本發(fā)明是關(guān)于一種具抗腫瘤活性及降低化療藥物副作用的牛樟芝菌絲體醣蛋白藥物安綽糖。

背景技術(shù)：

癌癥是人類致死的重要原因之一，嚴(yán)重威脅人類健康和生命，是人類急需解決的醫(yī)學(xué)難題之一。60年代rosenberg等人研究電場(chǎng)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)鉑化合物對(duì)細(xì)菌分裂的影響而發(fā)現(xiàn)順鉑(cisplatin)的抗癌活性。順鉑為一種含鉑藥物，為臨床上常用的化療藥物，因?yàn)榭勺钄郿na合成而被用于抗腫瘤的治療，對(duì)于卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌、肺癌、鼻咽癌、食道癌、惡性淋巴瘤、頭頸部鱗癌、甲狀腺癌及成骨肉瘤等多種癌癥具有抑制效果，具有骨髓抑制、惡心、嘔吐、腎臟毒性、神經(jīng)毒性等副作用，其中腎臟毒性是順鉑最常見副作用，重復(fù)用藥會(huì)加重其腎毒性，主要損害腎小管，此腎小管損傷不可逆，可能產(chǎn)生腎衰竭，甚至死亡。

身體中多種因子與癌細(xì)胞生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移有關(guān)，癌細(xì)胞所分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinase,mmps)具有降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力及促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，并且與癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移具有正相關(guān)性，在所有的mmps中，以mmp-2和mmp-9與腫瘤的轉(zhuǎn)移及侵襲最為相關(guān)，因其具有明膠酶(gelatinase)的活性可降解細(xì)胞外基質(zhì)；尿激酶型血纖維蛋白溶解酶原活化因子(urokinase-typeplasminogenactivator,upa)為絲胺酸蛋白酶，能使胞漿素原(plasminogen)轉(zhuǎn)換成胞漿素(plasmin)，而胞漿素參與基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的重塑，亦可促使活化態(tài)的mmps生成。轉(zhuǎn)錄激活蛋白3(signaltransducerandactivatoroftranscription3,stat3)被認(rèn)為與癌細(xì)胞增生、血管新生、轉(zhuǎn)移及免疫逃脫等相關(guān)。介白素-6(interleukin6,il-6)為參與宿主發(fā)炎反應(yīng)的重要細(xì)胞激素，可活化許多訊息傳 遞路徑，包括pi3k路徑j(luò)ak-stat路徑及有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,mapk)路徑，也是影響癌癥的進(jìn)程主要路徑。il-6藉由pi3k及mapk路徑促使癌細(xì)胞增以及癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。il-6亦活化stat3促使vegf蛋白質(zhì)表現(xiàn)，促使血管新生作用促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)。mapks家族可區(qū)分為3種不同亞類，包括細(xì)胞外訊號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellularsignal-regulatedkinase1and2,erk1/2)、c-jun胺激末端激酶(c-junn-terminalkinase,jnks)和p38，在癌細(xì)胞中erk/mapk可被表皮生長(zhǎng)因子接受器及ras等所活化，而促進(jìn)癌細(xì)胞增生、存活及轉(zhuǎn)移。干擾素γ(interferonγ,ifn-γ)可以藉由促進(jìn)先天性免疫反應(yīng)、巨噬細(xì)胞毒殺癌細(xì)胞、抗原呈現(xiàn)及th1型細(xì)胞活化抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)。

牛樟芝(antrodiacinnamomea)菌絲多糖體具有抗癌細(xì)胞增生、抑制血管新生、免疫調(diào)節(jié)、改善藥物副作用等許多生理功能。云芝與牛樟芝均不具有靈芝科的特征，而屬于多孔菌科(polyporaceae)菌類，云芝的糖蛋白產(chǎn)物—結(jié)合蛋白質(zhì)的多糖體k(protein-boundpolysaccharidek,psk,krestin)在日本已于1989年起被許可用于結(jié)合化學(xué)治療，以延長(zhǎng)胃癌結(jié)腸癌和小細(xì)胞肺腫瘤病患的存活。本案發(fā)明人已經(jīng)提出萃取牛樟菌絲體的糖蛋白安綽糖(antrodan)的制備方式及具有抑制發(fā)炎和護(hù)肝的效果(中國(guó)臺(tái)灣專利i500628)，此發(fā)明揭示安綽糖以蛋白質(zhì)的含量為主，為一種含β-1,3-葡甘露聚糖(β-1,3-glucomannan)鍵結(jié)的糖蛋白結(jié)構(gòu)。安綽糖在活體外(invitro)試驗(yàn)可藉由直接及免疫調(diào)節(jié)作用而抑制小鼠肺癌細(xì)胞株llc轉(zhuǎn)移(faetal.,2015.intjbiolmacromol.74:476)，但仍未有安綽糖對(duì)其他癌癥或藥物毒性影響的研究。

癌癥是人類致死的重要原因之一，但目前市售的抗腫瘤藥物有許多副作用，且一開始有效的藥物，終究也可能因抗藥性的產(chǎn)生，而導(dǎo)致疾病再度失去控制。因此，如何找出一種物質(zhì)，可以與抗癌藥物合并使用，增加抗癌藥物抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的效果，并降低抗癌藥物的腎毒性，即成為本發(fā)明在此欲解決的一重要課題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供安綽糖的新用途，可以與抗癌的化療藥物結(jié)合作為癌 癥治療醫(yī)藥組合物，且降低化療藥物的副作用。

本發(fā)明的目的即在于提供一種安綽糖用于制備癌癥治療醫(yī)藥組合物的用途，其中該醫(yī)藥組合物包括提供一有效量安綽糖、一有效量化療藥劑及其藥學(xué)上可接受的載體、佐藥或賦形劑；其中該化療藥劑是為順鉑；該癌癥治療包括抑制癌癥轉(zhuǎn)移、抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)或殺死癌細(xì)胞。

為達(dá)前述發(fā)明目的，該順鉑的有效量為5毫克；該安綽糖的有效量為每次50～250毫克。

為達(dá)前述發(fā)明目的，該癌癥可以是肺癌、肝癌、腎癌。

為達(dá)前述發(fā)明目的，其中該抑制癌癥轉(zhuǎn)移是藉由降低尿激酶型血纖維蛋白溶解酶原活化因子(urokinase-typeplasminogenactivator,upa)活性或介白素-6(interleukin6,il-6)表現(xiàn)所達(dá)成；該降低il-6表現(xiàn)是經(jīng)由降低有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,mapk)磷酸化、降低信號(hào)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3(signaltransducerandactivatoroftranscription3,stat3)磷酸化、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases,mmps)-2表現(xiàn)或基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases,mmps)-9表現(xiàn)而抑制癌癥轉(zhuǎn)移；該有絲分裂原活化蛋白激酶包含細(xì)胞外訊號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellularsignal-regulatedkinase,erk)、c-jun胺基末端激酶(c-junn-terminalkinase,jnk)或p38。

為達(dá)前述發(fā)明目的，其中該抑制癌癥生長(zhǎng)是藉由提高干擾素-γ(interferonγ,ifn-γ)所達(dá)成。

本發(fā)明的另一目的為一種安綽糖用于抑制化療藥物副作用的用途；該化療藥物是為順鉑；該副作用為腎臟毒性。

為達(dá)前述發(fā)明目的，該安綽糖有效量為每次50～250毫克。

附圖說明

圖1為安綽糖單獨(dú)使用或合并順鉑對(duì)于llc誘導(dǎo)腫瘤的c57bl/6小鼠體重的影響，每組小鼠有5～8只；

圖2為安綽糖單獨(dú)使用或合并順鉑對(duì)于llc誘導(dǎo)腫瘤的c57bl/6小鼠在第37天(給藥28天后)腫瘤面積的影響，每組小鼠有5～8只，腫瘤面積計(jì)算公式：圓周(π)÷4×長(zhǎng)×寬；

圖3為安綽糖單獨(dú)使用或合并順鉑對(duì)于llc誘導(dǎo)腫瘤的c57bl/6小鼠在給藥28天后肺臟腫瘤轉(zhuǎn)移數(shù)目的影響；

圖4為安綽糖單獨(dú)使用或合并順鉑對(duì)于llc誘導(dǎo)腫瘤的c57bl/6小鼠在給藥28天后肝臟腫瘤轉(zhuǎn)移數(shù)目的影響；

圖5為安綽糖單獨(dú)使用或合并順鉑對(duì)于llc誘導(dǎo)腫瘤的c57bl/6小鼠在給藥28天后血漿中mmp-2、mmp-9、upa酵素活性的影響；

圖6為安綽糖單獨(dú)使用或合并順鉑對(duì)于llc誘導(dǎo)腫瘤的c57bl/6小鼠在給藥28天后肺臟與肝臟組織mmp-2蛋白質(zhì)表現(xiàn)的影響，以蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)；

圖7為安綽糖單獨(dú)使用或合并順鉑對(duì)于llc誘導(dǎo)腫瘤的c57bl/6小鼠在給藥28天后肺臟與肝臟組織mmp-9蛋白質(zhì)表現(xiàn)的影響，以蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)；

圖8為安綽糖單獨(dú)使用或合并順鉑對(duì)于llc誘導(dǎo)腫瘤的c57bl/6小鼠在給藥28天后肺臟與肝臟組織stat3蛋白質(zhì)磷酸化的影響，以蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)；

圖9為安綽糖單獨(dú)使用或合并順鉑對(duì)于llc誘導(dǎo)腫瘤的c57bl/6小鼠在給藥28天后肺臟與肝臟組織erk1/2蛋白質(zhì)磷酸化的影響，以蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)；

圖10為安綽糖單獨(dú)使用或合并順鉑對(duì)于llc誘導(dǎo)腫瘤的c57bl/6小鼠在給藥28天后肺臟與肝臟組織jnk1/2蛋白質(zhì)磷酸化的影響，以蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)；

圖11為安綽糖單獨(dú)使用或合并順鉑對(duì)于llc誘導(dǎo)腫瘤的c57bl/6小鼠在給藥28天后肺臟與肝臟組織p38蛋白質(zhì)磷酸化的影響，以蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)；

圖12為安綽糖單獨(dú)使用或合并順鉑對(duì)于llc誘導(dǎo)腫瘤的c57bl/6小鼠在給藥28天后血漿中尿素氮(bun)含量的影響；

圖13為安綽糖單獨(dú)使用或合并順鉑對(duì)于llc誘導(dǎo)腫瘤的c57bl/6小鼠在給藥28天后腎臟組織p38蛋白質(zhì)磷酸化的影響，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)；

圖14為安綽糖治療癌癥的機(jī)制。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明是以下面的實(shí)施例予以示范闡明，但本發(fā)明不受下述實(shí)施例所限制。

安綽糖制備

安綽糖制備方式參考中國(guó)臺(tái)灣專利i500628，制備方法的步驟包括:將樟芝菌絲體(bcrc35398，由中壢市的葡萄王公司生物科技中心所提供)以熱水萃取，去除水溶性多糖體；將該熱水萃取后的殘?jiān)詨A萃取，以得到堿萃取物；將該堿萃取物以等電點(diǎn)沉淀方式來獲得堿可溶粗多糖；將該堿可溶粗多糖以sepharosecl-6b樹脂進(jìn)行膠體層析純化，最后得到多糖體，該多糖體即為安綽糖。該安綽糖的分子量為440kda，含有71％的蛋白質(zhì)及14.1％的糖類。

細(xì)胞株及培養(yǎng)

小鼠肺癌細(xì)胞株(lewislungcarcinoma,llc1)(bcrcno.60050)，培養(yǎng)于dmem培養(yǎng)基含有10％(v/v)胎牛血清、0.37％(w/v)nahco3、青霉素(100unit/ml)中，置于37℃，5％co2/95％空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

動(dòng)物與分組

c57bl/6品系的雄性小鼠(周齡5周)飼養(yǎng)于動(dòng)物房(室溫25±2℃、濕度65±5％，控制光照和黑暗時(shí)間分別為12小時(shí))，小鼠適應(yīng)一周后，將肺癌細(xì)胞株llc1(1×10⁵/100μl)以皮下注射方式注入小鼠背部，約9天后，可形成肉眼可見的原位腫瘤，依誘發(fā)出的腫瘤面積和小鼠體重將小鼠隨機(jī)分為六組，之后28天中每周給藥3次，分別為：(1)空白試驗(yàn)組(blank)；(2)腫瘤控制組(tumorcontrol：誘導(dǎo)出腫瘤，施用pbs磷酸緩沖液作為藥物的安慰劑)；(3)安綽糖(20mg/kg)；(4)安綽糖(40mg/kg)；(5)順鉑(1mg/kg)；(6)安綽糖(20mg/kg)+順鉑(1mg/kg)；(7)安綽糖(40mg/kg)+順鉑(1mg/kg)；其中(2)～(7)組是有誘發(fā)腫瘤的小鼠。小鼠飼料中三大營(yíng)養(yǎng)素含量分別為碳水化合物占58.9％、脂肪12.4％和蛋白質(zhì)28.7％，每克含有3.3大卡。藥物劑量換算參考shawetal.(thefasebjournal22:659-661,2007)提出的論述，成年人有效劑量(mg/kg)＝動(dòng)物劑量(mg/kg)×小鼠km值/成年人km值(小鼠km值為3、成年人km值為37)，因此小鼠每次使用的順鉑劑量(1mg/kg)換算至成年人(體重60公斤)的劑量為5毫克/次；小鼠每次使用的安綽糖劑量20mg/kg換算至60公斤成年人的劑量為每次97毫克；小鼠每次使用的安綽糖劑量(40mg/kg)換算至60公斤成年人的劑量為每次195毫克。

安綽糖及癌癥藥物順鉑的配制與給予

將安綽糖溶于pbs緩沖溶液，依據(jù)小鼠體重配制成20mg/kg和40mg/kg的 劑量，以經(jīng)口管喂方式給予，給予頻率為每天一次，持續(xù)28天。順鉑為水溶性溶液，每100毫升含有50mg的順鉑。給予小鼠順鉑的劑量為1mg/kg，經(jīng)換算大約一只小鼠每次要注射50μl，每周以腹腔注射給予小鼠順鉑，持續(xù)28天。同時(shí)每周測(cè)量2次小鼠體重。

腫瘤面積測(cè)量和肺臟與肝臟腫瘤轉(zhuǎn)移數(shù)目計(jì)數(shù)

癌細(xì)胞注射大約9天后，形成的原位腫瘤肉眼可見，利用卡方尺測(cè)量腫瘤最長(zhǎng)直徑及最短直徑，每周測(cè)量2次，腫瘤面積計(jì)算公式為π/4×長(zhǎng)×寬，小鼠犧牲后取下背部腫瘤、肺臟、肝臟、脾臟及腎臟，并測(cè)量各臟器重量，以肉眼計(jì)數(shù)肺臟及肝臟癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移數(shù)目。腫瘤及臟器儲(chǔ)存于-80℃冰箱或10％福爾馬林當(dāng)中備用。

細(xì)胞激素測(cè)定

以abc系統(tǒng)酵素免疫鏈接分析法(avidin-biotin-conjugatesystemelisa)測(cè)定。即以一級(jí)抗體(captureantibody)注入96孔微量孔盤(100μl/孔)中，置于室溫反應(yīng)4小時(shí)，或是4℃下反應(yīng)至隔日，以清洗緩沖液(washbuffer：含有0.05％tween20的pbs緩沖溶液,ph7.2-7.4)清洗三次去除多余未結(jié)合的一級(jí)抗體，再于每一孔加入150μl阻斷緩沖液(blockingbuffer：含有1％bsa的pbs緩沖溶液,ph7.2-7.4)，室溫靜置60分鐘以減少非特異性結(jié)合，再以清洗緩沖液清洗三次。清洗后，每個(gè)孔加入以稀釋液(reagentdiluents：含有1％bsa的pbs緩沖溶液,ph7.2-7.4)序列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品(standardsolution)和動(dòng)物血漿，室溫下反應(yīng)2個(gè)小時(shí)，再以清洗緩沖液清洗三次，每個(gè)孔加入100μl二級(jí)抗體(detectionantibody)在室溫下反應(yīng)2小時(shí)，反應(yīng)后以清洗緩沖液清洗三次去除多余未結(jié)合的二級(jí)抗體。于每個(gè)孔加入100μl稀釋200倍的山葵過氧化酵素(streptavidin-hrp)，避光靜置20分鐘，再以清洗緩沖液清洗三次去除未結(jié)合的山葵過氧化酵素，在每個(gè)孔加入100μl受質(zhì)溶液(為過氧化氫與3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺溶液(1:1，v/v)的混合物)，避光靜置，待其呈色后，每個(gè)孔加入50μl終止溶液(stopsolution：2nh2so4)終止反應(yīng)，以酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定波長(zhǎng)450nm的吸光值。利用標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，換算老鼠血漿中細(xì)胞激素的濃度。

免疫組織化學(xué)染色

自小鼠取下臟器組織，浸漬于10倍體積的10％福爾馬林緩沖溶液中固定，至于震蕩機(jī)上震蕩隔夜。固定后的組織以流動(dòng)的水沖洗30分鐘，依序?qū)⒔M織置入70％、80％、85％、90％及95％酒精中1小時(shí)進(jìn)行脫水，再浸漬于100％酒精中1.5小時(shí)，重復(fù)三次。再于二甲苯中置換兩次，于57℃液態(tài)石蠟中置換兩次，每次2小時(shí)。以液態(tài)石蠟將組織包埋成蠟塊并已組織切片機(jī)切成2μm后的切片，經(jīng)蘇木紫-伊紅染色后，以光學(xué)顯微鏡觀察切片。

血漿中尿素氮(bun)含量測(cè)定

小鼠犧牲前以眼窩采血收集血液，存放于含有k3edta抗凝血?jiǎng)┑碾x心管中，在4℃下以10,000×g離心10分鐘，以富士全自動(dòng)干式生化分析儀fujidri-chemfdc3500(fujitechnologies,japan)進(jìn)行分析，探針取上清液約20μl滴到專用的試片上。內(nèi)建化學(xué)分析儀和光反射密度的測(cè)量波長(zhǎng)為625nm，再利用內(nèi)建標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成bun濃度。

統(tǒng)計(jì)分析

經(jīng)由3次以上各別的實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到的平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以mean±sd表示，并使用spss統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行變異分析(anova)，當(dāng)f值<0.05時(shí)，以最小顯著差法leastsignificantdifference(lsd)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析比較組和組間的平均值是否有差異，當(dāng)p<0.05為具有顯著差異。

實(shí)施例1、安綽糖單獨(dú)使用或合并順鉑對(duì)于小鼠體重、肝臟及腎臟相對(duì)重量的影響

隨著飼養(yǎng)時(shí)間增加，各組小鼠體重均有增加的趨勢(shì)。到了第37天時(shí)，各組與腫瘤控制組相比，不具有顯著差異第圖1)。在相對(duì)體重部分，扣除犧牲后的腫瘤重量，結(jié)果顯示，各組體重于第37天與第0天相比有減少的現(xiàn)象，推測(cè)可能與癌癥惡病質(zhì)有關(guān)。此外各組小鼠相對(duì)體重與腫瘤控制組相比，不具有顯著差異(表1)。在肝臟及腎臟相對(duì)重量部分，將肝臟及腎臟重量除以小鼠體重所得，各組與腫瘤控制組相比，不具有顯著差異(表1)。

表1.安綽糖單獨(dú)使用或合并順鉑對(duì)于llc誘導(dǎo)腫瘤的c57bl/6小鼠體重、肝臟及腎臟相對(duì)重量的影響¹

¹腎癌細(xì)胞株llc(1×10⁵cells/100μl)以皮下注射方式注入c57bl/6小鼠背部，約9天后，可形成肉眼可見的原位腫瘤。

²相對(duì)體重：實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)測(cè)得的體重減去腫瘤重量所得。

³器官相對(duì)重量：器官除以小鼠個(gè)體重量的百分比。

實(shí)施例2、安綽糖單獨(dú)使用或合并順鉑藥物對(duì)于小鼠原位腫瘤面積及重量的影響

小鼠經(jīng)皮下注射llc誘發(fā)原位癌第9天后，每周測(cè)量2次腫瘤面積至第37天犧牲，結(jié)果如圖2所示；在腫瘤面積部分，結(jié)果顯示單獨(dú)給予安綽糖和順鉑的組別，不具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，在第37天其腫瘤面積與腫瘤控制組相比并無顯著差異；安綽糖(20mg/kg)合并順鉑(1mg/kg)，具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，在第37天其腫瘤體積與腫瘤控制組相比具有顯著差異，抑制率為35％(p<0.05)；安綽糖(40mg/kg)合并順鉑(1mg/kg)在腫瘤面積抑制率與腫瘤控制組相比為14％。在腫瘤重量部分，表1結(jié)果顯示，單獨(dú)給予安綽糖(20及40mg/kg)組別，與腫瘤控制組相比，不具有顯著降低腫瘤重量的作用；而單獨(dú)給予順鉑或是合并使用組別，與腫瘤控制組相比，可顯著降低腫瘤重量。

實(shí)施例3、安綽糖單獨(dú)使用或合并順鉑藥物對(duì)于小鼠肺臟與肝臟腫瘤轉(zhuǎn)移數(shù)目的影響

以肉眼計(jì)數(shù)在第37天犧牲的小鼠肺臟與肝臟腫瘤轉(zhuǎn)移情形。在肺臟腫瘤轉(zhuǎn)移數(shù)目部分結(jié)果顯示，單獨(dú)給予安綽糖(20及40mg/kg)可顯著抑制肺臟腫瘤轉(zhuǎn) 移數(shù)目，與腫瘤控制組相比，抑制率分別為58％(p<0.05)和63％(p<0.05)(圖3)；順鉑(1mg/kg)與腫瘤控制組，則無顯著差異(圖3)。在合并組別的部分，結(jié)果顯示安綽糖(20mg/kg)合并順鉑(1mg/kg)，可顯著降低肺臟腫瘤轉(zhuǎn)移數(shù)目，與腫瘤控制組相比，抑制率為47％(p<0.05)。而在安綽糖(40mg/kg)合并順鉑(1mg/kg)的組別，也具有顯著降低腫瘤生長(zhǎng)的作用，與腫瘤控制組相比，抑制率為67％(p<0.05)(圖3)。在肝臟腫瘤轉(zhuǎn)移數(shù)目部分，結(jié)果顯示，單獨(dú)給予安綽糖(20及40mg/kg)及順鉑(1mg/kg)可顯著抑制肝臟腫瘤轉(zhuǎn)移數(shù)目，與腫瘤控制組相比，抑制率分別為：90％(p<0.05)、85％(p<0.05)及81％(p<0.05)(第4圖)。在合并組別的部分，結(jié)果顯示安綽糖(20mg/kg)合并順鉑(1mg/kg)，可顯著降低肝臟腫瘤轉(zhuǎn)移數(shù)目，與腫瘤控制組相比，抑制率為92％(p<0.05)。而在安綽糖(40mg/kg)合并順鉑(1mg/kg)的組別，也具有顯著降低腫瘤生長(zhǎng)的作用，與腫瘤控制組相比，抑制率為99％(p<0.05)(圖4)。

實(shí)施例4、安綽糖單獨(dú)使用或合并順鉑藥物對(duì)于小鼠血漿中mmp-2、mmp-9和upa酵素活性的影響

在給藥28天后，利用酶譜法測(cè)定血漿中mmp-2、mmp-9和upa的酵素活性，upa、mmps與癌癥轉(zhuǎn)移有正相關(guān)性，結(jié)果顯示，以空白控制組血漿中mmp-2、mmp-9和upa的酵素活性定為100％，腫瘤控制組血漿中mmp-2、mmp-9和upa的酵素活性分別為191％(p<0.05)、183％(p<0.05)和167％(p<0.05)(圖5)。單獨(dú)給予安綽糖(20mg/kg)可顯著抑制mmp-2、mmp-9酵素活性，與腫瘤控制組相比，抑制率分別為17％(p<0.05)和48％(p<0.05)；單獨(dú)給予安綽糖(40mg/kg)亦顯著抑制mmp-2、mmp-9和upa酵素活性，與腫瘤控制組相比，抑制率分別為35％(p<0.05)、46％(p<0.05)和34％(p<0.05)(圖5)。同樣地，單獨(dú)給予順鉑(1mg/kg)也可顯著抑制mmp-2、mmp-9和upa酵素活性，與腫瘤控制組相比，抑制率分別為49％(p<0.05)、29％(p<0.05)和34％(p<0.05)(圖5)。在合并使用組別的部分，結(jié)果顯示，安綽糖(20mg/kg)合并順鉑(1mg/kg)，可顯著降低mmp-2、mmp-9和upa酵素活性，與腫瘤控制組相比，抑制率分別為53％(p<0.05)、36％(p<0.05)和45％(p<0.05)(圖5)。而安綽糖(40mg/kg)合并順鉑(1mg/kg)，可顯著降低mmp-9、mmp-2和upa酵素活性，與腫瘤控制組相比，抑制率分別為49％(p<0.05)(圖5)、51％(p<0.05)(圖5)和49％(p<0.05) (圖5)。

實(shí)施例5、安綽糖單獨(dú)使用或合并順鉑藥物對(duì)于小鼠肺臟及肝臟組織中mmp-2與mmp-9蛋白質(zhì)表現(xiàn)的影響

利用蛋白質(zhì)印跡法分析肺臟及肝臟組織中mmp-2與mmp-9蛋白質(zhì)表現(xiàn)。mmp-2蛋白質(zhì)表現(xiàn)結(jié)果如圖6所示，以空白控制組肺臟及肝臟中mmp-2蛋白質(zhì)表現(xiàn)量定為100％，腫瘤控制組肺臟及肝臟中mmp-2蛋白質(zhì)分別為345％(p<0.05)和313％(p<0.05)(圖6)。單獨(dú)給予安綽糖(20及40mg/kg)和順鉑(1mg/kg)的組別，可顯著抑制肺臟與肝臟組織中mmp-2的蛋白質(zhì)表現(xiàn)，與腫瘤控制組相比，在肺臟組織中，分別可抑制38％(p<0.05)、50％(p<0.05)及48％(p<0.05)；在肝臟組織中，分別可抑制32％(p<0.05)、46％(p<0.05)及45％(p<0.05)；在合并使用組別的部分，結(jié)果顯示安綽糖(20mg/kg)合并順鉑(1mg/kg)可顯著抑制肺臟及肝臟中mmp-2的蛋白質(zhì)表現(xiàn)，與腫瘤控制組相比，分別抑制48％(p<0.05)及44％(p<0.05)；而在安綽糖(40mg/kg)合并順鉑(1mg/kg)的組別，也可顯著抑制mmp-2的蛋白質(zhì)表現(xiàn)，與腫瘤控制組相比，在肺臟及肝臟抑制率分別為49％(p<0.05)及47％(p<0.05)。

mmp-9蛋白質(zhì)表現(xiàn)結(jié)果如圖7所示，以空白控制組肺臟及肝臟中mmp-9蛋白質(zhì)表現(xiàn)量定為100％，腫瘤控制組肺臟及肝臟中mmp-9蛋白質(zhì)分別為471％(p<0.05)和352％(p<0.05)；單獨(dú)給予安綽糖(20及40mg/kg)和順鉑(1mg/kg)的組別，可顯著抑制mmp-9的蛋白質(zhì)表現(xiàn)，跟腫瘤控制組相比，在肺臟組織中，分別可抑制47％(p<0.05)、52％(p<0.05)及55％(p<0.07)；在肝臟組織中，則分別可抑制45％(p<0.05)、41％(p<0.05)及41％(p<0.05)；在合并使用組別的部分，結(jié)果顯示安綽糖(20mg/kg)合并順鉑(1mg/kg)可顯著抑制肺臟及肝臟中mmp-9的蛋白質(zhì)表現(xiàn)，與腫瘤控制組相比，抑制率分別為64％(p<0.05)及49％(p<0.05)；而在安綽糖(40mg/kg)合并順鉑(1mg/kg)的組別可顯著抑制肺臟及肝臟中mmp-9的蛋白質(zhì)表現(xiàn)，與腫瘤控制組相比，抑制率分別為64％(p<0.05)及52％(p<0.05)。

實(shí)施例6、安綽糖單獨(dú)使用或合并順鉑藥物對(duì)于小鼠肺臟及肝臟組織中stat3磷酸化作用的影響

利用蛋白質(zhì)印跡法分析肺臟及肝臟組織中stat3磷酸化蛋白質(zhì)表現(xiàn)， stat3與癌細(xì)胞增生、轉(zhuǎn)移相關(guān)，結(jié)果顯示(圖8)以空白控制組肺臟及肝臟中stat3磷酸化蛋白質(zhì)表量現(xiàn)定為100％，腫瘤控制組肺臟及肝臟中stat3磷酸化蛋白質(zhì)分別為325％(p<0.05)和451％(p<0.05)；單獨(dú)給予安綽糖(20及40mg/kg)或順鉑(1mg/kg)，可顯著抑制肺臟組織中stat3磷酸化作用，與腫瘤控制組相比，分別可抑制20％(p<0.05)、58％(p<0.05)和65％(p<0.05)；在肝臟組織中，只有單獨(dú)給予安綽糖(40mg/kg)或順鉑(1mg/kg)可顯著抑制stat3磷酸化作用，與腫瘤控制組相比，分別抑制51％(p<0.05)和69％(p<0.05)；在合并使用組別的部分，結(jié)果顯示安綽糖(20mg/kg)合并順鉑(1mg/kg)可顯著抑制肺臟和肝臟中stat3磷酸化，與腫瘤控制組相比，在肺臟及肝臟可抑制65％(p<0.05)；而在安綽糖(40mg/kg)合并順鉑(1mg/kg)的組別，也可顯著抑制肺臟及肝臟中stat3磷酸化，與腫瘤控制組相比，抑制率為65％(p<0.05)及70％(p<0.05)。

實(shí)施例7、安綽糖單獨(dú)使用或合并順鉑藥物對(duì)于小鼠肝臟及肺臟組織中mapk磷酸化作用的影響

mapk包含細(xì)胞外訊號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellularsignal-regulatedkinase,erk)、c-jun胺基末端激酶(c-junn-terminalkinase,jnk)或p38，mapk可促進(jìn)癌細(xì)胞增生、存活及轉(zhuǎn)移。erk1/2：利用蛋白質(zhì)印跡法分析肺臟及肝臟組織中erk1/2磷酸化蛋白質(zhì)表現(xiàn)，結(jié)果顯示(圖9)以空白控制組肺臟及肝臟中erk1/2磷酸化蛋白質(zhì)表量現(xiàn)定為100％，腫瘤控制組肺臟及肝臟中erk1磷酸化蛋白質(zhì)分別為193％(p<0.05)和184％(p<0.05)，erk2磷酸化蛋白質(zhì)分別為194％(p<0.05)和184％(p<0.05)；單獨(dú)給予安綽糖(20及40mg/kg)和順鉑(1mg/kg)的組別，可顯著抑制erk1/2的磷酸化，在肺臟組織中，p-erk1抑制率分別為35％(p<0.05)、51％(p<0.05)及44％(p<0.05)，p-erk2抑制率分別為30％(p<0.05)、51％(p<0.05)及38％(p<0.05)；在肝臟組織中，p-erk1抑制率分別為16％(p<0.05)、32％(p<0.05)及45％(p<0.05)，p-erk2抑制率分別為12％(p<0.05)、22％(p<0.05)及24％(p<0.05)；在合并組別的部分，安綽糖(20mg/kg)合并順鉑(1mg/kg)可顯著抑制erk1/2的磷酸化，與腫瘤控制組相比，在肺臟組織中，p-erk1抑制率為48％(p<0.05)，p-erk2抑制率為44％(p<0.05)；在肝臟組織中p-erk1抑制率為44％(p<0.05)，p-erk2抑制率為42％(p <0.05)；在安綽糖(40mg/kg)合并順鉑(1mg/kg)的組別，也可顯著抑制erk1/2磷酸化，與腫瘤控制組相比，在肺臟組織中，p-erk1抑制率為46％(p<0.05)，p-erk2抑制率為47％(p<0.05)；在肝臟組織中p-erk1抑制率為45％，p-erk2抑制率為47％(p<0.05)。

jnk1/2：利用蛋白質(zhì)印跡法分析肺臟及肝臟組織中jnk1/2磷酸化蛋白質(zhì)表現(xiàn)。結(jié)果顯示(圖10)以空白控制組肺臟及肝臟中jnk1/2磷酸化蛋白質(zhì)表量現(xiàn)定為100％，腫瘤控制組肺臟及肝臟中jnk2磷酸化蛋白質(zhì)分別為207％(p<0.05)和174％(p<0.05)，jnk1磷酸化蛋白質(zhì)分別為208％(p<0.05)和174％(p<0.05)；單獨(dú)給予安綽糖(20及40mg/kg)和順鉑(1mg/kg)的組別，可顯著抑制jnk1/2的磷酸化，在肺臟組織中，p-jnk2抑制率分別為45％(p<0.05)、50％(p<0.05)及45％(p<0.05)，p-jnk1抑制率分別為46％(p<0.05)、49％(p<0.05)及47％(p<0.05)；在肝臟組織中，p-jnk2抑制率分別為37％(p<0.05)、37％(p<0.05)及28％(p<0.05)，p-jnk1抑制率分別為25％(p<0.05)、28％(p<0.05)及25％(p<0.05)；在合并使用組別的部分，安綽糖(20mg/kg)合并順鉑(1mg/kg)可顯著抑制jnk1/2的磷酸化，與腫瘤控制組相比，在肺臟組織中，pjnk2和p-jnk1抑制率為47％(p<0.05)；在肝臟組織中p-jnk2抑制率為37％(p<0.05)，p-jnk1抑制率為31％(p<0.05)；而在安綽糖(40mg/kg)合并順鉑(1mg/kg)的組別，也可顯著抑制jnk1/2磷酸化，與腫瘤控制組相比，在肺臟組織中，p-jnk2和p-jnk1抑制率為46％(p<0.05)；在肝臟組織中p-jnk2抑制率為36％，p-jnk1抑制率為31％(p<0.05)。

p38：利用蛋白質(zhì)印跡法分析肺臟及肝臟組織中p38磷酸化蛋白質(zhì)表現(xiàn)(圖11)，以空白控制組肺臟及肝臟中p38磷酸化蛋白質(zhì)表量現(xiàn)定為100％，腫瘤控制組肺臟及肝臟中p38磷酸化蛋白質(zhì)分別為189％(p<0.05)和156％(p<0.05)；單獨(dú)給予安綽糖(20及40mg/kg)或順鉑(1mg/kg)，可顯著抑制肺臟組織中p-38磷酸化作用，與腫瘤控制組相比，分別可抑制31％(p<0.05)、39％(p<0.05)和40％(p<0.05)；在肝臟組織中，單獨(dú)給予安綽糖(40mg/kg)或順鉑(1mg/kg)可顯著抑制p-38磷酸化作用，與腫瘤控制組相比，抑制率均為26％(p<0.05)；在合并使用組別，安綽糖(20mg/kg)合并順鉑(1mg/kg)可顯著抑制肺臟和肝臟中p-38磷酸化，與腫瘤控制組相比，在肺臟及肝臟可抑制45％(p<0.05)和24％ (p<0.05)。而在安綽糖(40mg/kg)合并順鉑(1mg/kg)的組別，也可顯著抑制肺臟及肝臟中p-38磷酸化，與腫瘤控制組相比，抑制率為44％(p<0.05)及28％(p<0.05)。

實(shí)施例8、安綽糖單獨(dú)使用或合并順鉑藥物對(duì)于小鼠血漿細(xì)胞激素的影響

il-6會(huì)促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)，各施藥組別小鼠血漿中il-6濃度如表2所示，腫瘤控制組其血漿中il-6濃度與空白試驗(yàn)組相比，可顯著增加，濃度分別為135±3和293±9pg/ml；單獨(dú)給予安綽糖(20及40mg/kg)的組別，與腫瘤控制組相比，血漿中il-6濃度顯著降低，且回復(fù)到與空白試驗(yàn)組相當(dāng)，分別為179±3及169±38pg/ml；單獨(dú)給予順鉑(1mg/kg)的組別，與腫瘤控制組相比則無顯著差異；在合并組別的部分，安綽糖(20,40mg/kg)合并順鉑(1mg/kg)的組別，與腫瘤控制組相比，顯著降低血漿中il-6濃度，且回復(fù)到與空白試驗(yàn)組相當(dāng)，分別為172±18及173±36pg/ml。

表2.安綽糖單獨(dú)使用或合并順鉑對(duì)于llc誘導(dǎo)腫瘤的c57bl/6小鼠il-6與ifn-γ的影響¹

¹腎癌細(xì)胞株llc(1×10⁵cells/100μl)以皮下注射方式注入c57bl/6小鼠背部，約9天后，可形成肉眼可見的原位腫瘤。

腫瘤控制組其血漿中ifn-γ濃度與空白試驗(yàn)組相比(表2)，可顯著增加，濃度分別為534±221和2410±450pg/ml。單獨(dú)給予安綽糖(40mg/kg)的組別，與腫瘤控制組相比，血漿中ifn-γ濃度顯著增加，濃度為4872±482。而單獨(dú)給予順鉑(1mg/kg)的組別，與腫瘤控制組相比則無顯著差異；在合并使用組別的部分，安綽糖(20,40mg/kg)合并順鉑(1mg/kg)的組別，與腫瘤控制組相比，無顯著差異。

實(shí)施例9、安綽糖單獨(dú)使用或合并順鉑藥物對(duì)于小鼠肝臟及肺臟組織的影響

以蘇木素-伊紅將肺臟與肝臟組織進(jìn)行染色后，在肺臟切片中，腫瘤控制組、安綽糖(20,40mg/kg)、順鉑(1mg/kg)及安綽糖(20,40mg/kg)合并順鉑組別均發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞藉由血管及淋巴管進(jìn)入肺臟組織并在肺臟組織中生長(zhǎng)。在腫瘤控制組具多發(fā)性腫瘤現(xiàn)象，單獨(dú)給予安綽糖(20,40mg/kg)及合并順鉑(1mg/kg)能顯著減少肺臟腫瘤生成。在肝臟切片中，腫瘤控制組、安綽糖(20,40mg/kg)、順鉑(1mg/kg)及安綽糖(20mg/kg)合并cisplatin組別均發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞藉由血管及淋巴管進(jìn)入肝臟組織并在肝臟組織中生長(zhǎng)，而安綽糖(40mg/kg)合并順鉑組的肝臟則是沒有發(fā)現(xiàn)腫瘤。

實(shí)施例10、安綽糖單獨(dú)使用或合并順鉑藥物對(duì)于小鼠血漿中尿素氮的影響

小鼠經(jīng)皮下注射llc1誘發(fā)原位癌第37天后犧牲，利用眼窩采血收集老鼠血液并離心取其血漿，測(cè)定血漿中尿素氮(bun)的含量，bun是蛋白質(zhì)的代謝產(chǎn)物，bun過高表示腎功能異常。結(jié)果顯示(圖12)腫瘤控制組其血漿中bun濃度與空白試驗(yàn)組相比，腫瘤控制組顯著增加血漿中bun含量；與腫瘤控制組相比，單獨(dú)給予安綽糖(20,40mg/kg)的組別，血漿中bun沒有顯著性增加，而順鉑(1mg/kg)的組別顯著性增加血漿中bun含量(101.7±25.0mg/dl)(p<0.05)；在合并組別的部分，結(jié)果顯示，與順鉑(1mg/kg)的組別相比，安綽糖(20,40mg/kg)合并順鉑(1mg/kg)可顯著降低且血漿bun含量，分別為46.3±19.0及40.8±7.1mg/dl，與順鉑(1mg/kg)的組別相比具有顯著差異。

實(shí)施例11、安綽糖單獨(dú)使用或合并順鉑藥物對(duì)于小鼠腎臟組織的影響

以蘇木素-伊紅將腎臟組織進(jìn)行染色后，在腎臟切片中，腫瘤控制組及單獨(dú)給予安綽糖(20,40mg/kg)及單獨(dú)給予順鉑(1mg/kg)組別均發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞藉由血管及淋巴管進(jìn)入腎臟組織中生長(zhǎng)；安綽糖(20,40mg/kg)及合并順鉑(1mg/kg)則是沒有發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)。

實(shí)施例12、安綽糖單獨(dú)使用或合并順鉑藥物對(duì)于小鼠腎臟組織中p38磷酸化作用的影響

小鼠經(jīng)皮下注射llc1誘發(fā)原位癌第37天后犧牲，取下腎臟均質(zhì)后利用蛋白質(zhì)印跡法分析腎臟組織中p-38磷酸化。結(jié)果顯示(圖13)以空白控制組腎臟中p38磷酸化蛋白質(zhì)表量現(xiàn)定為100％，腫瘤控制組腎臟中p38磷酸化蛋白質(zhì)表現(xiàn)量為193％(p<0.05)；單獨(dú)給予安綽糖(20,40mg/kg)可顯著抑制p-38的磷酸化， 與腫瘤控制組相比，在腎臟中可抑制13％及22％(p<0.05)，而順鉑(1mg/kg)的組別與腫瘤控制組沒有顯著差異。在合并組別的部分，結(jié)果顯示安綽糖(20,40mg/kg)合并順鉑(1mg/kg)可顯著降低p-38磷酸化，與腫瘤控制組相比，在腎臟可抑制30％(p<0.05)及37％(p<0.05)。

安綽糖抑制腫瘤轉(zhuǎn)移數(shù)量及原位腫瘤生長(zhǎng)的機(jī)制如圖14所示，安綽糖降低血漿中尿激酶型血纖維蛋白溶解酶原活化因子(urokinase-typeplasminogenactivator,upa)與基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases,mmps)-2與-9的酵素活性；安綽糖降低信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3(signaltransducerandactivatoroftranscription3,stat3)、降低有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,mapk)包括細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellularregulatedproteinkinases,erk)、c-jun氨基末端激酶(c-junn-terminalkinase,jnk)及p38的磷酸化作用與mmp-2及mmp-9的蛋白質(zhì)表現(xiàn)；安綽糖減少血漿中介白素-6(il-6)含量及增加血漿中ifn-γ含量。安綽糖改善順鉑造成的腎毒性，有效減少小鼠血漿中尿素氮含量及降低腎臟中p38磷酸化作用。

上列詳細(xì)說明是針對(duì)本發(fā)明的可行實(shí)施例的具體說明，惟該實(shí)施例并非用以限制本發(fā)明的專利范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所為的等效實(shí)施或變更，均應(yīng)包含于本案的專利范圍中。

上述多項(xiàng)功效，實(shí)屬充分符合新穎性及進(jìn)步性的法定專利要件，依法提出申請(qǐng)，懇請(qǐng)貴局核準(zhǔn)本件發(fā)明專利申請(qǐng)案，以勵(lì)發(fā)明。