通過抑制程序性細(xì)胞死亡1(pd-1)途經(jīng)治療持續(xù)性感染和癌癥的方法及組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于治療、預(yù)防、或者緩解持續(xù)性感染的方法及組合物，例如慢性感染，潛伏性感染，以及慢感染和腫瘤。本發(fā)明的方法及組合物對于緩解與上述感染及腫瘤相關(guān)的一種或者多種癥狀同樣是有效的。
【專利說明】通過抑制程序性細(xì)胞死亡1 (PD-1)途經(jīng)治療持續(xù)性感染和 癌癥的方法及組合物
[0001] 本申請是2006年6月8日遞交的申請?zhí)枮?00680027007. 6,發(fā)明名稱為"通過抑 制程序性細(xì)胞死亡I(PD-I)途經(jīng)治療持續(xù)性感染和癌癥的方法及組合物"的分案申請。
[0002] 關(guān)于由聯(lián)邦政府資助進(jìn)行研究的聲明
[0003] 本發(fā)明是利用NIH(美國全國衛(wèi)生研究所）的AI39671和CA84500號撥款，在美國 政府的資助下進(jìn)行的。政府享有本發(fā)明的部分權(quán)利。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0004] 本發(fā)明大體上涉及治療持續(xù)性感染和腫瘤的方法及組合物。

【背景技術(shù)】
[0005] 盡管預(yù)防性疫苗的出現(xiàn)已經(jīng)顯著的降低了病毒感染的死亡率，但使用這些疫苗對 抗導(dǎo)致持續(xù)性感染的病毒（例如，C型肝炎病毒）僅僅取得了有限的成功。與能夠?qū)е录?性感染和自限性感染（self-limited infections)的病毒相比，針對引起持續(xù)性感染的微 生物而進(jìn)行的免疫應(yīng)答通常是短暫的，并且不足以清除感染。因此，感染性微生物會在被感 染的宿主體內(nèi)保持一段長期的時(shí)間，不必然導(dǎo)致長期的宿主損傷。
[0006] 根除導(dǎo)致持續(xù)性感染的微生物的一個(gè)主要的障礙是這類微生物具備躲避宿主生 物體的免疫系統(tǒng)的能力。例如，某些病毒和寄生蟲下調(diào)宿主分子的表達(dá)，這些宿主分子的表 達(dá)對于T細(xì)胞有效識別被感染細(xì)胞來說是必要的。持續(xù)性感染還導(dǎo)致抗原特異性CD8+T細(xì) 胞的功能性損傷，這對于控制和根除病毒感染來說是至關(guān)重要的。盡管使用加入細(xì)胞因子 佐劑的疫苗是有用的，但由此引起的免疫應(yīng)答并不能成功的根除病原體。
[0007] 因此，需要更好的方法來治療、預(yù)防或者緩解持續(xù)性感染。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明提供了用于治療、預(yù)防或者減輕、或者緩和持續(xù)性感染或者腫瘤的一種或 者多種癥狀的方法及組合物。本發(fā)明基于下述發(fā)現(xiàn)：當(dāng)使用程序性死亡多肽（PD-I)進(jìn)行誘 導(dǎo)之后，抗原特異性⑶8+T細(xì)胞對感染性制劑產(chǎn)生功能性耐受（"衰竭的"）。因此，通過減 少程序性死亡多肽-I (PD-I)、程序性死亡多肽-1配體（PD-Ll)或者程序性死亡多肽-1配 體2 (TO-L2)的表達(dá)或者活性，使功能性耐受CD8+T細(xì)胞的擴(kuò)增、細(xì)胞因子的產(chǎn)生、以及感染 性制劑（例如，病毒，細(xì)菌，真菌，寄生蟲，支原體或者腫瘤）的清除速率都增加了，因而針對 感染性制劑的特異性免疫應(yīng)答被加強(qiáng)了。
[0009] 因此，本發(fā)明提供一種緩解或者預(yù)防持續(xù)性感染（例如，病毒感染，細(xì)菌感染，真 菌感染，支原體感染以及寄生蟲感染）或者腫瘤的癥狀的方法，該方法通過向需要接受治 療的宿主施用一種能夠降低CD28類家族成員（例如，程序性死亡多肽-1，細(xì)胞毒性T淋巴 細(xì)胞抗原-4(CTLA-4)，B、T淋巴細(xì)胞衰減因子（BTLA)以及它們的功能性片段或者突變體） 或者CD28類家族配體成員（例如，程序性死亡多肽-1配體，或者程序性死亡多肽-1配體 2)的活性或者表達(dá)的化合物來完成?；蛘?，向該宿主施用一種抗原特異性T細(xì)胞或者抗原 特異性B細(xì)胞，所述細(xì)胞與一種可以減少細(xì)胞中的程序性死亡多肽-1的表達(dá)或者活性的化 合物相接觸。例如，上述抗原特異性T細(xì)胞或者B細(xì)胞特異于一種病毒抗原。所述T細(xì)胞 或者B細(xì)胞可以來自于宿主本身，也可以來自于與被治療的宿主屬于相同種類或者不同種 類的其他宿主。
[0010] 除此之外，本發(fā)明描述了一種增加 T細(xì)胞（例如，免疫無能型T細(xì)胞或者對抗原具 有增強(qiáng)的耐受性的T細(xì)胞）的細(xì)胞毒素活性的方法，該方法通過將所述T細(xì)胞與能夠減少 程序性死亡多肽-1的活性或者表達(dá)的化合物相接觸來完成。
[0011] 在本發(fā)明的上述所有方面中，持續(xù)性病毒感染來自于下述病毒的感染，例如肝 炎病毒，人類免疫缺陷型病毒（HIV)，人類T淋巴細(xì)胞白血病病毒（HTLV)，皰疹病毒， Epstein-Barr病毒，或者人乳頭瘤病毒。持續(xù)性病毒感染還可以包括由潛伏性病毒引起 的感染。腫瘤包括淋巴增殖性疾病例如血管淋巴瘤以及結(jié)節(jié)性淋巴細(xì)胞為主型的霍奇金 淋巴瘤。期望的是,本發(fā)明的化合物通過增加被治療宿主體內(nèi)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞活性（例 如，加強(qiáng)細(xì)胞毒性細(xì)胞因子例如干擾素 Y (IFNY)、腫瘤壞死因子a (TNFa)、或者白細(xì)胞 介素-2 (IL-2)的產(chǎn)生，增強(qiáng)T細(xì)胞的擴(kuò)增，或者增強(qiáng)病毒的清除）來增強(qiáng)抗原特異性免疫 應(yīng)答。例如，該化合物減少程序性死亡多肽-1配體（PD-Ll)或者程序性死亡多肽-1配體 2 (TO-L2)的表達(dá)或者活性，或者減少程序性死亡多肽-I(PD-I)與程序性死亡多肽-1配 體（PD-Ll)間的相互作用，或者減少程序性死亡多肽-I(PD-I)與程序性死亡多肽-1配體 2 (TO-L2)間的相互作用。范例性的化合物包括抗體（例如，抗程序性死亡多肽-1抗體，抗 程序性死亡多肽-1配體抗體，以及抗程序性死亡多肽-1配體2抗體），RNAi分子（例如， 抗程序性死亡多肽-IRNAi分子，抗程序性死亡多肽-1配體RNAi分子，以及抗程序性死亡 多肽-1配體2RNAi分子），反義分子（例如，抗程序性死亡多肽-1反義RNA，抗程序性死亡 多肽-1配體反義RNA，抗程序性死亡多肽-1配體2反義RNA)，顯性負(fù)性蛋白（例如，顯性 負(fù)性程序性死亡多肽-1蛋白，顯性負(fù)性程序性死亡多肽-1配體蛋白，顯性負(fù)性程序性死亡 多肽-1配體2蛋白）以及小分子抑制劑。抗體包括單克隆抗體，人源化抗體，去免疫抗體， 以及Ig (免疫球蛋白）融合抗體。一個(gè)范例性的抗程序性死亡多肽-1配體抗體包括克隆 EH12〇
[0012] 除了減少程序性死亡多肽-I(PD-I)的表達(dá)或者活性的化合物之外，還可以向需 要被治療的宿主施用疫苗，該疫苗可以包括或者不包括佐劑或者灌泵升壓注射器（prime booster shot)。可選擇的，向宿主施用另一種化合物，例如抗病毒化合物（例如，阿糖腺 苷，無環(huán)鳥苷，丙氧鳥苷，valgancyclovir，核苷酸類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（NRTI)例如AZT (齊 多夫定），ddl (去羥肌苷），ddC (二脫氧胞苷），d4T (司他夫定），或者3TC (拉米夫定），非 核苷酸類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（NNRTI)例如奈韋拉平或者地拉韋定，蛋白酶抑制劑例如沙喹那 韋，利托那韋，茚地那韋，或者奈非那韋，利巴韋林，以及干擾素），抗細(xì)菌化合物，抗真菌化 合物，抗寄生蟲化合物，抗炎癥化合物，抗腫瘤化合物或者止痛劑。所述的另一種化合物也 可以是減少細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4(CTLA-4)或者B、T淋巴細(xì)胞衰減因子（BTLA)的表 達(dá)或者活性的化合物。可以給宿主施用的其他范例性化合物是抗細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原 4抗體，抗B、T淋巴細(xì)胞衰減因子抗體，抗CD28抗體，抗可誘導(dǎo)共刺激分子（ICOS)抗體，抗 可誘導(dǎo)共刺激分子配體抗體，抗B7-1抗體，抗B7-2抗體，抗B7-H3抗體，以及抗B7-H4抗體。
[0013] 本發(fā)明進(jìn)一步提供一種鑒定候選化合物的方法，所述候選化合物調(diào)節(jié)程序性死亡 多肽-1的活性或者表達(dá)，該方法包括下述步驟：(a)將表達(dá)程序性死亡多肽-1基因的細(xì)胞 (例如，程序性死亡多肽融合基因）與候選化合物進(jìn)行接觸；(b)測定程序性死亡多肽-1在 細(xì)胞中的表達(dá)或者活性（例如，通過測定程序性死亡多肽-ImRNA或者蛋白質(zhì)的表達(dá)）；以 及（c)將程序性死亡多肽-1在細(xì)胞中的表達(dá)或者活性與其在對照細(xì)胞中的表達(dá)或者活性 相比較，其中對照細(xì)胞沒有與化合物進(jìn)行接觸。程序性死亡多肽-1在表達(dá)或者活性上的增 加或者減少表明該候選化合物能夠有效的調(diào)節(jié)程序性死亡多肽-1的活性或者表達(dá)。
[0014] 或者，上述篩選方法可以包括下列步驟：（a)將過表達(dá)程序性死亡多肽-1基因的 T細(xì)胞與候選化合物進(jìn)行接觸；以及（b)測定T細(xì)胞的細(xì)胞毒素活性；（C)將該T細(xì)胞中的 細(xì)胞毒素活性與對照細(xì)胞中的細(xì)胞毒素活性進(jìn)行比較，其中對照細(xì)胞沒有與化合物進(jìn)行接 觸。這種活性的增加或者降低鑒定出該候選化合物能夠有效的調(diào)節(jié)程序性死亡多肽-1的 活性或者表達(dá)。細(xì)胞毒素活性包括細(xì)胞因子的生成，T細(xì)胞的擴(kuò)增以及病毒的清除。
[0015] 本發(fā)明進(jìn)一步提供一種篩選方法，包括下列步驟：(a)將程序性死亡多肽-1與候 選化合物進(jìn)行接觸；(b)測定上述候選化合物是否與程序性死亡多肽-1發(fā)生相互作用；以 及（C)鑒定出該候選化合物對于調(diào)節(jié)程序性死亡多肽-1的表達(dá)或者活性是有效的。所期 望的是，被鑒定的候選化合物與程序性死亡多肽-1發(fā)生相互作用，并且減少其活性。
[0016] 使用這里描述的篩選方法鑒定的候選化合物可以減少程序性死亡多肽-1與程序 性死亡多肽-1配體間的相互作用，或者減少程序性死亡多肽-1與程序性死亡多肽-1配體 2間的相互作用。這里描述的篩選方法中使用的細(xì)胞包括哺乳動物細(xì)胞例如嚙齒動物細(xì)胞 或者人類細(xì)胞。所述細(xì)胞是免疫細(xì)胞，例如T細(xì)胞。所期望的是，在這類篩選方法中使用的 程序性死亡多肽-1是人類程序性死亡多肽-1。
[0017] 這里還提供了一種用于診斷宿主是否已經(jīng)患有持續(xù)性感染或腫瘤、或者存在患有 持續(xù)性感染或腫瘤的危險(xiǎn)的方法，包括下列步驟：(a)提供一個(gè)來自于宿主的含有免疫細(xì) 胞（例如，T細(xì)胞或者B細(xì)胞）的樣品；并且（b)測定程序性死亡多肽-1在樣品中的表達(dá) 或者活性。與對照樣品中的表達(dá)或者活性相比，程序性死亡多肽-1的表達(dá)或者活性的增加 鑒定出該宿主已經(jīng)患有持續(xù)性感染或腫瘤，或者存在患有持續(xù)性感染或者腫瘤的危險(xiǎn)。所 期望的是，步驟（b)包括鑒定抗原特異性免疫細(xì)胞，例如病毒抗原，細(xì)菌抗原，寄生蟲抗原， 或者真菌抗原。
[0018] 還公開了一種為患有持續(xù)性感染或腫瘤、或者存在患有持續(xù)性感染或腫瘤的宿 主選擇治療方式的方法。該方法包括下列步驟：(a)提供一個(gè)來自于宿主的含有免疫細(xì)胞 (例如，T細(xì)胞或者B細(xì)胞）的樣品；并且（b)測定程序性死亡多肽-1在免疫細(xì)胞中的表 達(dá)或者活性，這樣，與對照樣品中的表達(dá)或者活性相比，程序性死亡多肽-1的表達(dá)或者活 性的增加鑒定出該宿主已經(jīng)患有持續(xù)性感染或腫瘤、或者存在患有持續(xù)性感染或者腫瘤的 危險(xiǎn)；以及（c)為診斷為已經(jīng)患有持續(xù)性感染或腫瘤、或者被診斷為存在患有持續(xù)性感染 或腫瘤的危險(xiǎn)的宿主選擇治療方式，所述的治療方式包括一種能夠減少程序性死亡多肽-1 的表達(dá)或者活性的化合物。所期望的是，步驟（b)包括鑒定抗原特異性免疫細(xì)胞，例如病毒 抗原，細(xì)菌抗原，寄生蟲抗原，或者真菌抗原。
[0019] 來自于宿主的樣品包括血液樣品，活體組織，以及骨髓樣品。而且，對照細(xì)胞可以 來自于不患有持續(xù)性感染或者不存在患有持續(xù)性感染的危險(xiǎn)的宿主。
[0020] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種組合物，該組合物包括：(a)能夠降低程序性死亡多 肽-1的活性水平的化合物；以及（b)另外一種化合物，例如抗病毒化合物，抗細(xì)菌化合物， 抗真菌化合物，抗寄生蟲化合物，抗炎癥化合物，止痛劑，抗細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4抗 體，抗B、T淋巴細(xì)胞衰減因子抗體，抗CD28抗體，抗可誘導(dǎo)共刺激分子（ICOS)抗體，抗可誘 導(dǎo)共刺激分子配體抗體，抗B7-1抗體，抗B7-2抗體，抗B7-H3抗體，或者抗B7-H4抗體。
[0021] 本發(fā)明還提供了一種試劑盒，該試劑盒包括（a)能夠降低程序性死亡多肽-1的活 性水平的化合物；以及（b)用于說明如何向宿主施用該化合物的說明書?；蛘?，該試劑盒包 括（a)能夠降低程序性死亡多肽-1的活性水平的第一種化合物；(b)另外一種化合物，例 如抗病毒化合物，抗細(xì)菌化合物，抗真菌化合物，抗寄生蟲化合物，抗炎癥化合物，止痛劑， 抗細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4抗體，抗B、T淋巴細(xì)胞衰減因子抗體，抗CD28抗體，抗可誘 導(dǎo)共刺激分子（ICOS)抗體，抗可誘導(dǎo)共刺激分子配體抗體，抗B7-1抗體，抗B7-2抗體，抗 B7-H3抗體，或者抗B7-H4抗體；以及（c)用于說明如何向宿主施用所述第一種化合物和第 二種化合物的說明書。
[0022] 與用于治療、預(yù)防以及減輕或者緩解持續(xù)性感染的一種或者多種癥狀的標(biāo)準(zhǔn)治療 方法相比，本發(fā)明的方法提供了顯著的優(yōu)點(diǎn)。施用能夠降低程序性死亡多肽-1的活性水平 的治療制劑增加了 CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性，由此增加了對可引起持續(xù)性感染的感染性制劑 的免疫應(yīng)答。除此之外，本發(fā)明提供的篩選候選化合物的方法也涉及新療法的鑒定，用來修 飾損傷處理，而不僅僅是減輕癥狀。
[0023] 除非特別定義，這里使用的全部技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語都具有發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通 技術(shù)人員理解的通常含義。盡管在本發(fā)明的實(shí)踐或試驗(yàn)中可以使用與這里描述的方法和物 質(zhì)相類似或者等同的方法和物質(zhì)，但下面描述了適合的方法和物質(zhì)。這里提及的全部公開 出版物、專利申請、專利、以及其他參考文件的全部內(nèi)容都在此引入作為參考。如果產(chǎn)生矛 盾，則以這里的詳細(xì)描述包括定義為準(zhǔn)。除此之外，這里提及的物質(zhì)、方法和實(shí)施例僅僅是 描述性的，并不構(gòu)成限制。
[0024] 本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將從下面的詳細(xì)描述以及權(quán)利要求中體現(xiàn)出來。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 附圖IA的柱狀圖表示的是使用基因排列分析方法進(jìn)行測量得到的轉(zhuǎn)基因小鼠、 經(jīng)過淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒（LCMV)Armstrong免疫的（大約在感染后30天）感染型 小鼠、或者CD4缺陷型LCMV-C1-13感染型小鼠（大約在感染后30天）的D bGP33-41特異 性T細(xì)胞和/或DbGP276-286特異性T細(xì)胞中的程序性死亡多肽-ImRNA的水平。
[0026] 附圖IB是流式細(xì)胞術(shù)試驗(yàn)得到的一系列圖像，圖像表明大約在感染之后的60 天，在經(jīng)過淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒（LCMV)Armstrong免疫的感染型小鼠和CD4缺陷型 LCMV-C1-13感染型小鼠中，程序性死亡多肽-1在⑶8+四聚體陽性（tetramer+)T細(xì)胞上 進(jìn)行表面表達(dá)。當(dāng)使用LCMV-C1-13病毒（標(biāo)記為"慢性"）產(chǎn)生慢性感染大約60天之后， 免疫無能性CD8+T細(xì)胞在細(xì)胞表面上表達(dá)高水平的程序性死亡多肽-1，但是當(dāng)急性淋巴細(xì) 胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒（LCMV)Armstrong感染（標(biāo)記為"免疫的"）被清除之后，病毒特異性 ⑶8+T細(xì)胞不表達(dá)程序性死亡多肽-1。
[0027] 附圖IC是流式細(xì)胞術(shù)試驗(yàn)得到的一系列圖像，圖像證明了在患有慢性感染的小 鼠和未被感染的小鼠的脾細(xì)胞中存在程序性死亡多肽-1。這證明了程序性死亡多肽-1在 脾細(xì)胞中具有最高水平的表達(dá)，所述脾細(xì)胞是被病毒感染的。
[0028] 附圖2A是一系列散點(diǎn)圖，該圖表明如果在感染后的第23天至第27天時(shí)對感 染了 C1-13的小鼠進(jìn)行治療，與未經(jīng)治療的對照組相比，DbNP396-404特異性⑶8 T細(xì)胞 和DbGP33-41特異性⑶8 T細(xì)胞的數(shù)量增加了大約3倍。為了確定是否會產(chǎn)生功能上 的改變，測定應(yīng)答于8個(gè)不同的淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒（LCMV)抗原決定基的干擾 素 -Y (IFN-Y )和腫瘤壞死因子-a (TNF-α )的生成。
[0029] 附圖2Β的散點(diǎn)圖表明，當(dāng)將所有已知的CD8 T細(xì)胞特異性計(jì)算在內(nèi)時(shí)，淋巴細(xì)胞 脈絡(luò)叢腦膜炎病毒（LCMV)特異性⑶8 T細(xì)胞的總數(shù)量增加了 2. 3倍。
[0030] 附圖2C的一系列流式細(xì)胞術(shù)試驗(yàn)表明應(yīng)答于8個(gè)不同淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病 毒（LCMV)抗原決定基的干擾素 -Y (IFN-Y)和腫瘤壞死因子-a (TNF-α)的生成。
[0031] 附圖2D的散點(diǎn)圖表明，在經(jīng)過治療的小鼠中更多的病毒特異性CD8 T細(xì)胞具有生 成腫瘤壞死因子-a (TNF-α)的能力。
[0032] 附圖2Ε的一系列柱狀圖表明，在脾、肝、肺以及血清中的程序性死亡多肽-1阻滯 劑同樣導(dǎo)致對病毒控制（viral control)的增強(qiáng)。
[0033] 附圖3A的圖表證明，與對照組（標(biāo)記為"untx"）相比，在被感染后的第46天至第 60天時(shí)使用抗程序性死亡多肽-1配體（標(biāo)記為" a TO-L1"）處理⑶-4缺陷型C1-13感染 型小鼠，小鼠的DbGP33-41特異性CD8+T細(xì)胞和DbGP276-286特異性CD8+T細(xì)胞（標(biāo)記為 "GP33"和"GP276"）會增力卩。這證明了與未經(jīng)過處理的小鼠相比，使用抗程序性死亡多肽-1 配體處理過的小鼠含有的DbGP276-286特異性脾臟CD8+T細(xì)胞增加了 7倍，而DbGP33-41 特異性脾臟CD8+T細(xì)胞增加了 4倍。
[0034] 附圖3B中的一系列圖像證明，與對照組（標(biāo)記為"untx"）相比，在被感染后的第 46天至第60天時(shí)使用抗程序性死亡多肽-1配體（標(biāo)記為" a ro-LlTx"）處理⑶-4缺陷型 C1-13感染型小鼠，小鼠脾內(nèi)的DbGP33-41特異性CD8+T細(xì)胞和DbGP276-286特異性CD8+T 細(xì)胞的頻率（frequency)會增加。
[0035] 附圖3C的一系列圖像證明，經(jīng)過抗程序性死亡多肽-1配體處理的小鼠的 DbGP276-286特異性⑶8+T細(xì)胞的擴(kuò)增增加了，該結(jié)果是通過導(dǎo)入BrdU (溴化脫氧尿嘧啶核 苷）和進(jìn)行Ki67表達(dá)來測定的。
[0036] 附圖3D的圖表表明了小鼠產(chǎn)生了高水平的⑶8+T細(xì)胞擴(kuò)張，這證明其對外周血 單個(gè)核細(xì)胞（PBMC)產(chǎn)生了顯著的應(yīng)答，該結(jié)果是通過比較外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)（PBMC)的 DbGP276-286特異性CD8+T細(xì)胞與脾內(nèi)的DbGP276-286特異性CD8+T細(xì)胞而得到的。
[0037] 附圖4A的一系列圖表證明，與對照組相比，在經(jīng)過抗程序性死亡多肽-1配體處 理的小鼠中，生成干擾素 -Y (IFN-γ)的DbGP276-286特異性⑶8+T細(xì)胞增加了。在經(jīng)過 抗程序性死亡多肽-1配體處理的小鼠中，同樣檢測到DbNP396-404特異性⑶8+T細(xì)胞、 KbNP205-212特異性CD8+T細(xì)胞、DbNP166-175特異性CD8+T細(xì)胞以及DbGP92-101特異性 ⑶8+T細(xì)胞的高頻率。
[0038] 附圖4B的圖表證明，在經(jīng)過抗程序性死亡多肽-1配體處理的小鼠中，50%的 DbGP276-286特異性⑶8+T細(xì)胞生成干擾素 -Y (IFN- γ )，而在對照組小鼠中，20 %的 DbGP276-286特異性CD8+T細(xì)胞生成干擾素 -γ (IFN- γ )。
[0039] 附圖4C的一系列圖像證明，與未經(jīng)過處理的慢性感染型小鼠相比，經(jīng)過抗程序性 死亡多肽-1配體處理的慢性感染型小鼠產(chǎn)生較高水平的腫瘤壞死因子-a (TNF-α )，但與 經(jīng)過淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒（LCMV)Armstrong感染的免疫小鼠相比，仍然產(chǎn)生較低水 平的腫瘤壞死因子-a (TNF- α )。
[0040] 附圖4D的圖表證明，與未經(jīng)過處理的感染型小鼠相比，使用抗程序性死亡多肽-1 配體對感染了 LCMV-C1-13的小鼠進(jìn)行處理會恢復(fù)病毒特異性T細(xì)胞的體外裂解活性，該結(jié) 果是通過51Cr釋放試驗(yàn)來測定的。
[0041] 附圖4Ε的一系列圖表證明，當(dāng)使用a PD-Ll對感染了 LCMV-C1-13的小鼠進(jìn)行處 理后，其不同器官中的病毒滴度會降低。與未經(jīng)過處理的對照小鼠相比，在使用抗程序性死 亡多肽-1配體處理兩周之后，其脾內(nèi)的病毒滴度減少大約3倍，肝內(nèi)的病毒滴度減少4倍， 肺內(nèi)的病毒滴度減少2倍，血清中的病毒滴度減少2倍。
[0042] 附圖5Α中的流式細(xì)胞術(shù)試驗(yàn)得到的一系列圖像表示的是程序性死亡多肽-1的表 面表達(dá)，其中使用特異于顯性抗原決定基的10個(gè)人類免疫缺陷型病毒（HIV)四聚體，該顯 性抗原決定基作用于慢性C亞型人類免疫缺陷型病毒（HIV)感染。其中的百分含量指的是 陽性程序性死亡多肽-I(PD-I +)占四聚體陽性細(xì)胞（tetramer+cells)的百分含量。
[0043] 附圖5B的一系列圖表證明，與抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療初級個(gè)體中的CD8 T細(xì)胞總數(shù)相 比（p < 0. 0001)，在HIV (人類免疫缺陷型病毒）-特異性⑶8 T細(xì)胞中程序性死亡多肽-1 的百分含量及平均熒光強(qiáng)度（MFI)發(fā)生了顯著的上調(diào)，與HIV(人類免疫缺陷型病毒）-血 清陰性對照組相比（分別為P = 〇. 0033以及p < 0. 0001)，感染了人類免疫缺陷型病毒后 在全部CD8 T細(xì)胞總數(shù)中程序性死亡多肽-1的數(shù)量增加了。在此項(xiàng)試驗(yàn)中對來自于65個(gè) 感染人類免疫缺陷型病毒的個(gè)體的120個(gè)人類免疫缺陷型病毒四聚體染色（stains)以及 11個(gè)人類免疫缺陷型病毒血清陰性對照組進(jìn)行了分析。
[0044] 附圖5C的一系列圖表表示的是程序性死亡多肽-1在四聚體陽性細(xì)胞中進(jìn)行抗原 決定基特異性表達(dá)的百分?jǐn)?shù)及平均熒光強(qiáng)度（MFI)。
[0045] 附圖的圖表描述了對于多種可探測應(yīng)答來說，個(gè)體中的不同抗原決定基特異 性群體上的程序性死亡多肽-1陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的變化。橫線表示的是每個(gè)個(gè)體的程序性 死亡多肽-1陽性人類免疫缺陷型病毒四聚體陽性細(xì)胞（PD-ΓΗ?ν tetramer+cells)的平均 百分?jǐn)?shù)。
[0046] 附圖6A的一系列圖表表明，人類免疫缺陷型特異性CD8 T細(xì)胞數(shù)量與血漿病毒載 量之間不存在相關(guān)性，這是通過四聚體染色檢驗(yàn)得到的結(jié)果，而在血漿病毒載量與四聚體 陽性細(xì)胞上的程序性死亡多肽-1的百分?jǐn)?shù)和程序性死亡多肽-1的平均熒光強(qiáng)度（MFI)之 間存在正相關(guān)（分別為P = 〇· 0013和p < 0· 0001)。
[0047] 附圖6B的一系列圖表表明，人類免疫缺陷型特異性CD8 T細(xì)胞數(shù)量與CD4計(jì)數(shù)之 間不存在相關(guān)性，而在CD4計(jì)數(shù)與人類免疫缺陷型病毒四聚體陽性細(xì)胞上的程序性死亡多 肽-1的百分?jǐn)?shù)和程序性死亡多肽-1的平均熒光強(qiáng)度（MFI)之間存在負(fù)相關(guān)（分別為p = 0· 0046 和 p = 0· 0150)。
[0048] 附圖6C的一系列圖表表明，全部⑶8 T細(xì)胞群上的程序性死亡多肽-1的百分?jǐn)?shù) 及程序性死亡多肽-1的平均熒光強(qiáng)度（MFI)與血漿病毒載量之間存在正相關(guān)（分別為P =0· 0021 和 p < 0· 0001)。
[0049] 附圖6D的一系列圖表表明，全部⑶8 T細(xì)胞群上的程序性死亡多肽-1的百分?jǐn)?shù)及 程序性死亡多肽-1的平均熒光強(qiáng)度（MFI)與⑶4計(jì)數(shù)之間存在負(fù)相關(guān)（分別為p = 0. 0049 和 p = 0· 0006)。
[0050] 附圖7A的一系列流式細(xì)胞術(shù)試驗(yàn)圖像表示的是來自于宿主SK222的B*4201 TL9 特異性⑶8 T細(xì)胞的代表性的表型染色，其中在該宿主中98%的B*4201 TL9特異性⑶8 T 細(xì)胞是程序性死亡多肽-1陽性的。
[0051] 附圖7B的圖表描述了來自于人的表型數(shù)據(jù)的概括，在這些人中大于95%的人類 免疫缺陷型特異性CD8 T細(xì)胞是程序性死亡多肽-1陽性的。針對每種涉及到的表型標(biāo)記 物，分析7個(gè)到19個(gè)樣品。橫線表示的是四聚體陽性程序性死亡多肽-1陽性細(xì)胞的百分 比中間值，這些細(xì)胞對于上述標(biāo)記物來說是陽性的。
[0052] 附圖8A的一系列流式細(xì)胞術(shù)試驗(yàn)圖像表示的是來自于一個(gè)B*4201陽性宿主的典 型的擴(kuò)增檢測數(shù)據(jù)。在抗程序性死亡多肽-1配體封閉抗體的存在下，使用肽刺激6天之后， B*4201 TL9特異性⑶8 T細(xì)胞的百分含量從5. 7%增加到12. 4%。
[0053] 附圖8B的線形圖描述了擴(kuò)增檢測數(shù)據(jù)的概況，表明當(dāng)抗程序性死亡多肽-1配體 封閉抗體存在時(shí)，人類免疫缺陷型病毒特異性CD8 T細(xì)胞的擴(kuò)增發(fā)生了顯著的增加 （η = 28, ρ = 0· 0006,配對 t 檢驗(yàn)）。
[0054] 附圖8C的柱狀圖表示的是對于同一個(gè)個(gè)體患者來說，程序性死亡多肽-1/程序性 死亡多肽-1配體阻滯劑對人類免疫缺陷型病毒特異性CD8 T細(xì)胞的擴(kuò)增所起的不同作用。 白色的柱表示的是僅使用肽時(shí)四聚體陽性細(xì)胞增加的倍數(shù)，黑色的柱表示的是同時(shí)使用肽 和抗程序性死亡多肽-1配體封閉抗體時(shí)四聚體陽性細(xì)胞增加的倍數(shù)。對試驗(yàn)個(gè)體中的多 于一個(gè)的抗原決定基進(jìn)行CFSE (羧基熒光素雙乙酸鹽琥珀酸酯）檢測，結(jié)果用星號、方塊兒 或者三角表示。

【具體實(shí)施方式】
[0055] 抗生素和疫苗在近幾十年來的應(yīng)用已經(jīng)顯著的降低了由微生物感染而導(dǎo)致的死 亡率。然而，由于某些感染性制劑具備躲避宿主器官免疫系統(tǒng)的能力，使抗微生物治療方式 的成功受到了限制，也因此形成了持續(xù)性感染。例如，針對于例如肝炎病毒和人類免疫缺陷 型病毒這樣的病毒而激發(fā)的免疫應(yīng)答不足以清除感染性制劑，該制劑仍然存在于被感染的 宿主體內(nèi)。在這類感染中，抗原特異性CD8+T細(xì)胞對感染性制劑產(chǎn)生功能性耐受，即以已知 的"免疫無能"或者"衰竭"狀態(tài)存在。免疫無能型T細(xì)胞失去其細(xì)胞毒素活性，即失去了 生成細(xì)胞因子、擴(kuò)增、以及清除感染性制劑的能力。
[0056] 本發(fā)明基于下述令人驚訝的發(fā)現(xiàn)：T細(xì)胞的免疫無能伴隨著程序性死亡多肽-1表 達(dá)的誘發(fā)，這種程序性死亡多肽-1的表達(dá)與某些類型的淋巴增殖性病變相關(guān)。因此，本發(fā) 明提供了增加 T細(xì)胞的細(xì)胞毒性的方法，該方法通過將T細(xì)胞與一種能夠減少程序性死亡 多肽-1、程序性死亡多肽-1配體（PD-Ll)或者程序性死亡多肽-1配體2 (TO-L2)的表達(dá) 或者活性的制劑進(jìn)行接觸來完成的。更具體的，本發(fā)明提供了治療或者預(yù)防持續(xù)性感染或 者淋巴增殖性病變（例如，腫瘤，例如血管淋巴瘤和結(jié)節(jié)性淋巴細(xì)胞為主型的霍奇金淋巴 瘤）的方法，該方法通過給宿主施用一種能夠減少程序性死亡多肽-1的表達(dá)或者活性的 制劑來完成。程序性死亡多肽-1、程序性死亡多肽-1配體或者程序性死亡多肽-1配體2 的表達(dá)或者活性的減少導(dǎo)致細(xì)胞毒性T細(xì)胞活性的增加，增加了對感染性制劑的特異性免 疫應(yīng)答。該方法提供的結(jié)果表明，給患有持續(xù)性感染的小鼠施用抗程序性死亡多肽-1配 體（PD-Ll)封閉抗體會增加免疫無能型T細(xì)胞的細(xì)胞毒素活性。特別的，阻斷程序性死亡 多肽-1的信號會誘發(fā)免疫無能型CD8+T細(xì)胞的擴(kuò)張，增加細(xì)胞因子的生成以及增強(qiáng)病毒的 清除。而且，經(jīng)過抗程序性死亡多肽-1配體治療后，患有持續(xù)性感染的CD4缺陷型小鼠的 CD8+T細(xì)胞會產(chǎn)生擴(kuò)增，并且恢復(fù)大部分的功能。
[0057] 為了使T細(xì)胞對異源蛋白產(chǎn)生應(yīng)答，必須提供兩種抗原呈遞細(xì)胞信號（APCs)使T 淋巴細(xì)胞休眠。第一信號使免疫應(yīng)答具有特異性，該信號在識別了存在于主要組織相容性 復(fù)合體（MHC)中的異源抗原多肽之后，經(jīng)由T細(xì)胞受體（TCR)進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。第二信號，稱為共 刺激性信號，誘導(dǎo)T細(xì)胞擴(kuò)增并具備功能性。共刺激既不是抗原特異性的，也不是主要組織 相容性復(fù)合體限制性的，是由一種或者多種獨(dú)特的細(xì)胞表面多肽引起的，這些細(xì)胞表面多 肽是抗原呈遞細(xì)胞（APCs)表達(dá)的。如果T細(xì)胞僅僅在T細(xì)胞受體中受到刺激，而不接收額 外的共刺激性信號，它們會變得無應(yīng)答，免疫無能，或者死亡，從而導(dǎo)致對免疫應(yīng)答的下調(diào) 節(jié)。
[0058] 在抗原呈遞細(xì)胞（APCs)上表達(dá)的⑶80 (B7-1)和⑶86 (B7-2)蛋白是臨界共刺激 多肽。由于在初級免疫應(yīng)答中B7-2占支配性地位，隨后在免疫應(yīng)答期間B7-1發(fā)生上調(diào) 節(jié)，以延長初級T細(xì)胞應(yīng)答或者共刺激刺激T細(xì)胞應(yīng)答。B7多肽能夠向免疫細(xì)胞發(fā)出共刺 激性信號或者抑制信號，來促進(jìn)或者抑制免疫細(xì)胞應(yīng)答。例如，當(dāng)程序性死亡多肽-1配體 (B7-4)以一種可溶形式存在時(shí)，將其與一種共刺激受體結(jié)合，其會誘發(fā)免疫細(xì)胞的共刺激 或者抑制免疫細(xì)胞的共刺激。當(dāng)與抑制性受體相結(jié)合時(shí)，B7-4分子可以向免疫細(xì)胞傳輸一 種抑制性信號。范例性的B7家族成員包括B7-1，B7-2, B7-3 (由抗體BB-I識別），B7h (程 序性死亡多肽-1配體），以及B7-4和它們的可溶性片段或者衍生物。B7家族成員與免疫 細(xì)胞上的一種或者多種受體相結(jié)合，例如細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原-4 (CTLA-4)，CD28,可誘 導(dǎo)共刺激分子（IC0S)，程序性死亡多肽-1和/或其他受體，并且，B7家族成員具有向免疫 細(xì)胞傳輸抑制性信號或者共刺激性信號的能力，信號的種類取決于受體。
[0059] ⑶28是一種主要在休眠性T細(xì)胞上表達(dá)的受體。當(dāng)信號經(jīng)過T細(xì)胞受體后，⑶28 的結(jié)合和共刺激性信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)誘發(fā)T細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增并且分泌白細(xì)胞介素-2 (IL-2)。細(xì)胞毒 性T淋巴細(xì)胞抗原-4(CD152)是一種與CD28同源的受體，該受體在休眠性T細(xì)胞中缺失， 但T細(xì)胞被激活后會誘導(dǎo)其表達(dá)。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原-4(CTLA-4)在T細(xì)胞應(yīng)答的 負(fù)性調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用?？烧T導(dǎo)共刺激分子（ICOS)，一種與CD28和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗 原-4相關(guān)的多肽，參與白細(xì)胞介素-IO(IL-IO)的生產(chǎn)。程序性死亡多肽-1，程序性死亡多 肽-1配體及程序性死亡多肽-1配體2結(jié)合的受體，也被迅速誘導(dǎo)于T細(xì)胞表面。程序性 死亡多肽同樣在B細(xì)胞表面進(jìn)行表達(dá)（應(yīng)答于抗免疫球蛋白M)，也在胸腺細(xì)胞及骨髓細(xì)胞 子集中表達(dá)。
[0060] 程序性死亡多肽-1的結(jié)合（例如通過交聯(lián)或者聚合的方式）導(dǎo)致了免疫細(xì)胞中 抑制性信號的傳輸，從而減少了免疫應(yīng)答，隨之增加了免疫細(xì)胞的免疫無能性。程序性死亡 多肽-1家族成員與抗原呈遞細(xì)胞上的一種或者多種受體相結(jié)合，例如程序性死亡多肽-1 配體以及程序性死亡多肽-1配體2。
[0061] 程序性死亡多肽-1配體和程序性死亡多肽-1配體2都是人類程序性死亡多肽-1 的配體多肽，是B7多肽家族的成員。每種程序性死亡多肽-1配體含有一個(gè)信號序列，一個(gè) IgV結(jié)構(gòu)域，一個(gè)IgC結(jié)構(gòu)域，一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，以及一個(gè)短的胞質(zhì)尾區(qū)。這些配體在胎盤、 脾臟、淋巴結(jié)、胸腺以及心臟中表達(dá)。程序性死亡多肽-1配體2還在胰腺、肺以及肝中表達(dá)， 而程序性死亡多肽-1配體在胎兒的肝中、活化的T細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)。兩種程序性 死亡多肽-1配體都在活化的單核細(xì)胞以及樹突細(xì)胞中發(fā)生上調(diào)節(jié)。
[0062] 定義
[0063] 這里使用的"持續(xù)性感染"指的是感染性制劑（例如，病毒，細(xì)菌，寄生蟲，支原體， 或者真菌）不能從被感染宿主中被清除或者除去的感染，即使在誘發(fā)了免疫應(yīng)答之后。持 續(xù)性感染可以是慢性感染，潛伏性感染，或者慢感染。急性感染時(shí)間比較短（持續(xù)幾天或 者幾個(gè)星期），并且可以通過免疫系統(tǒng)從機(jī)體中分解出來，而持續(xù)性感染可能持續(xù)幾個(gè)月， 幾年，甚至是一生。這類感染也可能在一段長的時(shí)間內(nèi)頻繁復(fù)發(fā)，包括隱性感染以及產(chǎn)毒 性感染階段，不具備細(xì)胞殺傷能力或者甚至對宿主細(xì)胞產(chǎn)生過多的損傷。即使在免疫應(yīng)答 結(jié)束后，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)也可以在宿主中（例如，在被感染個(gè)體的特異性細(xì)胞內(nèi)）檢測到引 起感染的感染性制劑。使用本領(lǐng)域已知的任何標(biāo)準(zhǔn)方法診斷患有持續(xù)性感染的哺乳動物， 在例如下列文件中描述，美國專利號碼6368832,6579854以及6808710,美國專利申請公開 號碼 20040137577, 20030232323, 20030166531，20030064380, 20030044768, 20030039653， 20020164600, 20020160000, 20020110836, 20020107363,以及 20020106730,上述所有文件 在此引入作為參考。例如，在使用PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）分析法對來自于宿主生物樣本中 的衣原體種類進(jìn)行探測之后，可以將該宿主診斷為患有持續(xù)性衣原體感染。沒有被診斷為 患有持續(xù)性感染的哺乳動物不需要依據(jù)本發(fā)明進(jìn)行治療。能夠引起持續(xù)性感染的微生物包 括病毒（例如，乳突淋瘤，肝炎病毒，人類免疫缺陷型病毒，以及皰疹病毒），細(xì)菌（例如，大 腸埃希氏桿菌，以及衣原體屬），寄生蟲（例如，瘧原蟲，利什曼原蟲屬，裂體吸蟲屬，錐形蟲 屬，弓形蟲屬）以及真菌。
[0064] "緩解持續(xù)性感染的癥狀"指的是在持續(xù)性感染發(fā)生之前或者之后，改善與持續(xù)性 感染相關(guān)的任何狀況或者癥狀?；蛘?，緩解持續(xù)性感染的癥狀可以包括減少負(fù)載于宿主中 的感染性微生物（例如，病毒，細(xì)菌，真菌，支原體，或者寄生蟲），這種減少是相對于未接受 治療的對照組中的載量而言的。與未接受治療的對照組相比，這種減少或者預(yù)防的程度為 至少 5%，10%，20%，40%，50%，60%，80%，90%，95%，或者 100%，通過任何標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測 得的結(jié)果。所期望的是，如果使用本領(lǐng)域任何的已知標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)檢測到持續(xù)性感染被完全清 除了，這種情況就表明持續(xù)性感染被治愈了。接受持續(xù)性感染治療的患者是醫(yī)學(xué)從業(yè)者已 經(jīng)診斷為具有這種癥狀的人。診斷可以通過任何適當(dāng)?shù)姆绞竭M(jìn)行。診斷和監(jiān)測可以包括例 如檢測生物樣品中（例如，活體組織，血液測試，或者尿液測試）的微生物載量，檢測生物樣 品中微生物感染的替代標(biāo)記（surrogate marker)的水平，檢測與持續(xù)性感染相關(guān)的癥狀， 或者檢測持續(xù)性感染的典型免疫應(yīng)答中存在的免疫細(xì)胞（例如，檢測免疫無能型抗原特異 性T細(xì)胞）。對于已經(jīng)預(yù)防了持續(xù)性感染的形成的患者來說，可以接受或者不接受上述診 斷。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，可以對這些患者進(jìn)行上述標(biāo)準(zhǔn)測試，也可以在不進(jìn)行檢查 的情況下確診該患者由于具有一種或者多種危險(xiǎn)因素（例如，家族病史或者接觸感染性制 齊U)而存在患病的高度危險(xiǎn)。
[0065] 這里使用的"程序性死亡多肽-I (PD-I) "指的是能夠與程序性死亡多肽-1配體 蛋白或者程序性死亡多肽-1配體2蛋白形成復(fù)合體的多肽，也因此參與免疫應(yīng)答，例如 T細(xì)胞的共刺激。本發(fā)明的程序性死亡多肽-1蛋白與天然存在的程序性死亡多肽-1在 本質(zhì)上等同（例如，參見Ishida等人于1992年在EMBO J. 11 :3887-3895中發(fā)表的文章； Shinohara等人于1994年在Genomics (《遺傳學(xué)》)23 :704-706中發(fā)表的文章，以及美國專 利NO. 5698520,在此引入作為參考）。程序性死亡多肽-1的信號可以通過例如減少T細(xì)胞 的擴(kuò)增、細(xì)胞因子的生成或者病毒的清除來降低CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性。根據(jù)本發(fā)明，程序 性死亡多肽-1以低于對照水平的至少5%，10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%， 90%，或者多于100%的水平降低CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒素活性，該結(jié)果是通過任何標(biāo)準(zhǔn)方法 測量得到的。
[0066] "程序性死亡多肽-1基因"指的是編碼程序性死亡多肽-1蛋白的核酸。
[0067] "程序性死亡多肽-1融合基因"指的是一個(gè)程序性死亡多肽-1啟動子和/或與 另外一個(gè)異源核酸序列形成可操作連接的程序性死亡多肽-1編碼區(qū)域的全部或者一部 分。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的另外一個(gè)異源核酸序列是報(bào)道基因，該基因的表達(dá)可以 被測定；報(bào)道基因包括但不局限于，編碼葡萄糖苷酸酶（GUS)、熒光素酶、氯霉素轉(zhuǎn)乙酰酶 (CAT)、綠色熒光蛋白（GFP)、堿性磷酸酶、以及β-半乳糖苷酶的基因。
[0068] "減少程序性死亡多肽-1的表達(dá)或者活性"指的是降低程序性死亡多肽-1的水平 或者生物活性，這種降低是與未接受治療的對照組中的程序性死亡多肽-1水平或者生物 活性相比而言的。根據(jù)本發(fā)明，相對于未接受治療的對照組相比，這種水平或者活性降低了 至少 5%，10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%，甚至多于 100%。例 如，如果將程序性死亡多肽-1與程序性死亡多肽-1配體、程序性死亡多肽-1配體2或者 程序性死亡多肽-1配體和程序性死亡多肽-1配體2進(jìn)行結(jié)合，程序性死亡多肽-1的生物 活性會降低，從而導(dǎo)致程序性死亡多肽-1的信號減弱，因此增加 CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性。 這里使用的關(guān)于程序性死亡多肽-1的術(shù)語"活性"包括天然存在的程序性死亡多肽-1蛋 白具有的任何活性，例如在活化的免疫細(xì)胞中調(diào)節(jié)抑制性信號的能力，例如通過與抗原呈 遞細(xì)胞上的天然配體相結(jié)合的方式。這種對免疫細(xì)胞中的抑制性信號的調(diào)節(jié)作用導(dǎo)致對擴(kuò) 增和/或由免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子進(jìn)行的調(diào)節(jié)。程序性死亡多肽-1也可以調(diào)節(jié)共刺激 性信號，通過與共刺激受體競爭結(jié)合Β7分子來調(diào)節(jié)。因此，術(shù)語"程序性死亡多肽-1活性" 包括程序性死亡多肽-1與其天然配體相結(jié)合的能力，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞共刺激性信號或者抑 制性信號的能力，以及調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的能力。因此，降低程序性死亡多肽-1的活性包括減 少程序性死亡多肽-1與程序性死亡多肽-1配體或者程序性死亡多肽-1配體2的相互作 用。這可以通過例如阻滯程序性死亡多肽-1配體或者程序性死亡多肽-1配體2來完成。 [0069] "免疫細(xì)胞"指的是在免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用的造血起源細(xì)胞。免疫細(xì)胞包括淋巴細(xì) 胞（例如，B細(xì)胞和T細(xì)胞），天然殺傷細(xì)胞，以及骨髓細(xì)胞（例如，單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，嗜 曙紅細(xì)胞，肥大細(xì)胞，嗜堿細(xì)胞，以及粒細(xì)胞）。
[0070] "Τ細(xì)胞"指的是⑶4+Τ細(xì)胞或者⑶8+Τ細(xì)胞。術(shù)語T細(xì)胞包括THl細(xì)胞和ΤΗ2細(xì) 胞。
[0071] 術(shù)語"Τ細(xì)胞的細(xì)胞毒性"包括由CD8+T細(xì)胞活性介導(dǎo)的任何免疫應(yīng)答。范例性的 免疫應(yīng)答包括細(xì)胞因子的生成，CD8+T細(xì)胞的擴(kuò)增，粒酶或者穿孔素的生成，以及感染性制 劑的清除。
[0072] "無應(yīng)答性"包括免疫細(xì)胞對刺激的屈光性（refractivity)，例如經(jīng)過活化受體 或者細(xì)胞因子的刺激。無應(yīng)答性可以發(fā)生在例如暴露于免疫抑制劑或者暴露于高劑量抗 原的情況中。這里使用的術(shù)語"免疫無能性"或者"耐受性"包括對活化受體介導(dǎo)的刺激的 屈光性。這種屈光性通常是抗原特異性的，并且在與tolerizing抗原的接觸終止之后仍 然持續(xù)。例如，T細(xì)胞的免疫無能性（與無應(yīng)答性相反）的特征是細(xì)胞因子例如白細(xì)胞介 素-2 (IL-2)的產(chǎn)量的缺失。當(dāng)T細(xì)胞暴露于抗原并且在第二信號（共刺激性信號）缺失 的條件下接受了第一信號（T細(xì)胞受體或者CD-3介導(dǎo)的信號）時(shí)，T細(xì)胞的免疫無能性產(chǎn)生 了。在這種情況下，將細(xì)胞重新暴露于相同抗原（即使這種重新暴露在共刺激分子存在的 情況下發(fā)生）會導(dǎo)致生產(chǎn)細(xì)胞因子的失敗，也因此導(dǎo)致了擴(kuò)增的失敗。然而，如果使用細(xì)胞 因子（例如白細(xì)胞介素-2)對免疫無能型T細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，所述T細(xì)胞可以對不相關(guān)抗原 產(chǎn)生應(yīng)答并且發(fā)生擴(kuò)增。例如，由T淋巴細(xì)胞生成的白細(xì)胞介素-2的缺乏可以導(dǎo)致T細(xì)胞 的免疫無能，該結(jié)果是通過ELISA (酶聯(lián)免疫吸附測定）進(jìn)行測定的，或者使用指示細(xì)胞系 進(jìn)行的擴(kuò)增試驗(yàn)來測定的?；蛘撸梢岳脠?bào)道基因的構(gòu)建。例如，在5'白細(xì)胞介素-2基 因增強(qiáng)子或者在該增強(qiáng)子內(nèi)發(fā)現(xiàn)的APl序列多聚體的控制下，免疫無能型T細(xì)胞不能激發(fā) 由異源啟動子誘導(dǎo)的白細(xì)胞介素-2基因轉(zhuǎn)錄（參見Kang等人于1992年在Science (《科 學(xué)》）257 :1134中發(fā)表的文章）。免疫無能的抗原特異性T細(xì)胞可以減少至少10%，20%， 30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，95%，或者甚至100 %的細(xì)胞毒素活性，與相應(yīng)的 對照組抗原特異性T細(xì)胞相比而言。
[0073] "純化抗體"指的是至少60%的重量不含蛋白質(zhì)以及與其天然相關(guān)的天然存在的 有機(jī)分子的抗體。優(yōu)選的，該重量為抗體重量的至少75%，更優(yōu)選為90%，最優(yōu)選為至少 99%，抗體的例子例如程序性死亡多肽-1特異性抗體，程序性死亡多肽-1配體特異性抗 體，或者程序性死亡多肽-1配體2特異性抗體。純化抗體可以通過例如親合色譜法來制備， 該方法使用重組蛋白或者保守基序多肽以及標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)完成。
[0074] "特異性結(jié)合"指的是識別和結(jié)合于一種抗原例如程序性死亡多肽-1、程序性死 亡多肽-1配體多肽、或者程序性死亡多肽-1配體2多肽的抗體在本質(zhì)上不能與樣品例如 天然的含有蛋白的生物樣品中的其他非抗原分子進(jìn)行識別和結(jié)合。與程序性死亡多肽-1、 程序性死亡多肽-1配體多肽、或者程序性死亡多肽-1配體2多肽結(jié)合的優(yōu)選抗體在下 列文獻(xiàn)中被公開：美國專利NO. 6808710,美國專利申請Nos. 20040137577,20030232323， 20030166531,20030064380,20030044768,20030039653,20020164600,20020160000, 20020110836, 20020107363,以及20020106730,上述全部文件在此引入作為參考。
[0075] "中和抗體"指的是影響程序性死亡多肽-1的任何生物活性、特別是影響其減少免 疫應(yīng)答例如T細(xì)胞的細(xì)胞毒性的能力的抗體。所述中和抗體使程序性死亡多肽-1減少免 疫應(yīng)答的能力優(yōu)選降低50%，更優(yōu)選降低70%，最優(yōu)選降低90%或者更多。可以使用測試 免疫應(yīng)答的任意標(biāo)準(zhǔn)方法來評價(jià)潛在的中和抗體，包括使用這里描述的方法。
[0076] 涉及到蛋白或者多肽的"本質(zhì)上等同"指的是與參考氨基酸序列相比，這類蛋白或 者多肽表現(xiàn)出至少75 %、優(yōu)選85 %、更優(yōu)選90 %、最優(yōu)選95 %、或者甚至99 %的同一性。對 于蛋白或者多肽來說，比較序列的長度通常為至少20個(gè)氨基酸，優(yōu)選至少30個(gè)氨基酸，更 優(yōu)選至少40個(gè)氨基酸，最優(yōu)選至少50個(gè)氨基酸，或者是該蛋白或者多肽的全長。編碼這類 "本質(zhì)上等同"的蛋白或者多肽的核酸構(gòu)成了"本質(zhì)上等同"的核酸的例子；由于遺傳密碼的 簡并性，這類核酸被公認(rèn)為包括編碼上述蛋白或者多肽的任意序列。除此之外，"本質(zhì)上等 同"的核酸序列還包括在高度嚴(yán)格的條件下與參考核酸分子雜交的多核苷酸。
[0077] "高度嚴(yán)格的條件"指的是被設(shè)置為高溫、低離子強(qiáng)度的任意條件，并且可以發(fā)生 與下列條件下進(jìn)行的相似的雜交：使用至少40個(gè)核苷長度的DNA探針、在含有0. 5M磷酸 氫鈉的緩沖液中、PH 7. 2、7%十二烷基磺酸鈉（SDS)、lmM乙二胺四乙酸（EDTA)、以及1% 牛血清白蛋白（BSA)(片段V)，65°C下進(jìn)行的雜交，或者是在含有48%甲酰胺、4. 8XSSC、 0. 2M Tris-鹽酸的緩沖液中，PH 7.6，1X Denhardt' s溶液，10%葡聚糖硫酸酯以及0. 1% 十二烷基磺酸鈉（SDS)，42°C下進(jìn)行的雜交。高度嚴(yán)格雜交的其他條件，例如PCR(聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）、Northern雜交、Southern雜交、或者原位雜交的條件是分子生物學(xué)領(lǐng)域的技 術(shù)人員熟知的。參見例如F. Ausubel等人于1998年在Current Protocol in Molecular Biology (《分子生物學(xué)當(dāng)代規(guī)程》），John Wiley&Sons，New York, N. Y中發(fā)表的文章，該文 章在此引入作為參考。
[0078] "本質(zhì)上純的"指的是已經(jīng)與其天然共存的組分進(jìn)行分離了的核酸、多肽或者其他 分子。典型的，當(dāng)所述多肽至少60 %、70%、80 %、90%、95 %、或者甚至99 %的重量不含蛋 白質(zhì)以及與其天然相關(guān)的天然存在的有機(jī)分子時(shí)，上述多肽是本質(zhì)上純的。例如，本質(zhì)上純 的多肽可以通過從天然來源中提取的方式獲得，或者通過在通常不表達(dá)蛋白的細(xì)胞中表達(dá) 重組核酸的方法獲得，或者通過化學(xué)合成的方法獲得。
[0079] 術(shù)語"分離的DNA"指的是不含有來自于有機(jī)體天然存在的基因組、與DNA側(cè)面連 接的基因的DNA。因此，術(shù)語"分離的DNA"包括例如cDNA，克隆的基因組DNA，以及合成DNA。
[0080] "有效劑量"指的是減少或者預(yù)防高血壓或者治療或預(yù)防哺乳動物慢性感染所需 要的以單獨(dú)的或者組合物形式存在的化合物的量?；钚曰衔锏挠行┝扛鶕?jù)給藥路徑、 宿主年齡、宿主體重、以及宿主的大致健康狀況而不同。最終，主治醫(yī)師或者獸醫(yī)會決定合 適的劑量以及給藥方案。
[0081] "候選化合物"指的是天然存在的或者人工合成的化學(xué)制劑。候選化合物可以包 括，例如，肽，多肽，合成有機(jī)分子，天然有機(jī)分子，核酸分子，肽核酸分子，以及上述物質(zhì)的 成分和衍生物。例如，根據(jù)本發(fā)明，一個(gè)有效的候選化合物能夠減少程序性死亡多肽-1與 程序性死亡多肽-1配體、程序性死亡多肽-1配體2或者與兩者的結(jié)合。
[0082] 術(shù)語"藥物組合物"指的是含有至少一種治療活性制劑或者生物活性制劑、并且適 合施用于患者的任意組合物?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的以及已經(jīng)接受的方法制備上述組合物 中的任意一種，例如，Remington 于 2000年在The Science and Practice of Pharmacy (《藥 劑學(xué)科學(xué)與實(shí)踐》）20sup.th edition (ed. A R Gennaro), Mark Publishing Co.，Easton， Pa中發(fā)表的文章。
[0083] 治療方法
[0084] 通過將T細(xì)胞與一種減少程序性死亡多肽-1的表達(dá)或者活性的化合物相接觸，來 增加 T細(xì)胞的細(xì)胞毒性。所述T細(xì)胞是天然T細(xì)胞，記憶性T細(xì)胞或者活化T細(xì)胞。或者， 所述T細(xì)胞是一種抗原特異性T細(xì)胞。這種抗原特異性T細(xì)胞對于感染性制劑來說是免疫 無能的或者是耐受的。T細(xì)胞的細(xì)胞毒性的特征是增加了的細(xì)胞擴(kuò)增和細(xì)胞因子釋放。
[0085] 本方法有效的緩解了各種感染和腫瘤引起的癥狀。通過向宿主施用程序性死亡多 肽-1抑制劑，達(dá)到治療或者預(yù)防感染或者腫瘤、或者緩解由此帶來的癥狀的目的。所述的 宿主是哺乳動物例如人類，靈長類，鼠類，狗，貓，牛，馬以及豬。所述的宿主患有感染或者存 在患有感染的危險(xiǎn)。所述患有感染或者存在患有感染危險(xiǎn)的宿主可以進(jìn)行適用于特殊感染 的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行治療。
[0086] 所述的感染例如細(xì)菌、病毒、真菌、支原體、或者寄生蟲感染是一種持續(xù)性感染。持 續(xù)性感染不同于急性感染，不能通過宿主免疫應(yīng)答的誘發(fā)被有效的清除。感染性制劑和免 疫應(yīng)答達(dá)到一種平衡，使得被感染宿主在很長一段時(shí)間內(nèi)保持著感染性，而不必須表現(xiàn)出 癥狀。持續(xù)性感染包括例如，潛伏性感染，慢性感染以及慢感染。
[0087] 在慢性感染中，任何時(shí)刻都能夠從機(jī)體中檢測到感染性制劑的存在。然而，在一段 很長的時(shí)間內(nèi)該疾病的跡象和癥狀可能出現(xiàn)，也可能不出現(xiàn)。慢性感染的例子包括肝炎B 腺病毒（由B型肝炎病毒引起）和肝炎C腺病毒（由C型肝炎病毒引起），細(xì)胞巨化病毒， Epstein-Barr病毒，單純皰疫病毒1，單純皰疫病毒2,人類皰疫病毒6,霍亂弧菌病毒，B型 肝炎病毒，D型肝炎病毒，乳頭瘤病毒，細(xì)小病毒B19,多瘤病毒BK,多瘤病毒JC，麻疫病毒， 風(fēng)疹病毒，人類免疫缺陷型病毒（HIV)，人類T細(xì)胞白血病病毒I，以及人類T細(xì)胞白血病病 毒II。利什曼原蟲、弓形蟲、錐形蟲、瘧原蟲、裂體吸蟲、以及腦炎微孢子蟲的感染可以引起 寄生蟲性持續(xù)性感染。
[0088] 在潛伏性感染中，感染性制劑（例如病毒）是表面上滅活和靜止的，因此宿主并不 總是表現(xiàn)出跡象或者癥狀。在潛伏性病毒感染中，在癥狀再次出現(xiàn)之前的很長一段時(shí)間內(nèi)， 病毒在宿主中保持一種平衡狀態(tài)，然而，直到疾病被再次激活，才能檢測到實(shí)際的病毒。潛 伏性感染的例子包括由HSV-I (發(fā)熱性皰疹）、HSV-2 (生殖皰疹）以及VZV (禽痘帶狀皰疹） 引起的感染。
[0089] 在慢感染中，感染性制劑的數(shù)量在一段相當(dāng)長的時(shí)間內(nèi)逐漸增加，在這個(gè)過程中 觀察不到明顯的跡象或者癥狀。慢感染的例子包括獲得性免疫功能缺陷綜合癥（由人類免 疫缺陷型病毒-1以及人類免疫缺陷型病毒-2引起的），能在動物體內(nèi)引起腫瘤的慢病毒 屬，以及朊病毒。
[0090] 除此之外，持續(xù)性感染通常作為急性感染的晚期并發(fā)癥而被引發(fā)。例如，在急性 麻疹感染之后可以發(fā)生亞急性硬化全腦炎（SSPE)，或者在風(fēng)疹感染之后可以發(fā)生退化性腦 炎。
[0091] 腫瘤包括例如血管淋巴瘤或者結(jié)節(jié)性淋巴細(xì)胞為主型的霍奇金淋巴瘤。
[0092] 血管淋巴瘤（AIL)是一種激進(jìn)（發(fā)展快速）類型的T細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤，其標(biāo) 志是擴(kuò)大的淋巴結(jié)點(diǎn)和血丙種球蛋白過多（血液中的抗體增多）。其他癥狀包括皮疹，發(fā) 燒，體重減輕，陽性Coomb' s測試或者夜間盜汗。這種惡性疾病通常發(fā)生在成人當(dāng)中。患 者通常在40至90歲之間（年齡平均值為65歲左右），并且多為男性。當(dāng)血管淋巴瘤發(fā)生 時(shí)，肝脾腫大、溶血性貧血以及多克隆高血丙種球蛋白癥也可能隨之發(fā)生。在大約40-50% 的患者中還存在皮膚病變。
[0093] 結(jié)節(jié)性淋巴細(xì)胞為主型的霍奇金淋巴瘤是一種B細(xì)胞腫瘤，起源于具有變異的、 非功能性免疫球蛋白基因的次級淋巴小結(jié)B細(xì)胞。與血管淋巴瘤相似，腫瘤細(xì)胞與濾泡性 樹突狀細(xì)胞的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)相關(guān)聯(lián)。程序性死亡多肽-1的在T細(xì)胞中的表達(dá)與結(jié)節(jié)性淋巴細(xì) 胞為主型的霍奇金淋巴瘤中的⑶20+細(xì)胞相關(guān)，其表達(dá)方式與⑶57+T細(xì)胞中的相似。⑶57 與CXCR5被鑒定為次級淋巴小結(jié)相關(guān)T細(xì)胞的又一個(gè)標(biāo)記，這個(gè)發(fā)現(xiàn)證明了下述結(jié)論：在結(jié) 節(jié)性淋巴細(xì)胞為主型的霍奇金淋巴瘤中的腫瘤細(xì)胞與次級淋巴小結(jié)相關(guān)T細(xì)胞之間具有 高度相關(guān)性。
[0094] 程序性死亡多肽-1抑制劑是具備能夠減少細(xì)胞中程序性死亡多肽-1、程序性死 亡多肽-1配體、或者程序性死亡多肽-1配體2的表達(dá)或者活性的能力的任何制劑。與對 照細(xì)胞中的表達(dá)或者活性相比，程序性死亡多肽-1的表達(dá)或者活性被減少了至少10%， 20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，或者100%。所述對照細(xì)胞指的是沒有使用 程序性死亡多肽-1抑制劑進(jìn)行處理的細(xì)胞。程序性死亡多肽-1的表達(dá)或者活性通過本領(lǐng) 域任何的標(biāo)準(zhǔn)方法來測定，包括這里所描述的方法?？蛇x擇的，程序性死亡多肽-1抑制劑 抑制或者減少程序性死亡多肽-1與程序性死亡多肽-1配體、程序性死亡多肽-1配體2之 一的結(jié)合或者與兩者的結(jié)合。程序性死亡多肽-1抑制劑包括多肽，多核苷酸，小分子拮抗 齊[J，或者siRNA。
[0095] 程序性死亡多肽-1抑制劑多肽包括，例如，能夠減少程序性死亡多肽-1的表達(dá)或 者信號的程序性死亡多肽-1抗體或其片段。范例性的抗體包括抗程序性死亡多肽-1抗體， 抗程序性死亡多肽-1配體抗體,抗程序性死亡多肽-1配體2抗體，抗細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞 抗原-4抗體，抗B、T淋巴細(xì)胞衰減因子抗體，抗CD28抗體，抗可誘導(dǎo)共刺激分子抗體，抗可 誘導(dǎo)共刺激分子配體抗體，抗B7-1抗體，抗B7-2抗體，抗B7-H3抗體，或者抗B7-H4抗體。 [0096] 或者，程序性死亡多肽-1抑制劑是一種能夠影響程序性死亡多肽-1的生物活性 (即程序性死亡多肽-1與程序性死亡多肽-1配體、程序性死亡多肽-1配體2之一的結(jié)合 或者與兩者的結(jié)合）的顯性負(fù)性蛋白，或者是編碼該顯性負(fù)性蛋白的核酸。這種顯性負(fù)性 蛋白是含有下述序列的任何氨基酸分子，該序列與該顯性負(fù)性蛋白相對應(yīng)的野生型蛋白的 至少10個(gè)、20個(gè)、35個(gè)、50個(gè)、100個(gè)、或者多于150個(gè)氨基酸具有至少50%、70%、80%、 90%、95%或者甚至99%的序列同一性。例如，顯性負(fù)性程序性死亡多肽-1發(fā)生變異，使其 不能再與程序性死亡多肽-1配體相結(jié)合。
[0097] 上述顯性負(fù)性蛋白可以作為一種表達(dá)載體進(jìn)行施用。這種表達(dá)載體可以是非病毒 載體，或者是病毒載體（例如，逆轉(zhuǎn)錄酶病毒載體，重組腺病毒相關(guān)病毒載體，或者重組腺 病毒載體）?；蛘?，這種顯性負(fù)性蛋白可以作為重組蛋白直接進(jìn)行全身施用，或者直接施用 于被感染部位，通過利用微注射技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。
[0098] 小分子包括，但不局限于，肽，模擬肽（例如，類肽），氨基酸，氨基酸類似物，多核 苷酸，多核苷酸類似物，核苷，核苷類似物，分子量小于大約5000克的有機(jī)化合物以及無機(jī) 化合物（包括異器官化合物以及有機(jī)金屬化合物），分子量小于大約2000克的有機(jī)化合物 或者無機(jī)化合物，分子量小于大約1000克的有機(jī)化合物或者無機(jī)化合物，分子量小于大約 500克的有機(jī)化合物或者無機(jī)化合物，以及鹽，酯，和這些化合物的其他藥物可接受性形式。 [0099] 程序性死亡多肽-1抑制劑是一種反義分子，一種RNA干擾（SiRNA)分子，或者是 一種作用于程序性死亡多肽-1的表達(dá)或者活性的小分子拮抗劑。術(shù)語"siRNA"指的是阻 止目標(biāo)mRNA進(jìn)行翻譯的雙鏈RNA分子。使用向細(xì)胞中導(dǎo)入siRNA的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，包括以DNA 為模板轉(zhuǎn)錄siRNA的技術(shù)。所述SiRNA包括正義程序性死亡多肽-1核酸序列、正義程序性 死亡多肽-1配體核酸序列、正義程序性死亡多肽-1配體2核酸序列、反義程序性死亡多 肽-1核酸序列、反義程序性死亡多肽-1配體核酸序列、反義程序性死亡多肽-1配體2核 酸序列，或者兩者均包含?？蛇x擇的，從目標(biāo)基因中構(gòu)建一個(gè)siRNA，這樣在一個(gè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中 既含有正義序列也含有反義序列，例如發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在目標(biāo)細(xì)胞中發(fā)生的siRNA與程序性死 亡多肽-1轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、程序性死亡多肽-1配體轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、或者程序性死亡多肽-1配體2轉(zhuǎn) 錄產(chǎn)物的結(jié)合會導(dǎo)致細(xì)胞生成的程序性死亡多肽-1、程序性死亡多肽-1配體、或者程序性 死亡多肽-1配體2的減少。其中寡核苷酸的長度為至少10個(gè)核苷，并且可以與天然存在 的程序性死亡多肽-1轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、程序性死亡多肽-1配體轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、或者程序性死亡多肽-1 配體2轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物具有相同的長度。優(yōu)選的，該寡核苷酸具有19到25個(gè)核苷的長度。最優(yōu) 選的，該寡核苷酸具有少于75個(gè)、50個(gè)、25個(gè)核苷的長度。
[0100] 其他適合的程序性死亡多肽-1抑制劑在例如下述文件中有所描述：美國專利 No. 6808710,美國專利申請 Nos. 20040137577, 20030232323, 20030166531，20030064380， 20030044768,20030039653,20020164600,20020160000,20020110836,20020107363,和 20020106730,上述全部文件在此引入作為參考。
[0101] 程序性死亡多肽-1抑制劑的優(yōu)選劑量是生物活性劑量。生物活性劑量是指能夠 誘發(fā)CD8+T細(xì)胞中的細(xì)胞毒素活性增加、導(dǎo)致針對感染性制劑的特異性免疫應(yīng)答增加的劑 量。所期望的是，這種程序性死亡多肽-1抑制劑具備將抗原特異性免疫細(xì)胞（例如，T細(xì) 胞如⑶8+T細(xì)胞）中的程序性死亡多肽-1的表達(dá)或者活性減少至少5%、10%、20%、30%、 40 %、50 %、60 %、70%、80 %、90 %、或者多于100 %的能力，這些百分?jǐn)?shù)是相對于未經(jīng)過處 理的對照水平而言的?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的任何方法測定免疫細(xì)胞中的程序性死亡多 肽-1的水平或者活性，包括例如Western印跡分析，免疫組織化學(xué)分析，酶聯(lián)免疫吸附測定 分析，以及Northern印跡分析?；蛘?，可以通過評價(jià)程序性死亡多肽-1與程序性死亡多 肽-1配體、程序性死亡多肽-1配體2中的一個(gè)或者兩個(gè)的結(jié)合來測定程序性死亡多肽-1 的生物活性。對程序性死亡多肽-1的生物活性的測定取決于它增加 CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性 的能力，包括例如細(xì)胞因子的生成，感染性制劑的清除以及抗原特異性CD8+T細(xì)胞的擴(kuò)增。 優(yōu)選的，所述制劑減少程序性死亡多肽-1的表達(dá)或者活性，從而增加針對感染性制劑的特 異性免疫應(yīng)答，與未經(jīng)處理的對照水平相比，這種增加為至少5 %、10 %、20 %、30 %、40 %、 50%、60%、70%、80%、90%、或者多于100%。因此，本發(fā)明所述的制劑是具有上述任意一 種或者多種活性的任何制劑。盡管本發(fā)明的制劑優(yōu)選的在CD8+T細(xì)胞中表達(dá)，可以理解，能 夠影響針對持續(xù)性感染的免疫應(yīng)答的任何細(xì)胞都可以運(yùn)用到本發(fā)明的方法中，包括例如B 細(xì)胞。
[0102] 可選擇的，給宿主施用一種或者多種其他的治療劑。其他的治療劑包括，例如，抗 病毒化合物（例如，阿糖腺苷，無環(huán)鳥苷，丙氧鳥苷，valgancyclovir，核苷酸類逆轉(zhuǎn)錄酶抑 制劑（NRTI)(例如，AZT(齊多夫定），ddl (去羥肌苷），ddC(二脫氧胞苷），d4T(司他夫 定），或者3TC(拉米夫定）），非核苷酸類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（NNRTI)(例如，奈韋拉平或者地 拉韋定），蛋白酶抑制劑（沙喹那韋，利托那韋，茚地那韋，或者奈非那韋，利巴韋林，或者干 擾素），抗細(xì)菌化合物，抗真菌化合物，抗寄生蟲化合物，抗炎癥化合物，抗腫瘤化合物或者 止痛劑。
[0103] 其他的治療劑可以在施用程序性死亡多肽-1抑制劑之前、之中或者之后進(jìn)行施 用。例如，將程序性死亡多肽-1抑制劑與其他的治療劑以至少1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小 時(shí)、10小時(shí)、12小時(shí)、18小時(shí)、或者多于24小時(shí)的時(shí)間間隔分別施用?？蛇x擇的，將其他的 治療劑與程序性死亡多肽-1抑制劑配置在一起。當(dāng)所述其他的治療劑存在于不同的組合 物中時(shí)，可以利用不同的給藥路徑。所述制劑的施用量是能夠有效達(dá)到治療、緩解或者預(yù)防 感染的目的的量。
[0104] 程序性死亡多肽-1抑制劑及其他的治療劑的濃度取決于很多因素，包括給藥方 式，作用位點(diǎn)，哺乳動物的生理狀況，以及其他藥物治療因素。因此，可以使用滴定測量法確 定治療劑量，以獲得最佳的安全性和功效性，這是在本領(lǐng)域技工的能力范圍內(nèi)的。確定特定 情況下的合適劑量和給藥方案在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。
[0105] 可選擇的，進(jìn)一步向宿主施用疫苗，該疫苗能夠引起針對于感染性制劑的保護(hù)性 免疫應(yīng)答，其中所述感染性制劑能夠?qū)е鲁掷m(xù)性感染。例如，給宿主接種能夠針對人類免疫 缺陷型病毒（HIV)、肺結(jié)核、流行性感冒、或者C型肝炎引起免疫應(yīng)答的疫苗。范例性的疫 苗在例如下述文件中有所描述：Berzofsky等人于2004年在J. Clin. Invest.(《臨床研究 雜志》）114:456-462中發(fā)表的文章。如果需要，可以使用灌泵升壓注射器（prime booster shot)或者使用佐劑來接種疫苗。
[0106] 程序性死亡多肽-1抑制劑以足以增加 T細(xì)胞例如CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性的量來 施用。T細(xì)胞的細(xì)胞毒性的增加導(dǎo)致免疫應(yīng)答的增加以及持續(xù)性感染的緩解。例如可以通 過免疫細(xì)胞例如T細(xì)胞或者B細(xì)胞擴(kuò)增的增加、細(xì)胞因子生成量的增加、以及感染性制劑清 除率的增加來測定免疫應(yīng)答的增加。這種緩解包括緩解與持續(xù)性感染相關(guān)的一種或者多種 癥狀。與未經(jīng)過治療的宿主相比，施用程序性死亡多肽-1抑制劑能夠以至少lO^dO%、 30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、或者100 %的水平緩解持續(xù)性感染或者緩解由持 續(xù)性感染帶來的一種或者多種癥狀。
[0107] 如果這種治療取得了臨床上的效果，例如減少了感染性制劑在宿主中的載量，則 該治療是有效的。當(dāng)進(jìn)行預(yù)防性的治療時(shí)，"有效"指的是該治療能夠阻止或者預(yù)防感染的 形成?？梢岳萌魏伪绢I(lǐng)域已知的用于診斷或者治療特定感染的方法來測定這種有效性。
[0108] 治療性給藥
[0109] 本發(fā)明包括給宿主施用一種組合物,該組合物包括一種能夠減少程序性死亡多 肽-1的表達(dá)或者活性（在這里使用"程序性死亡多肽-1抑制劑"或者"治療性組合物"表 示）的化合物。
[0110] 治療性化合物的有效劑量優(yōu)選為大約〇. 1毫克/千克至大約150毫克/千克。本 領(lǐng)域技術(shù)人員可以知曉，有效劑量根據(jù)給藥路徑、賦形劑的使用、以及與其他治療方法共同 使用的情況而有所變化，其中所述的其他治療方法包括使用其他抗感染制劑或者治療劑， 用于治療、預(yù)防或者緩解特定感染或者腫瘤引發(fā)的癥狀。通過使用標(biāo)準(zhǔn)方法對患有感染或 者腫瘤（或者存在患有的危險(xiǎn)）的哺乳動物例如人類患者進(jìn)行診斷，來確定治療方案。
[0111] 使用本領(lǐng)域已知的方法向這類個(gè)體施用藥物化合物。優(yōu)選的，該化合物通過口服 給藥、直腸給藥、鼻內(nèi)給藥、局部給藥或者非腸道注射給藥形式施用，其中非腸道注射給藥 形式包括皮下注射、腹膜內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、以及靜脈內(nèi)注射。所述化合物可以進(jìn)行預(yù)防 性的施用，或者是在檢測到感染之后施用?？梢赃x擇的將該化合物配置成治療性藥物混合 物中的一個(gè)組分的形式來治療感染。適合于非腸道注射給藥形式的混合物的例子包括活性 制劑在等壓鹽溶液、5%葡萄糖溶液、或者在其他標(biāo)準(zhǔn)的藥物學(xué)可接受賦形劑中形成的含水 溶液的形式。標(biāo)準(zhǔn)的增溶劑例如聚乙烯吡咯烷酮（PVP)或者環(huán)糊精也可以作為藥物學(xué)賦形 劑來使用，用于運(yùn)送治療性化合物。
[0112] 這里描述的治療性化合物可以利用通常的方法制備成組合物形式，以其他的給藥 方式進(jìn)行施用。例如，將程序性死亡多肽-1抑制劑制備成膠囊或者片劑的形式用于口服給 藥。膠囊可以包含任何標(biāo)準(zhǔn)的藥物學(xué)可接受原料例如凝膠或者纖維素。片劑可以根據(jù)傳統(tǒng) 的加工方法通過壓縮治療性化合物與固體載體以及潤滑劑的混合物來制備。固體載體的例 子包括淀粉和鹿糖膨潤土（sugar bentonite)。以硬殼狀片劑或者膠囊的形式施用該化合 物，其中硬殼狀片劑或者膠囊中含有粘合劑，例如乳糖或者甘露醇，傳統(tǒng)的填充劑，以及成 片劑。其他的形式包括藥膏、栓劑、藥糊、噴霧、藥片、乳液、凝膠、重復(fù)吸收的海綿、或者泡沫 形式。這類形式可以通過本領(lǐng)域熟知的方法進(jìn)行制備。
[0113] 當(dāng)所述的治療性化合物是編碼蛋白質(zhì)的核酸時(shí)，該治療性核酸以體內(nèi)給藥的形式 被施用，促進(jìn)其編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)，通過將其構(gòu)建成合適的核酸表達(dá)載體的一部分并且 進(jìn)行施用，使其變?yōu)榧?xì)胞內(nèi)物質(zhì)（例如，通過使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，通過直接注射，通過使 用微粒子轟擊，通過涂覆脂質(zhì)體或者細(xì)胞表面受體或者轉(zhuǎn)染性制劑，或者通過與已知的進(jìn) 入核子中的同源盒樣肽（homeobox-like peptide)聯(lián)接施用（參見例如Joliot等人于 1991年在Proc. Natl Acad Sci USA 88 :1864-1868中發(fā)表的文章），以及類似的方法）。或 者，將核酸治療劑導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)并且導(dǎo)入宿主細(xì)胞DNA中用于進(jìn)行表達(dá)，以同源重組物的形 式或者仍然以游離型載體的形式。
[0114] 使用標(biāo)準(zhǔn)基因治療載體進(jìn)行DNA的局部施用。這類載體包括病毒載體，包括那些 來自于復(fù)制缺陷型肝炎病毒（例如，B型肝炎病毒，C型肝炎病毒）、逆轉(zhuǎn)錄病毒（參見例如 W089/07136 ;Rosenberg 等人于 1990 年在 N. Eng. J. Med 323 (9) :570-578 中發(fā)表的文章）、 腺病毒（參見例如Morsey等人于1993年在J. Cell. Biochem.(《細(xì)胞生物化學(xué)雜志》）， Supp. 17E中發(fā)表的文章）、腺病毒相關(guān)病毒（Kotin等人于1990年在Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :2211-2215中發(fā)表的文章）、復(fù)制缺陷型單純皰疹病毒（HSV ;Lu等人于1992年在 基因治療會議上的摘要，摘要第66頁，九月，22-26日，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約）的載 體，以及這些載體的任意修飾形式。本發(fā)明可以應(yīng)用能夠完成核酸至真核細(xì)胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)移 的任意其他運(yùn)送系統(tǒng)。例如，可以將核酸包裹在脂質(zhì)體例如陽離子脂質(zhì)體（Lipofectin試 齊U )中、受體介導(dǎo)的運(yùn)送系統(tǒng)中、非病毒核酸基載體中、紅細(xì)胞血影中、或者微球體中（例 如微粒子；參見例如美國專利No. 4789734 ;美國專利No. 4925673 ;美國專利No. 3625214 ; Gregoriadis 于 1979 年在 Drug Carrier in Biology and Medicine (《生物學(xué)和藥物學(xué)藥 物載體》），PP. 287-341 (Academic Press學(xué)術(shù)出版社）中發(fā)表的文章）。也可以施用裸DNA。
[0115] 用于進(jìn)行基因治療的DNA可以通過非腸道注射方式施用于患者，例如，靜脈內(nèi)注 射，皮下注射，肌肉內(nèi)注射，以及腹膜內(nèi)注射。將DNA或者誘導(dǎo)劑置于藥物學(xué)可接受性載體 中進(jìn)行施用，藥物學(xué)可接受性載體即適用于向動物施用的生物學(xué)可相容性溶媒，例如生理 鹽水。治療有效劑量指的是能夠產(chǎn)生藥物學(xué)期望性結(jié)果的劑量，例如，能夠使被治療動物體 內(nèi)的程序性死亡多肽-1基因產(chǎn)物減少的劑量。這種劑量可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定。 在藥物領(lǐng)域已知，對于任意給定的患者來說，劑量取決于許多因素，包括患者的大小，體表 面積，年齡，施用的特定化合物，性別，給藥時(shí)間和給藥途徑，一般健康狀況，以及同時(shí)施用 的其他藥物。劑量可以發(fā)生變化，但用于DNA的靜脈內(nèi)給藥的優(yōu)選劑量是大約IO 6至IO22個(gè) 拷貝數(shù)的DNA分子。典型的，施用于哺乳動物的質(zhì)粒的劑量為大約1納克DNA至大約5000 微克DNA。所期望的是，組合物中含有大約5納克至1000微克DNA，10納克至800微克DNA， 0. 1微克至500微克DNA，1微克至350微克DNA，25微克至250微克DNA，或者100微克至 200微克DNA?；蛘撸梢韵虿溉閯游锸┯镁幋a程序性死亡多肽-1抑制劑的重組腺病毒載 體，可以以至少1〇 5，1〇6，1〇7，1〇8，1〇9，1〇 1°，或者1〇11個(gè)蝕斑形成單位狀11)的濃度來施用。
[0116] 將程序性死亡多肽-1基因產(chǎn)物溶于藥物學(xué)可接受性載體例如生理鹽水中，通過 靜脈內(nèi)注射的方式進(jìn)行施用?？梢允褂眉?xì)胞內(nèi)運(yùn)送多肽的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如將其包裹在脂質(zhì) 體中的方法。這類方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的?？梢灶A(yù)期，靜脈內(nèi)注射的劑量大約 為每千克體重每天施用1至100摩爾本發(fā)明所述的多肽。本發(fā)明所述的組合物能夠有效的 用于非腸道注射給藥，例如靜脈內(nèi)注射，皮下注射，肌肉內(nèi)注射，以及腹膜內(nèi)注射。
[0117] 將上述化合物直接與被接觸組織進(jìn)行接觸，可以使程序性死亡多肽-1抑制劑發(fā) 揮藥效。因此，上述化合物可以通過局部給藥形式施用。或者，程序性死亡多肽-1抑制劑 可以通過全身給藥形式施用。此外，可以將上述化合物灌輸至（直接進(jìn)入器官（例如腸或 者肝）或者通過皮下方式）固體或者重復(fù)吸收性基質(zhì)中進(jìn)行施用，所述固體或者基質(zhì)將化 合物緩慢的釋放到宿主的鄰近組織和周圍組織中。例如，在對胃腸感染的治療中，可以將上 述化合物進(jìn)行全身施用（例如，靜脈內(nèi)注射，直腸內(nèi)施用或者口服）或者局部施用（例如， 直接施用到胃組織）?；蛘?，將浸漬了程序性死亡多肽-1抑制劑的晶片或者可重復(fù)吸收的 海綿直接與胃組織進(jìn)行接觸。通過晶片上的藥物的擴(kuò)散以及聚合物基質(zhì)的侵蝕（erosion) 使程序性死亡多肽-1抑制劑在體內(nèi)緩慢的釋放。作為另外一個(gè)實(shí)施例，可以通過向肝血管 中注入含有程序性死亡多肽-1抑制劑的溶液來治療肝感染（即肝炎病毒）。
[0118] 為了治療神經(jīng)感染，可以通過靜脈內(nèi)注射或者鞘內(nèi)注射（即，直接注入到腦脊髓 液中）的形式施用程序性死亡多肽-1抑制劑。如果要局部施用，可以將浸漬了上述化合物 的晶片或者可重復(fù)吸收的海綿直接與中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS)組織進(jìn)行接觸。通過晶片上的 藥物的擴(kuò)散以及聚合物基質(zhì)的侵蝕，使上述化合物或者該化合物的混合物在體內(nèi)緩慢的釋 放?；蛘?，使用標(biāo)準(zhǔn)方法將化合物注入到大腦或者腦脊髓液中。例如，可以放置一個(gè)帶有導(dǎo) 管的磨孔環(huán)作為注射位點(diǎn)，該磨孔環(huán)在鉆入頭骨的磨孔處與頭骨相接合，導(dǎo)管連接一個(gè)儲 液室，儲液室內(nèi)的液體通過穿透磨孔環(huán)上方隔膜的針或者探針流入。導(dǎo)管組（描述于例如 美國專利No. 5954687)提供了流體的流通路徑，該路徑適合于將流體傳輸至大腦、大腦旁 或者大腦內(nèi)部的選定位置，或適合于使流體從上述位置中流出，以保證在一段時(shí)間內(nèi)完成 藥物的施用。
[0119] 為了治療心臟感染，可以將化合物運(yùn)送至例如心臟組織中（例如，心肌，心包膜， 或者心內(nèi)膜），通過穿透胸壁的直接冠狀動脈內(nèi)注射的方式，或者在熒光鏡的引導(dǎo)下使用標(biāo) 準(zhǔn)的經(jīng)皮導(dǎo)管方法。因此，所述抑制劑可以被直接注射到組織中，或者通過插入肌體內(nèi)腔的 血管內(nèi)支架或者導(dǎo)管被注入?？梢允褂萌魏畏N類的冠狀動脈導(dǎo)管或者灌流導(dǎo)管來施用該組 合物?；蛘?，將組合物涂覆于或者浸漬于血管內(nèi)支架上，所述支架被置于冠狀血管內(nèi)。
[0120] 可以通過例如吸入的方式施用該組合物以進(jìn)行對肺部感染的治療。所述組合物以 氣霧劑噴霧的形式通過壓力容器或者壓力分配器進(jìn)行運(yùn)送，其中含有適當(dāng)?shù)耐七M(jìn)劑，例如 氣體或者噴霧器，所述氣體是例如二氧化碳的氣體。
[0121] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，通過本發(fā)明的方法進(jìn)行治療的患者可以是通過上述相 同的測試被診斷出患有持續(xù)性感染的患者，也可以是未經(jīng)檢查的、由于具備一種或者多種 危險(xiǎn)因素（例如，與感染性制劑接觸，與被感染宿主接觸，遺傳傾向性，或者呈現(xiàn)出誘發(fā)繼 發(fā)性感染的病理狀態(tài)）而被鑒定為存在患有持續(xù)性感染的高度危險(xiǎn)的患者。減少持續(xù)性感 染的癥狀或者損傷也可以包括，但不局限于，緩解癥狀，減小疾病程度，穩(wěn)定（即，不惡化） 病情，延緩或者減慢疾病的發(fā)展，以及改善或者減輕病情?？梢栽诒＝√峁┱叩膰?yán)密監(jiān)督下 在家中進(jìn)行治療，也可以在保健機(jī)構(gòu)進(jìn)行治療。
[0122] 測量免疫應(yīng)答的方法
[0123] 根據(jù)本發(fā)明的方法進(jìn)行治療之后，測量免疫應(yīng)答的方法是本領(lǐng)域熟知的。例如可 以通過檢測細(xì)胞因子的生成量、測量T細(xì)胞的擴(kuò)增量、測量微生物制劑的清除率、以及測 量CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性來評價(jià)T細(xì)胞的活性。這些測量方法在例如下述文件中有所描 述：美國專利 No. 6808710,美國專利申請 Nos. 20040137577, 20030232323, 20030166531， 20030064380,20030044768,20030039653,20020164600,20020160000,20020110836, 20020107363,以及20020106730,上述全部文件在此引入作為參考。
[0124] 可選擇的，可以通過測量⑶8+T細(xì)胞的擴(kuò)增（例如，胸苷結(jié)合，溴化脫氧尿嘧啶核 苷檢測，以及細(xì)胞周期標(biāo)記物（例如，Ki67和CFSE)的染色，在例如Dong等人（于1999年 在Nature (《自然》）5:1365-1369)的文章中有所描述）來評價(jià)程序性死亡多肽-1抑制劑 增加 CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性的能力。在一個(gè)實(shí)施例中，通過使用程序性死亡多肽-1抑制 齊U、如上所述的初級活化信號、以及3H-胸苷培養(yǎng)純化T細(xì)胞來控制T細(xì)胞的擴(kuò)增。通過測 量胸苷結(jié)合來確定T細(xì)胞的擴(kuò)增水平。
[0125] 也可以通過溶菌檢測（lysis assays)(例如，51Cr的釋放檢測或者穿孔素的釋放 檢測或者粒酶的釋放檢測）、半胱天冬蛋白酶活化的檢測、或者測量微生物制劑從被感染宿 主中的清除率來評價(jià)CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性。例如，可以檢測治療前后來自于被感染宿主 的生物樣品中（例如血清、脾臟、肝臟、肺、或者具有病毒趨向性的組織）的病毒載量。
[0126] 也可以測量細(xì)胞因子的生成量，例如干擾素 Y、腫瘤壞死因子α、以及白細(xì)胞介 素-2的生成量。例如，在程序性死亡多肽-1抑制劑以及初級活化信號存在的條件下，對純 化的T細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。可以對上清液中各種細(xì)胞因子的水平進(jìn)行測定，通過夾心酶聯(lián)免疫 吸附測定方法或者其他慣用的檢測方法，例如參見Dong等人（于1999年在Nature (《自 然》）5 :1365-1369)發(fā)表的文章。
[0127] 如果需要，可以通過程序性死亡多肽-1抑制劑誘發(fā)T細(xì)胞的共刺激的能力來評價(jià) 它的功效性。例如，體外T細(xì)胞共刺激的方法包括向表達(dá)程序性死亡多肽-1的純化T細(xì)胞 提供第一活化信號或者初級活化信號，該信號來自于抗CD3單克隆抗體或者佛波酯，或者 來自于II型主要組織相容性復(fù)合體的相關(guān)抗原。之后，可以使用本領(lǐng)域已知的幾種常用方 法中的任何一種來測定候選化合物制劑減少程序性死亡多肽-1的表達(dá)或者活性的能力， 從而測定該化合物制劑向T細(xì)胞提供次級信號或者共刺激信號的能力，所述信號是調(diào)節(jié)免 疫功能的必要條件。
[0128] B細(xì)胞的應(yīng)答可以通過抗原特異性酶聯(lián)免疫吸附測定法（例如，淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢 腦膜炎病毒，人類免疫缺陷型病毒，肺結(jié)核或者瘧疾）、漿細(xì)胞酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法、記憶性B細(xì) 胞檢測法、B細(xì)胞表現(xiàn)型、以及對次級淋巴小結(jié)的免疫組織化學(xué)分析進(jìn)行評價(jià)。
[0129] 篩選方法
[0130] 本發(fā)明提供了一種篩選方法，該方法用于鑒定能夠抑制程序性死亡多肽-1的表 達(dá)或者活性的化合物。有效的化合物包括能夠抑制程序性死亡多肽-1的生物活性或者減 少程序性死亡多肽-1的細(xì)胞水平的任何制劑。例如，候選化合物可以減少程序性死亡多 肽-1與程序性死亡多肽-1配體、程序性死亡多肽-1配體2其中之一或者兩者的結(jié)合。使 用這類制劑作為先導(dǎo)化合物，例如，本發(fā)明的篩選方法也可以用來鑒定其他新的程序性死 亡多肽-1特異性抑制劑，該抑制劑具有治療、緩解、或者預(yù)防持續(xù)性感染、或者減輕這類感 染帶來的一種或者多種癥狀的功效。篩選方法可以包括大規(guī)模篩選技術(shù)。
[0131] "候選化合物"指的是天然存在的化學(xué)制劑或者人工合成的化學(xué)制劑。候選化合物 可以包括，例如肽，多肽，合成有機(jī)分子，天然有機(jī)分子，核酸分子，肽核酸分子，以及上述物 質(zhì)中的成分或者衍生物。例如，本發(fā)明所述的有效的候選化合物減少程序性死亡多肽-1與 程序性死亡多肽-1配體、程序性死亡多肽-1配體2其中之一或者兩者的結(jié)合。
[0132] 可以使用許多方法來完成這樣的篩選。在一種方法中，向表達(dá)程序性死亡多肽-1 的細(xì)胞培養(yǎng)基中加入不同濃度的候選化合物。"程序性死亡多肽-1基因"指的是編碼程序 性死亡多肽-1蛋白的核酸。"程序性死亡多肽-1融合基因"指的是程序性死亡多肽-1啟 動子和/或與另外一種異源核酸序列形成可操作連接的程序性死亡多肽-1編碼區(qū)域的全 部或者一部分。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的另外一種異源核酸序列是報(bào)道基因，其表達(dá)可 以被測定；報(bào)道基因包括，但不局限于，編碼葡萄糖苷酸酶（GUS)、熒光素酶、氯霉素轉(zhuǎn)乙酰 酶（CAT)、綠色熒光蛋白（GFP)、堿性磷酸酶、以及β-半乳糖苷酶的基因。
[0133] 隨后,通過例如標(biāo)準(zhǔn)的Northern印跡分析或者通過具有適當(dāng)引物的實(shí)時(shí)PCR(聚 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）（參見Ausubel等人的文章，見上）來測定程序性死亡多肽-1的基因表達(dá)， Northern印跡分析使用來自于程序性死亡多肽-1核酸分子的任意適當(dāng)?shù)钠巫鳛殡s交探 針。將使用候選化合物得到的基因表達(dá)水平與不含候選化合物的對照培養(yǎng)基中的水平進(jìn)行 比較。如果需要，可以使用相同的常規(guī)方法和標(biāo)準(zhǔn)的免疫技術(shù)通過程序性死亡多肽-1的 水平來測定候選化合物的作用，例如通過Western印跡或者利用程序性死亡多肽-1特異 性抗體的免疫沉淀反應(yīng)。例如，可以使用免疫檢測來探測或者監(jiān)測程序性死亡多肽-1的水 平?？梢允褂靡匀魏螛?biāo)準(zhǔn)免疫檢測形式存在的（例如，酶聯(lián)免疫吸附測定或者放射免疫性 測定）具有結(jié)合程序性死亡多肽-1的能力的多克隆抗體或者單克隆抗體來檢測程序性死 亡多肽-1的水平。還可以使用質(zhì)譜分析、高效液相色譜、分光光度測定技術(shù)或者熒光分析 技術(shù)、或者它們的組合來測定程序性死亡多肽-1。
[0134] 或者，本發(fā)明的篩選方法可以用于鑒定候選化合物，所述候選化合物能夠通過減 少程序性死亡多肽-1與程序性死亡多肽-1配體、程序性死亡多肽-1配體2其中之一或者 兩者的結(jié)合來降低程序性死亡多肽-1的生物活性，與未經(jīng)過處理的對照組相比，減少的量 為至少 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、或者100%。例如，可以 檢測候選化合物在天然表達(dá)程序性死亡多肽-1的細(xì)胞中降低程序性死亡多肽-1活性的能 力，在使用cDNA轉(zhuǎn)染程序性死亡多肽-1之后，或者在含有程序性死亡多肽-1的不含細(xì)胞 的溶液中，下面將會進(jìn)一步描述。候選化合物對程序性死亡多肽-1的結(jié)合作用或者活化作 用可以通過放射性結(jié)合分析以及非放射性結(jié)合分析、競爭性分析、以及受體信號分析來測 定。
[0135] 作為一個(gè)特殊的實(shí)施例，在候選化合物（例如，肽，多肽，合成有機(jī)分子，天然有 機(jī)分子，核酸分子，或者上述物質(zhì)的組分）存在的條件下培養(yǎng)能夠表達(dá)編碼程序性死亡多 肽-1的核酸的哺乳動物細(xì)胞（例如，嚙齒動物細(xì)胞）。上述細(xì)胞可以內(nèi)源性表達(dá)程序性死 亡多肽-I，或者可以通過本領(lǐng)域已知的任何標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)（例如，轉(zhuǎn)染以及病毒感染）將細(xì)胞遺 傳工程化，使其過表達(dá)程序性死亡多肽-1。使用Western印跡分析測定這些細(xì)胞中程序性 死亡多肽-1的表達(dá)水平，隨后與對照細(xì)胞中相同蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行比較，所述對照細(xì)胞 是沒有與候選化合物進(jìn)行接觸的細(xì)胞。能夠通過減少程序性死亡多肽-1的合成性或者生 物活性因而促進(jìn)其活性水平降低的化合物被認(rèn)為是能夠有效應(yīng)用于本發(fā)明的。
[0136] 在一個(gè)特殊的實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明，能夠影響程序性死亡多肽-1與程序性死亡 多肽-1配體、程序性死亡多肽-1配體2其中之一或者兩者的結(jié)合（從而降低程序性死亡 多肽-1的生物活性）、導(dǎo)致免疫應(yīng)答的增加的化合物是有效的。如果一個(gè)分子具有降低程 序性死亡多肽-1的生物活性的能力，這樣的分子可以被用來例如作為治療劑治療、減輕、 或者預(yù)防持續(xù)性感染，或者緩解與這類感染相關(guān)的一種或者多種癥狀。作為一個(gè)特殊的實(shí) 施例，候選化合物可以與兩種蛋白進(jìn)行接觸，第一種蛋白是與程序性死亡多肽-1在本質(zhì)上 等同的多肽，第二種蛋白是程序性死亡多肽-1配體或者程序性死亡多肽-1配體2 (即，在 可以發(fā)生結(jié)合的條件下與程序性死亡多肽-1結(jié)合的蛋白，并且這種結(jié)合導(dǎo)致降低的免疫 應(yīng)答）。在這種特殊的篩選方法中，在加入候選化合物之后測定兩種蛋白之間的相互作用。 在加入候選化合物之后，程序性死亡多肽-1與第二種多肽的結(jié)合的減少（相對于不加入化 合物時(shí)的結(jié)合）表明這種候選化合物具有抑制兩種蛋白間的相互作用的能力。最終，本發(fā) 明所述的篩選方法可以在例如不含細(xì)胞的系統(tǒng)或者在酵母雙雜交系統(tǒng)中使用。如果需要， 可以將兩種蛋白中的一種或者候選化合物固定于前述的載體上，或者可以具有一個(gè)可探測 基團(tuán)。
[0137] 作為選擇的，或者在此基礎(chǔ)之上，可以從那些能夠特異性結(jié)合程序性死亡多肽-1 并因而抑制程序性死亡多肽-1的物質(zhì)中篩選候選化合物。這類候選化合物的效果取決于 其與程序性死亡多肽-1相互作用的能力。這種相互作用可以很容易的通過任何標(biāo)準(zhǔn)的結(jié) 合技術(shù)以及功能檢測進(jìn)行測定（例如，那些描述于Ausubel等人發(fā)表的文章中的方法，見 上）。例如，可以在體外測定候選化合物與程序性死亡多肽-1的相互作用及結(jié)合情況，并且 可以通過任何標(biāo)準(zhǔn)檢測（例如，這里描述的那些方法）來測定其調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的能力。
[0138] 例如，可以使用基于色譜的技術(shù)鑒定結(jié)合于程序性死亡多肽-1的候選化合物。例 如，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從工程化細(xì)胞中純化重組程序性死亡多肽-1 (例如，通過上面描述的方 法），該工程化細(xì)胞表達(dá)程序性死亡多肽-1，并且將重組程序性死亡多肽-1固定于柱上。之 后，讓候選化合物溶液流經(jīng)該柱，由于具有與程序性死亡多肽-1結(jié)合的能力，特異于程序 性死亡多肽-1的化合物被鑒定出來并被固定于柱上。為了分離上述化合物，對柱進(jìn)行清洗 以除去非特異性結(jié)合的分子，然后將目標(biāo)化合物從柱中分離并且被收集。如果需要，通過這 種方法（或者通過其他任何適當(dāng)?shù)姆椒ǎ┓蛛x的化合物可以被進(jìn)一步純化（例如，通過高 效液相色譜法）。
[0139] 新抑制劑的篩選以及先導(dǎo)化合物的優(yōu)化可以通過下述方法進(jìn)行評價(jià)，例如通過使 用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)評價(jià)它們調(diào)節(jié)細(xì)胞毒性T細(xì)胞活性的能力或者調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的能力來進(jìn)行評 價(jià)。除此之外，可以檢測這些候選化合物作為抗微生物制劑（例如，上面所描述的）的能力。 通過這種方法分離的化合物也可以被用來作為治療劑治療、減輕、或者預(yù)防持續(xù)性感染，或 者緩解這類感染帶來的一種或者多種癥狀。被鑒定為與程序性死亡多肽-1以小于或者等 于IOmM的親合常數(shù)相結(jié)合的化合物被認(rèn)為在本發(fā)明中是格外有效的。
[0140] 可能的治療劑包括有機(jī)分子，肽，模擬肽，多肽，以及與編碼程序性死亡多肽-1的 核酸序列或者多肽相結(jié)合并因此抑制或者消除程序性死亡多肽-1活性的抗體?？赡艿目?微生物制劑還包括與這類多肽結(jié)合并且占用這類多肽的結(jié)合位點(diǎn)并因此阻止其與細(xì)胞結(jié) 合分子相結(jié)合的小分子，這種方式阻止了其正常的生物活性。其他可能的抗微生物制劑包 括反義分子。
[0141] 診斷方法和預(yù)測方法
[0142] 對腫瘤，例如血管T細(xì)胞淋巴瘤或者結(jié)節(jié)性淋巴細(xì)胞為主型的霍奇金淋巴瘤的探 測是通過檢查測試樣品（即，來自于患者的樣品）中的程序性死亡多肽-1含量來完成的。 與對照樣品相比，程序性死亡多肽-1水平的變化意味著宿主體內(nèi)存在腫瘤。相對于對照樣 品而言，這種變化可以是程序性死亡多肽-1的增加或者減少。所述的對照樣品是通過與測 試樣品相似的方式制備得到的（即，分離得到的）。
[0143] 樣品是例如血液、血清、acsites fluid、尿液、或者其他體液。優(yōu)選的該樣品是T 細(xì)胞或者B細(xì)胞。
[0144] 測定測試樣品中的程序性死亡多肽-1的量，并且與正常對照水平的表達(dá)進(jìn)行比 較。正常對照水平指的是不存在腫瘤的宿主中通常存在的程序性死亡多肽-1的表達(dá)水平。 來自于患者的樣品中增加的程序性死亡多肽-1水平意味著該宿主患有腫瘤，或者存在患 有腫瘤的危險(xiǎn)。相反的，當(dāng)以預(yù)防為目的應(yīng)用本方法時(shí)，來自于患者的樣品中相似水平的或 者降低水平的程序性死亡多肽-1意味著該宿主不存在腫瘤或者不存在患有腫瘤的危險(xiǎn)。 來自于患者的樣品中增加的程序性死亡多肽-1水平意味著該宿主患有腫瘤，或者存在患 有腫瘤的危險(xiǎn)。
[0145] 程序性死亡多肽-1的量的變化是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著指的是這種變化大 于僅僅是偶然產(chǎn)生的變化。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性可以通過本領(lǐng)域已知的方法來確定。例如可以使 用P值來確定統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。P值是指在一個(gè)試驗(yàn)中由偶然因素導(dǎo)致的組間差別的概率值。 (PO Ze))。例如，P值為0.01指的是有百分之一的結(jié)果是由偶然因素導(dǎo)致的。P值越 低，表明組間差別更可能是由于不同處理方式而導(dǎo)致的。如果P值至少為0.05,則表明這種 變化是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。優(yōu)選的，P值是〇. 04,0. 03,0. 02,0. 01，0. 005,0. 001或者更低。
[0146] 試驗(yàn)、檢測、或者方法的"診斷準(zhǔn)確率"表示該試驗(yàn)、檢測或者方法鑒別患有腫瘤、 或者存在患有腫瘤的危險(xiǎn)的患者的能力，所述"診斷準(zhǔn)確率"是根據(jù)患者是否具有"臨床顯 著存在的"程序性死亡多肽-1來決定的。"臨床顯著存在"指的是患者體內(nèi)（通常是指來 自于患者的樣品）存在的程序性死亡多肽-1高于或者低于預(yù)定的點(diǎn)值（或者閾值），因此 表明該患者患有腫瘤，這種相當(dāng)高的蛋白水平是一種標(biāo)記。
[0147] 術(shù)語"高度診斷準(zhǔn)確率"以及"相當(dāng)高度的診斷準(zhǔn)確率"指的是借助預(yù)定點(diǎn)值對程 序性死亡多肽-1進(jìn)行測定的試驗(yàn)或者檢測能夠準(zhǔn)確的（精確的）指示出腫瘤的存在或者 不存在。優(yōu)秀的試驗(yàn)應(yīng)當(dāng)具有優(yōu)秀的準(zhǔn)確率。因此，對于糖尿病患者來說，該試驗(yàn)只能顯示 出陽性試驗(yàn)結(jié)果，而無法將任何患者報(bào)告為"陰性"（不存在"假陰性")。換句話說，該試驗(yàn)的 "靈敏性（sensitivity)"（實(shí)際陽性率）應(yīng)當(dāng)是100%。另一方面，對于非糖尿病患者來說， 該試驗(yàn)只能顯示出陰性試驗(yàn)結(jié)果，而無法將任何患者報(bào)告為"陽性"（不存在"假陽性")。換 句話說，"特異性（specificity)"（實(shí)際陰性率）應(yīng)當(dāng)是100%。參見例如，O'Marcaigh AS, Jacobson RM 于 1993 年發(fā)表的文章 "Estimating The Predictive Value Of A Diagostic Test，How To Prevent Misleading Or Confusing Results (《估算診斷試驗(yàn)的預(yù)測值，防 止產(chǎn)生誤導(dǎo)和混亂的結(jié)果》）"，Clin. Ped. 32(8) :485-491,該文章中討論了在試驗(yàn)例如臨床 診斷試驗(yàn)中的特異性、靈敏性、以及陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值。
[0148] 改變試驗(yàn)（或者檢測）的點(diǎn)值或者閾值通常會改變靈敏性和特異性，這種改變呈 定性反比關(guān)系。例如，當(dāng)點(diǎn)值減小時(shí)，參與試驗(yàn)的更多個(gè)體將會產(chǎn)生高于該點(diǎn)值或者閾值的 試驗(yàn)結(jié)果。由于產(chǎn)生高于點(diǎn)值的試驗(yàn)結(jié)果的個(gè)體被認(rèn)為患有被檢測的疾病、狀況或者癥狀， 降低點(diǎn)值會導(dǎo)致更多的個(gè)體被認(rèn)為是具有陽性結(jié)果的（S卩，他們患有腫瘤）。因此，與實(shí)際 患有腫瘤的個(gè)體比例相比，會有更高比例的個(gè)體被該試驗(yàn)指定為患有腫瘤。因此，該試驗(yàn)的 靈敏性（實(shí)際的陽性率）會增加。然而，與此同時(shí)，更多的假陽性會出現(xiàn)，因?yàn)楦鄬?shí)際上 不存在疾病、狀況、或者癥狀的人（即，實(shí)際上是"陰性"的人）會被該試驗(yàn)指定為具有高于 點(diǎn)值的程序性死亡多肽-1，因而被報(bào)告為陽性（即，存在疾病、狀況或者癥狀），而不會通過 試驗(yàn)被準(zhǔn)確的診斷為陰性。因此，該試驗(yàn)的特異性（實(shí)際的陰性率）會降低。類似的，升高 點(diǎn)值將會導(dǎo)致降低的靈敏性和增大的特異性。因此，在評價(jià)一個(gè)用于診斷患者狀況的醫(yī)學(xué) 試驗(yàn)、檢測或者方法的時(shí)候，應(yīng)當(dāng)既考慮到靈敏性也考慮到特異性，并且要留意這種靈敏性 和特異性是在何種點(diǎn)值的情況下測定的，因?yàn)殪`敏性和特異性可以隨著點(diǎn)值范圍的變化而 發(fā)生顯著變化。
[0149] 然而，存在一種指示物，它能夠用一個(gè)單一的數(shù)值代表全部點(diǎn)值范圍內(nèi)的試驗(yàn)、檢 測、或者方法的靈敏性和特異性。這種指示物是被討論的試驗(yàn)、檢測、或者方法的接受物操 作特性（"R0C"）曲線。參見例如 Shultz 的文章 "Clinical Interpretation Of Laboratory Procedures (《實(shí)驗(yàn)室工作程序的臨床釋義》），第14章，Teitz的Fundamentals of Clinical Chemistry (臨床化學(xué)基本原理），Burtis 和 Ashwood (eds.編輯），4thedition (第四版）， 1996 年，W. B. Saunders Company，192-199 頁；以及 Zweig 等人于 1992 年在 Clin. Chem(臨 床化學(xué)）38(8) :1425-1428 中發(fā)表的文章 "ROC Curve Analysis :An Example Showing The Relationships Among Serum Lipid And Apolipoprotein Concentrations In Identifying Patients With Coronary Artery Disease (《接受物操作特性曲線分析：一 個(gè)能夠在診斷冠心病患者的方法中表示出血清油脂與阿樸脂蛋白濃度關(guān)系的例子》）"。
[0150] 接受物操作特性（ROC)曲線是一個(gè)x-y圖，y軸表示靈敏性，其刻度在0到1 (即 100% )之間，靈敏性數(shù)值與1減去特異性得到的數(shù)值相反，特異性在X軸表示，其刻度在0 到1(即100% )之間。換句話說，這是一個(gè)關(guān)于試驗(yàn)、檢測或者方法的實(shí)際陽性率與假陽 性率的圖線。為了構(gòu)建被討論的試驗(yàn)、檢測、或者方法的接受物操作特性（ROC)曲線，使用 一種特別準(zhǔn)確的方法或者"黃金標(biāo)準(zhǔn)"方法對患者進(jìn)行評價(jià)，該方法不同于被討論的試驗(yàn)、 檢測、或者方法，以確定患者針對于某種疾病、狀況、或者癥狀來說實(shí)際上是陽性還是陰性 (例如，冠狀動脈血管造影術(shù)是用于檢測冠狀動脈粥樣硬化的黃金標(biāo)準(zhǔn)方法）。同時(shí)使用被 討論的試驗(yàn)、檢測或者方法對患者進(jìn)行檢查，針對于不同的點(diǎn)值，這些患者被診斷為屬于陽 性或者陰性。針對每個(gè)點(diǎn)值，得到一個(gè)靈敏性（實(shí)際的陽性率）數(shù)值以及一個(gè)1減去特異 性得到的數(shù)值（該值等于假陽性率），將每對χ-y值作為一個(gè)點(diǎn)畫在χ-y圖表中。連接這些 點(diǎn)得到的"曲線"就是接受物操作特性（ROC)曲線。
[0151] 在曲線下的區(qū)域（"AUC"）就是以一個(gè)單一的數(shù)值代表全部點(diǎn)值范圍內(nèi)的試驗(yàn)、檢 測、或者方法的靈敏性和特異性的指示物。最大的曲線下區(qū)域（AUC)是1，最小的區(qū)域是二 分之一。曲線下區(qū)域越接近1，表明試驗(yàn)的準(zhǔn)確率越高。
[0152] "高度的診斷準(zhǔn)確率"指的是試驗(yàn)或者檢測（例如本發(fā)明所述的確定臨床顯著存在 的程序性死亡多肽-1、進(jìn)而診斷出是否存在糖尿病的試驗(yàn)）的AUC (該試驗(yàn)或者檢測的ROC 曲線下的區(qū)域）為至少0. 70,希望是至少0. 75,更希望是至少0. 80,優(yōu)選至少0. 85,更優(yōu)選 至少0. 90,最優(yōu)選至少0. 95。
[0153] "相當(dāng)高度的診斷準(zhǔn)確率"指的是試驗(yàn)或者檢測的AUC(該試驗(yàn)或者檢測的ROC曲 線下的區(qū)域）為至少0. 875,希望是至少0. 90,更希望是至少0. 925,優(yōu)選至少0. 95,更優(yōu)選 至少0. 975,最優(yōu)選至少0. 98。
[0154] 可選擇的，也可以測定其他已知的生物標(biāo)記物對特定腫瘤的表達(dá)來進(jìn)一步指示宿 主是否患有腫瘤。例如，測定CD10, bcl-6, CD20, CD57,或者CXCR5。
[0155] 可以使用任何適當(dāng)?shù)姆绞綔y定程序性死亡多肽-1以及其他生物標(biāo)記物，但是通 常使用下述方法進(jìn)行測定：將來自于患者的樣品與抗體進(jìn)行接觸，該抗體結(jié)合于程序性死 亡多肽-1或者生物標(biāo)記物，之后，測定是否生成反應(yīng)產(chǎn)物。所述的抗體可以是單克隆抗體， 多克隆抗體，嵌合抗體，或者是它們的片段，正如上面詳細(xì)討論過的，可以使用任何適當(dāng)?shù)?免疫檢測方法對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行探測。來自于患者的樣品通常是如上所述的生物液，可以使 用上述方法中使用過的相同的生物液樣品。
[0156] 可以利用程序性死亡多肽-1的表達(dá)監(jiān)測腫瘤的治療過程。在該方法中，提供來自 于經(jīng)過治療的宿主的生物樣品，所述的治療是例如針對腫瘤的外科手術(shù)治療、化療或者激 素治療。如果需要，在治療前、治療中、或者治療后的不同時(shí)間點(diǎn)從宿主中提取生物樣品。然 后，測定程序性死亡多肽-1的表達(dá)，并與參考組進(jìn)行對照，參考組是例如腫瘤病情已知的 對照組。對參考樣品進(jìn)行治療?；蛘?，不對參考樣品進(jìn)行治療。可選擇的，先進(jìn)行上述測定， 為第二期（second look)外科觀察操作及隨后的外科觀察操作做準(zhǔn)備。例如，從已經(jīng)接受 了腫瘤的初級外科治療以及隨后的抗腫瘤制劑治療的宿主中提取樣品，以監(jiān)測治療進(jìn)程。
[0157] 如果參考樣品來自于不存在腫瘤的宿主，當(dāng)測試樣品中的程序性死亡多肽-1的 量與參考樣品相似或者有所減少時(shí)，表明該治療是有效的。然而，當(dāng)測試樣品中的程序性死 亡多肽-1的量與參考樣品相比有所增加時(shí)，表明該治療沒有取得有效的臨床成果或者預(yù) 后。
[0158] "有效的"指的是該治療導(dǎo)致程序性死亡多肽-1的量的減少，或者導(dǎo)致宿主體內(nèi)的 腫瘤的大小、傳播、或者轉(zhuǎn)移可能性被減小。使用標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)對腫瘤進(jìn)行評價(jià)。有效性是 使用診斷或者治療特定腫瘤的任何已知方法進(jìn)行測定的。也可以利用程序性死亡多肽-1 的表達(dá)來鑒定能對全身系統(tǒng)治療產(chǎn)生應(yīng)答的宿主，所述的全身系統(tǒng)治療例如化療、激素治 療或者放射治療。在該方法中，在對宿主進(jìn)行腫瘤外科手術(shù)治療之前，從該宿主中提取生物 樣品。然后，測定程序性死亡多肽-1的表達(dá)，并且與來自于經(jīng)過腫瘤外科切除術(shù)后的宿主 的生物樣品進(jìn)行比較。如果在外科切除腫瘤之后程序性死亡多肽-1的量減少了，表明該患 者可能對全身系統(tǒng)治療產(chǎn)生了應(yīng)答性。相反，如果在外科切除腫瘤之后程序性死亡多肽-1 的量保持不變或者增加了，表明該患者可能沒有對全身系統(tǒng)治療產(chǎn)生應(yīng)答性。
[0159] 可以使用本領(lǐng)域已知的任何方法通過蛋白或者核酸的水平來測定程序性死亡多 肽-1或者其他腫瘤生物標(biāo)記物的表達(dá)。例如，可以使用Northern雜交分析來測定基因表 達(dá)，這種雜交分析使用的探針能夠特異性識別這些序列中的一種或者多種?；蛘?，使用逆轉(zhuǎn) 錄PCR技術(shù)對表達(dá)進(jìn)行測定，例如使用特異于不同的基因表達(dá)序列的引物。也可以通過檢 測蛋白水平來測定表達(dá)，即測定由上述基因產(chǎn)物編碼的肽的水平或者活性。這種方法是本 領(lǐng)域已知的，包括例如基于針對上述基因編碼的蛋白的抗體的免疫檢測?？梢允褂萌魏紊?物材料來檢測/量化所述蛋白或者其活性?；蛘?，可以根據(jù)每種被檢測蛋白的活性選擇適 當(dāng)?shù)姆椒▉頊y定由標(biāo)記基因編碼的蛋白的活性。
[0160] 宿主優(yōu)選是哺乳動物。所述哺乳動物是例如人類，非人類的靈長類，鼠類，狗，貓， 馬，或者牛。宿主通常是人類女性或者人類男性。該宿主之前被診斷為患有腫瘤，并且可能 已經(jīng)接受了腫瘤治療?；蛘撸撍拗髦皼]有被診斷為患有腫瘤。本發(fā)明能夠有效應(yīng)用于 存在患有腫瘤危險(xiǎn)的全部患者中。盡管每個(gè)種類的腫瘤都具有各自不同的危險(xiǎn)因素，誘發(fā) 腫瘤的危險(xiǎn)隨著年齡、性別、種族、個(gè)人病史及家族病史而增加。其他的危險(xiǎn)因素與生活方 式非常相關(guān)，同時(shí)某些感染、職業(yè)性照射以及某些環(huán)境因素也能夠誘發(fā)腫瘤。
[0161] 通常通過質(zhì)譜鑒定來診斷腫瘤，但也可以通過其他方式例如放射線診斷或者超聲 波診斷。通常使用腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)進(jìn)行治療，然后使用抗腫瘤制劑進(jìn)行治療，抗腫瘤制劑例 如多烯紫杉醇，長春瑞濱，吉西他濱，卡培他濱，或者環(huán)磷酰胺、氨甲喋呤和氟尿嘧啶的組合 物；環(huán)磷酰胺、阿霉素（亞德利亞霉素）和氟尿嘧啶的組合物；阿霉素（亞德利亞霉素）和 環(huán)磷酰胺的組合物；阿霉素（亞德利亞霉素）和環(huán)磷酰胺、紫杉醇、阿霉素，并且通過連續(xù)超 濾（CMF)處理；或者環(huán)磷酰胺，表柔比星和氟尿嘧啶。除此之外，許多患者還需要接受放射 治療。
[0162] 根據(jù)本發(fā)明實(shí)施的免疫檢測可以是同源檢測或者是異源檢測。在同源檢測中，免 疫反應(yīng)通常包括特異性抗體（例如，程序性死亡多肽-1)、標(biāo)記分析物、以及待測樣品。從標(biāo) 記分析物發(fā)出的信號在抗體與標(biāo)記分析物結(jié)合處經(jīng)過直接的或者間接的修飾。上述免疫反 應(yīng)以及對該反應(yīng)程度的檢測反應(yīng)是在同源溶液中進(jìn)行的?？梢允褂玫拿庖呋瘜W(xué)標(biāo)記物包括 自由基、放射性同位素、熒光染料、酶、抗菌素、或者輔酶。
[0163] 在異源檢測方法中，使用的試劑通常是樣品、抗體、以及能夠生成可探測信號的工 具。可以使用前面描述的樣品。所述抗體通常被固定化于載體例如珠、平板或者載玻片上， 并且與被懷疑為含有抗原的液相樣本相接觸。然后，從液相中分離出載體，并且使用能夠產(chǎn) 生可探測信號的工具在載體相或者液相中檢測信號。這種信號與樣品中存在的分析物有 關(guān)。能夠產(chǎn)生可探測信號的工具包括放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記、或者酶標(biāo)記。例如，如果待測 抗原上含有第二個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，那么結(jié)合于該位點(diǎn)之上的抗體可以與一個(gè)可探測基團(tuán)共軛連 接，并且在分離步驟之前被加入到液相反應(yīng)溶液中。存在于固體載體上的可探測基團(tuán)表明 在被測試樣品中含有抗原。合適的免疫檢測的例子是放射性免疫檢測、免疫熒光方法、或者 酶聯(lián)免疫測定。
[0164] 本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知能夠有效用于上述方法中的許多特異性免疫測定 方法以及由上述方法改變而來的方法。通?？蓞⒁奅. Maggio于1980年所著的 Enzyme-Immunoassay (《酶法免疫檢測》）（CRC Press，Inc. , Boca Raton，F(xiàn)la.);也可以參 見 Skold 等人申請的、名稱為 "Methods for Modulating Ligand-Receptor Interactions and their Application(《調(diào)節(jié)配體-受體間相互作用的方法及這類方法的應(yīng)用》）"的美 國專利No. 4727022，F(xiàn)orrest等人申請的、名稱為"Immunoassay of Antigens (《抗原的免疫 檢測》）"的美國專利No. 4659678，David等人申請的、名稱為"Immunometric Assays Using Monoclonal Antibodies (《使用單克隆抗體的免疫測量分析》）"的美國專利No. 4376110, Litman等人申請的、名稱為"Macromolecular Environment Control in Specific Receptor Assays (《特異性受體檢測中的大分子環(huán)境控制》）"的美國專利No. 4275149, Maggio等人 申請的、名稱為"Reagents and Method Employing Channeling(《使用通道的試劑以及 方法》）"的美國專利No. 4233402,以及Boguslaski等人申請的、名稱為"Heterogeneous Specific Binding Assay Employing a Coenzyme as Label (《利用輔酶作為標(biāo)記的異源特 異性結(jié)合分析》）"的美國專利No. 4230767。使用已知的技術(shù)例如沉淀法將抗體共軛結(jié)合于 用于診斷檢測的適當(dāng)固體載體上（例如，珠，平板，載玻片或者孔，由例如乳膠或者聚苯乙 烯的材料制成）。也可以使用已知的技術(shù)將這里描述的抗體共軛結(jié)合到可探測基團(tuán)例如放 射性標(biāo)記（例如，35S，1251，1311)、酶標(biāo)記（例如，辣根過氧化物酶，堿性磷酸酯酶）、以及熒 光標(biāo)記（例如，熒光素）之上。
[0165] 用于實(shí)施上述方法的診斷試劑盒可以通過許多方法來制備。在一種實(shí)施方式中， 該診斷試劑盒包括（a)共軛結(jié)合于固體載體上的抗體（例如，程序性死亡多肽-1)以及（b) 共軛結(jié)合于可探測基團(tuán)上的另一個(gè)抗體。該試劑也可以包括助劑例如緩沖劑以及蛋白穩(wěn)定 劑例如多糖以及類似物。如果需要的話，該診斷試劑盒可以進(jìn)一步包括：含有可探測基團(tuán)的 信號生成系統(tǒng)中的其他成員（例如，酶作用底物），減少試驗(yàn)背景干擾的制劑，控制劑，進(jìn)行 試驗(yàn)的儀器，以及類似物?；蛘撸囼?yàn)試劑盒包括（a)抗體，以及（b)針對共軛結(jié)合于可探 測基團(tuán)的抗體的特異性結(jié)合伙伴。該試劑盒也可以包括前面描述的助劑?？梢砸匀魏芜m當(dāng) 的形式包裝該試驗(yàn)試劑盒，典型的將所有組分裝在一個(gè)容器中，并且裝入用于說明如何進(jìn) 行試驗(yàn)的說明書。
[0166] 本發(fā)明將下面描述的實(shí)施例作為部分基礎(chǔ)。這些實(shí)施例的目的在于描述本發(fā)明， 并不構(gòu)成對發(fā)明的限制。
[0167] 實(shí)施例1 :抗稈序件死亡多狀-1配體抗體對慢件感染小鼠中稈序件死亡多狀-1 涂徑的抑制
[0168] 使用經(jīng)過不同的淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒（LCMV)菌株感染的小鼠，來研究慢 性病毒感染對CD8陽性T細(xì)胞功能的影響。淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒（LCMV)Armstrong 菌株引起的急性感染能夠在8天內(nèi)被清除，留下一批長期存活的、具備高度功能性的休眠 記憶性⑶8陽性T細(xì)胞。相反，LCMV C1-13菌株在宿主中形成持續(xù)性感染，表現(xiàn)為能夠持 續(xù)3個(gè)月的病毒血。這種病毒不確定的停留在某些組織中，因而抗原特異性⑶8陽性T細(xì) 胞的功能被削弱。D bNP396-404⑶8陽性T細(xì)胞被物理性刪除，而DbGP33-41 CD8陽性T細(xì) 胞以及DbGP276-286⑶8陽性T細(xì)胞依然存在，但是喪失了擴(kuò)增或者分泌抗病毒細(xì)胞因子 例如干擾素 -Y (IFN- Y )、腫瘤壞死因子-a (TNF- α )的能力。
[0169] C57BL/6 小鼠購買自 National Cancer Institute (國家腫瘤學(xué)會）（Frederick， MD)。使用2X106pfu個(gè)LCMV-C1-13對小鼠進(jìn)行感染。在感染當(dāng)天以及感染后的第二天， 注射存在于PBS (磷酸緩沖液）中的500微克GK (雜交瘤細(xì)胞）1. 5,以造成CD4缺失。通過 給小鼠注射2 X IO5Pfu個(gè)LCMV Armstrong來獲得淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒（LCMV)免疫 型小鼠。
[0170] 對經(jīng)過FACS (流式細(xì)胞術(shù)）純化的天然DbGP33-41特異性P14轉(zhuǎn)基因⑶8陽性T細(xì) 胞、來自于LCMV Armstrong免疫型小鼠的DbGP33-41特異性記憶性⑶8陽性T細(xì)胞、以及來 自于⑶4陽性缺陷型LCMV C1-13感染型小鼠的DbGP33-41⑶8陽性T細(xì)胞以及DbGP276-286 ⑶8陽性T細(xì)胞進(jìn)行基因排列分析。使用如Kaech等人（于2002年在Cell (《細(xì)胞》）111 : 837-51中）描述的方法進(jìn)行RNA分離和基因排列分析。與記憶性⑶8陽性T細(xì)胞相比，程 序性死亡多肽-ImRNA在衰竭的⑶8陽性T細(xì)胞中高度表達(dá)（附圖1A)。而且，程序性死亡 多肽-1表達(dá)于LCMV C1-13感染型小鼠的⑶8陽性T細(xì)胞表面，但經(jīng)過LCMV Armstrong清 除后，CD8陽性T細(xì)胞表面不存在程序性死亡多肽-1 (附圖1B)。與未感染的小鼠相比，慢 性感染型小鼠在大部分淋巴細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞（APC)上表達(dá)了更高水平的程序性死亡 多肽-1配體、程序性死亡多肽-1配體中的一種。因此,當(dāng)程序性死亡多肽-1的表達(dá)被誘 發(fā)時(shí)，伴隨著病毒抗原的持續(xù)性存在以及CD8陽性T細(xì)胞的衰竭。
[0171] 為了驗(yàn)證在慢性淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒感染過程中阻滯程序性死亡多肽-1/ 程序性死亡多肽-1配體的路徑能夠恢復(fù)T細(xì)胞功能并且增強(qiáng)對病毒的控制，在慢性淋巴細(xì) 胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒感染過程中使用a ro-Ll封閉抗體阻斷程序性死亡多肽-1/程序性死 亡多肽-1配體的共刺激。在感染后的第23天至第37天里，每隔三天向LCMV C1-13感染型 小鼠（克隆10F. 5C5或者10F. 9G2)施用抗程序性死亡多肽-1配體的封閉單克隆抗體（200 微克鼠用抗鼠類H)-L1 IgG2b單克隆抗體）。在第37天時(shí)，與未經(jīng)處理的對照組相比，經(jīng)過 處理的小鼠中的DbNP396-404特異性⑶8陽性T細(xì)胞增加了大約2. 5倍，而DbGP33-41特異 性⑶8陽性T細(xì)胞增加了大約3倍（附圖2A)。由于經(jīng)過處理的小鼠和未經(jīng)處理的小鼠的 脾臟中具有大致相同數(shù)量的^4+1'細(xì)胞（每個(gè)脾臟中含有大約6\10 4個(gè)從％?61-80^4+丁 細(xì)胞），因而誘發(fā)的擴(kuò)增是特異于CD8陽性T細(xì)胞的。
[0172] 除了 CD8+T細(xì)胞擴(kuò)增的增加，程序性死亡多肽-1信號的抑制也可以導(dǎo)致病毒 特異性CD8陽性T細(xì)胞中的抗病毒細(xì)胞因子產(chǎn)量的增加。測定由CD8+T細(xì)胞在8個(gè)不 同的CTL(細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞）抗原決定基上生成的干擾素 -γ (IFN- γ )、腫瘤壞死因 子-α (TNF-α)。與未經(jīng)處理的小鼠相比，經(jīng)過處理的小鼠的聯(lián)合應(yīng)答高出了 2.3倍（附圖 2B和2C)。在接受治療之后，也觀察到生產(chǎn)腫瘤壞死因子-a (TNF- α )的細(xì)胞的頻率增加 了 2倍（附圖2D)。病毒清除率也加速了，病毒從經(jīng)過處理的小鼠的血清、脾臟和肝臟中清 除了。在感染后的第37天（開始治療后的第14天），在經(jīng)過治療的小鼠的肺和腎內(nèi)觀察到 降低的病毒滴度（大約10倍）。然而，未經(jīng)處理的小鼠的上述全部組織內(nèi)都顯示出高水平 的病毒（附圖2Ε)。根據(jù)Ahmed等人（于1984年在J. Virol. 51 :34-41中）描述的方法利 用Vero細(xì)胞測定血漿和組織勻漿中的病毒滴度。結(jié)果表明程序性死亡多肽-1抑制劑增加 CD8+T細(xì)胞的擴(kuò)增和病毒清除率，因此表明程序性死亡多肽-1信號的抑制能夠恢復(fù)CD8+T 細(xì)胞的功能。并且，程序性死亡多肽-1信號的抑制也可以增加 B細(xì)胞的應(yīng)答，因?yàn)樵诮邮?治療后，脾臟中淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒特異性抗體分泌細(xì)胞的數(shù)量也增加了（大約10 倍）。
[0173] ⑶4陽性（CD4+)T細(xì)胞在⑶8+T細(xì)胞應(yīng)答的產(chǎn)生和維持中起到了重要的作用。在 這點(diǎn)上，當(dāng)CD4+T細(xì)胞缺失時(shí)，待發(fā)的CD8+T細(xì)胞（所謂的"無功能型"CD8+T細(xì)胞）不能激 發(fā)正常的免疫應(yīng)答。并且，當(dāng)CD4+T細(xì)胞缺失時(shí)，慢性淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒感染更加 嚴(yán)重。因此，與⑶4+T細(xì)胞的存在下生成的T細(xì)胞相比，在LCMV-C1-13感染中生成的無功 能型T細(xì)胞表現(xiàn)出更嚴(yán)重的功能削弱。D bNP396-404特異性⑶8陽性T細(xì)胞被刪除到無法 探測的水平，而DbGP33-41⑶8陽性T細(xì)胞和D bGP276-286⑶8陽性T細(xì)胞完全喪失了分泌 干擾素 -Y (IFN- γ )、腫瘤壞死因子-a (TNF- α )的能力。
[0174] 當(dāng)被LCMV-C1-13感染時(shí)，⑶4陽性T細(xì)胞發(fā)生了缺失，在感染發(fā)生后的第46天 至第60天時(shí)，使用抗程序性死亡多肽-1配體抗體處理小鼠。在處理前后使用細(xì)胞內(nèi)干擾 素-Y染色不能探測到LCMV-特異性⑶4陽性T細(xì)胞。在接受處理之后，與未經(jīng)處理的小 鼠相比，處理過的小鼠的脾臟內(nèi)的D bGP276-286⑶8陽性T細(xì)胞增加了大約7倍，DbGP33-41 CD8陽性T細(xì)胞增加了 4倍（附圖3A)。脾臟中的病毒特異性CD8陽性T細(xì)胞的數(shù)量也 增加了（附圖3B)。處理過的小鼠的病毒特異性CD8陽性T細(xì)胞的增加歸因于擴(kuò)增的增 力口，是通過導(dǎo)入溴化脫氧尿嘧啶核苷（BrdU)來檢測的。對于未經(jīng)處理的小鼠而言，向43% 的D bGP276-286⑶8陽性T細(xì)胞中導(dǎo)入中間水平的溴化脫氧尿嘧啶核苷（BrdU)，向2%的 DbGP276-286⑶8陽性T細(xì)胞中導(dǎo)入高水平的溴化脫氧尿嘧啶核苷（BrdU)，而對于經(jīng)過處 理的小鼠而言，向50%的D bGP276-286⑶8陽性T細(xì)胞中導(dǎo)入中間水平的溴化脫氧尿嘧啶 核苷（BrdU)，向37%的DbGP276-286⑶8陽性T細(xì)胞中導(dǎo)入高水平的溴化脫氧尿嘧啶核苷 (BrdU)。在處理過程中，導(dǎo)入1毫克/毫升溴化脫氧尿嘧啶核苷（BrdU)的飲用水溶液來進(jìn) 行溴化脫氧尿啼陡核苷（BrdU)分析，并且根據(jù)操作者規(guī)程（BD Biosciences，San Diego, CA)來進(jìn)行染色。而且，經(jīng)過處理的小鼠含有更高百分含量的CD8陽性T細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞周期 相關(guān)蛋白Ki67 (60%比19%，19%是未經(jīng)處理的小鼠得到的結(jié)果，附圖3C)。在外周血單個(gè) 核細(xì)胞中，CD8陽性T細(xì)胞對處理的應(yīng)答限制小鼠產(chǎn)生高水平的CD8陽性T細(xì)胞擴(kuò)張。
[0175] 程序性死亡多肽-1的抑制同樣增加了無功能型、衰竭的病毒特異性CD8陽性T細(xì) 胞中抗病毒細(xì)胞因子的產(chǎn)生。在接受治療后，產(chǎn)生干擾素 -Y (IFN-Y)的DbGP33-41⑶8陽 性T細(xì)胞和DbGP276-286⑶8陽性T細(xì)胞的數(shù)量顯著增加了（附圖4A)，盡管在經(jīng)過處理的 小鼠中也檢測到更高數(shù)量的D bNP396-404特異性⑶8陽性T細(xì)胞、KbNP205-212特異性⑶8 陽性T細(xì)胞、D bNP 166-175特異性⑶8陽性T細(xì)胞、以及DbGP92-101特異性⑶8陽性T細(xì)胞 (附圖4A)。經(jīng)過處理的小鼠中有50%的D bGP276-286特異性⑶8陽性T細(xì)胞能夠生成干 擾素 -Y (IFN- γ )，而在作為對照的未經(jīng)處理的小鼠中有20%的DbGP276-286特異性⑶8陽 性T細(xì)胞能夠生成干擾素 -γ (IFN- γ )(附圖4B)。然而，由經(jīng)過處理的小鼠的DbGP276-286 特異性⑶8陽性T細(xì)胞生成的干擾素 -Y (IFN- Y )、腫瘤壞死因子-a (TNF- α )的水平低于 功能性DbGP276-286特異性記憶細(xì)胞（附圖4C)。
[0176] 程序性死亡多肽-1的抑制也可以增加無功能型、衰竭的病毒特異性CD8陽性T 細(xì)胞的細(xì)胞溶解酶活性。在進(jìn)行治療之后，使用51Cr釋放檢測（Wherry等人于2003年在 J. Virol. 77 :4911-27中發(fā)表的文章）對病毒特異性⑶8陽性T細(xì)胞的體外細(xì)胞溶解酶活 性進(jìn)行測定。與未經(jīng)處理的小鼠相比，經(jīng)過2周的治療后，脾臟中的病毒滴度降低了大約3 倍，肝臟中的病毒滴度降低了大約4倍，肺中的病毒滴度降低了大約2倍，而血清中的病毒 滴度降低了大約2倍（附圖4E)。
[0177] 這些結(jié)果證明了阻滯程序性死亡多肽-1途徑能夠細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL)對 慢性病毒感染的外周免疫耐受，因此喪失了 CD4陽性T細(xì)胞功能的衰竭的CD8陽性T細(xì)胞 并不是被不可逆滅活的。
[0178] 實(shí)施例2 :抗病毒疫苗以及稈序件死亡多狀-1抑制劑的施用
[0179] 在持續(xù)性感染過程中，推動T細(xì)胞應(yīng)答的一種方法是治療性的接種疫苗。該方法 的基本原理是，在慢性病毒感染過程中，內(nèi)源性抗原可能不能以最佳形式或者免疫原的形 式存在，因而以疫苗的形式提供抗原可以提供一種對病毒特異性T細(xì)胞和B細(xì)胞來說更加 有效的刺激因素。使用慢性淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒（LCMV)小鼠模型，向小鼠施用表達(dá) LCMV GP33抗原決定基的重組牛痘病毒作為治療性疫苗（VVGP33)，該疫苗能夠在某些慢性 感染型小鼠中適度增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的應(yīng)答。在接種了治療性疫苗的小鼠中，有九分之五的 慢性感染型小鼠表現(xiàn)出陽性應(yīng)答，而在對照組小鼠中沒有表現(xiàn)出對GP33的免疫應(yīng)答的顯 著增加。當(dāng)將這種治療性疫苗的接種與程序性死亡多肽-1抑制劑聯(lián)合使用時(shí)，與單獨(dú)使用 任何一種處理相比，淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒（LCMV)特異性T細(xì)胞的應(yīng)答被推動到一個(gè) 更高的水平，這種組合處理的作用比兩種單獨(dú)作用的疊加更加明顯。
[0180] 實(shí)施例3 :稈序件死亡多狀-IRNAi對慢件感染型小鼠的稈序件死亡多狀-1涂徑 的抑制
[0181] RNA干擾（RNAi)能夠沉默哺乳動物細(xì)胞中的基因表達(dá)。將長的雙鏈RNAS (dsRNAs) 導(dǎo)入細(xì)胞中，并且繼續(xù)處理成小的、沉默RNAs (siRNAs)，后者能夠作用于特異性mRNA分子 或者小基團(tuán)mRNAs。當(dāng)抗體不具備功能性時(shí)，這項(xiàng)技術(shù)尤其有效。例如，當(dāng)單一拼接變體 (unique splice variants)生成可溶性的程序性死亡多肽-1以及細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗 原-4(CTLA-4)時(shí)，可以使用RNAi。
[0182] 將程序性死亡多肽-1沉默RNAs插入商業(yè)購買的siRNA表達(dá)載體例如pSilencer? 表達(dá)載體或者腺病毒載體中（Ambion，Austin，TX)。之后，在體內(nèi)或者體外將這些載體與目 標(biāo)衰竭的T細(xì)胞相接觸（參見實(shí)施例4)。
[0183] 實(shí)施例4 :衰竭件T細(xì)朐的體外復(fù)什
[0184] 使用磁性珠或者密度梯度離心方法，將病毒特異性衰竭CD8陽性T細(xì)胞從 LCMV-C1-13慢性感染型小鼠中分離出來。將轉(zhuǎn)染的CD8陽性T細(xì)胞與作用于程序性死亡 多肽-1配體、程序性死亡多肽-1配體2或者程序性死亡多肽-1的單克隆抗體相接觸。如 實(shí)施例1中所述，程序性死亡多肽-1途徑的抑制導(dǎo)致CD8陽性T細(xì)胞的復(fù)壯。因此，例如 CD8+T細(xì)胞的擴(kuò)增和細(xì)胞因子的生成被增加了。使用實(shí)施例1中描述的方法，將這些復(fù)壯的 CD8陽性T細(xì)胞重新導(dǎo)入感染型小鼠中，并測定其病毒載量。
[0185] 實(shí)施例5 :新的⑶8陽件T細(xì)朐復(fù)卄化合物的體外篩詵
[0186] 可以使用體內(nèi)篩選或者體外篩選的方法來鑒定能夠調(diào)節(jié)程序性死亡多肽-1途徑 的化合物，這種鑒定基于它們逆轉(zhuǎn)CD8陽性T細(xì)胞衰竭的能力，這種衰竭是由慢性病毒感染 導(dǎo)致的。
[0187] 衰竭的⑶8陽性T細(xì)胞來自于經(jīng)過LCMV-C1-13慢性感染的小鼠，之后將其與試驗(yàn) 化合物進(jìn)行接觸。使用例如ELISA (酶聯(lián)免疫吸附測定）或者其他定量方法測量從接觸的T 細(xì)胞中釋放的抗病毒細(xì)胞因子（例如，干擾素-Y或者腫瘤壞死因子-α)的數(shù)量，并且與 未接觸過試驗(yàn)化合物的衰竭T細(xì)胞中釋放的抗病毒細(xì)胞因子的數(shù)量相比較，如果后者能夠 釋放出抗病毒細(xì)胞因子的話。與未經(jīng)過處理的細(xì)胞釋放的量相比，處理過的細(xì)胞釋放出的 抗病毒細(xì)胞因子的數(shù)量的增加證明了該化合物是一種程序性死亡多肽-1抑制劑，能夠有 效的調(diào)節(jié)T細(xì)胞活性。
[0188] 實(shí)施例6 :新的⑶8陽件T細(xì)朐復(fù)卄化合物的體內(nèi)篩詵
[0189] 衰竭的⑶8陽性T細(xì)胞來自于經(jīng)過LCMV-C1-13慢性感染的小鼠。給感染型小鼠 靜脈內(nèi)注射試驗(yàn)化合物。使用例如ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定）或者其他定量方法測量釋 放到血清當(dāng)中的抗病毒細(xì)胞因子（例如，干擾素-Y或者腫瘤壞死因子-α)的數(shù)量，并且 測量未經(jīng)過處理的小鼠血清中的抗病毒細(xì)胞因子的數(shù)量并進(jìn)行比較。與未經(jīng)過處理的小鼠 相比，處理過的小鼠血清中檢測到的抗病毒細(xì)胞因子的數(shù)量的增加證明了這種試驗(yàn)化合物 是一種程序性死亡多肽-1抑制劑。或者，可以在使用試驗(yàn)化合物之前或者之后測定病毒滴 度（例如，血清病毒滴度）。
[0190] 實(shí)施例7 :以黑猩猩作為樽型的持續(xù)件HCV(C型肝炎病毒）感染的免疫治療
[0191] 將黑猩猩作為人類C型肝炎病毒的感染模型。由T細(xì)胞免疫缺失導(dǎo)致的長期存活 性病毒的持續(xù)包括HCV-特異性CD4+T輔助細(xì)胞的缺失以及CD8+T效應(yīng)細(xì)胞活性的削弱或 者改變。用針對細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原-4 (CTLA-4)的抗體、針對程序性死亡多肽-1的抗 體、或者兩者的組合對持續(xù)感染型黑猩猩進(jìn)行處理。把阻滯抑制性途徑的效用與疫苗的接 種相結(jié)合，其中接種的疫苗是具有重組結(jié)構(gòu)的HCV(C型肝炎病毒）蛋白以及非結(jié)構(gòu)性HCV(C 型肝炎病毒）蛋白，并且測定這種方案能否增加病毒特異性記憶性T細(xì)胞的頻率以及壽命。 在持續(xù)性感染型人類和持續(xù)性感染型黑猩猩中，T細(xì)胞免疫性的缺失是具有專一的HCV-特 異性的。檢測在Treg細(xì)胞（調(diào)控T細(xì)胞）存在時(shí)，感染型黑猩猩血液和肝臟中的細(xì)胞毒性 T淋巴細(xì)胞抗原-4 (CTLA-4)、程序性死亡多肽-1、B、T淋巴細(xì)胞衰減因子（BTLA)及其配體 的表達(dá)。隨后，通過向黑猩猩提供人源化單克隆抗體，恢復(fù)其抗病毒活性，所述人源化單克 隆抗體能夠阻滯這些分子中的信號。
[0192] 使用人源化a CTLA-4抗體（MDX-010,Medarex)或者a TO-I抗體對持續(xù)性感染型 黑猩猩進(jìn)行處理。MDX-010的初始劑量是0. 3毫克/千克，兩周之后，該劑量是I. 0毫克/ 千克，之后以每三周為一個(gè)時(shí)間間隔，分別是3毫克/千克、10毫克/千克和30毫克/千 克。在使用抗體處理共刺激分子之后，測定體液和細(xì)胞內(nèi)的免疫應(yīng)答，以及HCV (C型肝炎病 毒）RNA的載量。在第1、2、3、5、8周時(shí)收集樣品，之后以每月為一個(gè)時(shí)間間隔收集樣品。樣 品包括：1)用于分析轉(zhuǎn)氨酶、自身抗體、針對HCV的中和抗體、以及細(xì)胞因子應(yīng)答的血清，2) 用于負(fù)載病毒和基因組進(jìn)化的血漿，3)用于體外測定免疫性、共刺激性/抑制性受體的表 達(dá)和功能的外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC)，4)用于分離肝內(nèi)淋巴細(xì)胞和RNA的新鮮（未固定） 肝臟，以及5)用于組織學(xué)分析和免疫組織化學(xué)分析的固定化（福爾馬林/石蠟包埋的）肝 臟。還要在2個(gè)或者3個(gè)時(shí)間點(diǎn)處收集區(qū)域淋巴結(jié)，用以通過免疫組織化學(xué)技術(shù)和分子技 術(shù)評價(jià)共抑制性分子和接合變體的表達(dá)。按照這里描述的檢測方法對這些治療的安全性和 有效性進(jìn)行評價(jià)。
[0193] 為了確定接種HCV (C型肝炎病毒）抗原能夠加強(qiáng)程序性死亡多肽-1的抗體的治 療有效性，按照如下方法對黑猩猩進(jìn)行處理：1)在第〇周、第4周及第24周，使用重組包膜 糖蛋白El和Ε2(在MF59佐劑中）和其他蛋白（core plus NS3,4, 5,由ISCOMS (免疫刺激 復(fù)合物）配置成）對黑猩猩進(jìn)行肌肉內(nèi)免疫；2)使用1)中所述的疫苗對其進(jìn)行肌肉內(nèi)免 疫，但同時(shí)施用aCTLA-4抗體（每千克體重施用30毫克，在注射疫苗后的第0周、第4周 以及第24周時(shí)通過靜脈內(nèi)注射方式施用）；3)與2)相同，不同的是使用aro-U或者B、 T淋巴細(xì)胞衰減因子）抗體替代細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原-4 (CTLA-4)抗體；4)與2)和3) 步驟相同，不同的是除使用疫苗之外，還使用細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原-4抗體和程序性死 亡多肽-1 (或者B、T淋巴細(xì)胞衰減因子）抗體。在進(jìn)行免疫之后的1年內(nèi)，以每月為一個(gè) 時(shí)間間隔，監(jiān)測HCV-特異性T細(xì)胞和B細(xì)胞的應(yīng)答。
[0194] 在這項(xiàng)分析中，用于檢測HCV-四聚體和全部T細(xì)胞的標(biāo)記物包括分化標(biāo)記物 (例如，CD45RA/R0, CD62L，CCR7,以及 CD27)，活化標(biāo)記物（例如，CD25, CD69, CD38,以及 HLA-DR(人白細(xì)胞位點(diǎn)DR抗原）），存活/擴(kuò)增標(biāo)記物（例如，bcl-2以及Ki67)，細(xì)胞因子 潛在標(biāo)記物（例如，粒酶以及穿孔素），和細(xì)胞因子受體標(biāo)記物（⑶122以及⑶127)。在趨 化因子IP-10的預(yù)治療水平與聚乙二醇干擾素-Y/病毒唑的應(yīng)答之間存在有趣的相關(guān)性。 測定IP-10的水平，以研究在陰性調(diào)控途徑或者C型肝炎病毒特異性T細(xì)胞應(yīng)答與IP-10 水平之間存在的潛在相關(guān)性。通過流式細(xì)胞術(shù)來完成抑制性受體和配體在外周血單個(gè)核細(xì) 胞（PBMC)上的表達(dá)。
[0195] 實(shí)施例8 :在反應(yīng)件淋巴纟目織中的稈序件死亡多狀-1的免疫染色
[0196] 材料
[0197] 依照制度政策，病例材料（case material)來自于 Brigham&Women' s Hosptial, Boston, MA(Brigham女子醫(yī)院，波士頓，摩洛哥）。所有診斷都是依據(jù)世界衛(wèi)生組織淋巴瘤 分類系統(tǒng)（JafTe ES等人于2001年）中描述的組織學(xué)特征核免疫表型特征來進(jìn)行的，在所 有的病例中，用于診斷的材料都經(jīng)過血液病理學(xué)家的復(fù)查。
[0198] 免疫染色
[0199] 根據(jù)先前的描述（Jones D等人于1999年發(fā)表的文章 ；Dorfman DM等人于2003年 發(fā)表的文章），使用標(biāo)準(zhǔn)的間接親合素-生物素辣根過氧化物酶法以及二氨基聯(lián)苯胺顯色 反應(yīng)進(jìn)行程序性死亡多肽-1的免疫染色，該反應(yīng)是在用福爾馬林固定的、石蠟包埋的組織 切片中進(jìn)行的，在染色反應(yīng)之前，先在IOmM PH6.0的檸檬酸鹽緩沖液中使用先前描述的抗 人類程序性死亡多肽-1單克隆抗體（2H7 ;5)進(jìn)行微波抗原修復(fù)。如果有至少25%的腫瘤 細(xì)胞表現(xiàn)出陽性染色，則認(rèn)為該病例對程序性死亡多肽-1是具有免疫反應(yīng)性的。在對所有 病例的研究中，將程序性死亡多肽-1的染色與鼠類IgG (免疫球蛋白G)同形對照抗體的染 色進(jìn)行比對，以證實(shí)染色特異性，其中對照抗體是經(jīng)過稀釋的，其具有與程序性死亡多肽-1 相同的蛋白濃度。
[0200] 針對程序性死亡多肽-1的單克隆抗體2H7被用來對下列經(jīng)福爾馬林固定的、石蠟 包埋的樣本進(jìn)行染色：反應(yīng)性淋巴組織樣本、胸腺樣本、以及一系列患有B細(xì)胞和T細(xì)胞淋 巴擴(kuò)增疾病的病例樣本。在扁桃腺樣本中表現(xiàn)出反應(yīng)性變化，包括濾泡增生，次級淋巴小結(jié) 中的主要小淋巴細(xì)胞子集表現(xiàn)出程序性死亡多肽-1的細(xì)胞質(zhì)染色，在濾泡內(nèi)T細(xì)胞區(qū)域中 觀察到稀少的程序性死亡多肽-1陽性細(xì)胞。在次級淋巴小結(jié)中的程序性死亡多肽-1的染 色式樣實(shí)際上與使用針對CD3的抗體、泛T細(xì)胞標(biāo)記物的染色式樣是相同的，而針對CD20 的抗體、泛B細(xì)胞標(biāo)記物則將次級淋巴小結(jié)B細(xì)胞的絕大部分進(jìn)行了染色。在反應(yīng)性淋巴 結(jié)和脾臟的組織切片中也觀察到相似的結(jié)果。在成熟胸腺中沒有觀察到程序性死亡多肽-1 的染色。
[0201] 實(shí)施例9 :石蠟何埋的B細(xì)朐和T細(xì)朐淋巴擴(kuò)增病奪纟目織切片中的稈序件死亡多 狀-1的免疫染色
[0202] 對一系列B細(xì)胞和T細(xì)胞淋巴擴(kuò)增病變中的程序性死亡多肽-1表達(dá)進(jìn)行了研究； 研究結(jié)果概括在表1中。檢測了 42例B細(xì)胞淋巴擴(kuò)增病變中的程序性死亡多肽-1的表達(dá)， 包括前體B淋巴細(xì)胞性白血病/淋巴細(xì)胞性淋巴瘤的典型病例，以及一系列成熟B細(xì)胞的 淋巴擴(kuò)增病變，包括許多起源于濾泡的B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤，包括6個(gè)濾泡性淋巴瘤以及 7個(gè)伯基特氏淋巴瘤。這些B細(xì)胞淋巴擴(kuò)增病變中沒有一個(gè)顯示出程序性死亡多肽-1的染 色。在某些病例中，出現(xiàn)非腫瘤反應(yīng)性淋巴組織，并且表現(xiàn)出與在扁桃腺及前述提及的其他 反應(yīng)性淋巴組織中觀察到的相同的程序性死亡多肽-1染色式樣。
[0203] 類似的，在25例霍奇金淋巴瘤中，包括11例經(jīng)典霍奇金淋巴瘤和14例淋巴細(xì)胞 為主型的霍奇金淋巴瘤，腫瘤細(xì)胞中沒有表現(xiàn)出程序性死亡多肽-1的染色。有趣的是，在 全部14例淋巴細(xì)胞為主型的霍奇金淋巴瘤中，T細(xì)胞周圍腫瘤⑶20-陽性IAH細(xì)胞對程序 性死亡多肽-1是具有免疫反應(yīng)性的，與淋巴細(xì)胞為主型的霍奇金淋巴瘤中的CD57+T細(xì)胞 得到的染色式樣相似。這些程序性死亡多肽-1陽性細(xì)胞是全部存在的CD3+T細(xì)胞群的子 集。
[0204] 對一系列T細(xì)胞淋巴擴(kuò)增病變中的程序性死亡多肽-1表達(dá)進(jìn)行研究；研究結(jié)果概 括在表1中。前體T細(xì)胞淋巴細(xì)胞性白血病/淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、未成熟T細(xì)胞腫瘤病例 中的程序性死亡多肽-1是陰性的，它們是外周胸腺后T細(xì)胞腫瘤，包括T細(xì)胞幼淋巴細(xì)胞 性白血病，非特異性外周T細(xì)胞淋巴瘤，間變性大細(xì)胞淋巴瘤，以及成熟T細(xì)胞白血病/淋 巴瘤。相反，全部19例含有程序性死亡多肽-1陽性細(xì)胞焦點(diǎn)（foci)的血管淋巴瘤病例也 對泛T細(xì)胞標(biāo)記物例如⑶3產(chǎn)生免疫反應(yīng)性。在擴(kuò)張的⑶21+濾泡性樹突狀細(xì)胞（FDC)網(wǎng) 格結(jié)構(gòu)的焦點(diǎn)（foci)處一向存在程序性死亡多肽-1陽性細(xì)胞，這是血管淋巴瘤的一項(xiàng)重 要特征。
[0205] 表1 :淋巴擴(kuò)增病變中的程序性死亡多肽-1免疫染色
[0206]

【權(quán)利要求】
1. 一種化合物在制備用于緩解或者預(yù)防腫瘤癥狀的藥物組合物中的應(yīng)用，所述化合物 能夠降低宿主中程序性細(xì)胞死亡-1 (PD-1)多肽的活性或者表達(dá)，其中 (1) 所述腫瘤是淋巴增殖性腫瘤；并且 (2) 所述化合物抗程序性死亡多肽-1抗體，抗程序性死亡多肽-1配體抗體，抗程序性 死亡多肽-1配體2抗體，抗程序性死亡多肽-lRNAi，抗程序性死亡多肽-1配體RNAi，抗程 序性死亡多肽-1配體2RNAi，抗程序性死亡多肽-1反義RNA，抗程序性死亡多肽-1配體反 義RNA，抗程序性死亡多肽-1配體2反義RNA，顯性負(fù)性程序性死亡多肽-1蛋白，顯性負(fù)性 程序性死亡多肽-1配體蛋白，或者顯性負(fù)性程序性死亡多肽-1配體2蛋白。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述的抗體是單克隆抗體，人源化抗體，去免疫化抗 體，或者Ig融合蛋白。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述藥物組合物進(jìn)一步包括一種第二種化合物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述的第二種化合物選自抗炎癥化合物、抗腫瘤化合 物或者止痛劑。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4的應(yīng)用，其中所述的第二種化合物降低細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗 原-4(CTLA-4)或者B、T淋巴細(xì)胞衰減因子（BTLA)的表達(dá)或者活性。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4的應(yīng)用，其中所述的第二種化合物降低腫瘤細(xì)胞的量。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4的應(yīng)用，其中所述的第二種化合物是抗細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原-4 抗體，抗B、T淋巴細(xì)胞衰減因子抗體，抗CD28抗體，抗可誘導(dǎo)共刺激分子抗體，抗可誘導(dǎo)共 刺激分子配體抗體，抗B7-1抗體，抗B7-2抗體，抗B7-H3抗體，或者抗B7-H4抗體。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述淋巴增殖性腫瘤是血管淋巴瘤或者結(jié)節(jié)性淋巴細(xì) 胞為主型的霍奇金淋巴瘤。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述的降低程序性細(xì)胞死亡-1 (PD-1)表達(dá)或者活性的 化合物是一種抗程序性死亡多肽-1配體抗體，該抗程序性死亡多肽-1配體抗體可降低程 序性細(xì)胞死亡-l(PD-l)的活性。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，所述的降低程序性細(xì)胞死亡-l(PD-l)表達(dá)或者活性的化 合物使免疫無能型T細(xì)胞的細(xì)胞毒性T細(xì)胞活性增加。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10的應(yīng)用，其中所述的細(xì)胞毒性T細(xì)胞活性是細(xì)胞因子的生成或者 T細(xì)胞的擴(kuò)增。
12. -種化合物在制備用于使患有淋巴增殖性腫瘤的宿主的T細(xì)胞的擴(kuò)增增加的藥 物中的應(yīng)用，其中所述化合物抗程序性死亡多肽-1抗體，抗程序性死亡多肽-1配體抗體， 抗程序性死亡多肽-1配體2抗體，抗程序性死亡多肽-lRNAi，抗程序性死亡多肽-1配體 RNAi，抗程序性死亡多肽-1配體2RNAi，抗程序性死亡多肽-1反義RNA，抗程序性死亡多 肽-1配體反義RNA，抗程序性死亡多肽-1配體2反義RNA，顯性負(fù)性程序性死亡多肽-1蛋 白，顯性負(fù)性程序性死亡多肽-1配體蛋白，或者顯性負(fù)性程序性死亡多肽-1配體2蛋白。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12的應(yīng)用，其中所述的T細(xì)胞已與抗程序性死亡多肽-1抗體，抗程 序性死亡多肽-1配體2抗體，抗細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原-4抗體，抗B、T淋巴細(xì)胞衰減因 子抗體，抗CD28抗體，抗可誘導(dǎo)共刺激分子抗體，抗可誘導(dǎo)共刺激分子配體抗體，抗B7-1抗 體，抗B7-2抗體，抗B7-H3抗體，或者抗B7-H4抗體進(jìn)行接觸。
14. 根據(jù)權(quán)利要求12的應(yīng)用，其中所述的淋巴增殖性腫瘤是血管淋巴瘤或者結(jié)節(jié)性淋 巴細(xì)胞為主型的霍奇金淋巴瘤。
15. 根據(jù)權(quán)利要求12的應(yīng)用，其中所述的化合物是一種抗程序性死亡多肽-1配體抗 體。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15的應(yīng)用，所述的抗程序性死亡多肽-1配體抗體是單克隆抗體，人 源化抗體，去免疫化抗體，或者Ig融合蛋白。
17. -種體外針對血管淋巴瘤或者結(jié)節(jié)性淋巴細(xì)胞為主型的霍奇金淋巴瘤進(jìn)行樣品分 析的方法，包括：(a)提供一種樣品，該樣品包括免疫細(xì)胞；以及（b)測量該宿主樣品中的程 序性死亡多肽-1的表達(dá)或者活性，與陰性對照樣品中的表達(dá)或者活性相比，程序性死亡多 肽-1的表達(dá)或者活性的增加則表明該樣品載有血管淋巴瘤或者結(jié)節(jié)性淋巴細(xì)胞為主型的 霍奇金淋巴瘤。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述的樣品是血液樣品，活體組織，或者骨髓樣品。
19. 根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述的對照樣品是一種來自于沒有患有腫瘤的宿主 的細(xì)胞。
【文檔編號】A61K39/395GK104436190SQ201410597059
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2006年6月8日 優(yōu)先權(quán)日:2005年6月8日
【發(fā)明者】高丹·弗里曼, 阿琳·沙佩, 大衛(wèi)·M·多夫曼, 拉菲·阿梅德, 丹尼爾·巴伯, E·約翰·維爾瑞 申請人:達(dá)納-法伯癌癥研究院公司, 布賴漢姆婦女醫(yī)院, 埃默里大學(xué), 哈佛學(xué)院董事會