国产精品1024永久观看,大尺度欧美暖暖视频在线观看,亚洲宅男精品一区在线观看,欧美日韩一区二区三区视频,2021中文字幕在线观看

  • <option id="fbvk0"></option>
    1. <rt id="fbvk0"><tr id="fbvk0"></tr></rt>
      <center id="fbvk0"><optgroup id="fbvk0"></optgroup></center>
      <center id="fbvk0"></center>

      <li id="fbvk0"><abbr id="fbvk0"><dl id="fbvk0"></dl></abbr></li>

      有序修復(fù)材料及其制備方法和用途與流程

      文檔序號(hào):12481754閱讀:343來源:國(guó)知局
      有序修復(fù)材料及其制備方法和用途與流程

      本發(fā)明涉及一種有序的生物修復(fù)材料及其制備方法和用途。



      背景技術(shù):

      脊髓損傷(Spinal cord injury,SCI)是一種嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷,具有高度的致殘性。如今,中樞神經(jīng)損傷后的神經(jīng)修復(fù)被證明是可能的,然而常規(guī)的手術(shù)手段只能使這些傷者中的極少數(shù)人徹底康復(fù)。多項(xiàng)研究表明,脊髓內(nèi)部微環(huán)境不適合是造成脊髓再生能力十分有限的主要原因。脊髓損傷后在很短的時(shí)間內(nèi),在受損部位形成了空洞和疤痕,在這樣一個(gè)不利的環(huán)境下,軸突即使能夠生長(zhǎng),也很難逾越這樣的一個(gè)障礙。目前,對(duì)于脊髓損傷,應(yīng)用生物支架來橋接損傷兩側(cè)的脊髓,結(jié)合神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子或藥物或干細(xì)胞,從而促進(jìn)軸突再生是一個(gè)重要的治療策略。在制備用于神經(jīng)再生的生物支架材料時(shí),材料的取向性非常重要,因?yàn)榧顾枭窠?jīng)纖維(軸突)的生長(zhǎng)是有方向的。目前,神經(jīng)損傷修復(fù)材料主要由化學(xué)合成的材料制成,它們往往細(xì)胞相容性不好,容易引起免疫排斥問題。

      此外,肌腱損傷是最常見的運(yùn)動(dòng)損傷,損傷機(jī)率高,致殘率也高。肌腱損傷后,若未予以及時(shí)修復(fù),常會(huì)導(dǎo)致肢體功能障礙,重者甚至殘廢。對(duì)于較嚴(yán)重的肌腱損傷往往需要手術(shù)干預(yù),對(duì)于缺損性肌腱損傷往往需要植入修復(fù)體,如:自體肌腱、同種異體肌腱、異種肌腱或人工肌腱。前三者由于移植體來源有限或者排異反應(yīng)等諸多原因,不能滿足臨床治療需求,因此開發(fā)人工肌腱具有重要現(xiàn)實(shí)意義。肌腱獨(dú)特的生物力學(xué)性能主要?dú)w因于肌腱細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的高度組織性。細(xì)胞外基質(zhì)主要由I型膠原蛋白構(gòu)成,肌腱中的ECM呈等級(jí)束狀且分不同層面平行地排列在基質(zhì)蛋白中,棱形的肌腱成纖維細(xì)胞(也稱肌腱細(xì)胞)呈縱向排列且大量鞘樣細(xì)胞延伸至細(xì)胞外基質(zhì)。I型膠原可以誘導(dǎo)肌腱胞外基質(zhì)的形成增加410%。因此,基于膠原的并有一定取向性的材料是用于肌腱損傷修復(fù)的良好材料。

      牛的肌肉表面存在一層保護(hù)組織,通常稱為筋膜,屬于肌腱的延伸部分,其主要成分與肌腱一樣,由I型與III型膠原纖維構(gòu)成。這種材料具有平行排列的纖維狀結(jié)構(gòu),如圖1所示,有可能作為一種合適的神經(jīng)導(dǎo)向材料和肌腱修復(fù)材料。



      技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

      一方面,本發(fā)明涉及一種制備有序修復(fù)材料的方法,其包括:

      (1)使筋膜在氫氧化鈉溶液中處理;

      (2)使所得物在去污劑溶液中處理;

      (3)使所得物干燥。

      在實(shí)施方式中,筋膜可以取自哺乳動(dòng)物,例如牛、羊、馬等,優(yōu)選為牛。筋膜是新鮮的筋膜。

      在實(shí)施方式中,在步驟(1)之前,除去筋膜組織上粘附的組織,例如肌肉組織等。在實(shí)施方式中,還包括在步驟(1)之前去除筋膜組織中的脂肪。

      在實(shí)施方式中,氫氧化鈉溶液可以是氫氧化鈉的水溶液。氫氧化鈉溶液的濃度可以是約2~5N,例如約2N、3N、4N或5N。步驟(1)可以在約4℃~16℃進(jìn)行,例如約4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃或16℃。此外,步驟(1)可以進(jìn)行約30分鐘至300分鐘,例如約30分鐘、40分鐘、50分鐘、60分鐘、70分鐘、80分鐘、90分鐘、100分鐘、110分鐘、120分鐘、150分鐘、300分鐘等。在步驟(1)中,可以更換新的氫氧化鈉溶液,例如更換2~4次新的氫氧化鈉溶液。

      在實(shí)施方式中,步驟(2)中的去污劑可以是化學(xué)去污劑,例如吐溫-80、吐溫-20、TritonX-100等。去污劑溶液的濃度可以是約1~5%,例如約1%、2%、3%、4%、5%等。去污劑的溶液可以是去污劑的水溶液、緩沖液溶液等,其中緩沖液可以是磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液等。

      在實(shí)施方式中,在步驟(3)之前,對(duì)所得物進(jìn)行充分清洗。其中,可以用去熱源水對(duì)材料進(jìn)行清洗;也可以用其他水例如蒸餾水、去離子水進(jìn)行清洗。

      在實(shí)施方式中,在步驟(3)中,可以采用低溫干燥使所得物干燥,例如冷凍真空干燥等。在所得物干燥之后,可以進(jìn)行滅菌,例如輻照滅菌等。

      另一方面,本發(fā)明提供由上述方法制備得到的有序修復(fù)材料,其為線性膠原纖維。該線性膠原纖維包含I型膠原纖維和III型膠原纖維,其保留有天然膠原纖維的結(jié)構(gòu),并可以根據(jù)需要聚集成不同直徑的束狀,也可以修剪成任意形狀和長(zhǎng)度。此外,這些線性纖維具有利于細(xì)胞貼附的粗糙表面,并具有良好的生物相容性和生物可降解性。而且,在細(xì)菌和病毒殺滅方面更徹底,且排異反應(yīng)更小。

      再一方面,本發(fā)明提供本文有序修復(fù)材料作為組織修復(fù)材料的用途。

      在實(shí)施方式中,本發(fā)明的有序修復(fù)材料可以用于組織的修復(fù),尤其是神經(jīng)和肌腱的修復(fù)。

      本發(fā)明以天然筋膜為基礎(chǔ),用NaOH處理結(jié)合常見的去污劑處理,即可以以簡(jiǎn)單的處理工藝在短時(shí)間內(nèi)得到有序排列的線性膠原纖維。NaOH處理可以有效殺滅細(xì)菌和病毒,并且減少最終產(chǎn)品的排異反應(yīng)。這些線性膠原纖維保持有天然膠原纖維的結(jié)構(gòu),可以根據(jù)需要構(gòu)成任意長(zhǎng)度的片狀或任意直徑和長(zhǎng)度的束狀。此外,這些線性膠原材料具有可以引導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等在膠原纖維方向上生長(zhǎng)的有序方向性、利于細(xì)胞粘附的粗糙纖維表面、應(yīng)用于有機(jī)體的良好的生物相容性和生物可降解性。因此,本發(fā)明的線性膠原纖維可以用作組織修復(fù)材料,特別是用作神經(jīng)修復(fù)材料和肌腱修復(fù)材料。

      附圖說明

      圖1示出天然牛筋膜的平行排列的纖維狀結(jié)構(gòu)。

      圖2A示出根據(jù)本發(fā)明示例性實(shí)施方式的線性膠原纖維的宏觀外觀圖,其中圖下方為cm尺,可見纖維長(zhǎng)為約7cm,圖2B示出根據(jù)本發(fā)明示例性實(shí)施方式的線性膠原纖維的掃描電鏡圖。

      圖3A示出大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元在普通培養(yǎng)平皿中的軸突生長(zhǎng)方向,圖3B示出大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元在根據(jù)本發(fā)明示例性實(shí)施方式的線性膠原纖維上的軸突生長(zhǎng)方向,圖3C示出大鼠小腦顆粒細(xì)胞在根 據(jù)本發(fā)明示例性實(shí)施方式的線性膠原纖維上的生長(zhǎng)情況,其中各圖中的標(biāo)尺均為200μm。

      圖4A示出大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞在根據(jù)本發(fā)明示例性實(shí)施方式的線性膠原纖維上的生長(zhǎng)情況,圖4B示出人成纖維細(xì)胞在根據(jù)本發(fā)明示例性實(shí)施方式的線性膠原纖維上的生長(zhǎng)情況,其中各圖中的標(biāo)尺均為200μm。

      具體實(shí)施方式

      天然筋膜的結(jié)構(gòu)緊密,成分較為復(fù)雜,不適合細(xì)胞的貼附和生長(zhǎng),而且有引起機(jī)體免疫排斥的風(fēng)險(xiǎn)。

      本發(fā)明通過氫氧化鈉消蝕與去污劑處理的結(jié)合,除去筋膜中的細(xì)胞成分并保留細(xì)胞外基質(zhì),得到具有有序結(jié)構(gòu)、良好的生物相容性和良好的生物可降解性的線性膠原纖維。而且,這種線性膠原纖維在細(xì)菌和病毒殺滅方面更徹底,且排異反應(yīng)更小。

      本發(fā)明人發(fā)現(xiàn),氫氧化鈉和去污劑均可以起到脫細(xì)胞的作用,但強(qiáng)度不同。去污劑例如吐溫-80、TritonX-100的處理較為柔和,一般不破壞細(xì)胞外基質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)和成分,但是處理時(shí)間較長(zhǎng),且會(huì)損失一部分細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白。而NaOH的作用更為劇烈,但是由于比較容易洗去,沒有在最終產(chǎn)品上的殘留問題,對(duì)修復(fù)的組織和細(xì)胞沒有毒性。兩種處理的結(jié)合可以較好地去除筋膜的抗原性,并保留其I型和III型膠原纖維,主要保留I型膠原纖維。比起單獨(dú)去污劑的處理,NaOH的在先處理可以有效殺滅細(xì)菌和病毒,并且減少最終產(chǎn)品的排異反應(yīng)。由于NaOH成本低廉,且有上述效果,使得本發(fā)明的產(chǎn)品優(yōu)于傳統(tǒng)方法得到的產(chǎn)品。具體地,本發(fā)明提供一種制備有序修復(fù)材料的方法,其包括:

      (1)使筋膜在氫氧化鈉溶液中處理;

      (2)使所得物在去污劑溶液中處理;

      (3)使所得物干燥。

      筋膜可以是取自哺乳動(dòng)物,例如牛、羊、馬等的新鮮筋膜。由于來源較為便利且價(jià)廉,而處理后得到的材料沒有免疫原性,因此本發(fā)明的修復(fù)材料可以大量應(yīng)用于臨床。

      所使用的氫氧化鈉溶液為氫氧化鈉的水溶液,濃度可以是約2~5N,例如約2N、3N、4N或5N。當(dāng)氫氧化鈉的濃度小于2N時(shí),脫細(xì)胞效果不好,而當(dāng)濃度大于5N時(shí),對(duì)膠原材料的物理性能具有一定破壞作用。步驟(1)可以在約4℃~16℃的低溫下進(jìn)行,優(yōu)選為約10℃。此外,步驟(1)可以進(jìn)行30~300分鐘,并且優(yōu)選在此過程中更換新的氫氧化鈉溶液,例如更換2~4次新的氫氧化鈉溶液。延長(zhǎng)的處理時(shí)間和溶液的更新可以使處理效果更好,即更好地去除細(xì)胞成分。

      在步驟(2)中,去污劑的選擇要考慮其強(qiáng)度以及其殘留對(duì)所得材料應(yīng)用的影響。經(jīng)測(cè)試,吐溫-80、吐溫-20、TritonX-100可以用在本發(fā)明中,并具有良好的效果。而且,本領(lǐng)域技術(shù)人員可知,這幾種去污劑可以替換使用。去污劑的濃度在約1~5%的范圍內(nèi),濃度過低會(huì)使處理效果變差,而濃度過高會(huì)影響材料的性能。此外,去污劑的處理時(shí)間和溫度可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)確定。

      在步驟(3)中,可以采用低溫干燥對(duì)所得物進(jìn)行干燥。低溫真空干燥可以除去所得物中的水分和溶液殘留,完好保持筋膜處理后剩余部分的結(jié)構(gòu)。低溫干燥可以通過例如冷凍真空干燥的方法,在冷凍干燥儀中進(jìn)行。

      如果本發(fā)明方法的所得物要用于醫(yī)療用途,需要對(duì)所得物進(jìn)行充分清洗,并進(jìn)行殺菌消毒。其中,可以用去熱源水對(duì)材料進(jìn)行清洗;也可以用其他水例如蒸餾水、去離子水進(jìn)行清洗并輻照殺菌。其中,去熱源水為不含熱源物質(zhì)的水。去熱源水的制備方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知,如用超濾膜、反滲透、層析等方法處理水等而得到。

      使用本發(fā)明方法制備得到的有序修復(fù)材料是線性膠原纖維。該線性膠原纖維保留有天然膠原纖維的結(jié)構(gòu),可以根據(jù)要求隨意聚集成不同直徑的束狀,也可以修剪成任意長(zhǎng)度,方便用于任意大小和任意部位的組織修復(fù)。

      本發(fā)明的線性膠原纖維還具有方向性。這種方向性對(duì)于神經(jīng)纖維和肌腱成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)尤其重要。其中,神經(jīng)纖維(軸突)的方向性是準(zhǔn)確有效傳送神經(jīng)脈沖的基礎(chǔ),而本領(lǐng)域人員已知肌腱的成纖維細(xì)胞呈縱向排列。本發(fā)明的線性膠原纖維不僅給神經(jīng)纖維和肌腱成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)提供支持,還可以與藥物等結(jié)合使用來促進(jìn)兩種細(xì)胞的 生長(zhǎng)。

      另外,本發(fā)明的有序修復(fù)材料具有良好的生物相容性。本發(fā)明的有序修復(fù)材料由I型和III型天然膠原蛋白構(gòu)成,主要為I型膠原蛋白,沒有免疫原性,因此可以應(yīng)用到組織修復(fù)中。在損傷的脊髓中,本發(fā)明的膠原材料可以搭接損傷脊髓的兩側(cè),為軸突的生長(zhǎng)提供支持,并且可以結(jié)合神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子或藥物等促進(jìn)神經(jīng)再生。而本發(fā)明神經(jīng)纖維的粗糙表面,有利于細(xì)胞的貼附。此外,已經(jīng)證實(shí),肌腱的獨(dú)特生物力學(xué)性能主要?dú)w因于肌腱細(xì)胞外基質(zhì)的高度組織性,而本發(fā)明的有序修復(fù)材料中包含的I型膠原可以誘導(dǎo)肌腱細(xì)胞外基質(zhì)的形成增加410%。

      目前用于組織損傷修復(fù)的膠原生物材料,主要從酸溶的膠原制備,工藝復(fù)雜,步驟較多,而且主要以無序的管狀和膠原凝膠為主。本發(fā)明的加工方法,以機(jī)體天然筋膜為基礎(chǔ),利用獨(dú)特的處理工藝,開發(fā)出可用于脊髓和肌腱損傷修復(fù)的新材料,其對(duì)細(xì)胞具有良好相容性,免疫原性低。更重要的是,這種材料可以使神經(jīng)元或肌腱再生種子細(xì)胞沿著膠原纖維的方向有序生長(zhǎng),這對(duì)于肌腱及脊髓損傷的修復(fù)非常重要。因此,本發(fā)明的有序修復(fù)材料具有很好的臨床應(yīng)用前景。

      以下提供本發(fā)明的具體實(shí)施例,實(shí)施例僅為示例說明本發(fā)明,而并不限制本發(fā)明的范圍。

      制備例.線性膠原纖維的制備

      1.取新鮮帶有白色筋膜的成年牛的肌肉組織,用10℃去離子水沖洗3遍;

      2.用鑷子和手術(shù)刀分離出筋膜,盡量去除內(nèi)層粘附的肌肉組織;

      3.將外層的脂肪、附著的肌肉血管組織去除后,用氫氧化鈉水溶液處理(氫氧化鈉的摩爾濃度、溫度和處理時(shí)間見以下表格);

      4.更換新的氫氧化鈉溶液(摩爾濃度、溫度和處理時(shí)間與上一步保持一致),該步驟重復(fù)次數(shù)見以下表格;

      5.用去污劑溶液(去污劑的種類、濃度和溶劑見以下表格)在16℃下處理60分鐘;

      6.用去熱源水對(duì)材料進(jìn)行充分清洗;

      7.將材料用冷凍干燥儀凍干。

      參照以下表格,按照上述步驟進(jìn)行線性膠原纖維的制備。

      在步驟1中采用來自成年羊的肌肉組織,如上進(jìn)行制備例14~26;在步驟1中采用來自成年馬的肌肉組織,如上進(jìn)行制備例27~36。

      制備比較例.僅使用去污劑制備線性膠原纖維

      1.取新鮮帶有白色筋膜的成年牛的肌肉組織,用10℃去離子水沖洗3遍;

      2.用鑷子和手術(shù)刀分離出筋膜,盡量去除內(nèi)層粘附的肌肉組織;

      3.將外層的脂肪、附著的肌肉血管組織去除后,用5%的吐溫-20水溶液在16℃下處理60分鐘;

      4.用去熱源水對(duì)材料進(jìn)行充分清洗;

      5.將材料用冷凍干燥儀凍干。

      得到比較樣品1。

      實(shí)施例1.線性膠原纖維的形態(tài)觀察

      對(duì)各個(gè)制備例和制備比較例得到的樣品進(jìn)行形態(tài)觀察??梢钥吹?,各個(gè)制備例和制備比較例中得到的線性膠原纖維均可以聚集成束狀,如圖2A所示,其長(zhǎng)度和束狀直徑可以隨意調(diào)節(jié),并且呈現(xiàn)出方向性。之后,通過掃描電鏡來觀察制備例和制備比較例的膠原纖維,其中圖2B示出本發(fā)明制備例13膠原纖維的其中一根的結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)線狀膠原纖維具有有序結(jié)構(gòu),其粗糙的表面結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞的貼附。

      實(shí)施例2.線性膠原纖維的內(nèi)毒素含量測(cè)定

      盡管制備例和制備比較例得到的樣品在形態(tài)上沒有差別,但是制備例得到的產(chǎn)品在細(xì)菌和病毒殺滅方面更徹底,且排異反應(yīng)更小。在各制備例樣品的浸提液中,內(nèi)毒素含量<0.5EU/ml,而在將制備比較例樣品同樣處理得到的浸提液中,內(nèi)毒素含量>2.5EU/ml。

      內(nèi)毒素檢測(cè)方法:

      浸提液的制備:使用注射水按6cm2/ml比例浸提材料24小時(shí),測(cè)試浸提液的內(nèi)毒素含量。

      1、選擇所需規(guī)格(0.1ml)及靈敏度(0.25EU/ml)的鱟試劑(湛江安度斯生物有限公司)、細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定研究所,批號(hào)250601-201174)及細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(2ml/支,內(nèi)毒素含量低于0.003EU/ml,湛江安度斯生物有限公司)。

      2、取內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品(凍干品)1支,用水溶解后稀釋至所需濃度備用。

      3、取鱟試劑8支,2支作供試品檢查管,2支作陰性對(duì)照管,2支作陽性對(duì)照管,2支作供試品陽性對(duì)照管。

      4、陰性對(duì)照管加入0.2ml檢查用水,其余各管加入0.1ml檢查用水;每支供試品檢查管另加入0.1ml樣品;陽性對(duì)照管加入0.1ml濃度為2λ的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液;供試品陽性對(duì)照管加入0.1ml濃度為2λ內(nèi)毒素的樣品。

      5、封閉管口,輕輕搖勻,垂直放入37±1℃恒溫器中孵育60±2分鐘,然后觀察結(jié)果。試管孵育期間應(yīng)避免任何震動(dòng)。

      6、將試管從恒溫器中輕輕取出,緩慢倒轉(zhuǎn)180°時(shí),若管內(nèi)形成凝膠,且凝膠不變形,不從管壁滑脫者為陽性,記錄為(+);未形成凝膠或形成的凝膠不堅(jiān)實(shí)、變形并從管壁滑脫者為陰性,記錄為(-)。 保溫和拿取試管過程應(yīng)避免受到振動(dòng)造成假陰性結(jié)果。

      7、陰性對(duì)照管必須是陰性,陽性對(duì)照管、供試品陽性對(duì)照管必須是陽性,否則實(shí)驗(yàn)結(jié)果無效。

      實(shí)施例3.神經(jīng)元在線性膠原纖維上的生長(zhǎng)

      分離SD大鼠的背根神經(jīng)節(jié),分別接種在普通平皿或本發(fā)明制備例13的線性膠原纖維上。

      具體而言,在解剖顯微鏡下暴露E15胎鼠的椎管和椎間孔,用鑷子將脊髓連帶兩旁的神經(jīng)節(jié)一起取出,用顯微鑷逐個(gè)摘除神經(jīng)節(jié)。用0.25%(vol/vol)的胰蛋白酶(Sigma,SH3004201B,溶于PBS緩沖液)37℃消化30min,用約2ml血清(invitrogen,10099141)終止反應(yīng)。300目篩網(wǎng)過濾,1000rpm離心5min收集細(xì)胞。PBS(pH 7.4)清洗一遍后,離心收集,用適量DMEM/F12完全培養(yǎng)液(invitrogen,11330032)吹打成單細(xì)胞懸液,分別接種在普通平皿或本發(fā)明制備例13的線性膠原纖維上。接種后放在二氧化碳培養(yǎng)箱(品牌和型號(hào):HERAcell 150i)中培養(yǎng)(37℃,5%CO2)。

      接種7天后,在顯微鏡下觀察背根神經(jīng)節(jié)球的生長(zhǎng)情況。如圖3A所示,普通平皿中背根神經(jīng)節(jié)球的軸突四散分布,而在本發(fā)明的線性膠原纖維上,背根神經(jīng)節(jié)的軸突沿著膠原纖維的方向有序分布,如圖3B所示。

      此后,如下所述制備出大鼠的小腦顆粒細(xì)胞。出生一周的SD大鼠,延顱骨中縫打開顱骨,分離小腦置于冷的PBS(pH 7.4)中。將分離腦組織的腦膜和血管剝離干凈。剪碎腦組織至1mm3的小塊。將剪碎的腦組織轉(zhuǎn)移至2mL 0.25%(vol/vol)的胰酶(Sigma,SH3004201B,溶于PBS緩沖液)中,37℃消化15分鐘,加入100微升胰酶抑制劑(invitrogen,17075-029)終止消化。5分鐘后再加入4mL的DMEM/F121:1基礎(chǔ)培養(yǎng)基,用玻璃滴管將組織吹散,轉(zhuǎn)移上清至新離心管中,向剩余的沉淀物中加入4mL的新鮮基礎(chǔ)培養(yǎng)基繼續(xù)吹打,轉(zhuǎn)移上清后再吹打一次。將收集的所有上清和沉淀合并在一起,用40μm的濾膜(BD,352340)過濾。將濾后的液體于500g離心5分鐘,去除上清,將沉淀用神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基(含2%B27的DMEM-F12)(B27,invitrogen,17504044;DMEM-12,invitrogen,11330032)重懸,計(jì)數(shù)后接種至添 加有本發(fā)明制備例13的線性膠原纖維的包被有多聚賴氨酸(sigma,P0899)的培養(yǎng)皿上。

      具體而言,將所得的大鼠小腦顆粒細(xì)胞以5×104/mm3的密度接種在本發(fā)明的線性膠原纖維上。接種后放在二氧化碳培養(yǎng)箱(品牌和型號(hào):HERAcell 150i)中培養(yǎng)(37℃,5%CO2)。

      2天后,可以看到,神經(jīng)元細(xì)胞沿線性膠原纖維的纖維方向生長(zhǎng),呈現(xiàn)出很好的有序性,如圖3C所示。

      實(shí)施例4.大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞及人成纖維細(xì)胞在線性膠原纖維上的生長(zhǎng)

      如下所述制備出大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞。選取出生后4周的SD大鼠,脫臼處死,75%酒精浸泡5min,在無菌條件下取出雙側(cè)脛骨、股骨,然后清除兩端骨骺及軟組織,在暴露出骨髓腔后,把無血清L-DMEM培養(yǎng)液(HYCLONE,SH3002101B)作為沖洗液,用無菌注射器反復(fù)沖洗骨髓至透明為止,然后將所得的沖洗液裝入15mL離心管;1000rpm離心5min,棄上清。用10mL無血清L-DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,200目濾網(wǎng)過濾成單細(xì)胞。使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),細(xì)胞以1×106/mL接種于含10%血清的L-DMEM培養(yǎng)基中。將細(xì)胞置于5%CO2濃度,37℃培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。24h半量換液,48h全量換液,然后每3天進(jìn)行培養(yǎng)液的更換。當(dāng)細(xì)胞增殖并逐漸融合到90%時(shí),用0.25%的胰酶進(jìn)行消化傳代,然后以1×106/mL的密度,在培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行傳代,擴(kuò)增培養(yǎng)。

      如下制備得到人成纖維細(xì)胞。將人包皮組織用PBS溶液漂洗三次,洗去組織表面附著的血細(xì)胞;將包皮組織置于PBS的培養(yǎng)皿中,用眼科剪去除皮膚內(nèi)表面附著的皮下組織;再將包皮組織置于新的盛有PBS的3.5cm培養(yǎng)皿中,用眼科剪將組織剪成1mm3的組織塊;1000rpm離心2min;用1ml DMEM培養(yǎng)基(GIBCO,11330032)重懸組織塊,轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶(Corning,430639)中,用Pasteur管(Fisher,13-678-20A)使組織塊均勻分布,并小心吸出多余培養(yǎng)基;將T25培養(yǎng)瓶倒置,放置于37℃培養(yǎng)箱中;約20~24h后,將T25培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn),加入1~1.5ml培養(yǎng)基;隔日換液,約3~7日后可見細(xì)胞從組織塊周圍爬出;約10~14日后可進(jìn)行傳代(0.25%TE消化)。

      取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的大鼠MSC細(xì)胞(P3代)或人成纖維細(xì)胞(P5代),0.25%胰酶消化后,將細(xì)胞離心后重懸于約1ml DMEM培養(yǎng)基(GIBCO,11330032)中,接種于制備例13的線性膠原纖維上。置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中放置4~5h,加入適量DMEM培養(yǎng)基,以淹沒線性膠原纖維為宜。之后,繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

      2天后,可以在顯微鏡下觀察到,大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞(圖4A)和人成纖維細(xì)胞(圖4B)在本發(fā)明的線性膠原纖維上沿材料纖維方向良好生長(zhǎng),如圖4所示。

      當(dāng)前第1頁1 2 3 
      網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
      • 還沒有人留言評(píng)論。精彩留言會(huì)獲得點(diǎn)贊!
      1