)控機(jī)制，它 不僅控制細(xì)菌間的信息交流和細(xì)菌的多種生命活動(dòng)，而且也是致病菌生物被膜形成、毒力 因子釋放、致病力大小，以及耐藥性發(fā)生的重要調(diào)控系統(tǒng)。
[0004] agr是金黃色葡萄球菌主要的群體感應(yīng)系統(tǒng)，控制著許多毒力基因的表達(dá)，與細(xì) 菌的致病力密切相關(guān)。agr是一個(gè)雙組份信號(hào)系統(tǒng)，由AgrA，AgrB，AgrC，AgrD及效應(yīng)分子 RNAIII構(gòu)成。RNAIII是一個(gè)具有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)性RNA，在不同的葡萄球菌中RNAIII 的結(jié)構(gòu)高度保守。RNAIII-方面編碼26個(gè)氨基酸的δ-溶血素，另一方面能夠調(diào)節(jié)個(gè)別胞 外蛋白和多功能調(diào)節(jié)子的轉(zhuǎn)錄。
[0005] 反義抗菌劑突破以細(xì)菌蛋白為靶點(diǎn)的經(jīng)典研究思路，以細(xì)菌體內(nèi)致病、耐藥、群體 感應(yīng)等相關(guān)基因?yàn)殪朦c(diǎn)，從阻斷相關(guān)基因的表達(dá)入手，進(jìn)而達(dá)到抑制或殺滅細(xì)菌的作用，為 抗耐藥菌治療帶來(lái)了新的希望。與經(jīng)典的抗生素相比較，反義抗菌劑具備以下突出的優(yōu)點(diǎn)： 一、以細(xì)菌基因?yàn)榘悬c(diǎn)，特異性高；二、靶點(diǎn)明確，研發(fā)成本低，只需知道基因序列就可得到 相應(yīng)的反義藥物；三、生產(chǎn)成本低，用常規(guī)的寡核苷酸合成技術(shù)就能合成。因而反義抗菌劑 被認(rèn)為是抗耐藥菌感染最有希望的突破口，代表著21世紀(jì)分子治療領(lǐng)域革命性的進(jìn)展。
[0006] 10-23型脫氧核酶能在RNA的A-U位點(diǎn)切割，可切割任何mRNA的起始密碼AUG，從 而調(diào)控蛋白質(zhì)的表達(dá)。10-23型脫氧核酶是一種潛在的強(qiáng)有力的RNA特異性切割工具，在體 外可應(yīng)用于RNA限制性內(nèi)切酶，在生物系統(tǒng)內(nèi)，可在RNA水平上阻斷靶基因表達(dá)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于通過(guò)對(duì)MRSA群體感應(yīng)agr系統(tǒng)效應(yīng)分子RNAIII mRNA為靶點(diǎn) 進(jìn)行研究，提供一種反義脫氧核酶抗金黃色葡萄球菌agr系統(tǒng)的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：
[0009] 一種反義抗菌脫氧核酶 DNAzyme23,序列為 5' -TTAAACAACTCAGGCTAGCTACAACGACA A-3'，其中A為腺嘌呤核苷酸單體，T為胸腺嘧啶核苷酸單體，C為胞嘧啶核苷酸單體，G為 鳥嘌呤核苷酸單體；下劃線所示序列為10-23型脫氧核酶的催化核心；所有核苷酸均進(jìn)行 硫代修飾。
[0010] 本發(fā)明通過(guò)試驗(yàn)研究DNAzyme23對(duì)MRSA菌株（LAC)群體感應(yīng)agr系統(tǒng)效應(yīng)分子 RNAIII的影響，結(jié)果顯示DNAzyme23能濃度依賴性地抑制靶基因 RNA III的表達(dá)、顯著降低 a -toxin的分泌。另外，功能學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，DNAzyme23處理組的細(xì)菌培養(yǎng)上清對(duì)兔紅細(xì)胞的 裂解，與對(duì)照組相比明顯降低。根據(jù)這些試驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明提供了上述反義抗菌脫氧核酶在 制備抗耐藥菌的藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選所述的耐藥菌為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌。
[0011] 本發(fā)明所涉及的反義抗菌脫氧核酶具有如下優(yōu)點(diǎn)和顯著的進(jìn)步：以金黃色葡萄球 菌agr群體感應(yīng)系統(tǒng)RNAIII效應(yīng)分子為靶點(diǎn)，具有高特異性、低毒、安全、不易誘導(dǎo)細(xì)菌耐 藥性的增加等優(yōu)點(diǎn)。能夠有效阻斷agr信號(hào)通路、并減弱細(xì)菌毒力。具體表現(xiàn)在=RT-PCR法 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，DNAzyme23能劑量依賴性地抑制LAC菌株RNAIII基因的表達(dá)；Western blot顯 示DNAzyme23能夠顯著降低a -toxin的分泌。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012] 圖 IDNAzyme 對(duì) RNAIII 表達(dá)變化的影響柱狀圖；林*P〈0. OOlvs. control。
[0013] 圖 2DNAzyme23 對(duì) a-toxin 表達(dá)的影響柱狀圖；*Ρ〈0· 05vs. control ; 林Ρ〈0· Olvs. control ;***Ρ〈0· OOlvs. control。
[0014] 圖 3DNAzyme23 對(duì)溶血素分泌的影響柱狀圖；*P〈0. 05vs. control ;***P〈0. OOlvs. control〇

【具體實(shí)施方式】
[0015] 本發(fā)明以金黃色葡萄球菌agr群體感應(yīng)系統(tǒng)效應(yīng)分子RNAIII為靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成 特異性祀向RNAIII mRNA的脫氧核酶（deoxyribozyme, DNAzyme),通過(guò)細(xì)菌最小抑菌濃度 測(cè)定、RNAIII和a -toxin表達(dá)水平及溶血素分泌實(shí)驗(yàn)，探討脫氧核酶抑制金黃色葡萄球菌 感染的效果，并最終篩選出效果顯著的DNAzyme23,其可制備成為特異性降低MRSA致病力 的新型藥物--反義抗菌劑，為MRSA感染的防治尋找出了新的突破口。
[0016] 以下是本發(fā)明涉及的DNAzyme的篩選實(shí)施例及DNAzyme23的效果試驗(yàn)例。
[0017] 實(shí)施例1設(shè)計(jì)、合成并篩選抗金葡菌RNAIII mRNA的DNAzyme
[0018] ⑴篩選RNAIII mRNA的有效靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異高效的DNAzyme :采用RNA Structured 5軟件詳細(xì)分析RNAIII mRNA的序列并預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)，以30個(gè)堿基 為DNAzyme基本長(zhǎng)度，在非保守序列區(qū)、非折疊區(qū)選擇有效靶點(diǎn)，篩選出最優(yōu)的7條 DNAzyme (見表 1)。
[0019] 表1針對(duì)RNAIII mRNA設(shè)計(jì)的脫氧核酶（DNAzyme)
[0020]

【權(quán)利要求】
1. 一種反義抗菌脫氧核酶 DNAzyme23,序列為 5' -TTAAACAACTCAGGCTAGCTACAACGACAA-3'，其中A為腺嘌呤核苷酸單體，T為胸腺嘧啶核苷酸單體，C為胞嘧啶核苷酸單體，G為鳥 嘌呤核苷酸單體；下劃線所示序列為10-23型脫氧核酶的催化核心；所有核苷酸均進(jìn)行硫 代修飾。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述反義抗菌脫氧核酶，其特征在于：核苷酸單體中的堿基為鳥嘌 呤、腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶。
3. 權(quán)利要求1所述反義抗菌脫氧核酶在制備抗耐藥菌的藥物中的應(yīng)用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的耐藥菌為耐甲氧西林金黃色葡萄 球菌。
【文檔編號(hào)】A61P31/04GK104293790SQ201410545851
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月17日
【發(fā)明者】侯征, 羅曉星, 薛小燕, 李明凱, 周穎, 孟靜茹, 達(dá)飛 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)