一種枇杷葉總倍半萜苷提取物及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種枇杷葉總倍半萜苷提取物及其制備方法與應(yīng)用。該提取物以枇杷(Eriobotrya japonica)的干燥葉為原料，制備方法包括將干燥枇杷葉經(jīng)一定濃度乙醇回流提取，過(guò)濾，減壓濃縮；濃縮液離心，取上清液經(jīng)大孔樹(shù)脂吸附，水-乙醇梯度洗脫，收集一定濃度乙醇洗脫部分；收集液減壓濃縮，經(jīng)聚酰胺柱層析，水-甲醇梯度洗脫，收集一定濃度甲醇洗脫部分并回收溶劑，干燥，得到總倍半萜苷提取物。本發(fā)明制備的枇杷葉總倍半萜苷提取物能顯著促進(jìn)人肝癌細(xì)胞(HepG2)的葡萄糖消耗，提示其具有降血糖活性，可作為治療糖尿病的藥物或保健品進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)。本發(fā)明為枇杷葉治療糖尿病的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)，為開(kāi)發(fā)安全高效的新型抗糖尿病藥物或保健品提供了新資源。
【專利說(shuō)明】一種枇杷葉總倍半萜苷提取物及其制備方法與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于中藥領(lǐng)域，具體涉及一種從中藥枇杷葉中得到的總倍半萜苷提取物及 其制備方法和在治療糖尿病藥物或保健品上的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 枇杷葉是薔薇科枇杷屬植物枇杷（Eriobotryajaponica (Thunb. ) Lindl.)的干燥 葉，作為一味常用中藥，收載于歷版中國(guó)藥典供中醫(yī)臨床使用，具有清肺止咳、降逆止嘔等 作用，用于治療肺熱咳嗽、氣逆喘氣、胃熱嘔逆、煩熱口渴等癥狀，符合中醫(yī)治療糖尿病"消 渴"的范疇。1988年Noreen等曾報(bào)道枇杷葉的乙醇提取物對(duì)正常大鼠具有顯著但短暫的 降低血糖作用。本課題組從2000年起開(kāi)展"降血糖植物資源調(diào)查"工作，在民間走訪中發(fā) 現(xiàn)枇杷葉在我國(guó)一些地區(qū)作為單驗(yàn)方用于治療糖尿病，用量少、效果好，曾見(jiàn)有治愈糖尿病 的病例，提示枇杷葉可能成為對(duì)糖尿病具有良好療效的新的中藥資源。
[0003] 關(guān)于枇杷葉的化學(xué)成分，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的主要有黃酮類、多酚類、三萜和倍半萜苷類 以及其它類型化合物。為了驗(yàn)證枇杷葉的降血糖功能，課題組采用不同動(dòng)物模型開(kāi)展了藥 效學(xué)評(píng)價(jià)工作，試驗(yàn)表明枇杷葉乙醇粗提物能顯著降低四氧嘧啶糖尿病小鼠的血糖水平 (The American Journal of Chinese Medicine，2007, 35 :705-711)，進(jìn)一步研宄發(fā)現(xiàn)其 總?cè)埶峤M分和總倍半貓苷組分活性較強(qiáng)（Journal of Ethnopharmacology，2009,122: 486-491)。課題組還針對(duì)分離得到的三萜酸單體成分薔薇酸和倍半萜苷單體成分橙花叔 醇-3-0-a -L-吡喃鼠李糖基（1 - 4) - a -L-吡喃鼠李糖基（1 - 2) _[ a -L-吡喃鼠李糖基 (1 - 6)]_β-D-吡喃葡萄糖苷進(jìn)行了體內(nèi)降血糖作用評(píng)價(jià)，結(jié)果表明它們分別能顯著降低 正常小鼠和四氧嘧啶糖尿病小鼠空腹血糖水平（Phytomedicine，2008,15 :98-102)。國(guó)內(nèi) 已公開(kāi)的發(fā)明專利（200810018820. 8,200810024412. 3,200410015695. 7)分別指出了枇杷 葉總?cè)扑岷涂傸S酮具有抗糖尿病作用?？偙栋胼栖兆鳛殍凌巳~的重要活性成分之一，在 其降糖活性及其作用機(jī)理研宄方面，缺乏更廣泛而深入的研宄。
[0004] 糖尿病分為1型和2型，2型糖尿病的主要特征是胰島素抵抗，肝臟、骨骼肌、月旨 肪等靶組織對(duì)葡萄糖的攝取減少，造成血液中葡萄糖水平升高，形成高血糖。因此，提高胰 島素效能，包括促進(jìn)器官組織對(duì)葡萄糖的攝取成為2型糖尿病藥物研宄重要的研宄課題。 HepG2細(xì)胞源于人肝胚胎瘤細(xì)胞，是分化較好的人肝癌細(xì)胞，仍有肝細(xì)胞的形態(tài)和功能。 HepG2細(xì)胞可以表達(dá)胰島素受體和胰島素樣生長(zhǎng)因子的代謝反應(yīng)，能全面模擬肝細(xì)胞對(duì)周 圍環(huán)境中葡萄糖的攝入和消耗，因此檢測(cè)枇杷葉總倍半萜苷干預(yù)下H印G2細(xì)胞的葡萄糖消 耗，探討其對(duì)糖代謝的影響，可以評(píng)價(jià)枇杷葉總倍半萜苷的降血糖作用，對(duì)防治糖尿病及其 并發(fā)癥有積極意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，提供一種具有顯著促進(jìn)人肝癌 細(xì)胞（HepG2)的葡萄糖消耗活性從而達(dá)到抗糖尿病效果的枇杷葉總倍半萜苷提取物及其 制備方法以及在降糖藥物或保健品制備方面的應(yīng)用。
[0006] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種枇杷葉總倍半萜苷提取物及其制備方法。 該提取物以枇杷的干燥葉片為原料，通過(guò)以下操作步驟制備得到：
[0007] 將枇杷葉干燥和粉碎后，用乙醇溶液回流提取，所述乙醇溶液的質(zhì)量百分比濃度 為60-100 %，用量為6-10倍藥材質(zhì)量體積，提取次數(shù)為1-3次，提取溫度為50-80°C，提取 時(shí)間為1-3小時(shí)；提取液過(guò)濾，減壓濃縮至有沉淀析出，濃縮液分次離心，速率為2000-4000 轉(zhuǎn)/分鐘；取上清液，流經(jīng)大孔樹(shù)脂柱XAD16吸附，先用去離子水沖洗樹(shù)脂，再用水-乙醇 梯度洗脫，收集乙醇濃度為60-80%之間的洗脫液，減壓濃縮；濃縮液進(jìn)一步經(jīng)聚酰胺柱層 析，先用去離子水洗脫，再用水-甲醇梯度洗脫，收集甲醇濃度為0-20%之間的洗脫液，回 收溶劑，干燥，得到總倍半萜苷提取物。
[0008] 以上述方法制備得到的枇杷葉總倍半萜苷提取物，包含以橙花叔醇-3-0- a -L-吡 喃鼠李糖基（1 - 4)-a-L-吡喃鼠李糖基（1 - 2) _[α-L-吡喃鼠李糖基（1 - 6)]-β-D-吡 喃葡萄糖苷和橙花叔醇-3-0- a -L-吡喃鼠李糖基（1 - 4) - a -L-吡喃鼠李糖基 (1 - 2)-β -D-吡喃葡萄糖苷兩種倍半萜苷為代表的化學(xué)成分，該提取物中總倍半萜苷的 質(zhì)量百分含量> 50%。
[0009] 上述枇杷葉總倍半萜苷提取物在一定濃度下可以顯著促進(jìn)人肝癌細(xì)胞0fepG2) 的葡萄糖消耗，提示其具有降低血糖的功能，可以應(yīng)用于制備抗糖尿病藥物或保健品。
[0010] 所述抗糖尿病藥物或保健品分別為含有治療有效劑量或功效成分的枇杷葉總倍 半萜苷提取物在藥學(xué)上可接受的載體和保健食品。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例2中制備的枇杷葉總倍半萜苷提取物HPLC圖。
[0012] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例3中制備的枇杷葉總倍半萜苷提取物對(duì)H印G2細(xì)胞葡萄糖消 耗的影響效果圖。

【具體實(shí)施方式】
[0013] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0014] 實(shí)施例1 :
[0015] 取干燥枇杷葉1kg，粉碎，用質(zhì)量百分比濃度為80%的乙醇溶液IOL在70°C下回 流提取2次，每次2小時(shí)，合并提取液，過(guò)濾，減壓濃縮至有沉淀析出，3000轉(zhuǎn)/分鐘離心15 分鐘，取上清液備用；
[0016] 稱取Amberlite?XAD16大孔吸附樹(shù)脂8008,加入適量蒸餾水，在室溫下放置過(guò)夜， 使樹(shù)脂充分溶脹，濕法裝柱，用95%乙醇流動(dòng)清洗柱子，最后用蒸餾水充分淋洗柱子至流出 液無(wú)乙醇味，放置過(guò)夜；
[0017] 將上述上清液緩緩流過(guò)上述處理和平衡過(guò)的大孔樹(shù)脂柱，先用去離子水沖洗，再 用不同濃度的乙醇梯度洗脫，收集乙醇濃度為60-80%之間的洗脫液，流出液經(jīng)TLC展開(kāi)， 噴灑香草醛-硫酸試劑顯淡紫色；減壓濃縮收集液，備用。
[0018] 上述濃縮液進(jìn)一步流過(guò)經(jīng)處理過(guò)的聚酰胺（200mesh，2008)柱，先用去離子水洗 脫，再用水-甲醇梯度洗脫，收集甲醇濃度為0-20%之間的洗脫液，回收溶劑，干燥，得到總 倍半貓苷提取物。
[0019] 以上得到的總倍半萜苷提取物用一定體積色譜純甲醇溶解，45 μπι微孔濾膜過(guò)濾， 進(jìn)行制備型高效液相色譜（島津LC-6AD)分離，色譜方法如下：
[0020] 流動(dòng)相：Α水，B甲醇；洗脫方法：等度洗脫，65% B，0-50min ;流速6mL/min，室溫， 檢測(cè)波長(zhǎng)325nm，進(jìn)樣體積每次250 yL，運(yùn)彳丁時(shí)間55mins，C18柱（9. 4mm IDX250mm，5ym) 分離，收集保留時(shí)間分別為20. Omin和34. Omin處餾分。
[0021] 餾分減壓濃縮并經(jīng)高真空干燥，分別得到2個(gè)倍半萜苷類化合物，根據(jù)MS和 NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)比較，鑒定它們的結(jié)構(gòu)分別為：橙花叔醇-3-0- a -L-吡喃鼠李糖基 (1 - 4) - a -L-吡喃鼠李糖基（1 - 2) - [ a -L-吡喃鼠李糖基（1 - 6) ] - β -D-吡喃葡萄糖苷 ⑴和橙花叔醇-3-0- a -L-吡喃鼠李糖基（1 - 4) - a -L-吡喃鼠李糖基（1 - 2) - β -D-吡 喃葡萄糖苷（II)。它們的結(jié)構(gòu)如下圖所示：
[0022]

【權(quán)利要求】
1. 一種枇杷葉總倍半萜苷提取物及其制備方法與應(yīng)用，其特征在于：采用植物化學(xué)方 法，從枇杷葉中分離得到總倍半萜苷提取物，該提取物具有抗糖尿病功能，可以應(yīng)用于制備 抗糖尿病藥物或保健品。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的枇杷葉總倍半萜苷提取物，其中包含橙花叔醇-3-0- a -L-吡 喃鼠李糖基（1 -4)-a-L_吡喃鼠李糖基（1 -2)-[a-L_吡喃鼠李糖基（1 -6)]-f3_D-吡 喃葡萄糖苷和橙花叔醇-3-0- a -L-吡喃鼠李糖基（1 - 4) - a -L-吡喃鼠李糖基 (1 - 2)-0 -D-吡喃葡萄糖苷兩種代表性倍半萜苷化學(xué)成分，且該提取物中總倍半萜苷的 質(zhì)量百分含量> 50%。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的枇杷葉總倍半萜苷提取物的制備方法為：將枇杷葉干燥和粉 碎后，用乙醇溶液回流提取，所述乙醇溶液的質(zhì)量百分比濃度為60-100%，用量為6-10倍 藥材質(zhì)量體積，提取次數(shù)為1_3次，提取溫度為50-80°C，提取時(shí)間為1-3小時(shí)；提取液過(guò) 濾，減壓濃縮至有沉淀析出，濃縮液分次離心，速率為2000-4000轉(zhuǎn)/分鐘；取上清液，流經(jīng) 大孔樹(shù)脂柱XAD16吸附，先用去離子水沖洗樹(shù)脂，再用水-乙醇梯度洗脫，收集乙醇濃度為 60-80%之間的洗脫液，減壓濃縮；濃縮液進(jìn)一步經(jīng)聚酰胺柱層析，先用去離子水洗脫，再用 水-甲醇梯度洗脫，收集甲醇濃度為0-20%之間的洗脫液，回收溶劑，干燥，得到總倍半萜 苷提取物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的枇杷葉總倍半萜苷提取物的功能和應(yīng)用在于：該提取物在一 定濃度下具有顯著促進(jìn)人肝癌細(xì)胞（HepG2)的葡萄糖消耗作用，可以應(yīng)用于制備抗糖尿病 藥物或保健品。所述抗糖尿病藥物或保健品分別為含有治療有效劑量或功效成分的枇杷葉 總倍半萜苷提取物在藥學(xué)上可接受的載體和保健食品。
【文檔編號(hào)】A61K36/73GK104491048SQ201410802741
【公開(kāi)日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月18日
【發(fā)明者】陳劍, 趙磊, 李維林, 任冰如, 敖先燦, 馬麗, 呂寒, 劉艷 申請(qǐng)人:江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所