本發(fā)明屬于藥物領(lǐng)域并且涉及特別用于加速創(chuàng)面愈合的藥物，其含有具備檀香氣味的化合物。

背景技術(shù)：

創(chuàng)面愈合是指通過最大程度上復(fù)原受損身體組織封閉創(chuàng)面的身體內(nèi)生過程。這是一種在受傷僅幾分鐘后就已經(jīng)開始的自然生物過程，如可通過酶組織化學(xué)方法確定。血小板到達(dá)受傷區(qū)域并嘗試封閉創(chuàng)面。在有些情況下通過滲出物(分泌流體)結(jié)痂，其通常引起伴隨創(chuàng)面愈合的發(fā)癢。

創(chuàng)面愈合分為不同的階段。在損傷血管通過凝血封閉以后，最初不會(huì)發(fā)生宏觀或微觀上可見的反應(yīng)。第一潛伏階段過渡為滲出階段，在該階段異物和細(xì)菌通過創(chuàng)面分泌物的滲出被洗出創(chuàng)面。參與這一階段的主要是免疫系統(tǒng)的細(xì)胞和激素，不僅殺死侵入的細(xì)菌或病毒，而且促進(jìn)了愈合過程。凝血形成過程中形成血纖蛋白網(wǎng)，其使得相鄰的創(chuàng)面邊緣相互黏合。清澈的由血清構(gòu)成的創(chuàng)面分泌物中混有炎癥細(xì)胞。在該階段進(jìn)展過程中創(chuàng)面區(qū)域的有絲分裂增多。在創(chuàng)面區(qū)域單核白血球成長(zhǎng)為巨噬細(xì)胞，其清除了細(xì)胞碎片和血栓。由滲入以及在創(chuàng)面邊緣的結(jié)締組織細(xì)胞產(chǎn)生并通過細(xì)胞分裂增殖的成纖維細(xì)胞在下一階段進(jìn)行真正的構(gòu)建工作。

在接下來(lái)的肉芽形成階段創(chuàng)面缺損通過新的結(jié)締組織增多地填充。在創(chuàng)面缺損細(xì)胞豐富的填充時(shí)，血纖蛋白網(wǎng)通過纖溶酶分解(纖溶)。血管化，即血管數(shù)量增多，通過毛細(xì)血管生長(zhǎng)實(shí)現(xiàn)。成纖維細(xì)胞產(chǎn)生含有己糖胺的酸性粘多糖，其用作結(jié)締組織的細(xì)胞外底物，并通過細(xì)胞內(nèi)的初始階段形成細(xì)胞外的膠原結(jié)締組織纖維。時(shí)間進(jìn)程非常復(fù)雜并且受到很多生長(zhǎng)因子(細(xì)胞因子)的影響。

最后在再生階段創(chuàng)面表面通過上皮形成封閉。形成良好肉芽的創(chuàng)面的直徑三分子一僅通過萎縮封閉，三分之二通過表皮細(xì)胞的新生或細(xì)胞分裂以及借助纖維蛋白由創(chuàng)面邊緣向創(chuàng)面中部的細(xì)胞遷移封閉。其下的肉芽組織形成增多地膠原纖維，由此所有皮膚層的重建基本完成。疤痕組織強(qiáng)度的進(jìn)一步增強(qiáng)取決于膠原纖維的結(jié)網(wǎng)、固化和取向。組織的含水量減少，則最初稍微高出皮膚層的疤痕通常萎縮至低于皮膚層。疤痕組織的血管化同樣減少。最初新鮮紅色的疤痕變白。

現(xiàn)有技術(shù)中已知大量促進(jìn)創(chuàng)面愈合的藥物活性成分。例如氨基噻唑(EP 0967980 B1)、(EP 1070058 B1)、氰基鄰氨基苯甲酰胺(EP 1387838 B1)、抗胰糜蛋白酶多肽(EP 1392354 B1)或聯(lián)吡啶二氫吡唑(EP 1877396 B1)。這些物質(zhì)的作用機(jī)制完全不同：覆蓋從分泌生長(zhǎng)因子或特殊的白細(xì)胞介素，抑制HIF‐脯氨酰基‐4‐羥化酶，至產(chǎn)生整聯(lián)受體拮抗劑。

同樣參考以下文獻(xiàn)：

US 5,759,556 A(CHESEBROUGH)的主題是皮膚護(hù)理劑，其含有0.001‐10％視黃醇、0.0001‐50％脂環(huán)族不飽和化合物(例如婆羅門檀香(Brahmanol))，和化妝品可接受載體。該制劑用于治療銀屑病。

WO 2008/068683 A1(FIRMENICH)涉及香料組合物，其含有抗微生物關(guān)鍵成分和任選至少一種常用的香料成分(例如檀香醇(Sandalore)和婆羅門檀香(Brahmanol))，其中抗微生物關(guān)鍵成分含有3,4‐二甲基苯酚和一種或多種抗微生物香料成分，其抑制兩種或多種菌株的各自最小抑制濃度為1000ppm或更小，所述菌株選自具核梭桿菌(Fusobacterium Nucleatum)、Fusobacterium sp.、牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas Gingivalis)、中間普氏菌(Prevotella Intermedia)、克雷伯氏肺炎菌(Klebsiella Pneumoniae)、產(chǎn)堿韋榮菌(Veillonella Alcalescens)、產(chǎn)黑色素?cái)M桿菌(Bacteroides Melaninogenicus)/福賽斯擬桿菌(Bacteroides forsythus)、生痰新月形單胞菌(Selenomonas Sputagena)、牙髓卟啉單胞菌(Porphyromonas Endodontalis)、產(chǎn)黑色素普氏菌(Prevotella Melaninogenica)和變形鏈球菌(Streptococcus Mutans)。這些制劑用于治療牙周炎。

由WO 2009/153572 A1(UNIV ABERYSTWITH)已知使用檀香木提取物或檀香木油成分的類似物(例如檀香醇)作為動(dòng)物飼料的添加劑，從而減少反芻動(dòng)物和馬消化系統(tǒng)中致病菌的生長(zhǎng)。

長(zhǎng)久以來(lái)檀香木油被認(rèn)為是促進(jìn)創(chuàng)面愈合的天然物質(zhì)。由熱帶檀香木通過水蒸汽蒸餾得到的精油含有多種單一性能目前仍未知的物質(zhì)。特別地，哪種成分具備消炎作用仍未知。應(yīng)當(dāng)注意由于作為香水原料的廣泛使用，天然檀香木油已經(jīng)成為一種稀少并且非常昂貴的原料。

因此本發(fā)明的任務(wù)是確定檀香木油的消炎成分，并以這種方式生產(chǎn)加速創(chuàng)面愈合的藥物，其特別有益于創(chuàng)面愈合并且刺激細(xì)胞增殖以及白細(xì)胞介素IL‐1α的表達(dá)和分泌。確定該活性成分可以同時(shí)為合成這種物質(zhì)奠定基礎(chǔ)，從而保護(hù)自然資源并有助于保護(hù)自然多樣性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及含有式(I)衍生物的藥物

其中R¹是氫或甲基，用于加速創(chuàng)面愈合。

式(I)衍生物優(yōu)選具備檀香木氣味的香料如(R¹＝甲基)或(R¹＝氫)。兩種物質(zhì)均市售可得并且到目前為止僅用作具備檀香氣味的香味物質(zhì)。

令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，沒有任何一種檀香木油的已知成分在測(cè)試條件下表現(xiàn)出消炎或加速創(chuàng)面愈合。反之，這兩種合成物質(zhì)檀香醇和婆羅門檀香，其與檀香木油成分具備相似的結(jié)構(gòu)關(guān)系，并且也具備類檀香木的氣味，被確認(rèn)為是特別位于皮膚的嗅覺受體OR2AT4的唯一激動(dòng)劑，并且也是唯一能夠激活該受體的激動(dòng)劑。在鈣成像實(shí)驗(yàn)中80至90％的HaCaT‐細(xì)胞樣品以及原代角質(zhì)形成細(xì)胞被這兩種物質(zhì)重復(fù)刺激，鈣信號(hào)表現(xiàn)出顯著的致敏作用，以及每次施用后信號(hào)幅度增大。

隨著激活受體和引發(fā)信號(hào)級(jí)聯(lián)放大HaCaT‐細(xì)胞增殖和遷移增多。由此表現(xiàn)出這兩種物質(zhì)刺激MAP‐激酶p38和Erk1/2的磷酸化，其參與表皮創(chuàng)面愈合。在體外創(chuàng)面‐劃痕‐試驗(yàn)中顯示，當(dāng)用500μM Sandalore或Brahmanol處理細(xì)胞，HaCaT‐細(xì)胞的劃痕封閉快26％，角質(zhì)形成細(xì)胞快34％。

最后該結(jié)果確定，通過兩種合成的檀香木香味物質(zhì)提高到了IL‐1α的表達(dá)和分泌，并且活化了參與人類角質(zhì)形成細(xì)胞的分化過程的蛋白質(zhì)激酶Akt。

這一發(fā)現(xiàn)更令人驚異在于兩種非檀香木油成分的合成物質(zhì)僅是為了參考目的而進(jìn)行測(cè)試。

由該結(jié)果可以毫無(wú)疑義地的推斷，使用和/或優(yōu)選通過局部應(yīng)用于皮膚，可以加快創(chuàng)面愈合，即，通過活化受體OR2AT4以及由此引發(fā)的刺激MAP‐激酶磷酸化后的細(xì)胞增殖和遷移，和提高的白細(xì)胞介素IL‐1α‐分泌。

藥物

根據(jù)本發(fā)明的藥物通常局部使用。因此可以是洗劑、霜?jiǎng)?、乳劑、凝膠劑、膏劑、噴霧劑。也可以是用所述制劑浸漬或涂布的相應(yīng)敷料，如膏藥。

活性成分相對(duì)于最終藥物制劑(活性成分加上藥物可用的載體和任選添加劑)的濃度為0.001至約2重量％，優(yōu)選約0.01至約1重量％并且特別是約0.1至約0.5重量％。

該藥物可以含有其他典型助劑和添加劑，如溫和的表面活性劑、油體、乳化劑、珠光蠟、粘度調(diào)節(jié)劑、增稠劑、富脂劑、穩(wěn)定劑、聚合物、硅氧烷化合物、脂肪、蠟、卵磷脂、磷脂、UV防曬因子、潤(rùn)滑劑、生物活性成分、抗氧化劑、助水溶劑、增溶劑、防腐劑、芳香油、染料等。

表面活性劑

作為表面活性劑的物質(zhì)可以是陰離子、非離子、陽(yáng)離子和/或兩性或兩性離子表面活性劑，其含量通常為約1至70，優(yōu)選5至50，并且特別是10至30重量％。陰離子表面活性劑的典型實(shí)例為肥皂、烷基苯磺酸鹽、烷烴磺酸鹽、烯烴磺酸鹽、烷基醚磺酸鹽、甘油醚磺酸鹽、α‐甲酯磺酸鹽、磺基脂肪酸、烷基硫酸鹽、烷基醚硫酸鹽、甘油醚硫酸鹽、脂肪酸醚硫酸鹽、羥基混合醚硫酸鹽、單甘油酯(醚)硫酸鹽、脂肪酸酰胺(醚)硫酸鹽、單‐和二烷基磺基丁二酸鹽、單‐和二烷基磺基琥珀酰胺酸鹽、磺基甘油三酯、酰胺皂、醚羧酸及其鹽、脂肪酸羥乙磺酸鹽、脂肪酸肌氨酸鹽、脂肪酸?；撬猁}、N‐酰氨酸，例如?；樗猁}、?；剖猁}、?；劝彼猁}和酰基天冬氨酸鹽、烷基低聚葡糖苷硫酸鹽、蛋白質(zhì)脂肪酸縮合物(特別是小麥基植物產(chǎn)品)和烷基(醚)磷酸鹽。如果陰離子表面活性劑含有聚乙二醇醚鏈，則它們可具有常規(guī)的同族分布，但優(yōu)選具有窄同族分布。非離子表面活性劑的典型實(shí)例是脂肪醇聚乙二醇醚、烷基酚聚乙二醇醚、脂肪酸聚乙二醇酯、脂肪酸酰胺聚乙二醇醚、脂肪胺聚乙二醇醚、烷氧基化三甘油酯、混合醚或混合的甲醛縮二甲醇、任選部分氧化的烷基(烯基)寡葡糖苷或葡糖醛酸衍生物、脂肪酸‐N‐烷基葡糖酰胺、蛋白水解產(chǎn)物(尤其是基于小麥的植物產(chǎn)物)、多元醇脂肪酸酯、糖酯、脫水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯和胺基氧化物。如果非離子表面活性劑含有聚乙二醇醚鏈，則它們可具有常規(guī)的同族分布，但優(yōu)選具有窄同族分布。陽(yáng)離子表面活性劑的典型實(shí)例是季銨化合物，如二甲基二硬脂基氯化銨和酯季銨鹽，特別是季銨化的脂肪酸三鏈烷醇胺酯鹽。兩性或兩性離子表面活性劑的典型實(shí)例是烷基甜菜堿、烷基酰氨基甜菜堿、氨基丙酸鹽、氨基甘氨酸鹽、咪唑啉鎓甜菜堿和磺基甜菜堿。上述表面活性劑指的都是已知的化合物。特備適當(dāng)?shù)臏睾?，即?duì)皮膚特別溫和的表面活性劑的典型實(shí)例是脂肪醇聚乙二醇醚硫酸鹽、單酸甘油酯硫酸鹽、單和/或雙烷基磺基丁二酸酯、脂肪酸羥乙磺酸鹽、脂肪酸肌氨酸鹽、脂肪酸牛磺酸鹽、脂肪酸谷氨酸鹽、α‐烯屬磺酸酯、醚羧酸、烷基寡葡聚糖苷、脂肪酸葡糖酰胺、烷基酰氨基甜菜堿、兩性縮醛(amphoacetals)和/或蛋白質(zhì)脂肪酸縮合物，其中蛋白質(zhì)脂肪酸縮合物優(yōu)選基于小麥蛋白。

油體

油體是，例如，基于含有6至18個(gè)，優(yōu)選8至10個(gè)碳原子的脂肪醇的Guerbet醇，直鏈C₆‐C₂₂‐脂肪酸與直鏈或支鏈C₆‐C₂₂‐脂肪醇的酯或支鏈C₆‐C₁₃‐羧酸與直鏈或支鏈C₆‐C₂₂‐脂肪醇的酯，如例如肉豆蔻酸十四烷酯、棕櫚酸十四烷酯、硬脂酸十四烷酯、異硬脂酸十四烷酯、油酸十四烷酯、山崳酸十四烷酯、芥酸十四烷酯、肉豆蔻酸十六烷酯、棕櫚酸十六烷酯、硬脂酸十六烷酯、異硬脂酸十六烷酯、油酸十六烷酯、山崳酸十六烷酯、芥酸十六烷酯、肉豆蔻酸十八烷酯、棕櫚酸十八烷酯、硬脂酸十八烷酯、異硬脂酸十八烷酯、油酸十八烷酯、山崳酸十八烷酯、芥酸十八烷酯、肉豆蔻酸異十八烷酯、棕櫚酸異十八烷酯、硬脂酸異十八烷酯、異硬脂酸異十八烷酯、油酸異十八烷酯、山崳酸異十八烷酯、油酸異十八烷酯、肉豆蔻酸油醇酯、棕櫚酸油醇酯、硬脂酸油醇酯、異硬脂酸油醇酯、油酸油醇酯、山崳酸油醇酯、芥酸油醇酯、肉豆蔻酸二十二烷酯、棕櫚酸二十二烷酯、硬脂酸二十二烷酯、異硬脂酸二十二烷酯、油酸二十二烷酯、山崳酸二十二烷酯、芥酸二十二烷酯、肉豆蔻酸芥醇酯、棕櫚酸芥醇酯、硬脂酸芥醇酯、異硬脂酸芥醇酯、油酸芥醇酯、山崳酸芥醇酯和芥酸芥醇酯。同樣適當(dāng)?shù)氖侵辨淐₆‐C₂₂‐脂肪酸與支鏈醇，特別是2‐乙基己醇的酯、C₁₈‐C₃₈‐烷基羥基羧酸與直鏈或支鏈C₆‐C₂₂‐脂肪醇的酯，特別是蘋果酸二辛酯、直鏈和/或支鏈脂肪酸與多元醇(如，例如丙二醇、二聚二元醇(dimerdiol)或三聚三元醇(trimertriol))和/或Guerbet醇的酯、基于C₆‐C₁₀‐脂肪酸的甘油三酯、基于C₆‐C₁₈‐脂肪酸的液態(tài)單‐/二‐/三酸甘油酯混合物、C₆‐C₂₂‐脂肪醇和/或Guerbet醇與芳族羧酸，特別是苯甲酸的酯、C₂‐C₁₂‐二羧酸與具有1至22個(gè)碳原子的直鏈或支鏈醇或者具有2至10個(gè)碳原子和2至6個(gè)羥基的多元醇的酯、植物油、支鏈伯醇、取代環(huán)己烷、直鏈和支鏈C₆‐C₂₂‐脂肪醇的碳酸酯，如例如碳酸二辛酯( CC)、基于具有6至18個(gè)優(yōu)選8至10個(gè)碳原子的脂肪醇的Guerbet碳酸酯、苯甲酸與直鏈和/或支鏈C₆‐C₂₂‐醇的酯(例如 TN)、每個(gè)烷基具有6至22個(gè)碳原子的直鏈或支鏈、對(duì)稱或非對(duì)稱的二烷基醚，如例如二辛基醚( OE)、環(huán)氧化脂肪酸酯與多元醇的開環(huán)產(chǎn)物、硅油(環(huán)聚二甲基硅氧烷、硅酮甲基硅油類，等)和/或脂肪烴或環(huán)烷烴，如例如角鯊?fù)?、角鯊烯或二烷基環(huán)己烷。

乳化劑

乳化劑可以是例如選自至少下組之一的非離子表面活性劑

·2至30摩爾環(huán)氧乙烷和/或0至5摩爾環(huán)氧丙烷與直鏈C8‐22脂肪醇、與C12‐22脂肪酸、與烷基中具有8‐15個(gè)碳原子的烷基苯酚以及烷基中具有8‐22個(gè)碳原子的烷基胺的加成產(chǎn)物；

·在烷(烯)基中具有8至22個(gè)碳原子的烷基和/或烯基低聚苷及其乙氧基化類似物；

·1至15摩爾環(huán)氧乙烷與蓖麻油和/或氫化蓖麻油的加成產(chǎn)物；

·15至60摩爾環(huán)氧乙烷與蓖麻油和/或氫化蓖麻油的加成產(chǎn)物；

·甘油和/或脫水山梨糖醇與含有12至22個(gè)碳原子的不飽和、直鏈或飽和、支化脂肪酸和/或含有3至18個(gè)碳原子的羥基羧酸的偏酯及其與1至30mol環(huán)氧乙烷的加成產(chǎn)物；

·聚甘油(平均自縮合度為2‐8)、聚乙二醇(分子量為400‐5000)、三羥甲基丙烷、季戊四醇、糖醇(如山梨糖醇)、烷基葡糖苷(如甲基葡糖苷、丁基葡糖苷、月桂基葡糖苷)和聚葡糖苷(如纖維素)與含有12至22個(gè)碳原子的飽和和/或不飽和、直鏈或支化脂肪酸和/或含有3‐18個(gè)碳原子的羥基羧酸的偏酯及其與1至30mol環(huán)氧乙烷的加成產(chǎn)物；

·季戊四醇、脂肪酸、檸檬酸與脂肪醇的混合酯和/或含有6至22個(gè)碳原子的脂肪酸、甲基葡萄糖與多元醇，優(yōu)選甘油或聚甘油的混合酯；

·磷酸單烷基酯、磷酸二烷基酯和磷酸三烷基酯和磷酸單PEG烷基酯、磷酸二PEG烷基酯、磷酸三PEG烷基酯及其鹽；

·羊毛蠟醇；

·聚硅氧烷‐聚烷基‐聚醚共聚物和相應(yīng)的衍生物；

·嵌段共聚物，如聚乙二醇30二聚羥基硬脂酸酯；

·聚合物乳化劑，如獲自Goodrich的Pemulen型(TR‐1，TR‐2)或Cognis的SP；

·聚亞烷基二醇；和

·碳酸甘油酯。

以下詳細(xì)給出特別適當(dāng)?shù)娜榛瘎?/p>

烷氧基化合物。環(huán)氧乙烷和/或環(huán)氧丙烷在脂肪醇、脂肪酸、烷基苯酚或蓖麻油上的加成產(chǎn)物是市售可得的產(chǎn)品。在這里是指同系混合物，其平均烷氧基化度相當(dāng)于進(jìn)行加成反應(yīng)的環(huán)氧乙烷和/或環(huán)氧丙烷和基質(zhì)的用量比例。環(huán)氧乙烷與甘油加成產(chǎn)物的C_12/18脂肪酸單酯和二酯已知作為回脂劑用于化妝制劑。

烷基‐和/或烯基低聚苷。烷基‐和/或烯基低聚苷的生產(chǎn)和使用在現(xiàn)有技術(shù)中已知。尤其通過使用葡萄糖或具有8至18個(gè)碳原子的伯醇的低聚糖進(jìn)行生產(chǎn)。對(duì)于糖苷基團(tuán)，適合的不僅可以是單糖苷，其中環(huán)狀糖基與脂肪醇通過糖苷鍵連接，而且也可以是低聚度優(yōu)選為約8的低聚糖苷。低聚度是統(tǒng)計(jì)平均值，是對(duì)于這類技術(shù)產(chǎn)物常規(guī)的同系物分布的基礎(chǔ)。

偏甘油酯。適當(dāng)?shù)钠视王サ牡湫蛯?shí)例是羥基硬脂酸單甘油酯、羥基硬脂酸二甘油酯、異硬脂酸單甘油酯、異硬脂酸二甘油酯、油酸單甘油酯、油酸二甘油酯、蓖麻酸單甘油酯、蓖麻酸二甘油酯、亞油酸單甘油酯、亞油酸二甘油酯、亞油酸單甘油酯、亞油酸二甘油酯、芥酸單甘油酯、芥酸二甘油酯、酒石酸單甘油酯、酒石酸二甘油酯、檸檬酸單甘油酯、檸檬酸二甘油酯、蘋果酸單甘油酯、蘋果酸二甘油酯及其仍含有少量源自生產(chǎn)過程的甘油三酯的技術(shù)混合物。1至30且優(yōu)選5至10摩爾環(huán)氧乙烷與上述偏甘油酯的加成產(chǎn)物同樣適當(dāng)。

脫水山梨醇酯。脫水山梨醇酯是脫水山梨醇單異硬脂酸酯、脫水山梨醇倍半異硬脂酸酯、脫水山梨醇二異硬脂酸酯、脫水山梨醇三異硬脂酸酯、脫水山梨醇單油酸酯、脫水山梨醇倍半油酸酯、脫水山梨醇二油酸酯、脫水山梨醇三油酸酯、脫水山梨醇單芥酸酯、脫水山梨醇倍半芥酸酯、脫水山梨醇二芥酸酯、脫水山梨醇三芥酸酯、脫水山梨醇單蓖麻酸酯、脫水山梨醇倍半蓖麻酸酯、脫水山梨醇二蓖麻酸酯、脫水山梨醇三蓖麻酸酯、脫水山梨醇單羥基硬脂酸酯、脫水山梨醇倍半羥基硬脂酸酯、脫水山梨醇二羥基硬脂酸酯、脫水山梨醇三羥基硬脂酸酯、脫水山梨醇單酒石酸酯、脫水山梨醇倍半酒石酸酯、脫水山梨醇二酒石酸酯、脫水山梨醇三酒石酸酯、脫水山梨醇單檸檬酸酯、脫水山梨醇倍半檸檬酸酯、脫水山梨醇二檸檬酸酯、脫水山梨醇三檸檬酸酯、脫水山梨醇單馬來(lái)酸酯、脫水山梨醇倍半馬來(lái)酸酯、脫水山梨醇二馬來(lái)酸酯、脫水山梨醇三馬來(lái)酸酯及其技術(shù)混合物。1至30且優(yōu)選5至10摩爾環(huán)氧乙烷與上述脫水山梨醇酯的加成產(chǎn)物同樣適當(dāng)。

聚甘油酯。適當(dāng)?shù)木鄹视王サ牡湫蛯?shí)例是聚甘油‐2二聚羥基硬脂酸酯(PGPH)、聚甘油‐3‐二異硬脂酸酯( TGI)、聚甘油‐4異硬脂酸酯( GI 34)、聚甘油‐3油酸酯、聚甘油‐3二異硬脂酸酯( PDI)、聚甘油‐3甲基葡糖二硬脂酸酯(Tego450)、聚甘油‐3蜂蠟(Cera)、聚甘油‐4癸酸酯(聚甘油癸酸酯T2010/90)、聚甘油‐3鯨蠟基醚( NL)、聚甘油‐3二硬脂酸酯( GS 32)和聚甘油聚蓖麻酸酯( WOL 1403)、聚甘油二異硬脂酸酯(polyglyceryl dimerate isostearate)及其混合物。其它適當(dāng)?shù)亩嘣减サ膶?shí)例是任選與1至30摩爾環(huán)氧乙烷反應(yīng)的月桂酸、椰油酸、牛油酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、山崳酸等與三羥甲基丙烷或季戊四醇的單酯、二酯和三酯。

陰離子乳化劑。典型的陰離子乳化劑是具有12至22個(gè)碳原子的脂肪族脂肪酸，如例如棕櫚酸、硬脂酸或山崳酸，以及具有12至22個(gè)碳原子的二羧酸，如例如壬二酸或癸二酸。

兩性和陽(yáng)離子乳化劑。此外兩性離子表面活性劑可以用作乳化劑。兩性離子表面活性劑是分子中含有至少一個(gè)季銨基團(tuán)和至少一個(gè)羧酸酯基團(tuán)和一個(gè)磺酸酯基團(tuán)的表面活性化合物。特別適當(dāng)?shù)膬尚噪x子表面活性劑為所謂的甜菜堿，如N‐烷基‐N,N‐二甲基甘氨酸銨，例如椰油烷基二甲基甘氨酸銨、N‐酰胺基丙基‐N,N‐二甲基甘氨酸銨，例如椰油酰胺基丙基二甲基甘氨酸銨、和烷基或?；芯哂?‐18個(gè)碳原子的2‐烷基‐3‐羧甲基‐3‐羥乙基咪唑啉和椰油酰胺基乙基羥乙基羧甲基甘氨酸鹽。特別優(yōu)選已知CTFA名為椰油酰胺丙基甜菜堿的脂肪酸酰胺衍生物。同樣適當(dāng)?shù)娜榛瘎閮尚员砻婊钚詣尚员砻婊钚詣┦浅薈_8/18烷基或?；?，分子中還含有至少一個(gè)游離氨基和至少一個(gè)‐COOH或‐SO₃H基團(tuán)且能形成內(nèi)鹽的表面活性化合物。適當(dāng)?shù)膬尚员砻婊钚詣┑膶?shí)例為烷基中具有約8‐18個(gè)碳原子的N‐烷基甘氨酸、N‐烷基丙酸、N‐烷基氨基丁酸、N‐烷基亞氨基二丙酸、N‐羥乙基‐N‐烷基酰胺基丙基甘氨酸、N‐烷基牛磺酸、N‐烷基肌氨酸、2‐烷基氨基丙酸和烷基氨基乙酸。特別優(yōu)選的兩性表面活性劑為N‐椰油烷基氨基丙酸酯、椰油酰胺基乙基氨基丙酸酯和C_12/18酰基肌氨酸。最后也可以使用陽(yáng)離子表面活性劑作為乳化劑，如季銨鹽類，尤其優(yōu)選甲基季銨化的二脂肪酸三乙醇胺酯‐鹽。

脂肪和蠟

脂肪的典型實(shí)例是甘油酯，即固體或液體的植物或動(dòng)物產(chǎn)品，其主要由高級(jí)脂肪酸的混合甘油酯構(gòu)成，作為蠟的是天然蠟，如例如小燭樹蠟、巴西棕櫚蠟、日本蠟、蘆華草臘(Espartograswachs)、軟木蠟、小冠椰子臘(Guarumawachs)、米糠油蠟、糖甘蔗蠟、小冠巴西棕蠟(Ouricurywachs)、褐煤蠟、蜂蠟、紫膠蠟(Schellackwachs)、鯨蠟、羊毛脂(Wollwachs)、尾脂脂肪(Bürzelfett)、(純)地蠟、地蠟(石蠟)、凡士林、石油蠟、微蠟；化學(xué)改性的蠟類(硬蠟類)如例如褐煤酯蠟(Montanesterwachse)、德國(guó)沙索集團(tuán)石油蠟(Sasolwachse)、氫化霍霍巴蠟(Jojobawachse)以及合成蠟類如例如聚亞烷基蠟類和聚乙二醇蠟類。除了脂肪，作為添加劑的還可以是類脂肪物質(zhì)，如卵磷脂和磷脂。卵磷脂是指由脂肪酸、甘油、磷酸和膽堿通過酯化形成的甘油磷脂。因此在專業(yè)領(lǐng)域卵磷脂通常被稱為磷脂酰膽堿(PC)。天然卵磷脂的實(shí)例為腦磷脂，其也被稱為磷脂酸并且是1,2‐二?；\sn‐甘油基‐3‐磷酸的衍生物。與之相反磷脂是指磷酸與甘油的常規(guī)單酯和優(yōu)選二酯(甘油磷酸酯)，其通常屬于脂肪。此外還可以包括鞘氨醇和鞘類脂物。

珠光蠟

珠光蠟是例如：烷二醇酯，尤其是乙二醇二硬脂酸酯；脂肪酸烷醇酰胺，尤其是椰油脂肪酸二乙醇酰胺；偏甘油酯，尤其是硬脂酸單甘油酯；多元、任選羥基取代的羧酸與具有6‐22個(gè)碳原子的脂肪醇的酯，尤其是酒石酸的長(zhǎng)鏈酯；具有總計(jì)至少24個(gè)碳原子的脂肪物質(zhì)，如例如脂肪醇、脂肪酮、脂肪醛、脂肪醚和脂肪碳酸酯，尤其是月桂酮和二硬脂醚；脂肪酸如硬脂酸、羥基硬脂酸或山崳酸、具有12‐22個(gè)碳原子的環(huán)氧烯烴與具有12‐22個(gè)碳原子的脂肪醇和/或具有2‐15個(gè)碳原子和2‐10個(gè)羥基的多元醇的開環(huán)產(chǎn)物、及其混合物。

清涼劑

清涼劑是在皮膚上產(chǎn)生清涼感受的化合物。一般涉及薄荷醇化合物，除了本體薄荷醇自身，選自例如組包括薄荷醇甲醚、薄荷酮甘油縮醛(FEMA GRAS¹3807)、薄荷酮甘油縮酮(FEMA GRAS 3808)、乳酸薄荷酯(FEMA GRAS 3748)、薄荷醇乙二醇碳酸酯(FEMA GRAS 3805)、薄荷醇丙二醇碳酸酯(FEMA GRAS 3806)、N‐乙基草氨酸薄荷酯、琥珀酸單薄荷酯(FEMA GRAS 3810)、谷氨酸單薄荷酯(FEMA GRAS 4006)、薄荷氧基‐1,2‐丙二醇(FEMA GRAS 3784)、薄荷氧基‐2‐甲基‐1,2‐丙二醇(FEMA GRAS 3849)以及薄荷烷碳酸酯和酰胺WS‐3、WS‐4、WS‐5、WS‐12、WS‐14和WS‐30及其混合物。

這類物質(zhì)的第一種重要代表是琥珀酸單薄荷酯(FEMA GRAS 3810)。不僅琥珀酸酯，而且類似物谷氨酸單薄荷酯(FEMA GRAS 4006)也是基于二元或多元羧酸的單薄荷酯的重要代表。

這類物質(zhì)的使用實(shí)例參見例如文獻(xiàn)WO 2003 043431(Unilever)或EP 1332772 A1(IFF)。

本發(fā)明優(yōu)選的下一組重要薄荷醇化合物包括薄荷醇和多元醇，如例如乙二醇、甘油或碳水化合物的碳酸酯，如例如薄荷醇乙二醇碳酸酯(FEMA GRASMGC)、薄荷醇丙二醇碳酸酯(FEMA GRAS MPC)、2‐甲基‐1,2‐丙二醇碳酸薄荷醇酯(FEMA GRAS 3849)或相應(yīng)的糖衍生物。同樣優(yōu)選薄荷醇化合物是乳酸薄荷酯(FEMA GRAS ML)并且特別是薄荷酮甘油縮醛(FEMA GRAS 3807)、或薄荷酮甘油縮酮(FEMA GRAS 3808)，市場(chǎng)上以名稱 MGA出售。這類物質(zhì)中特別有利是薄荷酮甘油縮醛/縮酮和乳酸薄荷酯、薄荷醇乙二醇碳酸酯或薄荷醇丙二醇碳酸酯，被申請(qǐng)人以名稱 MGA、 ML、 MGC和 MPC市售。

在上世紀(jì)七十年代第一次發(fā)現(xiàn)薄荷醇化合物，其在3位有一個(gè)C‐C‐鍵并且同樣有一系列可以使用的代表物。這類物質(zhì)通常被稱為WS‐類。本體是薄荷醇衍生物，其中羥基被羧基取代(WS‐1)。由該結(jié)構(gòu)產(chǎn)生所有其他的WS‐類，如例如優(yōu)選的WS‐3、WS‐4、WS‐5、WS‐12、WS‐14和WS‐30。

粘度調(diào)節(jié)劑和增稠劑

作為粘度調(diào)節(jié)劑可以首先考慮具有12至22并且優(yōu)選16至18個(gè)碳原子的脂肪醇或羥基脂肪醇以及偏甘油酯、脂肪酸或羥基脂肪酸。優(yōu)選的是這些物質(zhì)與烷基低聚苷和/或相同鏈長(zhǎng)的脂肪酸‐N‐甲基糖胺和/或聚甘油聚‐12‐羥基硬脂酸酯的結(jié)合。適當(dāng)?shù)脑龀韯┦侨鏏erosil‐類(親水性二氧化硅)、多糖，更特別是黃原膠、瓜爾膠、瓊脂、藻酸鹽和纖基乙酸鈉(Tylosen)、羧甲基纖維素和羥乙基和羥丙基纖維素、以及脂肪酸的高分子量聚乙二醇單酯和二酯、聚丙烯酸酯(例如Goodrich的和Pemulen‐類；Sigma的Kelco的Keltrol‐類；Seppic的Sepigel‐類；Allied Colloids的Salcare‐類)、聚丙烯酰胺、聚合物、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮。特別有效的是膨潤(rùn)土，如例如凝膠VS‐5PC(Rheox)，其涉及環(huán)戊硅氧烷、二硬脂基二甲基胺鋰皂石和碳酸丙烯酯的混合物。

其他可以考慮的是表面活性劑如，例如乙氧基化脂肪酸甘油酯、脂肪酸與多元醇如季戊四醇或三羥甲基丙烷的酯、窄同系物分布的脂肪醇乙氧基化物或烷基低聚苷以及電解質(zhì)如氯化鈉和氯化銨。

富脂劑和穩(wěn)定劑

作為富脂劑可以使用物質(zhì)如例如羊毛脂和卵磷脂以及聚乙氧基化或?；蛎吐蚜字苌?、多元醇脂肪酸酯、單甘油酯和脂肪酸烷醇酰胺，其中脂肪酸烷醇酰胺也可用作泡沫穩(wěn)定劑。作為穩(wěn)定劑可以使用脂肪酸的金屬鹽，如例如硬脂酸或蓖麻酸鎂、鋁和/或鋅。

聚合物

適當(dāng)?shù)年?yáng)離子聚合物是例如，陽(yáng)離子纖維素衍生物，例如以商品名Polymer JR由Amerchol得到的季銨化羥乙基纖維素、陽(yáng)離子淀粉、二烯丙基銨鹽和丙烯酰胺的共聚物、季銨化乙烯基吡咯烷酮/乙烯基咪唑聚合物如，例如(BASF)、聚乙二醇和胺的縮合產(chǎn)物、季銨化膠原多肽如，例如月桂基二甲基銨羥丙基胺水解膠原( L,Grünau)、季銨化小麥多肽、聚乙烯亞胺、陽(yáng)離子硅氧烷聚合物如，例如氨基二甲聚硅氧烷(Amodimethicone)、己二酸和二甲基氨基羥丙基二亞乙基三胺的共聚物(Sandoz)、丙烯酸與二甲基二烯丙基氯化銨的共聚物(550,Chemviron)、聚氨基聚酰胺及其交聯(lián)水溶性聚合物、陽(yáng)離子角質(zhì)素衍生物如，例如任選以微晶分布的季銨化殼聚糖、

二鹵代烷基如二溴丁烷與雙二烷基胺的縮合產(chǎn)物，例如雙‐二甲基氨基‐1,3‐丙烷、陽(yáng)離子瓜爾膠如，例如Celanese公司的 CBS、 C‐17、 C‐16、季銨鹽聚合物如，例如Miranol公司的 A‐15、 AD‐1、 AZ‐1以及各種聚季銨鹽類。

陰離子、兩性離子、兩性和非離子聚合物是例如，乙酸乙烯酯/巴豆酸共聚物、乙烯基吡咯烷酮/丙烯酸乙烯酯共聚物、乙酸乙烯酯/馬來(lái)酸丁酯/丙烯酸異冰片酯共聚物、甲基乙烯基醚/馬來(lái)酸酐混合共聚物及其酯、未交聯(lián)的和與多元醇交聯(lián)的聚丙烯酸、丙烯酰胺基丙基三甲基氯化銨/丙烯酸酯共聚物、

辛基丙烯酰胺/甲基丙烯酸甲酯/甲基丙烯酸叔丁基氨基乙酯/甲基丙烯酸2‐羥丙酯共聚物、聚乙烯吡咯烷酮，乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物、乙烯基吡咯烷酮/甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯/乙烯基己內(nèi)酰胺三元共聚物和任選衍生的纖維素醚和硅氧烷。

硅氧烷化合物

適當(dāng)?shù)墓柩跬榛衔锸?，例如二甲基聚硅氧烷、甲基苯基聚硅氧烷、環(huán)硅氧烷以及氨基、脂肪酸、醇、聚醚、環(huán)氧、氟、糖苷和/或烷基改性的硅氧烷化合物，在室溫下它們可以是液態(tài)以及呈樹脂態(tài)。其它適當(dāng)?shù)氖怯袡C(jī)硅樹脂，其為平均鏈長(zhǎng)為200至300個(gè)二甲基硅氧烷單元的二甲基硅油與氫化硅酸鹽的混合物。

UV‐防曬因子

UV‐防曬因子是指例如在室溫下以液態(tài)或晶體存在的有機(jī)物質(zhì)(光保護(hù)過濾物質(zhì))，其吸收紫外光線并將吸收的能量以長(zhǎng)波輻射的形式，例如熱，再次放出。通常UV‐防曬因子的用量為0.1至5優(yōu)選0.2至1重量％。UVB‐過濾物質(zhì)可以是油溶或水溶的。作為油溶物質(zhì)可以是，例如：

·3‐亞芐基樟腦或3‐亞芐基降樟腦及其衍生物，例如3‐(4‐甲基亞芐基)‐樟腦；

·4‐氨基苯甲酸衍生物，優(yōu)選4‐(二甲基氨基)苯甲酸‐2‐乙基己酯、4‐(二甲基氨基)苯甲酸‐2‐辛酯和4‐(二甲基氨基)苯甲酸‐戊酯。

·肉桂酸酯，優(yōu)選4‐甲氧基肉桂酸2‐乙基己酯、4‐甲氧基肉桂酸丙酯、4‐甲氧基肉桂酸異戊酯、2‐氰基‐3,3‐苯基肉桂酸‐2‐乙基己酯(Octocrylene)；

·水楊酸酯，優(yōu)選水楊酸2‐乙基己酯、水楊酸‐4‐異丙基芐酯、水楊酸高薄荷酯；

·苯甲酮衍生物，優(yōu)選2‐羥基‐4‐甲氧基苯甲酮、2‐羥基‐4‐甲氧基‐4‘‐甲基苯甲酮、2,2‘‐二羥基‐4‐甲氧基苯甲酮；

·亞芐丙二酸酯，優(yōu)選4‐甲氧基亞芐丙二酸二‐2‐乙基己酯；

·三嗪衍生物，如例如2,4,6‐三苯胺基‐(對(duì)‐羰基‐2‘‐乙基‐1‘‐己氧基)‐1,3,5‐三嗪和辛基三嗪酮或二辛基丁酰胺三嗪酮( HEB)

·丙‐1,3‐二酮如例如1‐(4‐叔丁基苯基)‐3‐(4‘‐甲氧基苯基)丙‐1,3‐二酮；

·掛式三環(huán)(5.2.1.0)癸烷衍生物。

作為水溶性物質(zhì)可以考慮：

·2‐苯基苯并咪唑‐5‐磺酸及其堿金屬鹽、堿土金屬鹽、銨鹽、烷基銨鹽、烷醇基銨鹽和葡糖銨鹽；

·1H‐苯并咪唑‐4,6‐二磺酸，2,2‐(1,4‐亞苯基)雙，二鈉鹽(Neo AP)；

·苯甲酮的磺酸衍生物，優(yōu)選2‐羥基‐4‐甲氧基苯甲酮‐5‐磺酸及其鹽

·3‐亞芐基樟腦的磺酸衍生物，如例如4‐(2‐氧‐3‐冰片烯基甲基)苯甲?；撬岷?‐甲基‐5‐(2‐氧‐3‐冰片烯基)磺酸及其鹽。

作為典型的UVA過濾物質(zhì)尤其考慮苯甲?；淄?，如例如1‐(4‘‐叔丁基苯基)‐3‐(4‘‐甲氧基苯基)丙‐1,3‐二酮、4‐叔丁基苯基‐4‘‐甲氧基二苯甲?；淄?1789)、2‐(4‐二乙基氨基‐2‐羥基苯甲?；?‐苯甲酸己酯( A Plus)、1‐苯基‐3‐(4‘‐異丙基苯基)‐丙‐1,3‐二酮以及烯胺化合物。UVA過濾物質(zhì)和UVB過濾物質(zhì)可以單獨(dú)也可以混合使用。特別有利的是由苯甲?；淄檠苌?，例如4‐叔丁基苯基‐4‘‐甲氧基二苯甲?；淄?1789)和2‐氰基‐3,3‐苯基肉桂酸‐2‐乙基己酯(Octocrylene)與肉桂酸酯，優(yōu)選4‐甲氧基肉桂酸‐2‐乙基己酯和/或4‐甲氧基肉桂酸丙酯和/或4‐甲氧基肉桂酸異戊酯結(jié)合的結(jié)合物。有利的是這類結(jié)合物與水溶性過濾物質(zhì)如例如2‐苯基苯并咪唑‐5‐磺酸及其堿金屬鹽、堿土金屬鹽、銨鹽、烷基銨鹽、烷醇基銨鹽和葡糖銨鹽結(jié)合。

除了上述溶解性物質(zhì)，為實(shí)現(xiàn)目的也可以考慮不溶性的光保護(hù)顏料，即精細(xì)分散的金屬氧化物和鹽。適當(dāng)?shù)慕饘傺趸飳?shí)例特別是氧化鋅和二氧化鈦，以及鐵、鋯、硅、錳、鋁和鈰的氧化物級(jí)其混合物。可使用的鹽為硅酸鹽(滑石)、硫酸鋇或硬脂酸鋅。氧化物和鹽以顏料的形式用于皮膚護(hù)理和護(hù)膚乳液，以及修飾性化妝品。顆粒應(yīng)具有小于100nm，優(yōu)選5‐50nm，特別是15‐30nm的平均直徑。它們可具有球形，但是也可使用具有橢圓形或以某種其它方法偏離球面形狀的那些顆粒。

顏料也可以以表面處理的形式，即親水化或疏水化存在。典型實(shí)例為涂覆的二氧化鈦，例如二氧化鈦T805(Degussa)或 T‐2000、 T、 T‐EC0、 T‐S、 T‐Aqua、 T‐45D(所有Merck)、Uvinul TiO₂(BASF)。疏水性涂層主要為聚硅氧烷，具體而言，三烷氧基辛基硅烷或二甲基硅油(Simethicone)。在防曬組合物中，優(yōu)選使用所謂的微細(xì)顏料或納米顏料。優(yōu)選使用微粉化氧化鋅，如或Z-COTE

濕潤(rùn)劑

濕潤(rùn)劑用于進(jìn)一步優(yōu)化組合物的感官性能并且調(diào)節(jié)皮膚濕度。同時(shí)本發(fā)明組合物的溫度穩(wěn)定性，特別是在乳液的情況下，提高。濕潤(rùn)劑的含量通常為0.1至15重量％，優(yōu)選1至10重量％，并且特別是5至10重量％。

根據(jù)本發(fā)明適當(dāng)?shù)氖前被?、吡咯烷羧酸、乳酸及其鹽、乳糖醇、脲和脲衍生物，脲酸，葡糖胺，肌氨酸酐，膠原質(zhì)水解產(chǎn)物，殼聚糖或殼聚糖鹽/衍生物，特別是多元醇和多元醇衍生物(如丙三醇、二丙三醇、三丙三醇、乙二醇、丙二醇、丁二醇、赤蘚醇、1,2,6‐己三醇、聚乙二醇如PEG‐4、PEG‐6、PEG‐7、PEG‐8、PEG‐9、PEG‐10、PEG‐12、PEG‐14、PEG‐16、PEG‐18、PEG‐20)、糖和糖衍生物(如果糖、葡萄糖、麥芽糖、麥芽糖醇、甘露醇、肌醇、山梨糖醇，山梨糖醇硅烷二醇，蔗糖，海藻糖，木糖，木糖醇，葡糖醛酸及其鹽)、乙氧基化山梨醇(Sorbeth‐6、Sorbeth‐20、Sorbeth‐30、Sorbeth‐40)、蜂蜜和氫化蜂蜜、氫化淀粉水解物以及氫化小麥蛋白混合物和PEG‐20‐乙酸酯共聚物。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選適當(dāng)?shù)臐駶?rùn)劑是丙三醇、二丙三醇、三丙三醇和丁二醇。

生物活性物質(zhì)和抗氧化劑

生物活性物質(zhì)是例如生育酚、生育酚乙酸酯、生育酚棕櫚酸酯、抗壞血酸、(脫氧)核糖核酸及其碎裂產(chǎn)物、β‐葡聚糖、視黃醇、紅沒藥醇、尿囊素、植烷三醇、泛醇、AHA酸、氨基酸、神經(jīng)酰胺、假神經(jīng)酰胺、香精油、植物提取物如、桃李提取物、班馬納堅(jiān)果提取物和維生素絡(luò)合物。

抗氧化劑打斷UV輻射透過皮膚時(shí)觸發(fā)的光化學(xué)反應(yīng)鏈。其典型實(shí)例為氨基酸(例如甘氨酸、組氨酸、酪氨酸、色氨酸)及其衍生物，咪唑(例如尿刊寧酸)及其衍生物，肽，例如D,L‐肌肽、D‐肌肽、L‐肌肽及其衍生物(例如鵝肌肽)，類胡蘿卜素、胡蘿卜素(例如α‐胡蘿卜素、β‐胡蘿卜素、番茄紅素)及其衍生物，綠原酸及其衍生物，硫辛酸及其衍生物(例如二氫硫辛酸)，金硫葡糖，丙硫氧嘧啶和其它硫醇(例如硫氧還蛋白、谷胱甘肽、半胱氨酸、胱氨酸、胱胺及其糖基、N‐乙?；?、甲基、乙基、丙基、戊基、丁基和月桂基、棕櫚?；?、油基、γ‐亞油基、膽甾烯基和甘油基酯)及其鹽，硫代二丙酸二月桂酯、硫代二丙酸雙十八酯、硫代二丙酸及其衍生物(酯類、醚類、肽類、脂類、核苷酸類、核苷類和鹽)以及非常低的耐藥劑量(例如pmol至mmol/kg)的亞砜亞胺化合物(例如丁硫氨酸亞砜亞胺、同型半胱氨酸亞砜亞胺、丁硫氨酸砜、五‐、六‐和七‐硫氨酸亞砜亞胺)、以及(金屬)螯合劑類(例如，α‐羥基脂肪酸類、棕櫚酸、植酸、乳鐵蛋白)、α‐羥基酸類(例如檸檬酸、乳酸、蘋果酸)、腐殖酸、膽汁酸、膽汁提取物、膽紅素、膽綠素、EDTA、EGTA及其衍生物、不飽和脂肪酸及其衍生物(例如γ‐亞麻酸、亞油酸、油酸)、葉酸及其衍生物、泛醌和泛醇及其衍生物、維生素C及其衍生物(例如抗壞血酸棕櫚酸酯、抗壞血酸磷酸鎂、抗壞血酸乙酸酯)、生育酚及衍生物(例如維生素E乙酸酯)、維生素A及衍生物(維生素A棕櫚酸酯)以及安息香樹脂的苯甲酸松酯、蕓香十烯酸及其衍生物、α‐糖基蕓香苷、阿魏酸、亞糠基葡糖醇、肌肽、丁基羥基甲苯、丁基羥基茴香醚、去甲二氫化愈創(chuàng)木酸()、去甲二氫愈創(chuàng)木酸木脂酸()、三羥基丁酰苯、尿酸及其衍生物，甘露糖及其衍生物，超氧化物歧化酶，鋅及其衍生物(例如ZnO,ZnSO₄)、硒及其衍生物(例如硒代蛋氨酸)、芪及其衍生物(例如氧化芪、反氧化芪)和根據(jù)本發(fā)明合適的這些所述活性成分的衍生物(例如鹽、酯、醚、糖、核苷酸、核苷、肽和脂類)。

助水溶物

此外助水溶物例如乙醇、異丙醇或多元醇類可以用于改善流動(dòng)性；這些物質(zhì)大部分相當(dāng)于上述載體。適合的多元醇類優(yōu)選包含2‐15個(gè)碳原子和至少2個(gè)羥基。多元醇類可以包含其他官能團(tuán)，尤其是氨基或可以被氮修飾。典型的實(shí)例是:

·甘油；

·亞烷基二醇例如乙二醇、二乙二醇、丙二醇、丁二醇、己二醇和具有100‐1000道爾頓平均分子量的聚乙二醇類；

·具有1.5‐10自縮合度的專用(technische)寡聚甘油混合物例如具有40‐50％重量二甘油含量的專用二甘油混合物；

·羥甲基化合物，特別是例如三羥甲基乙烷、三羥甲基丙烷、三羥甲基丁烷、季戊四醇和二季戊四醇；

·低級(jí)烷基糖苷類，特別是在烷基上包含1‐8個(gè)碳原子的那些，例如甲基和丁基糖苷；

·包含5‐12個(gè)碳原子的糖醇類例如山梨醇或甘露糖醇；

·包含5‐12個(gè)碳原子的糖類例如葡萄糖或蔗糖；

·氨基糖類例如葡萄糖胺；

·二醇胺類例如二乙醇胺或2‐氨基‐1,3‐丙二醇。

防腐劑

適當(dāng)?shù)姆栏瘎┦抢绫窖跻掖?、甲醛溶液、?duì)羥苯甲酸類、戊二醇或山梨酸以及已知的名稱為的銀化合物和Kosmetikverordnung附錄6中A部分和B部分中列舉的其他類型的化合物。

芳香油和芳香劑

適當(dāng)?shù)姆枷阌褪翘烊环枷銊┡c合成芳香劑的混合物。天然芳香劑是花(百合、薰衣草、玫瑰、茉莉、橙花、依蘭)、莖和葉(天竺葵、廣藿香、苦橙)、水果(茴香、胡荽、香菜、杜松)、果皮(佛手柑、檸檬、橙)、根(肉豆蔻、當(dāng)歸、芹菜、小豆蔻、木香、虹膜、菖蒲)、木材(松木、檀香、愈創(chuàng)木、雪松木、花梨木)、草本植物和禾本植物(龍蒿、檸檬草、鼠尾草、百里香)、松針和樹枝(云杉、冷杉、松樹、矮松)、樹脂和香脂(格蓬、欖香脂、安息香、沒藥、乳香、紅沒藥)的提取物。還可使用動(dòng)物原料，例如麝貓香和海貍香。典型的合成芳香劑化合物是酯、醚、醛、酮、醇和烴類產(chǎn)物。酯類芳香劑化合物實(shí)例是例如乙酸芐酯，異丁酸苯氧基乙酯、環(huán)己基乙酸對(duì)叔丁酯、乙酸芳樟酯、乙酸二甲基芐基原酯(dimethyl benzyl carbinyl acetate)、乙酸苯乙酯、苯甲酸芳樟酯、甲酸芐酯、苯基甘氨酸乙基甲酯、環(huán)己基丙酸烯丙酯、丙酸蘇合香酯和水楊酸芐酯。醚類包括，例如芐基乙基醚；醛類包括，例如含有8至18個(gè)碳原子的直鏈烷醛、檸檬醛、香茅醛、香茅基氧基乙醛、仙客來(lái)醛、羥基香茅醛、鈴蘭醛和波潔紅醛；酮類是例如紫羅蘭酮、α‐異甲基紫羅酮和甲基柏木酮；醇類是例如茴香腦、香茅醇、丁香酚、異丁香酚、香葉醇、芳樟醇、苯乙醇和松油醇；烴類主要包括萜烯類和香脂類。然而，優(yōu)選使用不同芳香劑化合物的混合物，它們一起產(chǎn)生令人愉快的香味。其它適當(dāng)?shù)姆枷阌蜑榇蠖嘤米鞣枷愠煞值膿]發(fā)性較低的精油，實(shí)例是鼠尾草油、甘菊油、丁香油、蜂花油、薄荷油、肉桂葉油、萊姆花油、杜松子油、香根草油、乳香油、白松香油、巖薔薇油和熏衣草油。以下為單獨(dú)或以混合形式優(yōu)選使用的物質(zhì)：佛手柑油、二氫月桂烯醇、鈴蘭醛、新鈴蘭醛、香茅醇、苯乙醇、α‐己基肉桂醛、香葉醇、芐丙酮、仙客來(lái)醛、芳樟醇、乙氧基甲氧基環(huán)十一烷、龍涎呋喃、吲哚、二氫茉莉酮酸甲酯(Hedione)、Sandelice、柑橘類精油、柑橘油、橙油、乙醇酸烯丙基戊酯、Cyclovertal、醒目熏衣草油、鼠尾草油、大馬酮、波旁香葉油、水楊酸環(huán)己酯、Vertofix Coeur、Iso‐E‐Super、Fixolide NP、Evernyl、Iraldein gamma、苯乙酸、乙酸香葉酯、乙酸芐酯、玫瑰醚、Romilllat、2‐乙基‐己酸乙酯(Irotyl)和2‐叔丁基環(huán)己基乙基碳酸酯(Floramat)。

適合的芳香物質(zhì)是例如辣薄荷油、荷蘭薄荷油、茴香油、日本八角茴香油、藏茴香油、桉葉油、小茴香油、檸檬油、冬青油、丁香油、薄荷醇等。

染料

適合的染料是例如德國(guó)研究學(xué)會(huì)染料協(xié)會(huì)(Farbstoff‐kommission der Deutschen Forschungsgemeinschaft)的公開物“Kosmetische”，Verlag Chemie，Weinheim，1984，頁(yè)81至106中列舉的適于并批準(zhǔn)用于化妝品的物質(zhì)中的任何一種。實(shí)例包括胭脂紅A(C.I.16255)、專利藍(lán)V(C.I.42051)、靛藍(lán)(C.I.73015)、葉綠酸(C.I.75810)、喹啉黃(C.I.47005)、二氧化鈦(C.I.77891)、陰丹士林藍(lán)RS(C.I.69800)和茜草紅(C.I.58000)。魯米諾(Luminol)也可用作熒光染料?；诳偦旌衔?，這些染料通常的使用濃度在0.001‐0.1重量％。

助劑和添加劑的總量為1至50，優(yōu)選5至40總量％，基于制劑計(jì)。制劑的制備可以通過常用的冷或熱步驟進(jìn)行；優(yōu)選根據(jù)相轉(zhuǎn)化溫度方法進(jìn)行。

篩選方法

本發(fā)明的另一個(gè)主題涉及一種確認(rèn)活性成分的方法，其有利于或加速創(chuàng)面愈合，其中

(a)提供一種角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)物，其含有嗅覺受體OR2AT4，

(b)向該培養(yǎng)物加入待測(cè)試的活性成分，以及

(c)確定細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的變化。

當(dāng)受體被活性成分活化并且在細(xì)胞內(nèi)，優(yōu)選HaCaT‐細(xì)胞內(nèi)有增多的鈣分泌，則該活性成分可能有利于甚至加速創(chuàng)面愈合。尤其是如果每次施用活性成分與前一次相比都能提高鈣濃度幅度，則是這種情況。

實(shí)施例

OR2AT4在異源表達(dá)系統(tǒng)中的表征

為了明確受體在組織中的功能，了解配體非常重要，從而保證受體在原生系統(tǒng)中的活化能力。到目前為止大部分OR仍未去孤兒化。因此首先在異源表達(dá)系統(tǒng)更準(zhǔn)確的表征在人類角質(zhì)形成細(xì)胞中確定的OR2AT4并確定受體域。

OR2AT4在Hana3A‐細(xì)胞中的異源表達(dá)

使用穩(wěn)定表達(dá)內(nèi)源性嗅覺傳導(dǎo)因數(shù)的Hana3A‐細(xì)胞作為異源表達(dá)系統(tǒng)，其有針對(duì)地協(xié)助OR嵌入細(xì)胞膜并改善其活性。此外，將視紫質(zhì)的(Rho‐tag)20位第一N‐末端氨基酸加至OR編碼序列的N端之前，也用于協(xié)助異源表達(dá)。

為了檢測(cè)OR2AT4在Hana3A‐細(xì)胞中的異源表達(dá)，通過磷酸鈣方法用受體質(zhì)粒(pcDNA3‐OR2AT4)轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞48小時(shí)并用OR2AT4‐特異性抗體(α‐OR2AT4‐Ak)和視紫質(zhì)‐特異性抗體(α‐Rho‐AK)進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。這兩種抗體清晰可見的共染色使其可以顯示α‐OR2AT4‐Ak特定結(jié)合至受體，并使受體能夠在Hana3A細(xì)胞中異源表達(dá)。添加OR編碼序列的N‐端同樣可以協(xié)助異源表達(dá)。為了檢測(cè)OR2AT4在Hana3A細(xì)胞中的異源表達(dá)，通過磷酸鈣方法用受體質(zhì)粒(pcDNA3‐OR2AT4)轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞48小時(shí)并用OR2AT4‐特異性抗體(α‐OR2AT4‐Ak)和視紫質(zhì)‐特異性抗體(α‐Rho抗體)進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。這兩種抗體清晰可見的共染色使其可以顯示α‐OR2AT4‐Ak特定結(jié)合至受體，并使受體能夠在Hana3A細(xì)胞中異源表達(dá)(圖1，上)。

通過使用另一種可異源表達(dá)的OR，OR1A2的控制轉(zhuǎn)染可以排除α‐OR2AT4‐Ak的非特異結(jié)合。在使用OR1A2轉(zhuǎn)染的Hana3A細(xì)胞中，清楚的視紫質(zhì)染色顯示了受體的表達(dá)，但是無(wú)法識(shí)別α‐OR2AT4‐Ak的染色(圖1，下)。作為進(jìn)一步的對(duì)比不用初級(jí)抗體培育Hana3A細(xì)胞，從而排除二級(jí)抗體的非特異結(jié)合。

OR2AT4在Hana3A‐細(xì)胞中的膜表達(dá)

為了確保胞外配體結(jié)合至Hana3A細(xì)胞中異源表達(dá)的OR2AT4，必須將所述受體結(jié)合至細(xì)胞質(zhì)膜。已知OR非常難以在異源系統(tǒng)表達(dá)，其通常無(wú)法將受體由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運(yùn)至細(xì)胞表面。因此有必要在進(jìn)行去孤兒化研究前檢驗(yàn)受體結(jié)合至膜，并確定轉(zhuǎn)染率。為此可以進(jìn)行根據(jù)Zhang和Matsunami(2008)的活細(xì)胞染色，其中只有表面蛋白被選擇染色，因?yàn)榧?xì)胞膜沒有透化。

再次使用α‐Rho‐Ak染色，其檢測(cè)重組表達(dá)OR的N‐端Rho tag。染色顯示出，通過磷酸鈣方法的48小時(shí)轉(zhuǎn)染后，OR2AT4被成功結(jié)合至膜(圖2a)。通過確定染色Hana3A細(xì)胞的數(shù)量(平均＝12細(xì)胞)相對(duì)于總細(xì)胞量(平均＝1050細(xì)胞)，染色率為約1.3％(圖2b)。

本結(jié)果示出，OR2AT4以膜結(jié)合的方式在Hana3A細(xì)胞中表達(dá)，因此滿足了表征受體受體域的要求。

重組表達(dá)OR2AT4的受體域

波鴻魯爾大學(xué)的細(xì)胞生理學(xué)系建立的用于去孤兒化研究的方法是鈣成像，其中使用熒光染料轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)的鈣濃度變化使通過香味物質(zhì)激活OR可視(cf.Wetzel et al.in:J.Neurosci.19,pp.7426‐7433(1999)；Spehr et al.in:Science 299,pp.2054‐2058(2003)；Neuhaus et al.in:J.Biol.Chem.284,pp.16218‐16225(2009))。在該方法中，Hana3A細(xì)胞使用香味物質(zhì)短時(shí)(20s)刺激，并選擇用于香味物質(zhì)篩分的高濃度(高至1mM)，從而確定在Hana3A細(xì)胞中弱表達(dá)的OR的活性。

重組表達(dá)OR2AT4的潛在激動(dòng)劑的研究。通過激活OR2AT4首先借助鈣成像檢查。使用1mM激活，短時(shí)OR2AT4轉(zhuǎn)染的Hana3A細(xì)胞表現(xiàn)出特異鈣信號(hào)，該細(xì)胞僅被檀香木氣味激活一次(圖3a)。在定量分析中，觀察到Hana3A細(xì)胞相對(duì)于Ringer‐對(duì)比樣表現(xiàn)出顯著提高的響應(yīng)率，其證明了檀香木氣味激活受體。因?yàn)槭荏w通常能夠被多種結(jié)構(gòu)相關(guān)的分子激活，使用六種其他合成檀香木香味物質(zhì)(婆羅門檀香、黑檀醇、環(huán)己異龍腦酯、爪哇檀香(Javanol)、聚檀香醇(Polysantol)和Sandranol)以及天然檀香木油刺激OR2AT4并檢測(cè)受體活性。在這種情況下，只有婆羅門檀香在鈣成像實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出提高的響應(yīng)率，盡管該提高并不顯著(圖3b)。

通過進(jìn)行未轉(zhuǎn)染Hana3A細(xì)胞的對(duì)比測(cè)量，可以排除通過直接激活Hana3A‐細(xì)胞導(dǎo)致的兩種檀香木香味物質(zhì)響應(yīng)率提高(圖3b，右)。

為了檢驗(yàn)鈣成像結(jié)果并研究OR2AT4的劑量依賴性活性，使用了另一種基于雙熒光素酶系統(tǒng)的去孤兒化方法。在這種方法中，除了OR，兩種熒光素酶被引入Hana3A細(xì)胞。當(dāng)表達(dá)的OR被香味物質(zhì)激活，并在信號(hào)級(jí)聯(lián)放大的過程中形成cAMP，這引發(fā)了螢火蟲熒光素酶通過CRE(cAMP響應(yīng)元件)的表達(dá)。第二熒光素酶，海腎熒光素酶(Renilla熒光素酶)用作細(xì)胞轉(zhuǎn)染和活力的對(duì)比樣。通過計(jì)算兩種熒光素酶值，可以確定OR被香味物質(zhì)激活的能力。在CRE‐熒光素酶檢測(cè)中香味物質(zhì)在細(xì)胞上保持4小時(shí)，從而確保表達(dá)熒光素酶。由于香味物質(zhì)的長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間以及在96孔激活更多受體的可能性，該方法比鈣成像更敏感并且適用于建立劑量效果關(guān)系。

在CRE‐熒光素酶檢測(cè)中，和表現(xiàn)出對(duì)在Hana3A‐細(xì)胞中表達(dá)的重組受體的顯著的劑量依賴性的活性。然而，對(duì)于需要比更高的濃度(≥75μM)，從而在受體產(chǎn)生顯著作用(圖3c)。其在測(cè)定濃度下沒有反應(yīng)，用作另一種檀香木香味物質(zhì)(圖3c)。

由于在熒光素酶檢測(cè)中4小時(shí)的培養(yǎng)使香味物質(zhì)從一個(gè)特定濃度開始對(duì)Hana3A有毒性作用，不能使用過高的香味物質(zhì)濃度并因此無(wú)法建立完整的劑量‐效果曲線。這種毒性特別對(duì)比報(bào)告子海腎熒光素酶的低量中表現(xiàn)。因此只有一致高的海腎信號(hào)值用于評(píng)估(Zhuang和Matsunami,2008)。對(duì)于檀香木香味物質(zhì)爪哇檀香、聚檀香醇、環(huán)己異龍腦酯和檀香木油最高可用濃度為10‐25μΜ。然而，在該濃度下沒有表現(xiàn)出OR2AT4提高的活性。

重組表達(dá)OR2AT4的潛在拮抗劑的研究。香味物質(zhì)不僅可以激活受體，還可以用作OR的拮抗劑。借助鈣成像技術(shù)，香味物質(zhì)覆盆子酮(Oxyphenylon)和2‐異丁酸苯氧基乙酯(Phenirat)被確定為拮抗劑，其與共用時(shí)(1:1，均為1mM)顯著減小了引發(fā)的鈣信號(hào)。使用香味物質(zhì)(Dimetol)作為對(duì)比樣，其在共用時(shí)不會(huì)影響引發(fā)的鈣信號(hào)。2,6‐二甲基‐2‐庚醇、2‐異丁酸苯氧基乙酯和覆盆子酮單獨(dú)都對(duì)Hana3A細(xì)胞沒有影響。

總之發(fā)現(xiàn)對(duì)于異源表達(dá)的OR2AT4和為激動(dòng)劑，覆盆子酮和2‐異丁酸苯氧基乙酯為拮抗劑。在圖5中示出了OR2AT4的受體域以及研究的香味物質(zhì)的結(jié)構(gòu)式。

檢測(cè)OR2AT4在人類角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)

為了確定OR2AT4在各種人類皮膚細(xì)胞和組織中的異位表達(dá)進(jìn)行RT‐PCR分析。此外，OR2AT4在人類角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)分析通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色進(jìn)行。

通過RT‐PCR在人類皮膚細(xì)胞和組織中表達(dá)OR2AT4

為了在轉(zhuǎn)錄水平上檢測(cè)OR2AT4，分離了各種皮膚細(xì)胞種類和皮膚活檢標(biāo)本的DNA，并進(jìn)行RT‐PCR。在各個(gè)分化階段的人類原代角質(zhì)形成細(xì)胞，HaCaT細(xì)胞和人類活檢標(biāo)本(全層皮膚)中檢測(cè)OR2AT4的轉(zhuǎn)錄本(圖6)。除了角質(zhì)形成細(xì)胞這一主要成分，人類皮膚也包括其他細(xì)胞，如結(jié)締組織、色素細(xì)胞和免疫細(xì)胞，因此這些細(xì)胞種類分別通過RT‐PCR檢測(cè)受體表達(dá)。發(fā)現(xiàn)樹突細(xì)胞和黑色素細(xì)胞也表達(dá)OR2AT4。相反，在脂肪細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中沒有檢測(cè)到受體表達(dá)(圖6，中心)

為了確定受體是否僅在皮膚中表達(dá)，使用各種人類組織(腦，乳腺，結(jié)腸，腎，肺，和睪丸)的全部RNA樣本進(jìn)行進(jìn)一步的RT‐PCR分析。發(fā)現(xiàn)OR2AT4不僅在皮膚，也在其他組織如腦、腎和睪丸中表達(dá)。相反在乳腺、大腸和肺中，沒有發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄本(圖6，底部)。為了排除PCR‐產(chǎn)物由于難以分離或降解的RNA而未被檢測(cè)到，對(duì)所有樣本進(jìn)行β‐actin‐對(duì)比以檢測(cè)RNA‐量，該對(duì)比在所有RNA樣品中為陽(yáng)性(圖6)。

通過免疫細(xì)胞化學(xué)法在人類角質(zhì)形成細(xì)胞中表達(dá)OR2AT4

為了檢測(cè)OR2AT4在蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)進(jìn)行自生α‐OR2AT4‐Ak的免疫細(xì)胞化學(xué)染色。在OR2AT4瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的Hana3A‐細(xì)胞中檢測(cè)抗體的特異性。通過使用α‐OR2AT4‐AkHaCaT細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞的清晰染色在共聚焦免疫熒光圖像中可見(圖7a)。

為了排除抗體非特異結(jié)合至皮膚細(xì)胞，使用封閉肽。該肽封閉了α‐OR2AT4‐Ak，其隨后不能連接至結(jié)合點(diǎn)。通過使用封閉肽，僅有輕微染色的細(xì)胞核和核周邊區(qū)域可見(圖7b)。作為進(jìn)一步的對(duì)比，不用初級(jí)抗體培育細(xì)胞，從而排除二級(jí)抗體的非特異結(jié)合(數(shù)據(jù)未示出)。因此α‐OR2AT4‐Ak的結(jié)合是特異的，并且確定了受體在蛋白質(zhì)水平上在人類角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)。

除了培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞，研究了OR2AT4在人類皮膚中的蛋白質(zhì)表達(dá)。為此同樣用α‐OR2AT4‐Ak染色皮膚切片。在染色中可見受體在表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中的清楚表達(dá)(圖8，上部)，其中基底角質(zhì)形成細(xì)胞與抗體的結(jié)合最強(qiáng)(圖8a，截面圖)。位于表皮下的真皮未顯現(xiàn)特異染色。在對(duì)比染色中，其中初級(jí)抗體被兔血清替代，也沒有觀察到特異染色(圖8b)。

在人類角質(zhì)形成細(xì)胞中表征引發(fā)的鈣信號(hào)

為了在皮膚細(xì)胞中表征OR2AT4的生理功能，重要的是通過確定的配體和在培養(yǎng)的人類角質(zhì)形成細(xì)胞中檢測(cè)受體的活性。在這部分工作中關(guān)注配體

在鈣成像實(shí)驗(yàn)中，80‐90％的HaCaT細(xì)胞以及原代角質(zhì)形成細(xì)胞由重復(fù)刺激，引發(fā)的鈣信號(hào)表現(xiàn)出顯著的致敏性，以及在每一次施用后信號(hào)幅度增大(圖9a和9b)。

第一次應(yīng)用幅度的更精確檢測(cè)示出了HaCaT細(xì)胞通過的劑量依賴性活性，其起始于100μΜ并在約2mM達(dá)到飽和(圖9c)。在第四次應(yīng)用中，飽和出現(xiàn)在約500μΜ(圖9d)。在第一次應(yīng)用中ECR50R值為430μΜ并且在第四次應(yīng)用中為112μΜ

引發(fā)的鈣信號(hào)的致敏性研究

對(duì)于引發(fā)的鈣信號(hào)，特征在于重復(fù)刺激提高幅度(圖9)。為了研究細(xì)胞‐細(xì)胞通道(間隙連接)，通過該通道角質(zhì)形成細(xì)胞可以交換分子如ATP或Ca²⁺，在致敏機(jī)制中的作用，使用兩種間隙連接阻滯劑1‐辛醇和生胃酮。

在用阻滯劑1‐辛醇預(yù)培育角質(zhì)形成細(xì)胞或HaCaT細(xì)胞后，可以在鈣成像實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到引發(fā)的鈣信號(hào)的加強(qiáng)(圖10a)。結(jié)果的定量分析示出，使用1‐辛醇對(duì)于HaCaT細(xì)胞通過引發(fā)的第一幅度提高約400％(圖10b)，而對(duì)于角質(zhì)形成細(xì)胞提高甚至約1000％(圖10c)。在重復(fù)刺激中，相對(duì)于對(duì)比測(cè)量隨后的鈣信號(hào)連續(xù)減小。使用第二種間隙連接阻滯劑生胃酮產(chǎn)生相同結(jié)果(圖10b)。

為了排除由于間隙連接的封閉導(dǎo)致的非特異效果，在生胃酮預(yù)培育后用另一種同樣在皮膚細(xì)胞中引發(fā)鈣信號(hào)的香味物質(zhì)新鈴蘭醛(lyral)刺激細(xì)胞。對(duì)新鈴蘭醛引發(fā)的響應(yīng)圖案沒有影響(圖10b)。

引發(fā)的鈣信號(hào)的藥理特性

借助鈣成像技術(shù)和使用用于信號(hào)級(jí)聯(lián)放大蛋白的特異阻滯劑藥理表征了HaCaT細(xì)胞和原代角質(zhì)形成細(xì)胞中引發(fā)的信號(hào)級(jí)聯(lián)放大。首先檢測(cè)通過由細(xì)胞外空前的鈣流入是否產(chǎn)生鈣信號(hào)。為此使用加入螯合鈣(EGTA)的無(wú)鈣細(xì)胞外溶液。在無(wú)鈣溶液存在下，‐引發(fā)的鈣信號(hào)顯著降低(圖11a和11e)。為了研究腺苷酸環(huán)化酶的作用，使用特異阻滯劑SQ‐22536和MDL‐12330A。在各個(gè)阻滯劑的存在下同樣表現(xiàn)出引發(fā)的鈣信號(hào)的顯著降低(圖11b和11e)。反之排除了磷脂酶C的作用，因?yàn)镻LC阻滯劑U‐73122對(duì)引發(fā)的鈣信號(hào)沒有作用(圖11c和11e)。阻滯劑的效率使用組胺測(cè)試，其活化了PLC信號(hào)通路(圖11c)。

為了確定鈣通道，通過該通道鈣離子由外流入皮膚細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，使用CNG通道阻滯劑L‐順式‐硫氮酮。該阻滯劑同樣顯著降低引發(fā)的鈣信號(hào)(圖11d和11e)。為了借助鈣成像技術(shù)檢驗(yàn)藥理特性數(shù)值，額外進(jìn)行cAMP‐檢驗(yàn)。為此使用不同的濃度刺激HaCaT細(xì)胞，并測(cè)定cAMP含量。結(jié)果示出劑量依賴性的cAMP增多，EC50‐值為197μM(圖11f)。

總之，CNG通道參與的cAMP‐依賴的信號(hào)通道用于HaCaT細(xì)胞和原代角質(zhì)形成細(xì)胞的引發(fā)的鈣信號(hào)。

嗅覺信號(hào)級(jí)聯(lián)放大成分和結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白質(zhì)的表征

在精子細(xì)胞和腎臟中，除了OR的功能異位表達(dá)，檢測(cè)到嗅覺信號(hào)級(jí)聯(lián)放大的其他成分，如嗅覺G蛋白Gαolf和腺苷酸環(huán)化酶3(AC3)的亞單位。此外，除了OR的異位表達(dá)，研究顯示嗅覺信號(hào)級(jí)聯(lián)放大成分在多種組織中廣泛分布。因此在本研究中，借助轉(zhuǎn)錄組分析(下一代測(cè)序，NGS)得到了對(duì)于在角質(zhì)形成細(xì)胞中表達(dá)并參與嗅覺信號(hào)級(jí)聯(lián)放大的信號(hào)級(jí)聯(lián)放大蛋白質(zhì)的概觀。

嗅覺信號(hào)級(jí)聯(lián)放大成分和結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)

為了研究信號(hào)級(jí)聯(lián)放大蛋白質(zhì)評(píng)估了原代角質(zhì)形成細(xì)胞的NGS‐數(shù)據(jù)。除了在嗅覺信號(hào)級(jí)聯(lián)放大中出現(xiàn)的成分，如Gαolf、AC3、CNGA2和TMEM16B，研究了其他結(jié)構(gòu)相關(guān)的信號(hào)級(jí)聯(lián)放大蛋白質(zhì)。通過評(píng)估原代角質(zhì)形成細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，可以確定Gαolf(FPKM＝3.6)和AC3(FPKM＝2.1)亞單位的表達(dá)。與相關(guān)蛋白質(zhì)，如激動(dòng)型G蛋白Gαs(FPKM＝69.2)的亞單位或AC6(FPKM＝14.1)相比，這種表達(dá)非常少。

此外，在角質(zhì)形成細(xì)胞中檢測(cè)到了C NG‐通道‐亞單位CNGA1(FPKM＝2.2)以及十種檢測(cè)氯通道家族TMEM16中的七種的轉(zhuǎn)錄本(圖12a)。為了確定NGS‐數(shù)據(jù)，使用原代角質(zhì)形成細(xì)胞和HaCaT細(xì)胞進(jìn)行RT‐PCR實(shí)驗(yàn)(圖12b)。在兩種細(xì)胞類中都確定了Gαolf和AC3的表達(dá)。此外，證明氯通道TMEM16H、TMEM16J、TMEM16F、TMEM16K以及CNGA1亞單位除了在原代角質(zhì)形成細(xì)胞，同樣在HaCaT細(xì)胞中表達(dá)。此處使用的NGS‐數(shù)據(jù)具備非常低的測(cè)序深度(≈18million reads)，因此低表達(dá)基因可能無(wú)法通過這種方法檢測(cè)。因此，根據(jù)NGS‐數(shù)據(jù)無(wú)法表達(dá)的一些基因也可以通過RT‐PCR檢測(cè)。在這種情況下發(fā)現(xiàn)除了CNGA1‐亞單位，CNGB1亞單位同樣在HaCaT細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞中表達(dá)。

嗅覺信號(hào)級(jí)聯(lián)放大成分和結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)水平上的表征

除了RT‐PCR‐實(shí)驗(yàn)，用于檢測(cè)嗅覺信號(hào)級(jí)聯(lián)放大成分Gαolf、RAC3和CNGA1的免疫細(xì)胞化學(xué)染色也可以用HaCaT細(xì)胞和原代角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)行。對(duì)于兩種細(xì)胞在免疫細(xì)胞化學(xué)染色中可以識(shí)別出Gαolf、AC3和CNGA1的清晰表達(dá)(圖13a)。除了細(xì)胞質(zhì)位置Gαolf‐和AC3‐染色示出清晰的核染色。不含初級(jí)抗體的染色用作對(duì)比并且沒有二級(jí)抗體的非特異結(jié)合。

除了培育的角質(zhì)形成細(xì)胞，在準(zhǔn)備階段通過皮膚切片的免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)Gαolf。為了完善數(shù)據(jù)用α‐AC3‐Ak為人類皮膚切片染色。在表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中可見AC3的強(qiáng)表達(dá)。在使用兔血清替代初級(jí)抗體的對(duì)比染色中沒有特異染色(圖13b)。

OR2AT4對(duì)人類角質(zhì)形成細(xì)胞中引發(fā)鈣信號(hào)的作用。

人類角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)受體OR2AT4并且在配體刺激下表現(xiàn)出鈣信號(hào)。為了檢驗(yàn)引發(fā)的鈣信號(hào)通過OR2AT4而不通過其他受體或機(jī)制傳輸，應(yīng)當(dāng)一方面進(jìn)行RNA干擾實(shí)驗(yàn)并且另一方面檢測(cè)上述的OR2AT4拮抗劑。

RNA‐干擾‐實(shí)驗(yàn)

在RNA干擾中將小干擾RNA引入細(xì)胞，由此具備siRNA的互補(bǔ)1T2T 1T2T核苷酸序列的mRNA分解，相應(yīng)編碼的1T2T 1T蛋白1T以及1T2T不再合成。為了進(jìn)行該RNA干擾實(shí)驗(yàn)使用兩種針對(duì)OR2AT4的自生siRNA。如果siRNA成功起效，OR2AT4的mRNA分解，使得沒有功能蛋白被翻譯，導(dǎo)致引發(fā)的鈣信號(hào)降低。

為了排除非特異效果，使用兩種對(duì)細(xì)胞沒有作用的對(duì)比siRNA(scRNA)。首先在Hana3A‐細(xì)胞的對(duì)比實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)這兩種自生siRNA是否成功導(dǎo)致OR2AT4轉(zhuǎn)錄本的分解。為此使用特定的熒光素酶‐和OR2AT4‐表達(dá)報(bào)告質(zhì)粒(pmirGLO‐OR2AT4)和各個(gè)siRNA或scRNA共轉(zhuǎn)染Hana3A細(xì)胞。如果OR2AT4的mRNA被siRNA分解，由于熒光素酶和OR2AT4的融合熒光素酶的mRNA被破壞，結(jié)果是熒光信號(hào)降低。

結(jié)果說(shuō)明，兩種siRNA變體導(dǎo)致OR2AT4轉(zhuǎn)錄本的分解，其通過熒光信號(hào)的顯著降低而明顯。這兩種scRNA不起作用(圖14a)。由此滿足了成功敲除實(shí)驗(yàn)的前提，并且可以在HaCaT細(xì)胞上進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)。首先驗(yàn)證通過siRN，AOR2AT4的表達(dá)在HaCaT細(xì)胞中是否同樣減少。為此使用兩種siRNAsscRNA的混合物轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞兩天，并進(jìn)行使用特異OR2AT4抗體的免疫組化轉(zhuǎn)染。成功錄入該siRNA或scRNA的HaCaT細(xì)胞可以借助GFP確定，其同樣通過pGeneClip‐載體表達(dá)。siRNA或cRNA‐表達(dá)細(xì)胞的α‐OR2AT4‐Ak染色的對(duì)比示出，染色以及OR2AT4的表達(dá)在使用siRNA時(shí)顯著降低，因此siRNA在HaCaT細(xì)胞中有功能(圖14b)。

為了確定OR2AT4在引發(fā)的鈣信號(hào)中是否起作用，使用兩種siRNA或scRNA的混合物轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞兩天(圖14c)并用于鈣成像實(shí)驗(yàn)。在測(cè)定中通過GEP共表達(dá)難以區(qū)別siRNA或scRNA表達(dá)以及非表達(dá)細(xì)胞(圖14d)。使用重復(fù)刺激轉(zhuǎn)染細(xì)胞，計(jì)算鈣信號(hào)的幅度。在三次應(yīng)用中，siRNA轉(zhuǎn)染的HaCaT細(xì)胞表現(xiàn)出相對(duì)于scRNA‐表達(dá)細(xì)胞顯著降低的引發(fā)鈣信號(hào)(圖14e和14f)。

人類角質(zhì)形成細(xì)胞中拮抗劑引發(fā)鈣信號(hào)的作用

借助拮抗劑受體活性也可以通過其特異配體確定，因?yàn)樵诋愒聪到y(tǒng)和原生細(xì)胞中配體引發(fā)鈣信號(hào)的抑制示出了相同受體的活性。已經(jīng)提到2‐異丁酸苯氧基乙酯和覆盆子酮是OR2AT4的拮抗劑，其在共同使用中分別抑制異源系統(tǒng)中引發(fā)的鈣信號(hào)。使用2,6‐二甲基‐2‐庚醇作為對(duì)比樣，其與共同使用時(shí)不表現(xiàn)抑制作用。因此測(cè)試這兩種拮抗劑在HaCaT細(xì)胞對(duì)引發(fā)鈣信號(hào)的潛在抑制性，從而檢驗(yàn)OR2AT4的作用。

為了表征拮抗劑，首先用(1mM)重復(fù)刺激HaCaT細(xì)胞。在第三次施用中，進(jìn)行和一種拮抗劑的共刺激(1:1)。施用2‐異丁酸苯氧基乙酯或覆盆子酮，可以看到引發(fā)鈣信號(hào)的顯著降低，而與2,6‐二甲基‐2‐庚醇共使用，鈣信號(hào)僅輕微降低(圖15a和15b)。基于此應(yīng)當(dāng)進(jìn)行抑制性的劑量依賴性表征。為此，不同濃度的和拮抗劑共刺激。在(500μΜ)與覆盆子酮(500μΜ)或2‐異丁酸苯氧基乙酯(500μΜ)的結(jié)合使用中，鈣信號(hào)顯著降低至對(duì)比(不含拮抗劑的)幅度的8％或9％。將拮抗劑濃度降低至250μΜ，引發(fā)鈣信號(hào)的抑制降低并且幅度為對(duì)比幅度的39％或45％。進(jìn)一步將拮抗劑濃度降低至100μΜ，兩種拮抗劑的抑制作用完全消失(圖15c)。測(cè)得的IC50值(平均抑制濃度)對(duì)于2‐異丁酸苯氧基乙酯和覆盆子酮分別為178μΜ和174μΜ(圖15d)。

在恒定拮抗劑濃度下(500μM)并同時(shí)提高濃度(750μM)，拮抗劑阻滯同樣降低。進(jìn)一步提高至1mM則完全消除了拮抗劑的抑制性(圖15c)?？傊ㄟ^拮抗劑覆盆子酮和2‐異丁酸苯氧基乙酯劑量依賴的抑制了引發(fā)的鈣信號(hào)。這支持了siRNA實(shí)驗(yàn)的結(jié)果并且證實(shí)了在HaCaT細(xì)胞中通過配體活化OR2AT4。

OR2AT4在人類角質(zhì)形成細(xì)胞中的生理功能

在鈣成像實(shí)驗(yàn)中，通過使用短時(shí)刺激(20s)導(dǎo)致皮膚細(xì)胞中胞內(nèi)鈣濃度的變化。然而，規(guī)律使用霜?jiǎng)┗蛳闼阄段镔|(zhì)在皮膚上停留更長(zhǎng)時(shí)間(幾小時(shí)至幾天)。通過活化皮膚細(xì)胞中的OR2AT4所引發(fā)的生理功能通過長(zhǎng)時(shí)間刺激實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)。

刺激對(duì)增殖和遷移的作用

為了得到活化OR2AT4所導(dǎo)致的可能的生理作用的初始證據(jù)，使用刺激HaCaT細(xì)胞和原代角質(zhì)形成細(xì)胞5天。由此可能出現(xiàn)的細(xì)胞凋亡或壞死效果通過使用透射光顯微鏡和隨后的碘化丙啶(PI)染色觀察細(xì)胞形態(tài)揭示，其中只有凋亡或壞死細(xì)胞的穿孔膜通過。使用500μΜ的培育5天后，HaCaT細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞都沒有表現(xiàn)出形態(tài)變化或PI染色。因此可以排除香味物質(zhì)的致死效果(圖16a)。

隨后檢驗(yàn)對(duì)皮膚細(xì)胞的生長(zhǎng)行為是否有影響。為此再次使用刺激HaCaT細(xì)胞5天，并且借助增殖實(shí)驗(yàn)確定細(xì)胞數(shù)量。發(fā)現(xiàn)相對(duì)于對(duì)比樣(0.1％DMSO)將HaCaT細(xì)胞增殖提高了33％(圖16b)。為了證明增殖增長(zhǎng)是由OR2AT4的活化引發(fā)的，使用siRNA或scRNA分別轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞并再次進(jìn)行增殖實(shí)驗(yàn)。用scRNA轉(zhuǎn)染的HaCaT細(xì)胞表現(xiàn)出與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相同的增殖增長(zhǎng)。而siRNA轉(zhuǎn)染卻導(dǎo)致由所引發(fā)效果的顯著減少(圖16b)。

此外，確定使用與拮抗劑覆盆子酮(500μM)或2‐異丁酸苯氧基乙酯(500μM)共轉(zhuǎn)染(1:1)后的細(xì)胞數(shù)。在拮抗劑的存在下增殖減少。覆盆子酮的效果顯著。單獨(dú)的覆盆子和2‐異丁酸苯氧基乙酯對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖沒有顯著影響。

總之，siRNA和拮抗劑實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示出的促生長(zhǎng)活性通過OR2AT4活性調(diào)節(jié)。例如，在表皮再植過程中角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖出現(xiàn)細(xì)微增長(zhǎng)。除了增殖，在該過程中皮膚細(xì)胞的遷移細(xì)微增長(zhǎng)。因此借助瓊脂糖遷移試驗(yàn)檢驗(yàn)細(xì)胞生長(zhǎng)的增多是否伴隨著趨化行為。在試驗(yàn)中將HaCaT細(xì)胞接種至瓊脂糖介質(zhì)混合物，并且對(duì)細(xì)胞在500μM或0.1％DMSO方向上的增殖進(jìn)行持續(xù)5天的觀察。測(cè)量細(xì)胞通過的路徑，或細(xì)胞生長(zhǎng)的面積，證明HaCaT細(xì)胞在方向上的顯著趨化遷移。

總之結(jié)果顯示，通過OR2AT4引發(fā)信號(hào)級(jí)聯(lián)放大，其導(dǎo)致HaCaT細(xì)胞增殖和遷移的增多。

刺激對(duì)MAP激酶磷酸化的作用

促分裂原活化蛋白(MAP)‐激酶在將細(xì)胞外刺激傳輸和轉(zhuǎn)換為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)中起到重要作用，從而調(diào)節(jié)許多過程如細(xì)胞分裂、細(xì)胞增殖或細(xì)胞應(yīng)激。信號(hào)通路包括至少三種通過磷酸化依次激活的激酶：上游MAP‐激酶‐激酶‐激酶(MAPKKK)，下游MAP‐激酶‐激酶(MAPKK)和端位MAP‐激酶(MAPK)。MAP信號(hào)通路根據(jù)其端位MAPK命名，其中最重要的三種是ERK1/2(細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶)‐MAPK，p38‐MAPK和JNK/SAPK(c‐Jun NH2‐端位激酶/應(yīng)激激活磷酸化‐激酶)。

隨后檢驗(yàn)在皮膚細(xì)胞中‐刺激是否激活MAPK‐信號(hào)通路，如果是是哪種信號(hào)通路。為了檢驗(yàn)用500μM刺激HaCaT細(xì)胞0‐30分鐘，分離蛋白質(zhì)并用于蛋白印跡分析檢測(cè)。蛋白印跡結(jié)果顯示在5‐30分鐘內(nèi)Erk1/2‐MAPK和p38‐MAPK磷酸化增多，但是沒有由細(xì)胞刺激引發(fā)的JNK/SAPK磷酸化(圖17a)。HaCaT細(xì)胞的蛋白印跡‐分析的定量化顯示通過刺激三十分鐘Erk1/2‐MAPK和p38‐MAPK磷酸化顯著增多。額外培育MAPK抑制劑SB203580和U0126，分別用于p38MAPK和ERK1/2MAPK，磷酸化再次顯著降低(圖17b)

為了揭示兩種MAPK‐信號(hào)通路的相互作用，在p38‐MAPK‐抑制劑SB203580或Erk1/2‐MAPK‐抑制劑U0126的存在下分別研究Erk1/2‐磷酸化和p38‐MAPK‐磷酸化。相對(duì)于僅使用刺激細(xì)胞，在各自抑制劑的存在下兩種激酶的磷酸化都增多。對(duì)于p38‐MAPK效果更顯著(圖17c)。

總之，結(jié)果示出p38和ERK1/2MAPK通過刺激磷酸化并且存在信號(hào)通路的相互調(diào)節(jié)。

在體外創(chuàng)傷愈合試驗(yàn)中刺激對(duì)人類角質(zhì)形成細(xì)胞的作用

MAP‐激酶p38和Erk1/2通常與表皮創(chuàng)傷愈合中增多的增殖和遷移相關(guān)。因此在進(jìn)一步的生理實(shí)驗(yàn)中研究對(duì)HaCaT細(xì)胞或原代角質(zhì)形成細(xì)胞的融合細(xì)胞層“創(chuàng)傷愈合”的作用。為此使用創(chuàng)面‐劃痕‐試驗(yàn)，其是用于初始檢驗(yàn)角質(zhì)形成細(xì)胞中創(chuàng)面愈合過程所建立的體外方法。在創(chuàng)面‐劃痕‐試驗(yàn)中使用移液管頭在HaCaT細(xì)胞或原代角質(zhì)形成細(xì)胞的融合細(xì)胞層劃出劃痕，并觀察該“創(chuàng)面”兩天。結(jié)果示出，當(dāng)用500μM處理細(xì)胞后，HaCaT‐細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞上的劃痕閉合封閉加快了26％和34％(圖18a和18b)。

為了研究OR2AT4受體在該效果中的作用，檢驗(yàn)兩種拮抗劑覆盆子酮和2‐異丁酸苯氧基乙酯是否會(huì)使通過提高的創(chuàng)面愈合再次降低。為此以相同的比例將分別與一種拮抗劑混合，并再觀察HaCaT細(xì)胞“創(chuàng)面愈合”效果48小時(shí)。發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)使“創(chuàng)面愈合”再次降至常規(guī)水平(圖18c)。這兩種拮抗劑單獨(dú)對(duì)“創(chuàng)面愈合”沒有影響(圖18d)。MAP‐激酶n p38和Erk1/2的作用借助激酶的特異抑制劑檢測(cè)。對(duì)于p38MAPK使用ERK1/2抑制劑SB203580，對(duì)于ERK1/2MAPK使用p38抑制劑U0126。在各個(gè)抑制劑的存在下，“創(chuàng)面愈合”再次降至常規(guī)水平(圖18c)，其確定了p38MAPK和ERK1/2MAPK對(duì)‐引發(fā)的“創(chuàng)面愈合”過程的作用。這兩種抑制劑單獨(dú)對(duì)“創(chuàng)面愈合”沒有影響(圖18d)。

白細(xì)胞介素分泌和Akt蛋白激酶磷酸化的研究

如上所述，對(duì)于培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞在體外創(chuàng)面‐劃痕‐試驗(yàn)中的“創(chuàng)面愈合”有積極作用。創(chuàng)面愈合是一種復(fù)雜過程，包括各種生理過程。為了進(jìn)一步獲得OR2AT4‐活化的信號(hào)級(jí)聯(lián)放大如何改善皮膚細(xì)胞創(chuàng)面愈合的信息，應(yīng)當(dāng)借助定量實(shí)時(shí)PCR和ELISA分析研究HaCaT‐細(xì)胞中刺激后白細(xì)胞介素的產(chǎn)生和分泌。此外，應(yīng)當(dāng)通過蛋白印跡‐分析檢驗(yàn)，參與角質(zhì)形成細(xì)胞分化過程的蛋白激酶Akt是否通過刺激磷酸化。

為了研究白細(xì)胞介素分泌，首先進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR。為此使用提前用刺激6或24小時(shí)的HaCaT細(xì)胞的RNA。使用各種白細(xì)胞介素的特異引物(IL‐1α、IL‐1β、IL‐6、IL‐8)和腫瘤壞死因子(TNFα)進(jìn)行檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)24小時(shí)后，相對(duì)于對(duì)比樣(0.1％DMSO)IL‐1α的表達(dá)提高了約10000％，白細(xì)胞介素IL‐1β的表達(dá)提高了約1700％。對(duì)于其他白細(xì)胞介素，表達(dá)率沒有提高(圖19a)。為了支持這一結(jié)果，進(jìn)行ELISA‐試驗(yàn)，其中細(xì)胞上清液中分泌的白細(xì)胞介素可以通過免疫反應(yīng)檢測(cè)。借助使用的試驗(yàn)，研究了白細(xì)胞介素(IL‐1α、IL‐1β、IL‐2、IL‐4、IL‐6、IL‐8、IL‐10、IL‐12和IL‐17α)、TNFα、γ‐干擾素(IFNγ)、和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GMCSF)的分泌。用刺激24小時(shí)后，僅對(duì)于IL‐1α可見相對(duì)于對(duì)比樣(0.1％DMSO)顯著提高的分泌。HaCaT細(xì)胞表現(xiàn)出極高的IL‐8分泌，但是并不顯著高于對(duì)比樣(0.1％DMSO)(圖19b)。

除了已經(jīng)檢驗(yàn)的磷酸化激酶，研究蛋白質(zhì)激酶Akt的磷酸化。為此用刺激HaCaT細(xì)胞0、5、15和30分鐘并通過蛋白印跡‐分析和針對(duì)非磷酸化或磷酸化形式的Akt蛋白的特異抗體，研究磷酸化。發(fā)現(xiàn)Akt‐激酶在刺激五分中內(nèi)磷酸化，并且刺激更長(zhǎng)(15或30分鐘)該效果進(jìn)一步提高(圖19c)。

總之結(jié)果證明通過提高了IL‐1α的表達(dá)和分泌，并且參與人類角質(zhì)形成細(xì)胞分化過程的蛋白質(zhì)激酶Akt被激活。

附圖說(shuō)明

在下文中本發(fā)明通過大量附圖詳細(xì)說(shuō)明，其內(nèi)容討論如下。

圖1

OR2AT4在Hana3A細(xì)胞中的異源表達(dá)。用OR2AT4瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的Hana3A細(xì)胞(頂行)在使用α‐Rho‐AKs(紅色)和α‐OR2AT4‐AKs(綠色)的免疫細(xì)胞化學(xué)染色中表現(xiàn)出清楚的疊加。相反，在用OR1A2s瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的Hana3A細(xì)胞的對(duì)比染色中(底行)，只有視紫質(zhì)染色可見。為了確定細(xì)胞的位置和數(shù)量，平行進(jìn)行細(xì)胞核染色(DAPI，藍(lán)色)。使用共聚焦顯微鏡獲得熒光圖像。尺寸：20μm。

圖2

OR2AT4在Hana3A‐細(xì)胞中的膜表達(dá)。圖2a示出了使用α‐Rho‐Ak的Hana3A細(xì)胞活細(xì)胞染色。左側(cè)：OR2AT4瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的Hana3A細(xì)胞表現(xiàn)出膜染色。右側(cè)：未轉(zhuǎn)染的Hana3A細(xì)胞未表現(xiàn)出視紫質(zhì)染色。使用共聚焦顯微鏡獲得熒光圖像。尺寸：20μm。圖2b中給出了活細(xì)胞染色的定量分析。為了確定轉(zhuǎn)染率，在熒光顯微鏡下計(jì)算總細(xì)胞數(shù)和轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)。示出的是包括標(biāo)準(zhǔn)誤差的三次獨(dú)立轉(zhuǎn)染的平均細(xì)胞數(shù)。

圖3

重組表達(dá)OR2AT4受體域的確定。如3a示出了用(1mM)刺激兩次(每次20s，水平桿)的瞬時(shí)OR2AT4‐表達(dá)Hana3A細(xì)胞的代表鈣成像痕跡。作為對(duì)比，用刺激未轉(zhuǎn)染的Hana3A細(xì)胞。在每次測(cè)試的最后使用100μΜATP作為陽(yáng)性對(duì)照刺激。圖3b示出鈣成像測(cè)定的分析，其中使用各種檀香木香味物質(zhì)(1mM)刺激瞬時(shí)OR2AT4‐表達(dá)Hana3A細(xì)胞。示出了相對(duì)于Ringer對(duì)比樣的包括標(biāo)準(zhǔn)偏差的細(xì)胞平均響應(yīng)率。測(cè)定量：Ringer(23)、(22)、(14)、爪哇檀香(15)、Sandranol(18)、聚檀香醇(14)、環(huán)己異龍腦酯(14)、檀木油(14)。Isobornyl.：環(huán)己異龍腦酯；S.：檀木油。多重比較的Kruskal‐Wallis試驗(yàn)。*:p<0.05。圖3c示出了雙螢光素酶測(cè)定的評(píng)價(jià)。確定了OR2AT4‐pcDNA3轉(zhuǎn)染的Hana3A細(xì)胞和無(wú)插入pcDNA3轉(zhuǎn)染的Hana3A細(xì)胞之間的顯著水準(zhǔn)。點(diǎn)標(biāo)記示出了包括標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均歸一化熒光素酶‐活性。曼‐惠特尼U檢驗(yàn)(Mann‐Whitney U test)；n＝3次試驗(yàn).*:p<0.05；**:p<0.01；***:p<0.001。

圖4

重組表達(dá)OR2AT4的拮抗劑。該圖示出使用(藍(lán)色痕跡)、+2,6‐二甲基‐2‐庚醇(淡藍(lán)色痕跡)、Sandalore+2‐異丁酸苯氧基乙酯(灰色痕跡)或+覆盆子酮(黑色痕跡)刺激兩次的瞬時(shí)OR2AT4‐轉(zhuǎn)染Hana3A細(xì)胞的代表鈣成像痕跡。在每次測(cè)試的最后使用100μΜATP作為陽(yáng)性對(duì)照刺激。圖4b示出了用不同香味物質(zhì)(1mM)刺激的瞬時(shí)OR2AT4‐表達(dá)Hana3A細(xì)胞的代表鈣成像測(cè)定分析。示出了相對(duì)于Ringer對(duì)比樣包括標(biāo)準(zhǔn)偏差的細(xì)胞平均響應(yīng)率。測(cè)定量：Ringer(23)、(22)、+2,6‐二甲基‐2‐庚醇(11)、2,6‐二甲基‐2‐庚醇(11)、2‐異丁酸苯氧基乙酯(14)、+2‐異丁酸苯氧基乙酯(22)、覆盆子酮(12)和+覆盆子酮(20)。S:。多重比較的Kruskal‐Wallis試驗(yàn).*:p<0,05。

圖5

OR2AT4的受體域以及香味物質(zhì)的結(jié)構(gòu)式。受體域包括激動(dòng)劑(內(nèi)圈)、非活性物質(zhì)(灰圈)、和拮抗劑(上部方形)。對(duì)于測(cè)試的檀香木油，使用例如兩種主要成分α‐白檀油烯醇和β‐白檀油烯醇

圖6

OR2AT4在不同人類細(xì)胞類型和組織中的表達(dá)。為了檢測(cè)OR2AT4使用不同人類RNA‐樣本(“+”)的cDNA進(jìn)行PCR‐分析?；讴\RT樣本(“‐”)排除了基因組DNA的污染。片段尺寸：OR2AT4(400bp)、β‐Aktin(250bp)。M:標(biāo)記子，P:細(xì)胞培養(yǎng)通道。

圖7

OR2AT4在HaCaT細(xì)胞和人類原代角質(zhì)形成細(xì)胞中蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)。圖7a示出HaCaT細(xì)胞和原代角質(zhì)形成細(xì)胞，其在使用sα‐OR2AT4‐Ak(紅色)中表現(xiàn)出清晰的免疫細(xì)胞化學(xué)染色。圖7b示出在使用封閉肽(封閉肽，OR2AT4‐Ak與封閉肽的比例為1:2)的對(duì)比染色中染色顯著降低。為了確定細(xì)胞的位置和數(shù)量，平行進(jìn)行細(xì)胞核染色(DAPI，藍(lán)色)。使用共聚焦顯微鏡獲得熒光圖像。尺寸：20μm。

圖8

OR2AT4在人類皮膚切片中的表達(dá)。在圖8a中使用α‐OR2AT4‐Ak(綠色)的表皮角質(zhì)形成細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的免疫細(xì)胞化學(xué)染色。圖8b示出對(duì)比染色，其中用兔血清替代初級(jí)抗體；在這種情況下，染色顯著降低。上部：400倍放大；下部：截面圖。E:表皮，D:真皮，B:基底層。

圖9

OR2AT4配體對(duì)培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的作用。在A)原代角質(zhì)形成細(xì)胞(n＝175細(xì)胞)和B)HaCaT細(xì)胞(n＝186細(xì)胞)中通過用(500μΜ)重復(fù)刺激在鈣成像實(shí)驗(yàn)中引發(fā)鈣信號(hào)(水平桿)。左側(cè)：引發(fā)鈣信號(hào)的代表鈣成像痕跡。在每次測(cè)試的最后使用100μΜATP作為陽(yáng)性對(duì)照刺激。右側(cè)：4次施用(500μΜ)的鈣信號(hào)的定量分析。示出了包括標(biāo)準(zhǔn)偏差的單次使用的平均值。曼‐惠特尼U檢驗(yàn)*。:p<0.05。C)和D)：在鈣成像實(shí)驗(yàn)中HaCaT細(xì)胞的劑量依賴活性。示出了第一次(C)和第四次(D)應(yīng)用中不同濃度下的包括標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均幅度。測(cè)量的細(xì)胞數(shù)：0.0125mM(39),0.025mM(30),0.1mM(46),0.5mM(34),1mM(63),2mM(41),10mM(36)。

圖10

間隙連接阻滯劑對(duì)引發(fā)鈣信號(hào)致敏性的作用。A)用間隙連接阻滯劑1‐辛醇(500μM)培育并隨后用(500μM，水平桿)重復(fù)刺激的HaCaT細(xì)胞(左)和原代角質(zhì)形成細(xì)胞(右)的代表鈣信號(hào)痕跡(藍(lán)色痕跡)。黑色痕跡是不用阻滯劑預(yù)培育的重復(fù)‐刺激(對(duì)比)。在每次測(cè)試的最后使用100μΜATP作為陽(yáng)性對(duì)照刺激。用間隙連接阻滯劑1‐辛醇(500μM)或生胃酮(10μΜ)培育并隨后用(500μM)或新鈴蘭醛(1mM)在鈣成像實(shí)驗(yàn)中重復(fù)刺激的HaCaT細(xì)胞(B)和原代角質(zhì)形成細(xì)胞(C)的定量分析。示出了相對(duì)于對(duì)比測(cè)量(不含阻滯劑，施用)單次施用的包括標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均值。曼‐惠特尼U檢驗(yàn)。測(cè)量的細(xì)胞數(shù)：+1‐辛醇(HaCaT(110)，角質(zhì)形成細(xì)胞(26))，HaCaT(74)；或新鈴蘭醛+生胃酮:HaCaT(43)。***:p<0,001。

圖11

在人類角質(zhì)形成細(xì)胞中‐引發(fā)的信號(hào)級(jí)聯(lián)放大的藥理特性。A)‐D)。示出了在阻滯劑存在下原代角質(zhì)形成細(xì)胞的代表鈣成像痕跡(藍(lán)色)。水平桿對(duì)應(yīng)施用時(shí)間。在每次測(cè)試的最后使用100μΜ ATP作為陽(yáng)性對(duì)照刺激。A)使用無(wú)鈣細(xì)胞外液(+10mM EGTA)測(cè)試。B)使用腺苷酸環(huán)化酶阻滯劑SQ‐22536(100μΜ)測(cè)試。C)使用磷脂酶‐C阻滯劑U‐73122(10μΜ)。使用100μΜ組胺作為陽(yáng)性對(duì)比。D)使用CNG通道阻滯劑L‐順式‐硫氮酮(150μΜ)測(cè)試。E)HaCaT細(xì)胞和原代角質(zhì)形成細(xì)胞(Kera)藥理測(cè)試概覽。給出了相對(duì)于對(duì)比測(cè)試(虛線)的平均幅度。MDL‐12330A(40μΜ)。EGTA：無(wú)鈣Ringer(HaCaT n＝46,Kera n＝52)，SQ:SQ‐22536(HaCaT n＝60,Kera n＝26)，MDL:MDL‐12330A(HaCaT n＝69,Kera n＝24)，U‐73122(HaCaT n＝41,Kera n＝25)，L‐cis‐D.:L‐順式‐硫氮酮(HaCaT n＝41,Kera n＝25)。曼‐惠特尼U檢驗(yàn)。***:p<0.001。F)刺激后通過cAMP‐GloTM試驗(yàn)確定HaCaT細(xì)胞的cAMP含量。點(diǎn)標(biāo)記示出了刺激(1μΜ‐10000μΜ)10分鐘后包括標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均cAMP含量。確定了用刺激的HaCaT細(xì)胞和用等體積DMSO(0.2％)刺激的HaCaT細(xì)胞之間的顯著水準(zhǔn)。多重比較的Kruskal‐Wallis試驗(yàn)；n＝3次試驗(yàn)。*:p<0.05。

圖12

通過NGS‐數(shù)據(jù)和RT‐PCR進(jìn)行信號(hào)級(jí)聯(lián)放大成分和結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)分析。A)NGS結(jié)果和進(jìn)行的RT‐PCR概覽。NGS‐數(shù)據(jù)結(jié)果以FPKM數(shù)值給出。用(√)標(biāo)識(shí)RT‐PCR實(shí)驗(yàn)中成功檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄本；沒有檢測(cè)到用(x)表示。k.A.:沒有數(shù)據(jù)。嗅覺信號(hào)級(jí)聯(lián)放大成分用(*)表示。B)不同信號(hào)級(jí)聯(lián)放大成分的RT‐PCR。片段尺寸：AC3(311bp)、ANO1(288bp)、ANO6(432bp)、ANO8(427bp)、ANO9(416bp)、ANO10(373bp)、CNGA1(2790bp)、CNGB1(288bp)、GNAL(485bp)。M：標(biāo)記子，K:對(duì)比樣，GNAL:GαolfR亞單元，GNAS:G·SR亞單元，ADCY:腺苷酸環(huán)化酶，ANO:anoctamin(透膜蛋白16)。

圖13

通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色進(jìn)行的AC3和CNGA1的表達(dá)分析。A)使用特異抗體α‐Gαolf、α‐CNGA1和α‐AC3，HaCaT細(xì)胞和原代角質(zhì)形成細(xì)胞表現(xiàn)出清晰的免疫細(xì)胞化學(xué)染色。僅用第二種抗體的染色用作對(duì)比。為了確定細(xì)胞的位置和數(shù)量，平行進(jìn)行細(xì)胞核染色(DAPI，藍(lán)色)。使用共聚焦顯微鏡獲得熒光圖像。尺寸：20μm。B)通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)AC3在人類皮膚切片中的表達(dá)。當(dāng)使用α‐AC3‐Ak時(shí)(綠色)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞表現(xiàn)出清晰的免疫細(xì)胞化學(xué)染色。在對(duì)比染色中，其中用兔血清替代初級(jí)抗體，不可見特異染色。400倍放大。E:表皮，D:真皮，B:基底層。

圖14

用于驗(yàn)證OR2AT4在HaCaT細(xì)胞內(nèi)Sandalore引發(fā)鈣信號(hào)作用的RNA‐干擾‐實(shí)驗(yàn)。A)測(cè)定siRNA在Hana3A細(xì)胞中活性的雙熒光素酶檢測(cè)。示出了用siRNA或scRNA和受體載體pmirGLO‐OR2AT4共轉(zhuǎn)染的Hana3A細(xì)胞相對(duì)于僅用pmirGLO‐OR2AT4轉(zhuǎn)染的Hana3A細(xì)胞的歸一化熒光信號(hào)(螢火蟲/海腎)。曼‐惠特尼U檢驗(yàn)，n＝3次試驗(yàn)。***:p<0.001。B)左側(cè)：用siRNA或scRNA表達(dá)質(zhì)粒和α‐OR2AT4‐Ak轉(zhuǎn)染的HaCaT細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)染色(紅色)。通過GFP表達(dá)(綠色)確定siRNA或scRNA‐表達(dá)細(xì)胞。右側(cè)：定量分析示出與scRNA‐表達(dá)細(xì)胞(n＝17個(gè)細(xì)胞)相比siRNA‐表達(dá)細(xì)胞(n＝17個(gè)細(xì)胞)中顯著減少的α‐OR2AT4染色。示出了相對(duì)于scRNA‐表達(dá)細(xì)胞的包括標(biāo)準(zhǔn)偏差的siRNA‐表達(dá)細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度。曼‐惠特尼U檢驗(yàn)。**:p<0.01。C)用兩種siRNAs混合物轉(zhuǎn)染的HaCaT細(xì)胞的透射光圖像和熒光圖像。尺寸：50μm。D)鈣成像測(cè)定的熒光圖像。通過GFP的共表達(dá)確定siRNA‐表達(dá)細(xì)胞(圓圈)并且示出了用刺激細(xì)胞內(nèi)鈣濃度沒有增多。E)(500μΜ，水平桿)重復(fù)刺激siRNA(藍(lán)色痕跡)或scRNA(黑色痕跡)轉(zhuǎn)染的HaCaT細(xì)胞的代表鈣成像痕跡。在每次測(cè)試的最后使用100μΜATP作為陽(yáng)性對(duì)照刺激。F)siRNA和scRNA表達(dá)細(xì)胞中引發(fā)鈣信號(hào)的定量分析。首先將鈣信號(hào)的幅度標(biāo)準(zhǔn)化至ATP，并隨后相對(duì)于scRNA‐表達(dá)HaCaT細(xì)胞表達(dá)siRNA‐表達(dá)細(xì)胞。示出了包括標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均值。曼‐惠特尼U檢驗(yàn)，n＝18個(gè)細(xì)胞(siRNA)，n＝17個(gè)細(xì)胞(scRNA)。*:p<0.05；**:p<0.01。

圖15

OR2AT4拮抗劑對(duì)HaCaT細(xì)胞中引發(fā)鈣信號(hào)的作用。A)使用(1mM)重復(fù)刺激的HaCaT細(xì)胞的代表鈣成像痕跡。在第三次施用中，進(jìn)行(藍(lán)黑痕跡)刺激或+2,6‐二甲基‐2‐庚醇(淡藍(lán)色痕跡)、+覆盆子酮(黑色痕跡)或+2‐異丁酸苯氧基乙酯(棕色痕跡)的共刺激。在每次測(cè)試的最后使用100μΜ ATP作為陽(yáng)性對(duì)照刺激。水平桿對(duì)應(yīng)施用時(shí)間。香味物質(zhì)：1mM。B)單獨(dú)使用的刺激或與2,6‐二甲基‐2‐庚醇、2‐異丁酸苯氧基乙酯或覆盆子酮的共刺激的鈣信號(hào)的定量分析。S.:。示出了包括標(biāo)準(zhǔn)偏差的第三次施用的平均值。曼‐惠特尼U檢驗(yàn)。***:p<0.001。測(cè)定的細(xì)胞量：(121)、+覆盆子酮(43)、+2‐異丁酸苯氧基乙酯(67)、Sandalore+2,6‐二甲基‐2‐庚醇(120)。C)使用拮抗劑覆盆子酮和2‐異丁酸苯氧基乙酯研究引發(fā)鈣信號(hào)的劑量依賴性抑制。在第三次施用中使用不同濃度的(500‐1000μΜ)和一種拮抗劑(100‐500μΜ)共刺激HaCaT細(xì)胞。為了可以比較香味物質(zhì)引發(fā)的鈣信號(hào)，將第三次施用的幅度標(biāo)準(zhǔn)化至前次施用。示出了包括標(biāo)準(zhǔn)偏差的標(biāo)準(zhǔn)化香味物質(zhì)引發(fā)鈣信號(hào)相對(duì)于對(duì)比細(xì)胞的平均值(未用拮抗劑，施用)。曼‐惠特尼U檢驗(yàn)。***:p<0.001。D)由C)給出的500μΜ數(shù)據(jù)計(jì)算兩種拮抗劑的IC50值。

圖16

長(zhǎng)期刺激對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)和遷移過程的作用。A)用(500μΜ)刺激或0.1％DMSO(對(duì)比)刺激五天后HaCaT細(xì)胞和原代角質(zhì)形成細(xì)胞的相對(duì)比圖像和PI染色。陽(yáng)性PI染色中，細(xì)胞核被染成紅色。尺寸：100μm。B)在用500μΜ或0.1％DMSO(對(duì)比)刺激五天后的HaCaT細(xì)胞上使用CyQuant細(xì)胞增殖試劑盒進(jìn)行增殖試驗(yàn)的評(píng)估。對(duì)于RNA干擾實(shí)驗(yàn)，在刺激前用siRNA或scRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。示出了相對(duì)于未處理細(xì)胞的包括標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均細(xì)胞量。曼‐惠特尼U檢驗(yàn)；n＝3次試驗(yàn)。*:p<0.05；**:p<0.01。S:。C)測(cè)定HaCaT細(xì)胞遷移的瓊脂糖試驗(yàn)。頂部：在(500μΜ)或0.1％DMSO方向上遷移的的HaCaT細(xì)胞的透射光圖像。細(xì)胞的生長(zhǎng)邊界被黑色環(huán)繞。尺寸：250μm。底部：遷移試驗(yàn)的評(píng)估。測(cè)定了細(xì)胞的最長(zhǎng)遷移路徑以及生長(zhǎng)面積并與對(duì)比樣(0.1％DMSO)相比。雙側(cè)配對(duì)T檢驗(yàn)。包括標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均值；n＝4次試驗(yàn)。**:p<0.01；***:p<0.001。

圖17

刺激對(duì)皮膚細(xì)胞中MAP激酶磷酸化的作用。A)用于檢測(cè)(500μΜ)刺激0、5、15和30分鐘的HaCaT細(xì)胞中MAP激酶磷酸化的蛋白印跡分析。為了確定均勻的蛋白質(zhì)量，α‐微管蛋白被用作對(duì)比樣。ERK1/2:42/44kDa；p38:43kDa；JNK/SAPK:46/54kDA；α‐微管蛋白:52kDa。B)用(500μΜ)或額外用p38抑制劑SB203580(10μΜ)或ERK1/2抑制劑U0126(10μΜ)刺激30分鐘的HaCaT細(xì)胞的p38和ERK1/2磷酸化的定量分析。為了進(jìn)行分析確定磷酸化(p)和未磷酸化蛋白質(zhì)的比例并與未處理細(xì)胞相比。平均值包括標(biāo)準(zhǔn)偏差。曼‐惠特尼U檢驗(yàn)。*:p<0.05；***:p<0.001。在C)中，使用了其他MAP激酶的抑制性以及磷酸化與單獨(dú)使用(500μΜ)刺激的細(xì)胞相比。平均值包括標(biāo)準(zhǔn)偏差。曼‐惠特尼U檢驗(yàn)。*:p<0.05。使用三種不同的蛋白分離物進(jìn)行蛋白印跡分析。

圖18

在體外“創(chuàng)傷愈合”實(shí)驗(yàn)中刺激對(duì)人類角質(zhì)形成細(xì)胞的作用。在(500μΜ)或0.1％DMSO作為對(duì)比樣的存在下，通過創(chuàng)面‐劃痕‐試驗(yàn)研究A)原代角質(zhì)形成細(xì)胞和B)HaCaT細(xì)胞的“創(chuàng)傷愈合率”。左側(cè)：不同時(shí)間電觀察的“創(chuàng)面”透射光圖像。細(xì)胞的生長(zhǎng)邊界被黑色包圍。尺寸：200μm。右側(cè)：創(chuàng)面‐劃痕‐試驗(yàn)的定量分析。測(cè)定創(chuàng)面的面積并與初始創(chuàng)面(0h)相比。平均值包括標(biāo)準(zhǔn)偏差。曼‐惠特尼U檢驗(yàn)；n＝4次試驗(yàn)。*:p<0.05；***:p<0.001。C)在(500μΜ)和一種選自覆盆子酮(500μM)或2‐異丁酸苯氧基乙酯(500μM)的拮抗劑或p38MAPK抑制劑SB203580(10μΜ)或ERK1/2MAPK抑制劑U0126(10μΜ)的存在下進(jìn)行創(chuàng)面‐劃痕‐試驗(yàn)。測(cè)定的處理細(xì)胞的創(chuàng)面面積(刺激48小時(shí)后)與對(duì)比樣(0.1％DMSO)相比。平均值包括標(biāo)準(zhǔn)偏差。多重比較的Kruskal‐Wallis試驗(yàn)；n＝3次試驗(yàn)。*:p<0.05。D)C)中使用覆盆子酮(500μM)或2‐異丁酸苯氧基乙酯(500μM)或SB203580(10μΜ)或U0126(10μΜ)進(jìn)行的創(chuàng)面‐劃痕‐試驗(yàn)的對(duì)比。將處理細(xì)胞的創(chuàng)面面積與對(duì)比樣(0.1％DMSO)相比。包括平均值。

圖19

刺激后白細(xì)胞介素分泌和Akt蛋白激酶磷酸化的研究。A)通過qRT‐PCR研究用(500μΜ)刺激6小時(shí)和24小時(shí)后的HaCaT細(xì)胞中白細(xì)胞介素的調(diào)節(jié)。0.1％DMSO用作對(duì)比樣。GAPDH用作參考基因，并且確定了未處理和刺激細(xì)胞之間的相對(duì)表達(dá)。平均值包括標(biāo)準(zhǔn)偏差。n＝3次試驗(yàn)。B)ELISA試驗(yàn)檢測(cè)用(500μΜ)刺激24小時(shí)后的HaCaT細(xì)胞上清液中的白細(xì)胞介素。0.1％DMSO用作對(duì)比樣。表達(dá)了相對(duì)于背景測(cè)定的處理細(xì)胞在450nm的光密度。使用了三次獨(dú)立刺激的上清液。平均值包括標(biāo)準(zhǔn)偏差。曼‐惠特尼U檢驗(yàn)。*:p<0.05。C)用于檢測(cè)(500μΜ)刺激0、5、15和30分鐘的HaCaT細(xì)胞的Akt蛋白激酶的磷酸化的蛋白印跡。Akt(60kDA)；p‐Akt:磷酸化Akt蛋白質(zhì)(60kDA)。