載脂蛋白A1的純化方法和ApoAI蛋白注射抗原的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種載脂蛋白A1的純化方法，包括：獲取血漿樣品，并進(jìn)行澄清處理；對(duì)澄清后的血漿樣品進(jìn)行第一次疏水層析，得第一次純化產(chǎn)物；將第一次純化產(chǎn)物進(jìn)行脫脂處理；將脫脂處理后的第一次純化產(chǎn)物進(jìn)行第二次疏水層析；其中，第一次純化的洗脫中包括兩次洗脫；第一次洗脫用5～10％的有機(jī)醇進(jìn)行洗脫、第二次洗脫用25～30％的醇進(jìn)行洗脫；第二次疏水層析用洗脫強(qiáng)度低于25～30％的醇的洗脫液洗脫。本發(fā)明的方法利用HDL結(jié)構(gòu)中存在脂質(zhì)產(chǎn)生的強(qiáng)疏水性的機(jī)理進(jìn)行第一次純化，然后破壞HDL的脂蛋白結(jié)構(gòu)使載脂蛋白A1與脂類分離，造成載脂蛋白A1與同樣高疏水性雜蛋白質(zhì)疏水性差異增大后再次疏水分離，即得到純度較好載脂蛋白A1；方法簡(jiǎn)便新穎、處理樣品的量更大、效率高。
【專利說明】載脂蛋白Al的純化方法和ApoAI蛋白注射抗原

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物分離【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種載脂蛋白Al的純化方法和ApoAI蛋白注射抗原。

【背景技術(shù)】
[0002]載脂蛋白是構(gòu)成血漿脂蛋白的蛋白質(zhì)組分，主要分A、B、C、D、E五類，是構(gòu)成血漿脂蛋白的重要組分；其基本功能是與脂類和固醇類分子形成復(fù)合球體，以運(yùn)載脂類和固醇類物質(zhì)。由于載脂蛋白的上述基本特性功能，因此其常是構(gòu)成高密度脂蛋白(High DensityLipprotein，HDL)的結(jié)構(gòu)功能成分。所構(gòu)成的高密度脂蛋白(High Density Lipprotein，HDL)是一種抗動(dòng)脈粥樣硬化的血漿脂蛋白，是心腦血管疾病的保護(hù)因子，HDL主要在肝(部分在小腸)合成。由于其可輸出膽固醇促進(jìn)膽固醇的代謝，所以被作為動(dòng)脈硬化預(yù)防因子而受到重視。
[0003]在高密度脂蛋白HDL的結(jié)構(gòu)蛋白中，占HDL總蛋白的75 %的是載脂蛋白Al (apolipoprotein Al，ApoAl)，而其他結(jié)構(gòu)蛋白主要是ApoA II約占20%比例。ApoAI由243個(gè)氨基酸殘基組成，分子量28300D，由于去氨基酸構(gòu)成多為疏水性氨基酸，因此其是一種極其疏水的蛋白質(zhì)，并通過其疏水性較高的特點(diǎn)和脂類以及膽固醇結(jié)合，起到穩(wěn)定脂蛋白復(fù)合體結(jié)構(gòu)，運(yùn)載脂類到達(dá)特定的組織中去?；谏鲜龈呙芏戎鞍譎DL的蛋白構(gòu)成特點(diǎn)，因此通過檢測(cè)ApoAI的含量即可直接反映出HDL的水平，進(jìn)一步通過其含量的測(cè)定，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化、心血管疾病進(jìn)行判斷和預(yù)測(cè)。
[0004]而目前，ApoAI的測(cè)定主要采用免疫比濁法和酶聯(lián)免疫吸附法，這些測(cè)定方法需要的試劑主要由標(biāo)準(zhǔn)ApoAI樣品和抗ApoAI抗體組成；檢測(cè)的過程的關(guān)鍵在于高效快速的從血漿中獲取高純度的ApoAI樣品以及所選擇的抗ApoAI抗體的特異性。其中從血漿中獲取高純度的ApoAI樣品的制備，現(xiàn)有主要采用的是包括或部分包括超高速梯度離心、離子交換層析、凝膠排阻層析和高效液相色譜等，逐步進(jìn)行分離、純化和驗(yàn)證，從而獲得高純度的ApoAI樣品。該方法過程中處理設(shè)備昂貴，處理樣品體積有限，工藝時(shí)間較長(zhǎng)，造成制造ApoAI檢測(cè)的成本居高，并且在長(zhǎng)時(shí)間的處理中ApoAI部分發(fā)生異構(gòu)、降解等，降低了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明實(shí)施例的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種使用同一種疏水層析填料，從人血漿中快速高效大量分離純化載脂蛋白Al的方法和ApoAI蛋白注射抗原。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案如下:
[0007]一種載脂蛋白Al的純化方法，包括如下步驟:
[0008]獲取血漿樣品，并將血漿樣品進(jìn)行澄清處理；
[0009]對(duì)澄清后的所述血漿樣品進(jìn)行第一次疏水層析，得第一次純化產(chǎn)物；
[0010]將所述第一次純化產(chǎn)物進(jìn)行脫脂處理；
[0011]將所述脫脂處理后的第一次純化產(chǎn)物進(jìn)行第二次疏水層析；
[0012]其中，所述第一次純化過程的洗脫中包括第一次洗脫和第二次洗脫，且第二次洗脫的洗脫液為所述第一次純化產(chǎn)物；所述第一次洗脫為采用5?10%的有機(jī)醇進(jìn)行洗脫、第二次洗脫為25?30%的醇進(jìn)行洗脫；
[0013]所述第二次疏水層析過程中采用洗脫強(qiáng)度低于25?30%的醇的洗脫液洗脫。
[0014]本發(fā)明的方法通過利用HDL自身結(jié)構(gòu)中存在脂質(zhì)產(chǎn)生的強(qiáng)疏水性的機(jī)理進(jìn)行第一次純化，通過化學(xué)手段破壞HDL的脂蛋白結(jié)構(gòu)使載脂蛋白Al與脂類分離，造成載脂蛋白Al與第一次純化所得的其他雜蛋白質(zhì)疏水性呈現(xiàn)較大差異進(jìn)行第二次純化，即得到純化了的載脂蛋白Al ;純化過程成本低、且能夠簡(jiǎn)單的線性放大，處理樣品的量更大，方法簡(jiǎn)便新穎、效率高。
[0015]本發(fā)明進(jìn)一步還提出一種ApoAI蛋白注射抗原，該ApoAI蛋白注射抗原為采用上述方法步驟得到的純化產(chǎn)物。
[0016]本發(fā)明的ApoAI蛋白注射抗原，其直接由上述方法制備獲得，其組分中的蛋白活性以及成分于生物體無害，且本身以機(jī)體最適合的PH7.4的緩沖系作為ApoAI蛋白注射抗原的溶劑，直接最適于機(jī)體環(huán)境。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]下面將結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，附圖中:
[0018]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1的各步驟中分別獲得的樣品的SDS-PAGE 二維電泳檢測(cè)結(jié)果圖；
[0019]圖2為本發(fā)明實(shí)施例2的各步驟中分別獲得的樣品的SDS-PAGE 二維電泳檢測(cè)結(jié)果圖。

【具體實(shí)施方式】
[0020]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0021]本發(fā)明實(shí)施例提供一種載脂蛋白Al的純化方法，包括如下步驟:
[0022]S10,獲取血漿樣品，并將血漿樣品進(jìn)行澄清處理；
[0023]S20，用疏水層析對(duì)澄清后的血漿樣品進(jìn)行第一次純化；
[0024]S30，將第一次純化產(chǎn)物進(jìn)行脫脂處理；
[0025]S40，將脫脂處理后的一次純化產(chǎn)物用疏水層析進(jìn)行第二次純化。
[0026]本發(fā)明的上述方法過程中，首先在步驟SlO中采用將樣品進(jìn)行澄清處理，其目的是除去血漿中含有的非蛋白類的其它成分物質(zhì)，出于提升工藝的時(shí)間效率，在該步驟中還可以將血漿樣品進(jìn)行低速離心(3000?4500g)，在低速離心處理中還能進(jìn)一步加快提升非蛋白類的顆粒等成分的分離，進(jìn)一步使澄清液中含有目的載脂蛋白Al之外的其它結(jié)合物盡量擯除。
[0027]同時(shí)，在步驟SlO之后，步驟S20采用疏水層析對(duì)澄清液進(jìn)行一次純化，其中在一次純化的過程中，本發(fā)明中疏水層析采用裝柱的填料為phenyl sepharose highperformance (苯基-瓊脂糖)；并且在將澄清后的血漿樣品裝柱上樣之后，對(duì)目的載脂蛋白Al洗脫的過程中本發(fā)明采用分步洗脫的方式進(jìn)行，其具體包括:
[0028]第一次洗脫:采用5?10%的有機(jī)醇進(jìn)行洗脫；
[0029]第二次洗脫:采用25?30%有機(jī)醇進(jìn)行洗脫；
[0030]采用不同濃度的有機(jī)醇進(jìn)行分次梯度洗脫，洗脫的過程中基于本身高密度脂蛋白HDL由蛋白和脂類共同構(gòu)成的特點(diǎn)，脂類具有極高的疏水性，當(dāng)使用疏水層析填料處理含有HDL的人血漿時(shí)，HDL與其他的雜蛋白或者其他也能與層析柱疏水結(jié)合的成分相比，可以更加牢固的與疏水填料結(jié)合，其結(jié)合強(qiáng)度遠(yuǎn)大于普通的蛋白質(zhì)。因此在第一次純化中采用的第二次洗脫的過程中，采用常規(guī)以及超過常規(guī)洗脫能力的有機(jī)醇進(jìn)行洗脫，從而在第二次洗脫過程中便可以達(dá)到高效的初步分離。
[0031]同時(shí)，步驟S30中進(jìn)一步將第一次分離純化產(chǎn)物即第二次洗脫的洗脫液進(jìn)行脫脂處理，脫脂處理的方法可以采用S/D法或高濃度尿素處理進(jìn)行；其中:
[0032]S/D法:向第二次洗脫的洗脫液中加入0.3%磷酸三丁酯和1%曲拉通X-100，室溫靜置處理；
[0033]高濃度尿素法:將第二次洗脫的洗脫液邊攪拌邊加入一定量的固體尿素，使溶液中尿素的終濃度為6M，持續(xù)攪拌進(jìn)行脫脂；
[0034]在該步驟S30中采用化學(xué)手段進(jìn)一步破壞HDL的脂蛋白結(jié)構(gòu)，使本身結(jié)合在載脂蛋白Al表面的脂類脫離，脂質(zhì)脫離以后，則ApoAI在疏水層析填料上的結(jié)合能力大幅降低。而第二次洗脫液中存在的其它疏水能力較強(qiáng)的費(fèi)目的蛋白則依然能保持其本身的疏水結(jié)合性，不受脫脂過程的影響，疏水性并未降低。
[0035]所以在上述脫脂的過程處理之后，步驟S40中將脫脂處理后的一次純化產(chǎn)物進(jìn)行第二次疏水層析，那么在該步驟中經(jīng)過初步分離后ApoAI溶液中殘留的其它極高疏水蛋白質(zhì)，不受該脫脂過程的影響，疏水性并未降低，從而顯示出疏水性的差異，再次通過疏水性洗脫的難以程度，便可以通過合適的洗脫能力的洗脫液洗脫進(jìn)行分離。該步驟S40實(shí)施中也可以依然繼續(xù)采用上述步驟S20中的phenyl sepharose high performance疏水層析柱進(jìn)行，但是洗脫的過程中采用ImM EDTA洗脫液進(jìn)行洗脫，洗脫下的洗脫組分即為高度純化的 ApoAI ο
[0036]本發(fā)明的上述方法步驟，通過利用HDL自身結(jié)構(gòu)中存在脂質(zhì)產(chǎn)生的強(qiáng)疏水性的機(jī)理，通過化學(xué)手段破壞HDL的脂蛋白結(jié)構(gòu)，使結(jié)合在ApoAI表面的脂類脫離，從而造成脂類的脫離解吸附使ApoAI在疏水層析填料上的結(jié)合能力大幅降低；從而通過前后疏水能力的變化將ApoAI與普通的疏水能力蛋白和其它該疏水能力蛋白實(shí)現(xiàn)分離；整個(gè)過程中采用單一的疏水層析方法即可實(shí)現(xiàn)大量制備高純度的載脂蛋白Al樣品。
[0037]本發(fā)明的上述方法相比現(xiàn)有高速離心、凝膠排阻層析、以及液相色譜等結(jié)合才能制備少量載脂蛋白Al樣品的方法，首先其不需要依賴價(jià)值昂貴的設(shè)備，成本低；且能夠簡(jiǎn)單的線性放大，處理樣品的量更大；其次血漿應(yīng)用于疏水層析，采用不同的乙醇溶液洗脫得到的目的ApoAI蛋白，洗脫液成分于生物體無害，可直接作為注射抗原使用；并且整個(gè)血漿樣品采用疏水層析填料分兩步處理即可得到純化的目的蛋白，方法簡(jiǎn)便新穎、效率高。
[0038]同時(shí)，本發(fā)明的上述步驟S20的疏水層析第一次純化過程中，進(jìn)行洗脫的有機(jī)醇溶液，需要根據(jù)對(duì)疏水層析柱的上樣的平衡緩沖液進(jìn)行替換。比如在本發(fā)明中該步驟可以采用的裝柱的平衡液為PH7.4的25mM Tris-HCl+25mM NaCl的平衡體系；澄清后的血樣樣品過柱時(shí)的上樣緩沖液用25mM Tris-HCl PH7.4，那么在之后進(jìn)行洗脫的梯度洗脫液即為:
[0039]第一次洗脫的洗脫液:ΡΗ7.4的25mM Tris-HCl+5?10%乙醇(V/V)
[0040]第二次洗脫的洗脫液:PH7.4的25mM Tris-HCl+25?30%乙醇(V/V)
[0041]當(dāng)然，上述乙醇是最常用的洗脫有機(jī)醇，根據(jù)工業(yè)現(xiàn)存條件，也可以甲醇、丙醇等有機(jī)醇進(jìn)行類似替換。
[0042]因此，在上述實(shí)施方式中，如果采用疏水層析的平衡和上樣的緩沖體系為PBS磷酸緩沖系，那么相應(yīng)的兩次洗脫過程中的有機(jī)醇溶液也采用對(duì)應(yīng)的緩沖系作為洗脫體系。
[0043]基于在步驟S40中疏水層析進(jìn)行第二次純化中基于的疏水結(jié)合能力，通過該第二次的疏水層析即可將脫脂之后高疏水性降低的載脂蛋白Al，與步驟S20的第二次洗脫液中的其它高疏水能力保持不變的非目的蛋白進(jìn)行分離。在本發(fā)明的疏水能力上進(jìn)行區(qū)分，在第一次疏水層析得到的第一次純化液中，其包含的蛋白質(zhì)采用相同濃度的25%?30%的醇洗脫所得，因此疏水性的能力本身相近，且均為高疏水性蛋白(低疏水性的雜蛋白被5%?10%的醇第一次洗脫去除)，因此在該步驟中通過疏水能力的變化即可以直接將步驟S20的第二次洗脫液中的載脂蛋白Al采用低于25%?30%洗脫強(qiáng)度的洗脫液將載脂蛋白洗脫下來；經(jīng)過多重考量洗脫過程中的效果和本身的成分對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的影響，本發(fā)明中優(yōu)選采用的低于25%?30%洗脫強(qiáng)度的洗脫液為I?3mM EDTA的洗脫液。
[0044]在該步驟中采用的洗脫液如果依然是PH7.4的Tris-HCl平衡上樣體系，那么洗脫液即采用PH7.4的2.5mM Tris_HCl+l?3mM EDTA進(jìn)行。當(dāng)然，洗脫過程中可以根據(jù)疏水能力的大小，還可以采用符合這一條件要求的洗脫液，在此不做限定。
[0045]進(jìn)一步，在上述實(shí)施方式中優(yōu)選采用的疏水層析填料為phenyl sepharose highperformance (苯基-瓊脂糖)，在使用中基于目的蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的范圍，也可以選擇工作pH 范圍為 3-13 的 Octyl Sepharose 4Fast Flow、Butyl_S-QZT 6FF 等作為疏水層析填料，當(dāng)然在工作中需要將其PH進(jìn)行調(diào)整，使其適合于Al等電點(diǎn)等結(jié)合效果。在本發(fā)明中采用苯基-瓊脂糖的疏水層析填料介質(zhì)，其原因在于采用的這一中疏水調(diào)料其本身是胺基烷烴與BrCN—活化的瓊脂糖反應(yīng)形成的改性瓊脂糖，之后將一系列長(zhǎng)度不同的碳?xì)浠衔锝拥江傊禽d體上，從而得到一系列相應(yīng)的疏水性瓊脂糖層析介質(zhì)。由于其疏水性主要是由3，6-甲烯二醚鍵橋提供的，其表面積大、多孔性更加利于本發(fā)明中含有多種載脂蛋白和之類結(jié)合的大體積結(jié)構(gòu)的高密度脂蛋白HDL的結(jié)合與分離。
[0046]并且，進(jìn)一步苯基-瓊脂糖在水中溶脹，含水量可達(dá)96腸，可以保證其中的的水分環(huán)境，而這一環(huán)境在再結(jié)合本發(fā)明中采用的上述帶有25mM NaCl的上上樣平衡體系，在鹽離子的降低極性效果下，更加利于改變影響蛋白質(zhì)的構(gòu)造，因?yàn)楸旧睇}具有加強(qiáng)疏水反應(yīng)的作用，水鹽離子會(huì)按照鹽析的特性排列，鹽析離子的存在會(huì)增強(qiáng)含有脂質(zhì)的高密度脂蛋白HDL蛋白質(zhì)吸附在碳?xì)浠衔锝又Φ沫傊巧系哪芰?，更利于?shí)現(xiàn)本發(fā)明中大量高效制備高純度載脂蛋白Al。
[0047]為使本發(fā)明上述純化方法的實(shí)施細(xì)節(jié)更加清楚完整、易于本領(lǐng)域技術(shù)人員的實(shí)施參考，以及使本發(fā)明方法的突出的進(jìn)步性效果更加顯著，以下通過實(shí)施例對(duì)上述過程的實(shí)施進(jìn)行具體舉例說明。
[0048]實(shí)施例1
[0049]在該實(shí)施例1中采用疏水層析填料phenyl sepharose high performance處理經(jīng)過靜置的人血漿。
[0050]S11，將裝填有phenyl sepharose high performance填料的層析柱，高度 10cm、直徑1.6cm，用平衡液A(PH7.4的25mM Tris_HCl+25mM NaCl)平衡，平衡至層析柱出液口液體PH值與平衡液相同；
[0051]S12，將靜置后的人血漿經(jīng)過低速離心(4000g)，除去懸浮顆粒物后的澄清液作為樣品備用。
[0052]S21，將步驟S12的20ml樣品用血漿稀釋液(25mM Tris-HCl PH7.4)稀釋4倍體積后，直接上樣于經(jīng)平衡液A平衡的上述層析柱。上樣完成后采用平衡液A沖洗層析填料中未結(jié)合的人血漿成分；其中，平衡、上樣和沖洗過程中控制流速均為3ml/min ；
[0053]S22，使用洗脫液Al (25mM PH7.4的Tris-HCl+5%乙醇(V/V))進(jìn)行洗脫，獲得洗脫組分Al ;再使用洗脫液A2(25mM PH7.4的Tris-HCl+25 %乙醇(V/V))進(jìn)行洗脫，獲得洗脫組分A2 ;洗脫完畢后采用50ml的200mM氫氧化鈉在位清洗層析柱中的層析填料。洗脫和在位清洗流速3ml/min。
[0054]S30，S/D法脫脂:將步驟S22的洗脫組分A2按照溶液體積在其中加入0.3%磷酸三丁酯和I %曲拉通X-100室溫放置處理4個(gè)小時(shí)。
[0055]S40，將步驟S30經(jīng)處理后的溶液上樣于經(jīng)過平衡液B (1mM Tris-HCl PH7.4)平衡 phenyl sepharose high performance 層析柱，高度 10cm，直徑 1.6cm ；
[0056]然后將步驟S30脫脂后的溶液進(jìn)行上樣，上樣完成后采用洗脫液BI (PH7.4的2.5mM Tris-HCl+lmM EDTA)洗脫，得到洗脫組分BI ;洗脫組分BI即為高度純化的ApoAI。
[0057]S50，然后采用20%乙醇洗脫，得到洗脫組分B2 ;洗脫完畢后采用50ml的250mM氫氧化鈉在位清洗層析柱中的層析填料；洗脫和在位清洗流速3ml/min。該步驟中洗脫的洗脫組分B2及洗脫組分A2中除去ApoAI之外的其它疏水性強(qiáng)的雜蛋白。
[0058]同時(shí)在該實(shí)施例1中，將各步驟中分別獲得的澄清血漿樣品、未被填料吸附的上樣穿透液、洗脫組分Al、洗脫組分A2、洗脫組分B2、洗脫組分BI進(jìn)行SDS-PAGE 二維電泳檢測(cè)，其檢測(cè)之后的膠片染色結(jié)果圖如圖1所示。其中圖1中條帶I為澄清血漿樣品、條帶2為未被填料吸附的上樣穿透液、條帶3為洗脫組分Al、條帶4為洗脫組分A2、條帶5為洗脫組分B2、條帶6為洗脫組分BI。
[0059]實(shí)施例2
[0060]S11，將裝填有phenyl sepharose high performance填料的層析柱，高度 10cm、直徑1.6cm，用平衡液A(PH7.4的25mM Tris_HCl+25mM NaCl)平衡，平衡至層析柱出液口液體PH值與平衡液相同；
[0061]S12，將靜置后的人血漿經(jīng)過低速離心(4100g)，除去懸浮顆粒物后的澄清液作為樣品備用。
[0062]S21，將步驟S12的20ml樣品用血漿稀釋液(25mM Tris-HCl PH7.4)稀釋4倍體積后，直接上樣于經(jīng)平衡液A平衡的上述層析柱。上樣完成后采用平衡液A沖洗層析填料中未結(jié)合的人血漿成分；其中，平衡、上樣和沖洗過程中控制流速均為3ml/min ；
[0063]S22，使用洗脫液Al (25mM PH7.4的Tris-HCl+10%乙醇(V/V))進(jìn)行洗脫，獲得洗脫組分Al ;再使用洗脫液A2(25mM PH7.4的Tris_HCl+30%乙醇(V/V))進(jìn)行洗脫，獲得洗脫組分A2 ;洗脫完畢后采用50ml的200mM氫氧化鈉在位清洗層析柱中的層析填料。洗脫和在位清洗流速3ml/min。
[0064]S30，高濃度尿素法脫脂:將步驟S22的洗脫組分A2邊攪拌邊加入一定量的固體尿素，使溶液中尿素的終濃度為6M，持續(xù)攪拌2小時(shí)以使脫脂完全。。
[0065]S40，將步驟S30經(jīng)處理后的溶液上樣于經(jīng)過平衡液B (1mM Tris-HCl PH7.4)平衡 phenyl sepharose high performance 層析柱，高度 10cm，直徑 1.6cm ；
[0066]然后將步驟S30脫脂后的溶液進(jìn)行上樣，上樣完成后采用洗脫液BI (PH7.4的2.5mM Tris-HCl+lmM EDTA)洗脫，得到洗脫組分BI ;洗脫組分BI即為高度純化的ApoAI。
[0067]S50，然后采用20%乙醇洗脫，得到洗脫組分B2 ;洗脫完畢后采用50ml的250mM氫氧化鈉在位清洗層析柱中的層析填料；洗脫和在位清洗流速3ml/min。該步驟中洗脫的洗脫組分B2及洗脫組分A2中除去ApoAI之外的其它疏水性強(qiáng)的雜蛋白。
[0068]同時(shí)在該實(shí)施例2中，將各步驟中分別獲得的澄清血漿樣品、洗脫組分Al、洗脫組分A2、洗脫組分B2、洗脫組分BI進(jìn)行SDS-PAGE 二維電泳檢測(cè)，其檢測(cè)之后的膠片染色結(jié)果圖如圖2所示。其中圖2中條帶I為澄清血漿樣品、條帶2為洗脫組分Al、條帶3為洗脫組分A2、條帶4為洗脫組分B1、條帶5為洗脫組分B2。
[0069]從上述各實(shí)施例的2D電泳的條帶中可以看出，標(biāo)準(zhǔn)洗脫組分BI的條帶清晰，且不帶有雜帶，因此分離的效果和純度比較理想。同時(shí)進(jìn)一步根據(jù)上述疏水層析柱用不同的上樣量進(jìn)行能效分析。每毫升疏水層析填料可以最多可處理13ml血清，并對(duì)最大的上樣量洗脫的結(jié)果中計(jì)量，其能吸附其中17mg載脂蛋白Al，并最后獲得至少13mg高純度載脂蛋白Al，根據(jù)不同的脫脂方法，全程操作步驟需要3?5個(gè)小時(shí)。同時(shí)，由于層析純化的線性放大特點(diǎn)，理論上任何規(guī)模的工藝放大，所需要的時(shí)間相同。在本發(fā)明的上述10cm、直徑1.6cm的層析柱最大可獲得260mg目的產(chǎn)物。
[0070]在對(duì)比條件下，若采用高速離心方法獲取高純度HDL蛋白，每次離心需要至少30分鐘的離心時(shí)間，并只能處理約60ml血清，并且不可以線性放大，若需要擴(kuò)大處理規(guī)模只能通過增加離心機(jī)數(shù)量和離心次數(shù)達(dá)到。若采用分子篩過濾方式獲得目的蛋白，每次處理樣品的體積不能超過層析柱體積的5%，且以實(shí)驗(yàn)室常用的60cm高，2.6cm直徑的凝膠過濾為例，每次只能處理6ml血清。因此與現(xiàn)有的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用中的方法過程中處理設(shè)備昂貴，處理樣品體積有限，工藝時(shí)間較長(zhǎng)的的能效相比，本發(fā)明的上述方法的思路以及實(shí)施步驟本身就有突出的進(jìn)步性效果和優(yōu)良的經(jīng)濟(jì)效益。
[0071]基于本發(fā)明的上述實(shí)施方式，本發(fā)明進(jìn)一步還提出一種ApoAI蛋白注射抗原，該ApoAI蛋白注射抗原為采用上述方法步驟得到的洗脫組分Al，即用疏水層析進(jìn)行第二次純化后的純化產(chǎn)物。其組分中的蛋白活性以及成分于生物體無害，且本身以機(jī)體最適合的PH7.4的緩沖系作為ApoAI蛋白注射抗原的溶劑，直接最適于機(jī)體環(huán)境。
[0072]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種載脂蛋白Al的純化方法，其特征在于，包括如下步驟: 獲取血漿樣品，并將血漿樣品進(jìn)行澄清處理； 對(duì)澄清后的所述血漿樣品進(jìn)行第一次疏水層析，得第一次純化產(chǎn)物； 將所述第一次純化產(chǎn)物進(jìn)行脫脂處理； 將所述脫脂處理后的第一次純化產(chǎn)物進(jìn)行第二次疏水層析； 其中，所述第一次純化過程的洗脫中包括第一次洗脫和第二次洗脫，且第二次洗脫的洗脫液為所述第一次純化產(chǎn)物；所述第一次洗脫為采用5?10%的有機(jī)醇進(jìn)行洗脫、第二次洗脫為25?30%的醇進(jìn)行洗脫； 所述第二次疏水層析過程中采用洗脫強(qiáng)度低于25?30%的醇的洗脫液洗脫。
2.如權(quán)利要求1所述的載脂蛋白Al的純化方法，其特征在于，所述第一次疏水層析和第二次疏水層析中采用的層析柱的疏水填料為phenyl sepharose high performance。
3.如權(quán)利要求1或2所述的載脂蛋白Al的純化方法，其特征在于，所述所述第二次疏水層析過程中的洗脫液為含有I?3mM EDTA的層析平衡液。
4.如權(quán)利要求2所述的載脂蛋白Al的純化方法，其特征在于，所述第一次疏水層析過程中，采用的層析柱平衡液為含有25mM NaCl的PH7.4的25mM Tris-HCl緩沖系。
5.如權(quán)利要求4所述的載脂蛋白Al的純化方法，其特征在于，所述第一次洗脫過程中的洗脫液為含有5?10%的醇的PH7.4的25mM Tris-HCl ； 所述第二次洗脫過程中的洗脫液為含有25?30%的醇的PH7.4的25mM Tris-HCl。
6.如權(quán)利要求1或2所述的載脂蛋白Al的純化方法，其特征在于，所述所述脫脂處理為S/D法脫脂或高濃度尿素法脫脂。
7.如權(quán)利要求1或2所述的載脂蛋白Al的純化方法，其特征在于，所述醇為乙醇。
8.—種ApoAI蛋白注射抗原，其特征在于，該ApoAI蛋白注射抗原為權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)所述的載脂蛋白Al的純化方法制備的載脂蛋白Al純化產(chǎn)物。
【文檔編號(hào)】A61K38/17GK104513306SQ201410778677
【公開日】2015年4月15日 申請(qǐng)日期:2014年12月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月15日
【發(fā)明者】李光飛, 蘇少博 申請(qǐng)人:山西瑞亞力科技有限公司