本發(fā)明涉及藥用提取物，具體涉及白肉靈芝提取物用于抗炎方面的應用。

背景技術：
靈芝(Ganodermalucidum(Leyss.exFr.)Karst.)隸屬于真菌門(Eumycota)、擔子菌亞門(Basidiomycotina)、層菌綱(Hymenomycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、靈芝科(Gamodermataceae)、靈芝屬(Ganoderma)類?！吨腥A本草》中記錄“其性甘；味平；無毒；歸肺、心、脾、腎經。益氣血；安心神；健脾胃。主治虛勞、心悸、失眠、頭暈、神疲乏力、久咳氣喘、冠心病、矽肺、腫瘤?！薄吨袊幍洹分袑㈧`芝收錄為中藥材，其中的靈芝多糖、三萜、核苷、生物堿、氨基酸多肽、微量元素等成分是其藥效物質的主要基礎，以三萜和多糖為其中主要活性成分。現(xiàn)代藥理研究表明，靈芝三萜類化合物具有保肝、抗腫瘤、抗HIV-4及HIV-4蛋白酶活性、抗組織胺釋放、抑制血管緊張素、抗氧化等作用。靈芝分類歷史悠久，歸類各有不同，《本草綱目》等古籍中以“六色”將靈芝歸為：青芝、赤芝、黃芝、白芝、黑芝、紫芝。近日廣東省微生物研究所李泰輝等人在真菌學雜志《Mycoscience》發(fā)表文章宣布他們在西藏林芝地區(qū)發(fā)現(xiàn)了一個靈芝新種——白肉靈芝Ganodermaleucocontextum(LiTH,HuHP,DengWQ,etal.Ganodermaleucocontextum,anewmemberoftheG.lucidumcomplexfromsouthwesternChina.Mycoscience,2015,56(1)：81-85.)。中國西藏新聞網2014年8月報道西藏自治區(qū)農牧科學院研究人員白肉靈芝人工栽培獲得成功。針對白肉靈芝的食用及藥用價值急需進行系統(tǒng)研究和開發(fā)。

技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明以白肉靈芝Ganodermaleucocontextum為研究對象，對其提取物進行了化學和生物活性研究，發(fā)現(xiàn)白肉靈芝提取物具有很好的抗炎作用，具有很好的藥用和食用價值。為此，本發(fā)明的第一方面，提供白肉靈芝提取物在制備用于預防和/或治療炎癥的藥物中的應用，所述提取物中含有式1和式2所示的化合物的組合，本發(fā)明的白肉靈芝Ganodermaleucocontextum提取物是按照如下的方法制備的，所述方法包括如下步驟：用提取溶劑提取白肉靈芝的子實體至少一次；和去除溶劑以獲得所述提取物。所述提取溶劑可選自水、C1～C4烷基醇、甲酸C1～C3烷基酯、乙酸C1～C3烷基酯、鹵代C1～C3烷烴、R1C(O)R2中的一種，或者兩種或更多種的混合溶劑，其中R1和R2各自獨立地為C1～C3烷基。所述提取溶劑優(yōu)選選自水、甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、甲酸甲酯、甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷、丙酮、丁酮、戊酮中的一種或多種。特別優(yōu)選所述提取溶劑為20～98％(v/v)的乙醇水溶液，更優(yōu)選40～98％(v/v)、最優(yōu)選70～95％(v/v)的乙醇水溶液。白肉靈芝的子實體與所述提取溶劑的重量體積比(g:ml或kg:L)為1:3～10；優(yōu)選為1:2～5；最優(yōu)選為1:3。為提高提取效果，優(yōu)選事先將白肉靈芝的子實體碎化。所述提取方法可以是任何適宜的方法，例如但不限于浸漬提取、超聲提取、加熱回流提取等。提取溫度為室溫～105℃，優(yōu)選20～50℃。本文中所說室溫通常指18～30℃。根據一種實施方式，提取可進行1～5次，優(yōu)選提取2～4次，最優(yōu)選為3次。提取時間為每次15min～2小時，優(yōu)選為30～70min。優(yōu)選地，所述提取溶劑可回收再利用。去除或回收提取溶劑的方法可根據不同溶劑靈活選取。例如可以進行蒸餾或減壓蒸餾等。根據本發(fā)明的另一種實施方式，所述方法進一步包括以下步驟：將所獲得的提取物分散于水中，用弱極性有機溶劑萃取以除去脂溶性雜質；用萃取劑萃取水相；和取萃取劑層并去除萃取劑。所述萃取劑可選自乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷和正丁醇中的一種，優(yōu)選乙酸乙酯。用于除去脂溶性雜質的弱極性有機溶劑可以是常用用萃取分離有機物的那些非極性溶劑。例如可選自C5～C12的烷烴、C5～C8的環(huán)烷烴、鹵代C1～C3烷烴、石油醚中的一種或多種。根據一種實施方式，所述有非極性機溶劑可選自正己烷、正庚烷、正辛烷、環(huán)己烷、氯仿、二氯乙烷、沸點60～90℃的石油醚中的一種或多種。優(yōu)選使用所述石油醚和/或環(huán)己烷。可用所述弱極性有機溶劑進行多次萃取以盡量除去脂溶性雜質。例如可萃取2～5次。用萃取劑的萃取也同樣可進行多次。例如可為2～5次。所述弱極性有機溶劑以及所述萃取劑的用量分別為每次為水相體積的50～200％；優(yōu)選用與水相等體積的弱極性有機溶劑(或萃取劑)進行萃取。根據本發(fā)明的一種實施方式，所述提取溶劑為水、或選自C1～C4烷基醇、甲酸C1～C3烷基酯、乙酸C1～C3烷基酯中的一種或多種溶劑的40％(v/v)以下(例如5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％(v/v))的水溶液，所述方法進一步包括以下步驟：將所獲得的提取物分散于水中，用萃取劑萃取所獲得的提取液；和取萃取劑層并去除萃取劑，所述萃取劑可為選自乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷和正丁醇中的一種，優(yōu)選乙酸乙酯。同樣的，用萃取劑的萃取可進行多次。例如可為2～5次。所述萃取劑的用量分別為每次為水相體積的50～200％；優(yōu)選用與水相等體積的萃取劑進行萃取。該實施方式可獲得水溶性更好的提取物，以便制備水溶劑或茶飲等產品。所述炎癥是選自肝炎、肺炎、胃炎、腸炎中的至少一種。本發(fā)明的第二方面提供含有上述白肉靈芝提取物的可食用的產品用于抗炎的用途。其中白肉靈芝提取物中含有下式1和式2所示的化合物的組合。所述炎癥為肝炎、肺炎、胃炎、腸炎等。其中，胃炎例如急性、慢性胃炎，胃潰瘍等；肝炎例如細菌性肝損傷、藥物性肝損害、病毒性肝損傷、脂肪肝等；肺炎例如細菌性肺炎、病毒性肺炎等；腸炎例如細菌性腸炎、慢性腸炎等。所述可食用的產品具體形式可為口服液、茶飲、含片、膠囊、飲品、泡騰片等等。本發(fā)明的研究發(fā)現(xiàn)，白肉靈芝可采用任何常規(guī)的溶劑，包括水進行提取，提取方法簡單，提取物可溶于水。提取物中含有較大量的三萜類化合物，并經驗證具有顯著的抑制炎癥發(fā)生的效果。因此，白肉靈芝的提取物具有廣闊的藥用和食用的應用前景。附圖說明圖1為用不同有機溶劑提取白肉靈芝粗提物的HPLC指紋圖譜；和圖2為根據本發(fā)明一種實施方式獲得的白肉靈芝提取物的HPLC圖譜。具體實施方式參照附圖及以下詳細描述的優(yōu)選實施方式和具體實施例，更加詳細地說明本發(fā)明的各個方面和上述的及其他的優(yōu)點。本領域技術人員應理解，下面描述的這些內容是為了更好地理解本發(fā)明，本發(fā)明的范圍并不受限于此。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。白肉靈芝由西藏自治區(qū)農科院蔬菜研究所提供。實施例1白肉靈芝乙醇提取物的制備將白肉靈芝子實體剪碎，稱重5000克。用15L體積百分含量95％乙醇的水溶液回流提取3次，每次1小時。合并提取液，減壓濃縮干燥得到170克提取物，將提取物記作GL-1。進一步將提取物用蒸餾水600ml溶解，用等體積的正己烷萃取三次，棄去有機相。再用等體積乙酸乙酯萃取水相三次，棄去水相，合并乙酸乙酯萃取液。用旋轉蒸發(fā)儀蒸干乙酸乙酯獲得浸膏54g，記作GL-1E。實施例2純化及鑒定實施例1GL-1E提取物中的主要化合物取40g實施例1制備的提取物GL-1E，通過硅膠柱色譜分離，以正己烷:乙酸乙酯體系和二氯甲烷:甲醇體系依次進行梯度洗脫，每個梯度洗3個保留體積，每個體積500ml。在二氯甲烷:甲醇(體積比為100:1)中得到餾分19，命名為GL-E19。GL-E19(10.5g)利用ODS反相硅膠柱分離，用體積百分含量為10％～100％甲醇的水溶液依次進行洗脫，每個洗脫體系3個保留體積，每個保留體積為500ml，每300ml收集一個餾分。體積百分含量為40％的甲醇水溶液系統(tǒng)的第三個餾分和體積百分含量為50％的甲醇水溶液系統(tǒng)的第三個餾分，分別命名為GL-E19-23和GL-E19-27。對GL-E19-23以體積百分含量40％乙腈的酸水(此處的酸水為體積百分含量為0.01％三氟乙酸的水溶液)溶液為洗脫劑進行HPLC制備，流速為2ml/min，收集28min的色譜峰，得到化合物1。對GL-E19-27以體積百分含量42％乙腈酸水(此處的酸水為體積百分含量為0.01％三氟乙酸的水溶液)溶液為洗脫劑進行HPLC制備，流速為2ml/min，收集25.2min的色譜峰得到化合物2。上述HPLC色譜條件如下：以色譜純的甲醇將樣品配制為10mg/ml的溶液，上樣量為15ul每次，色譜柱為Kromasil10×250mmC18半制備柱，柱溫為25℃，210nm波長進行檢測?；衔?和化合物2通過鑒定，結構式如下式1、式2所示，數據歸屬見表1和2。表1化合物1和化合物2的13CNMR數據(125MHz，CDCl3)表2化合物1和化合物2的1HNMR數據(JinHz,500MHz，CDCl3)實施例3提取物GL-1的指紋圖譜檢測高效液相化學指紋圖譜分析條件如下：使用Agilent1200高效液相色譜儀，四元梯度泵，DAD檢測器，Agilent色譜工作站。色譜柱YMCC8分析柱(4.6mm×150mm，5μm)，流動相為乙腈-體積百分含量0.04％的三氟乙酸的水溶液，溫度室溫(20～30℃)的條件下進行梯度洗脫(洗脫程序以及各成分的體積百分含量如下所示)，流速1.00mL/min。將粗提物G1用乙腈溶解，配成10mg/mL的溶液，進樣量10μl，紫外檢測波長為210nm。梯度洗脫步驟如下表3：表3按照上述洗脫條件得到提取物GL-1的色譜圖如圖1所示，并對實施例2分離得到的2個化合物進行指認，這兩個化合物的峰面積占總峰面積的10.82％。實施例4用甲醇提取白肉靈芝將所述白肉靈芝子實體剪碎，按照子實體:甲醇＝1g:3ml的量加入甲醇，浸泡超聲提取3次，每次30分鐘，將提取液用旋轉蒸發(fā)儀蒸干獲得浸膏，得到提取物GL-2。甲醇純度為分析純，購自北京化學試劑公司。將GL-2進行高效液相色譜檢測，分析條件同實施例3所述。如圖1所示，1和2標示的峰與從GL-1E中分離得到的2個化合物一致，這兩個化合物的峰面積占總峰面積的6.58％。實施例5:用乙酸乙酯提取白肉靈芝將所述白肉靈芝子實體剪碎，按照子實體:乙酸乙酯＝1g:3ml的量加入乙酸乙酯，浸泡超聲提取3次，每次30分鐘，將提取液用旋轉蒸發(fā)儀蒸干獲得浸膏，即提取物GL-3。乙酸乙酯純度為分析純，購自北京化學試劑公司。將GL-3進行高效液相色譜檢測，分析條件同實施例3所述。如圖1所示，1和2標示的峰與從GL-1E中分離得到的2個化合物一致，這兩個化合物的峰面積占總峰面積的8.45％。實施例6:用二氯甲烷提取白肉靈芝將所述白肉靈芝子實體剪碎，按照子實體:二氯甲烷＝1g:3ml的量加入二氯甲烷，浸泡超聲提取3次，每次30分鐘，將提取液用旋轉蒸發(fā)儀蒸干獲得浸膏，得到粗提物GL-4。所述二氯甲烷純度為分析純，購自北京化學試劑公司。將GL-4進行高效液相色譜檢測，分析條件同實施例3所述。如圖1所示，1和2標示的峰與從GL-1E中分離得到的2個化合物一致，這兩個化合物的峰面積占總峰面積的12.38％。實施例7:用丙酮提取白肉靈芝將所述白肉靈芝子實體剪碎，按照子實體:丙酮＝1g:3ml的量加入丙酮，浸泡超聲提取3次，每次30分鐘，將提取液用旋轉蒸發(fā)儀蒸干獲得浸膏，得到提取物GL-5。所述丙酮純度為分析純，購自北京化學試劑公司。將GL-5進行高效液相色譜檢測，分析條件同實施例3所述。如圖1所示，1-2標示的峰與從GL-1E中分離得到的2個化合物一致，這兩個化合物的峰面積占總峰面積的6.31％。實施例8:用水提取白肉靈芝將所述白肉靈芝子實體剪碎，按照子實體:水＝1g:3ml的量加入去離子水，浸泡超聲提取3次，每次30分鐘，將提取液用旋轉蒸發(fā)儀蒸干獲得浸膏，得到提取物GL-6。將GL-6提取物浸膏用適量蒸餾水混懸，然后用等量乙酸乙酯萃取三次，旋轉蒸發(fā)儀蒸干溶液獲得水提物的乙酸乙酯浸膏GL-6E。所述水為去離子水。將GL-6E進行高效液相色譜檢測，分析條件同實施例3所述。如圖2所示，1-2標示的峰與從GL-1E中分離得到的2個化合物一致，這兩個化合物的峰面積占總峰面積的12.24％。實施例9白肉靈芝提取物對脂多糖LPS誘導的小鼠單核巨噬細胞RAW264.7釋放NO的抑制活性測試實驗材料：被測樣品溶液為實施例1和實施例4～8所述的8個提取物(GL-1E、GL-1～GL-6和GL-6E)，以及陽性藥氫化可的松(sigma)。準確稱取各樣品，用DMSO(二甲亞砜)配制成50mg/ml溶液(制備時溶于少量DMSO后，再用蒸餾水稀釋至相應濃度，控制DMSO的最終體積百分含量<1％)，用DMEM培養(yǎng)基進行2倍梯度稀釋，共8個濃度，供活性測試。DMEM、胎牛血清和馬血清購自Gibco公司。小鼠單核巨噬細胞RAW264.7(ATCCTIB-71)培養(yǎng)于含10％熱滅活(56℃,30min)胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素鈉(Gibco)、100μg/ml鏈霉素(Gibco)的RPMI1640(Gibco)培養(yǎng)液中，37℃下，5％CO2的恒溫培養(yǎng)箱中孵育。脂多糖LPS購自SIGMA公司。N-萘乙二胺鹽酸鹽(北京韻邦生物科技有限公司)，對氨基苯磺酰胺(上海士鋒科技有限公司)。實驗方法：白肉靈芝提取物對脂多糖(LPS)誘導RAW264.7細胞釋放NO的抑制活性參考文獻方法(GiangPM,JinHZ,SonPT,LeeJH,HongYS,LeeJJ.ent-KauranediterpenoidsfromCrotontonkinensisinhibitLPS-inducedNF-κBactivationandNOproduction.JournalofNaturalProducts,2003,66(9),1217-1220.)。LPS是革蘭氏陰性細菌致病的主要因素，刺激體內多種細胞合成和釋放眾多內源性生物活性因子，導致全身性炎癥反應發(fā)生，由此引起全身炎癥反應綜合征。RPMI1640培養(yǎng)液將RAW264.7細胞稀釋制成1×105個/mL的單細胞懸液，接種于96孔板中(每孔200μL)，每組設三個平行孔。CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h后每孔加入終濃度為1μg/mL的LPS(Sigma)和DMSO溶解的不同濃度的測試樣品0.4μL(或陽性藥氫化可的松0.4μL)，同時設定LPS組(加入LPS，但不加樣品，對NO釋放的抑制率為0％)和空白對照組(不加LPS和樣品，僅加入0.4μLDMSO，對NO釋放的抑制率為100％)。37℃下，5％CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，吸取上清100μL到酶標板上，離心(1000*g，4℃，3min)，加入100μLGriessreagent(GriessreagentA：0.1％N-萘乙二胺鹽酸鹽溶液；GriessreagentB：1％對氨基苯磺酰胺溶液+5％磷酸溶液，使用前1:1混合)于96孔板混合，室溫靜止10min后，用酶標儀在540nm處測定OD值。由于NO極不穩(wěn)定，在細胞培養(yǎng)上清液中代謝成為亞硝酸基NO2-,故采用Griess法測定樣品中NO2-的濃度作為衡量NO水平的指標。用濃度分別為1、5、10、50μmol/L的NaNO2繪制標準曲線，根據NaNO2標準曲線計算細胞培養(yǎng)上清液中NO2-的濃度以及對NO釋放的抑制率，抑制率計算公式為：實驗結果：結果如表4所示，式(Ⅰ)所示化合物對小鼠單核巨噬細胞NO釋放顯示出較強的抑制力，即具有較強的抗炎活性。表4提取物IC50，μg/ml提取物IC50，μg/mlGL-1E24.6±3.25GL554.3±9.35GL159.8±4.98GL-662.8±7.06GL276.3±6.25GL-6E31.3±6.02GL388.2±12.5氫化可的松16.76±3.08GL467.9±8.72實施例10白肉靈芝提取物對藥物性肝損傷小鼠的作用材料：被測樣品溶液為實施例1和實施例4～8所述的8個提取物(GL-1E、GL-1～GL-6和GL-6E)。準確稱取各樣品，用0.5％CMC-Na溶液配制100mg/ml溶液，供活性測試。SPF級昆明種小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，溫度20～24攝氏度，恒濕50～60％，光照12小時(8:00～20:00)，隔音，自由攝食、飲水，適應環(huán)境一周后進行實驗。谷丙轉氨酶ALT試劑盒(批號20131006)、丙二醛MDA試劑盒(批號20140502)、谷胱甘肽GSH試劑盒(批號2040906)購自南京建成生物工程研究所。方法：取雄性SPF級昆明種小鼠，20±2g，適應性飼養(yǎng)一周后進行實驗，隨機分為9組，每組12只。各組分別灌胃給與0.1ml的100mg/ml提取物溶液(相當于500mg/kg)，連續(xù)10天，空白組和模型組給予等量的0.5％CMC-Na溶液。末次給藥2小時后，空白組腹腔注射給予花生油0.2ml，其余各組按照0.1ml/10g體重的給藥劑量給予四氯化碳花生油(0.2％)。禁食不禁水20小時后，麻醉處死小鼠，心臟取血和肝臟。測定血清ALT和肝臟MDA、GSH含量。結果：本模型模擬了藥物性肝損傷，主要是指環(huán)境污染、飲食飲酒及長期用藥引起的肝損傷，同時也可以模擬肝細胞變性、纖維增生而導致的肝硬化、肝小葉結構紊亂等肝病(施彥等.沙棘籽油對小鼠實驗性肝硬化的保護作用及參數分析.醫(yī)學研究生學報,2006,19,40-42.)。與對照組比較，白肉靈芝提取物顯著的抑制了四氯化碳引起的小鼠血清ALT及肝臟MDA含量的升高及GSH含量的降低，對四氯化碳引起的肝損傷具有保護作用，見表5。表5分組ALTU/LMDAnmol/gGSHnmol/g空白組37.56±5.85412.58±15.693.98±0.67模型組152.07±26.02##1537.46±240.07##3.12±0.52#GL-1E49.85±15.98**628.74±120.36**4.48±0.54**GL196.67±14.89**1322.58±315.083.69±0.71GL2108.51±25.02*1472.44±222.683.72±0.63GL390.24±17.36**1327.85±231.093.92±0.28*GL4109.4±18.02*1409.37±130.083.61±0.43GL5118.7±27.04*1398.45±317.723.79±0.57GL696.52±12.58**1425.58±265.873.87±0.49GL-6E62.9±15.91**916.28±134.28*4.18±0.46**P<0.05，**P<0.01與模型組相比#P<0.05，##P<0.01與空白組相比實施例11白肉靈芝提取物對細菌性肝損傷小鼠的作用材料：被測樣品溶液為實施例1和實施例4～8所述的8個提取物(GL-1E、GL-1～GL-6和GL-6E)。準確稱取各樣品，用0.5％CMC-Na溶液配制100mg/ml溶液，供活性測試。SPF級昆明種小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，溫度20～24攝氏度，恒濕50～60％，光照12小時(8:00～20:00)，隔音，自由攝食、飲水，適應環(huán)境一周后進行實驗。谷丙轉氨酶ALT試劑盒(批號20131006)購自南京建成生物工程研究所。MouseTNF-αELISA試劑盒購自R&D公司(美國)。方法：取雄性SPF級昆明種小鼠，20±2g，適應性飼養(yǎng)一周后進行實驗，隨機分為9組，每組12只。各組分別灌胃給與0.1ml的100mg/ml提取物溶液(相當于500mg/kg)，連續(xù)10天，空白組和模型組給予等量的0.5％CMC-Na溶液。末次給藥2小時后，空白組腹腔注射給予RPMI-1640培養(yǎng)基0.2ml，其余各組按照0.1ml/10g體重的給藥劑量給予LPS(4mg/kg)。禁食不禁水6小時后，麻醉處死小鼠，心臟取血和肝臟。測定血清ALT和肝臟TNF-α。結果：LPS是革蘭氏陰性細菌致病的主要因素，本模型用LPS模擬了細菌性肝損傷，同時也有報道表明LPS可加重酒精性肝損傷、四氯化碳肝病及肝硬化引起的肝損傷(VishnyakovaTG,etal.JBiolChem,2003,278(25):22771-22780)。在我們的研究中，與空白對照組比較，白肉靈芝提取物顯著的抑制了LPS引起的小鼠血清ALT含量的升高及肝臟TNF-α含量的的降低，對LPS引起的肝損傷具有保護作用，見表6。表6分組ALTU/LTNF-α(pg/mL)空白對照組27.56±6.2587.53±10.58模型組102.05±23.08##61.28±12.28GL-1E39.28±6.48**98.25±16.11**GL194.57±12.69*71.47±14.28*GL288.42±24.24*68.55±9.42GL364.24±17.44*65.27±4.72GL479.37±18.22*70.55±5.69GL578.45±27.84*72.29±4.39*GL-664.58±19.25*74.26±5.71*GL-6E52.65±15.11**85.47±14.28***P<0.05，**P<0.01與模型組相比#P<0.05，##P<0.01與空白組相比實施例12白肉靈芝提取物對病毒性肝損傷小鼠的作用測試用腫瘤細胞：將人肝癌細胞HepG2.2.15細胞購自解放軍(北京)第302醫(yī)院，用含體積百分含量10％的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。培養(yǎng)條件均為37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，隔天傳代。被測樣品溶液：實施例1和實施例4～8所述的8個提取物(GL-1E、GL-1～GL-6和GL-6E)。準確稱取各樣品，用DMSO(二甲亞砜)配制成50mg/ml溶液(制備時溶于少量DMSO后，再用蒸餾水稀釋至相應濃度，控制DMSO的最終體積百分含量<1％)，用DMEM培養(yǎng)基進行2倍梯度稀釋，共8個濃度，供活性測試。陽性對照拉米夫定(葛蘭素史克，拉米夫定是核苷類似物，抗病毒藥物，對病毒DNA鏈的合成和延長有競爭性抑制作用，對體外及實驗性感染動物體內的乙型肝炎病毒(HBV)有較強的抑制作用。)配制成50mg/ml水溶液(制備時溶于少量DMSO后，再用蒸餾水稀釋至相應濃度，控制DMSO的最終體積百分含量<1％)，用DMEM培養(yǎng)基溶液進行2倍梯度稀釋，共8個濃度。采用細胞增殖抑制活性測試方法(MTT法)測試樣品的抗腫瘤細胞增殖活性。乙肝表面抗原及e抗原檢測試劑盒為華美生物工程公司產品。取對數生長期的HepG2.2.15，用胰酶消化，制成每毫升含3×104個細胞的單細胞懸液，接種于96孔板內(每孔100μL)，每組設3個平行孔。在37℃下24小時后加入1μl上述不同濃度的被測樣品溶液，作為給藥組，同時設空白對照組(1μlDMSO替代上述的被測樣品溶液)和陽性對照組(1μl不同濃度的拉米夫定溶液替代上述的被測樣品溶液)，培養(yǎng)11天，收集上清液。用酶聯(lián)免疫法，按照乙肝表面抗原及e抗原檢測試劑盒進行檢測。藥物對抗原的抑制率＝(1-給藥組OD值/空白對照組OD值)×100％，計算IC50。吸去上清后的細胞孔中加入100μL含0.4g/L的MTT的RPMI-1640溶液，再培養(yǎng)4小時，移出培養(yǎng)液后加入150μLDMSO溶解甲臜，在540nm處測定其吸收度，檢測藥物對細胞的毒性(％)。抑制率(％)(I)＝(1-給藥組OD值/空白對照組OD值)×100％，并計算CC50(藥物半數毒性濃度，即試驗孔存活細胞為50％時的藥物濃度)。結果如表7所示，白肉靈芝提取物具有一定的抗乙肝病毒活性，對HBsAg和HBeAg都有一定的抑制作用。表7提取物CC50(μg/ml)HBsAgIC50(μg/ml)HBeAgIC50(μg/ml)GL-1E307.9±65.835.72±3.85159.67±16.30GL1>500239.24±34.06383.9±28.91GL2382±39.1268.27±12.09425.8±30.75GL3408.96±29.07305.75±29.87459.8±42.09GL4451.08±35.80325.84±26.70391.7±30.28GL5403.08±12.39401.8±36.54408.7±40.29GL6458.93±18.97368.15±28.79368.47±36.97GL-6E429.85±20.58369.57±29.80261.08±26.30拉米夫定>50037.25±7.8298.28±10.08實施例13白肉靈芝提取物對脂肪肝大鼠的作用材料：被測樣品溶液為實施例1和實施例4～8所述的8個提取物(GL-1E、GL-1～GL-6和GL-6E)。準確稱取各樣品，用0.5％CMC-Na溶液配制100mg/ml溶液，供活性測試。SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，溫度20～24攝氏度，恒濕50～60％，光照12小時(8:00～20:00)，隔音，自由攝食、飲水，適應環(huán)境一周后進行實驗。谷丙轉氨酶ALT試劑盒(批號20131006)、丙二醛MDA試劑盒(批號20140506)均購自南京建成生物工程研究所。方法：取雄性健康SD大鼠，200±20g，大鼠適應性飼養(yǎng)一周后進行實驗，隨機分為8組，每組10只?？瞻讓φ战M給予蒸餾水灌胃(10ml/kg)，模型組和給藥組給予脂肪乳劑灌胃(10ml/kg)(脂肪乳劑：豬油25g，膽固醇10g，1g丙賽優(yōu)，加熱融化充分攪勻，加入25ml吐溫80，制成油相。另2g脫氧膽酸鈉、30ml蒸餾水、1，2丙二醇20ml，加熱溶解，制成水相。然后水相和油相充分混勻，即制成脂肪乳劑。)，每天一次，連續(xù)3周。同時各組大鼠分別每天在給予脂肪乳劑6小時后，灌胃給與1ml的100mg/ml提取物溶液(相當于500mg/kg)，空白對照組和模型對照組給予等量的0.5％CMC-Na溶液。末次給藥后，取血，4攝氏度3000rpm離心，測定血清谷丙轉氨酶ALT、肝勻漿丙二醛MDA含量。結果：與對照組比較，上述提取物可以顯著改善大鼠高血脂脂肪肝的情況，對大鼠血清ALT和肝勻漿MDA也有很好的逆轉作用，提示可以保護高血脂性脂肪肝，結果見表8。表8*P<0.05，**P<0.01與模型組相比#P<0.05，##P<0.01與空白組相比實施例14白肉靈芝提取物對慢性胃炎的作用材料：被測樣品溶液為實施例1和實施例4～8所述的8個提取物(GL-1E、GL-1～GL-6和GL-6E)。準確稱取各樣品，用0.5％CMC-Na溶液配制100mg/ml溶液，供活性測試。SPF級SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，溫度20～24攝氏度，恒濕50～60％，光照12小時(8:00～20:00)，隔音，自由攝食、飲水，適應環(huán)境一周后進行實驗。一氧化氮NO試劑盒(批號20140105)、NOS試劑盒(批號20130507)購自南京建成生物工程研究所、胃泌素試劑盒購自解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免所(批號130815)。方法：取雄性SPF級SD大鼠，220±20g，適應性飼養(yǎng)一周后進行實驗。隨機取出10只作為空白對照組，其他大鼠以1.5ml/100g的劑量灌胃給予1.5％的脫氧膽酸鈉，連續(xù)60天，同時每周灌胃60％乙醇一次。60天后，各給藥組分別灌胃給與1ml的100mg/ml提取物溶液(相當于500mg/kg)，連續(xù)30天，空白組和模型組給予等量的0.5％CMC-Na溶液。末次給藥后禁食禁水12小時，眼眶取血。離心留取血清，采用試劑盒測定血清NOS、NO和胃泌素的含量。結果：與對照組比較，白肉靈芝提取物顯著的改善了胃組織炎癥的病理生化環(huán)境，具有改善胃腸炎癥和消化分泌功能的作用趨勢，見表9。表9*P<0.05，**P<0.01與模型組相比#P<0.05，##P<0.01與空白組相比實施例15白肉靈芝提取物對大鼠乙醇型胃潰瘍的作用材料：被測樣品溶液為實施例1和實施例4～8所述的8個提取物(GL-1E、GL-1～GL-6和GL-6E)。準確稱取各樣品，用0.5％CMC-Na溶液配制100mg/ml溶液，供活性測試。SPF級SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，溫度20～24攝氏度，恒濕50～60％，光照12小時(8:00～20:00)，隔音，自由攝食、飲水，適應環(huán)境一周后進行實驗。。方法：取雄性SPF級SD大鼠，200±20g，適應性飼養(yǎng)一周后進行實驗。隨機分為9組，各給藥組分別灌胃給與1ml的100mg/ml提取物溶液(相當于500mg/kg)，連續(xù)10天，空白組和模型組給予等量的0.5％CMC-Na溶液。末次給藥后禁食禁水2小時后，大鼠灌胃給予無水乙醇1ml/200g，1小時后處死大鼠。剖腹，結扎賁門和幽門，向胃內注入4％福爾馬林溶液10ml。取胃，浸入4％福爾馬林溶液固定0.5小時后，沿胃大彎剖開，觀察胃黏膜潰瘍形成情況，并測量胃潰瘍面積，計算胃潰瘍抑制率：潰瘍抑制率(％)＝(對照組潰瘍面積-給藥組潰瘍面積)/對照組潰瘍面積×100％。結果：與對照組比較，白肉靈芝提取物對無水乙醇造成的胃潰瘍有顯著的對抗作用，見表10。表10*P<0.05，**P<0.01與模型組相比#P<0.05，##P<0.01與空白組相比實施例16白肉靈芝提取物對致敏小鼠抗原攻擊后支氣管肺灌流液中炎癥細胞的作用材料：被測樣品溶液為實施例1和實施例4～8所述的8個提取物(GL-1E、GL-1～GL-6和GL-6E)。準確稱取各樣品，用0.5％CMC-Na溶液配制100mg/ml溶液，供活性測試。SPF級昆明種小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，溫度20～24攝氏度，恒濕50～60％，光照12小時(8:00～20:00)，隔音，自由攝食、飲水，適應環(huán)境一周后進行實驗。。方法：取雄性SPF級昆明種小鼠，20±2g，適應性飼養(yǎng)一周后進行實驗。隨機分為9組，各給藥組分別灌胃給與0.1ml的100mg/ml提取物溶液(相當于500mg/kg)，連續(xù)10天，空白組和模型組給予等量的0.5％CMC-Na溶液。小鼠乙醚麻醉，0.1％卵白蛋白(sigmachemicalCo.,gradeV；用10％的氫氧化鋁凝膠配制)于兩后足掌，兩腹股溝，兩腋下，頸部以及背部共八點皮下注射0.4mL，致敏第10天腹腔注射0.1％卵白蛋白氫氧化鋁凝膠0.2mL再次致敏1次，第2次致敏11天后，用1％的卵白蛋白(生理鹽水配制)霧化吸入進行攻擊，每次30分鐘，連續(xù)攻擊6天。每次攻擊前1小時根據分組給藥，末次攻擊后24小時后取出小鼠支氣管進行肺泡灌洗。脫臼處死小鼠，縱行剪開頸部皮膚，分離暴露氣管，行氣管插管，用灌洗液(Thornwell-Mcdowell溶液：NaCl6.6g,KCl0.46g,CaCl20.05g,NaHCO32.52g,MgCl20.09g,Na2HPO40.1g,加水至1000mL)灌洗，每次0.5mL，共3次，收集支氣管肺泡灌洗液，搖勻后取出50微升，用白細胞稀釋液稀釋4倍，取少量滴于細胞計數板上，在顯微鏡下計數白細胞總數。將支氣管肺泡灌洗液低溫1000rpm離心10min后，棄去上清液，用移液器打勻后涂片。涂片室溫干燥，染色6-8min，復染1分鐘。用自來水將染料沖洗干凈，在光學顯微鏡40倍鏡下進行白細胞分類計數。計數200個細胞，計算淋巴單核細胞以及嗜酸性粒細胞的百分比。結果：如表11，表明白肉靈芝提取物對小鼠哮喘模型支氣管肺泡的炎癥細胞聚集有明顯的抑制作用。表11*P<0.05，**P<0.01與模型組相比#P<0.05，##P<0.01與空白組相比。