本申請要求2014年8月8日提交的標題為“凋亡小體”的美國臨時專利申請?zhí)?2/035,246(代理人案號064693-0302)的權(quán)益，其全部內(nèi)容以引用的方式并入本文。

技術(shù)領(lǐng)域

本公開涉及凋亡小體。本公開具體地涉及一種包含凋亡小體的組合物。本公開還涉及由干細胞制備凋亡小體。本公開還涉及包括使用包含凋亡小體的組合物的醫(yī)學治療。

相關(guān)技術(shù)描述

本公開總體上涉及細胞療法和細胞治療產(chǎn)品。細胞治療產(chǎn)品的一些實例包括干細胞來源的產(chǎn)品和干細胞，諸如來自間充質(zhì)干細胞、造血干細胞、胚胎干細胞和臍帶血干細胞的那些；癌癥療法和免疫療法，諸如樹突細胞疫苗；活化的T淋巴細胞或B淋巴細胞、單核細胞以及修飾的或未修飾的癌細胞、同種異體胰島細胞、用于骨再生的骨形成細胞、用于軟骨修復(fù)的軟骨細胞、角質(zhì)形成細胞、成纖維細胞和肝細胞。參見，例如，Wonnacott K.“Cellular Therapy Products”Food and Drug Administration,Web Seminar Series,UCM273197。這個出版物的全部內(nèi)容以引用的方式并入本文。

細胞治療產(chǎn)品的實例為包含間充質(zhì)干細胞(MSC)的組合物。MSC擁有多潛能分化潛力和調(diào)控免疫應(yīng)答的能力。例如，參見Uccelli等“Mesenchymal stem cells in health and disease”(2008)Nat.Rev.Immunol.8:726-736；Nauta等“Immunomodulatory properties of mesenchymal stromal cells”(2007)Blood 110:3499-3506；和Aggarwal等“Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses”(2005)Blood 105:1815–1822；這些出版物的全部內(nèi)容以引用的方式并入本文。MSC已經(jīng)顯示在體外或體內(nèi)分化成的細胞類型包括成骨細胞、軟骨細胞、肌細胞、脂肪細胞、內(nèi)皮細胞和β-胰島支持細胞。

MSC具有較大自我更新能力，同時保持其多潛能性。證實多潛能性的標準測試是細胞分化為成骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞以及可能的神經(jīng)元樣細胞。然而，培養(yǎng)物將分化的程度因個體和誘導(dǎo)分化的方式(例如，化學對比機械)而不同。已知細胞增殖和分化的能力隨供體的年齡以及培養(yǎng)時間降低。

公開了人MSC可以避免同種識別、干擾樹突細胞和T細胞功能并通過分泌細胞因子產(chǎn)生局部免疫抑制微環(huán)境。還公開了當細胞暴露于特征在于存在升高的局部干擾素-γ水平的炎性環(huán)境時，可增強人MSC的免疫調(diào)節(jié)功能。

因此，MSC可用于組織再生和免疫療法。例如，參見Le Blanc等“Mesenchymal stem cells for treatment of steroid-resistant,severe,acute graft-versus-host disease:a phase II study”(2008)Lancet 371:1579-1586；Sun等“Mesenchymal stem cell transplantation reverses multiorgan dysfunction in systemic lupus erythematosus mice and humans”(2009)Stem Cells 27:1421-1432；和Akiyama等“Mesenchymal-stem-cell-induced immunoregulation involves FAS-ligand-/FAS-mediated T cell apoptosis”(2012)Cell Stem Cell 10:544-555；這些出版物的全部內(nèi)容以引用的方式并入本文。

然而，仍然需要其他來源的細胞治療產(chǎn)品和用于其制備的新方法，以及此類產(chǎn)品用于醫(yī)學治療的用途。

概述

本公開涉及凋亡小體。本公開具體地涉及一種包含凋亡小體的組合物。本公開還涉及由干細胞制備凋亡小體。優(yōu)選地，凋亡小體由多潛能干細胞或多能干細胞、而不是全能干細胞制備。更優(yōu)選地，凋亡小體由多潛能干細胞、而不是多能干細胞或全能干細胞制備。本公開還涉及包括使用包含凋亡小體的組合物的醫(yī)學治療。

本公開涉及一種組合物。所述組合物可適合于治療哺乳動物。所述組合物可包含凋亡小體。凋亡小體可包含凋亡干細胞。

在本公開中，凋亡干細胞可包括任何凋亡干細胞。例如，凋亡干細胞可包括凋亡間充質(zhì)干細胞、凋亡胚胎干細胞、凋亡胎兒干細胞、凋亡成體干細胞、凋亡羊膜干細胞、凋亡臍帶血干細胞、凋亡誘導(dǎo)的多能干細胞或其組合。例如，凋亡干細胞可包括凋亡間充質(zhì)干細胞。例如，凋亡干細胞可包括凋亡骨髓來源的間充質(zhì)干細胞、凋亡牙髓干細胞、來自人脫落乳牙的凋亡干細胞、凋亡牙周韌帶干細胞、凋亡牙囊干細胞、凋亡牙胚祖細胞、來自根尖牙乳頭(apical papilla)的凋亡干細胞、凋亡口腔上皮祖細胞/干細胞、凋亡牙齦來源的間充質(zhì)干細胞、凋亡骨膜來源的干細胞、凋亡唾液腺來源的干細胞或其組合。例如，凋亡干細胞可包括來源于培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞的凋亡小體、來源于未培養(yǎng)的牙齦來源的間充質(zhì)干細胞的凋亡小體、凋亡牙髓干細胞、凋亡骨髓來源的干細胞或其組合。

在本公開中，凋亡干細胞可通過干細胞的細胞凋亡來獲得，例如，干細胞的細胞凋亡可通過饑餓法、紫外線照射法、熱應(yīng)力法、星形孢菌素法或其組合進行誘導(dǎo)。

例如，凋亡干細胞可通過將干細胞在無血清培養(yǎng)基中孵育1小時至1,000小時范圍內(nèi)的時間段來獲得。或者，凋亡干細胞可通過將干細胞在無血清培養(yǎng)基中孵育10小時至100小時范圍內(nèi)的時間段來獲得。

在另一個實例中，凋亡干細胞可通過在30℃至100℃范圍內(nèi)的溫度下加熱干細胞持續(xù)預(yù)定時間段來獲得?；蛘撸蛲龈杉毎赏ㄟ^在30℃至100℃范圍內(nèi)的溫度下加熱干細胞1分鐘至1,000分鐘范圍內(nèi)的時間段來獲得?；蛘?，凋亡干細胞可通過在30℃至100℃范圍內(nèi)的溫度下加熱干細胞10分鐘至100分鐘范圍內(nèi)的時間段來獲得?；蛘?，凋亡干細胞可通過在40℃至70℃范圍內(nèi)的溫度下加熱干細胞持續(xù)預(yù)定時間來獲得。或者，凋亡干細胞可通過在40℃至70℃范圍內(nèi)的溫度下加熱干細胞1分鐘至1,000分鐘范圍內(nèi)的時間段來獲得?；蛘?，凋亡干細胞可通過在40℃至70℃范圍內(nèi)的溫度下加熱干細胞10分鐘至100分鐘范圍內(nèi)的時間段來獲得。

然而，在另一個實例中，凋亡干細胞可通過用1nm星形孢菌素至10,000nM星形孢菌素范圍內(nèi)的量的星形孢菌素處理干細胞持續(xù)1小時至1,000小時范圍內(nèi)的時間段來獲得?；蛘?，凋亡干細胞可通過用1nm星形孢菌素至10,000nM星形孢菌素范圍內(nèi)的量的星形孢菌素處理干細胞持續(xù)5小時至100小時范圍內(nèi)的時間段來獲得?；蛘?，凋亡干細胞可通過用100nm星形孢菌素至1,000nM星形孢菌素范圍內(nèi)的量的星形孢菌素處理干細胞持續(xù)1小時至1,000小時范圍內(nèi)的時間段來獲得?；蛘撸蛲龈杉毎赏ㄟ^用100nm星形孢菌素至1,000nM星形孢菌素范圍內(nèi)的量的星形孢菌素處理干細胞持續(xù)5小時至100小時范圍內(nèi)的時間段來獲得。或者，凋亡干細胞可通過用1nm星形孢菌素至10,000nM星形孢菌素范圍內(nèi)的量的星形孢菌素處理無血清培養(yǎng)基中的干細胞持續(xù)1小時至1,000小時范圍內(nèi)的時間段來獲得?；蛘?，凋亡干細胞可通過用1nm星形孢菌素至10,000nM星形孢菌素范圍內(nèi)的量的星形孢菌素處理無血清培養(yǎng)基中的干細胞持續(xù)5小時至100小時范圍內(nèi)的時間段來獲得?；蛘撸蛲龈杉毎赏ㄟ^用100nm星形孢菌素至1,000nM星形孢菌素范圍內(nèi)的量的星形孢菌素處理無血清培養(yǎng)基中的干細胞持續(xù)1小時至1,000小時范圍內(nèi)的時間段來獲得?；蛘?，凋亡干細胞可通過用100nm星形孢菌素至1,000nM星形孢菌素范圍內(nèi)的量的星形孢菌素處理無血清培養(yǎng)基中的干細胞持續(xù)5小時至100小時范圍內(nèi)的時間段來獲得。

然而，在另一個實例中，凋亡干細胞可通過在100nm至400nm范圍內(nèi)的波長下照射干細胞持續(xù)0.1分鐘至1,000分鐘范圍內(nèi)的時間段來獲得。或者，凋亡干細胞可通過在對于UV燈100nm至400nm范圍內(nèi)的波長下照射干細胞持續(xù)1分鐘至100分鐘范圍內(nèi)的時間段來獲得。

本公開還涉及一種用于制備本公開的組合物的方法。所述制備方法可例如包括誘導(dǎo)干細胞的細胞凋亡且由此制備包含凋亡干細胞的凋亡小體。

在所述制備方法中，干細胞可包括任何干細胞。例如，干細胞可包括胚胎干細胞、胎兒干細胞、成體干細胞、羊膜干細胞、臍帶血干細胞、誘導(dǎo)的多能干細胞或其組合。例如，干細胞可包括間充質(zhì)干細胞。例如，干細胞可包括骨髓來源的間充質(zhì)細胞、牙髓干細胞、來自人脫落乳牙的干細胞、牙周韌帶干細胞、牙囊干細胞、牙胚祖細胞、來自根尖牙乳頭的干細胞、口腔上皮祖細胞/干細胞、牙齦來源的間充質(zhì)干細胞、骨膜來源的干細胞、唾液腺來源的干細胞或其組合。例如，干細胞可包括培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞、未培養(yǎng)的牙齦來源的間充質(zhì)干細胞、牙髓干細胞、骨髓來源的干細胞或其組合。

例如，在本公開中，細胞凋亡可通過饑餓法、紫外線照射法、熱應(yīng)力法、星形孢菌素法或其組合進行誘導(dǎo)。

在本公開中，凋亡小體可例如通過離心進行收集。

所述制備方法還可包括通過熒光顯微術(shù)技術(shù)、流式細胞術(shù)技術(shù)、離心技術(shù)或其組合來鑒定、定量和/或分離凋亡小體。

本公開還涉及一種治療人受試者的方法。所述治療方法可例如包括向人受試者施用有效量的組合物并且由此治療所述人受試者，所述組合物包含含有人凋亡干細胞的凋亡小體。

在本公開中，治療可包括治療疾病。所述疾病可例如包括炎癥、自身免疫性疾病、由卵巢切除術(shù)引起的骨丟失、腫瘤形成和/或傷口。

例如，炎癥和/或自身免疫性疾病可以是移植物抗宿主病(GvHD)、糖尿病、類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、自身免疫性腦脊髓炎、全身性紅斑狼瘡(SLE)、多發(fā)性硬化癥(MS)、牙周炎、炎性腸病(IBD)、粘膜炎、結(jié)腸炎、敗血癥等或其組合。例如，炎癥和/或自身免疫性疾病可包括結(jié)腸炎。例如，炎癥和/或自身免疫性疾病可包括全身性紅斑狼瘡。例如，所述疾病可以是由卵巢切除術(shù)引起的骨丟失。例如，所述疾病可以是腫瘤形成。例如，所述腫瘤可以是肝細胞癌、多發(fā)性骨髓瘤或其組合。例如，所述疾病可以是傷口。

在所述治療方法中，人凋亡干細胞可例如包括人凋亡間充質(zhì)干細胞、人凋亡胚胎干細胞、人凋亡胎兒干細胞、人凋亡成體干細胞、人凋亡羊膜干細胞、人凋亡臍帶血干細胞、人凋亡誘導(dǎo)的多能干細胞或其組合。例如，人凋亡干細胞可包括人凋亡間充質(zhì)干細胞。例如，人凋亡干細胞可包括人凋亡骨髓來源的間充質(zhì)細胞、人凋亡牙髓干細胞、來自人的人脫落乳牙的凋亡干細胞、人凋亡牙周韌帶干細胞、人凋亡牙囊干細胞、人凋亡牙胚祖細胞、來自人的根尖牙乳頭的凋亡干細胞、人凋亡口腔上皮祖細胞/干細胞、人凋亡牙齦來源的間充質(zhì)干細胞、人凋亡骨膜來源的干細胞、人凋亡唾液腺來源的干細胞或其組合。例如，人凋亡干細胞可包括來源于人的培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞的凋亡小體、來源于人的未培養(yǎng)的牙齦來源的間充質(zhì)干細胞的凋亡小體、人凋亡牙髓干細胞、人凋亡骨髓來源的干細胞或其組合。

本公開還涉及一種改善干細胞特性的方法(“改善方法”)。所述改善方法可包括使用有效量的本公開的組合物。所述改善方法可包括包含凋亡干細胞的凋亡小體。所述改善方法可改善：(a)骨髓間充質(zhì)干細胞在體內(nèi)和/或體外的集落形成；(b)骨髓間充質(zhì)干細胞在體內(nèi)和/或體外的免疫調(diào)節(jié)；(c)骨髓間充質(zhì)干細胞在體內(nèi)和/或體外的骨生成；(d)骨髓間充質(zhì)干細胞在體內(nèi)和/或體外的脂肪形成；或其組合。例如，所述改善方法可包括改善骨髓間充質(zhì)干細胞在體內(nèi)和/或體外的集落形成。例如，所述改善方法可包括改善骨髓間充質(zhì)干細胞在體內(nèi)和/或體外的免疫調(diào)節(jié)。例如，所述改善方法可包括改善骨髓間充質(zhì)干細胞在體內(nèi)和/或體外的骨生成。例如，所述改善方法可包括改善骨髓間充質(zhì)干細胞在體內(nèi)和/或體外的脂肪形成。

還可進行和遵循本文所述的產(chǎn)品(諸如包含凋亡小體的組合物)、其制備方法及其使用方法的任何組合。

這些以及其他部件、步驟、特征、對象、益處以及優(yōu)點現(xiàn)在將從閱讀以下說明性實施方案的詳述、附圖以及權(quán)利要求的綜述變得顯而易見。

附圖簡述

附圖公開了說明性實施方案。附圖并不列出所有實施方案。此外或作為替代，可使用其他實施方案?？墒÷钥赡苁秋@而易見的或不必要的細節(jié)，以便節(jié)省空間或用于更有效的說明。相反，可在無所公開所有細節(jié)的情況下實踐一些實施方案。當相同的數(shù)字出現(xiàn)在不同附圖中時，它是指相同或相似的部件或步驟。

圖1.GMSC的示意圖。通過星形孢菌素法誘導(dǎo)細胞凋亡。通過使用光學顯微鏡和流式細胞術(shù)分析來檢測細胞凋亡。

圖2.凋亡小體收集的示意圖。

圖3.通過熒光顯微術(shù)進行的凋亡小體鑒定。

圖4.相對計數(shù)法的示意圖以及通過使用此方法獲得的凋亡小體計數(shù)的實驗結(jié)果。

圖5A-B.使用流式細胞分選法的凋亡小體純化和分選。DRAQ5用作熒光標記。

圖6.凋亡小體純化的示意圖和通過此方法純化的細胞的顯微鏡檢查。

圖7A-B.通過凋亡小體進行的小鼠的全身輸注以及BMMSC的收獲的示意圖。實驗CFU數(shù)目示于此圖中。

圖8A-B.通過凋亡小體處理進行的BMMSC體外增殖。(A)細胞顯微鏡檢查和(B)細胞百分比。

圖9A-B.在體外用凋亡小體處理的BMMSC的成骨分化潛力。(A)茜素染色和(B)免疫印跡分析。

圖10A-B.用凋亡小體處理的BMMSC的礦化組織形成潛力。(A)組織顯微鏡檢查和(B)骨體積面積。

圖11A-B.用凋亡小體處理的BMMSC的脂肪形成潛力。(A)油紅O染色和(B)免疫印跡分析。

圖12A-B.通過凋亡小體處理改善BMMSC體外免疫調(diào)節(jié)潛力。

圖13A-D.用凋亡小體處理結(jié)腸炎小鼠。

圖14A-I.用凋亡小體處理切除卵巢的小鼠。

圖15A-G.用凋亡小體處理全身性紅斑狼瘡(SLE)小鼠。

圖16A-B.凋亡小體輸注抑制小鼠肝細胞癌模型中的實體瘤生長。(A)用凋亡小體處理的異種移植腫瘤顯示腫瘤體積減小。(B)HE染色示出與對照腫瘤相比，凋亡小體處理的腫瘤誘導(dǎo)的造血細胞的浸潤。

圖17A-B.凋亡小體處理降低體外腫瘤細胞存活。(A)細胞存活分析表明與凋亡小體共培養(yǎng)以劑量依賴性方式降低腫瘤細胞存活。(B)全基因表達模式的微陣列分析表明凋亡小體處理增加細胞凋亡和溶酶體功能。

圖18.凋亡小體輸注提高多發(fā)性骨髓瘤小鼠模型的存活率。小鼠模型的卡普蘭-邁耶(Kaplan-Meier)存活分析表明凋亡小體處理顯著提高小鼠壽命。

圖19A-E.凋亡小體(AB)腸內(nèi)輸注改善DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎。(A)由于DSS施用可在小鼠中誘導(dǎo)結(jié)腸炎，所以在DSS誘導(dǎo)后約3天輸注約1×10⁷個AB或骨髓間充質(zhì)干細胞(MSC)，并且在DDS誘導(dǎo)后約10天收獲樣品以評價AB的治療作用，并使用MSC腸內(nèi)輸注作為陽性對照。凋亡小體處理顯示：(B)在挽救體重方面與MSC組相比的顯著治療作用和(C)結(jié)腸中的組織學活性指數(shù)降低和降低。(D和E)與結(jié)腸炎組相比，AB處理在結(jié)腸炎誘導(dǎo)后約10天在小鼠中顯示在降低Th1和Th17細胞水平方面的顯著作用。這些實驗結(jié)果證明AB腸內(nèi)輸注可用作治療免疫病癥(諸如結(jié)腸炎)的新方法。

圖20A-C.AB輸注改善小鼠耳打孔模型中的傷口愈合。(A)將約5×10⁶個AB在耳打孔之前或之后輸注到小鼠中。(B和C)在耳打孔后約7天，當與未處理的對照組相比時，AB處理組的耳孔面積顯著減小。

說明性實施方案的詳述

現(xiàn)在討論說明性實施方案。此外或作為替代，可使用其他實施方案。對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可能顯而易見的或不必要的某些細節(jié)可從本公開中省略以提供清楚且簡潔的公開內(nèi)容。相反，可在無所公開的所有細節(jié)的情況下實踐一些實施方案。

在本公開中使用以下首字母縮略詞和縮寫。

AB：凋亡小體

BMMSC：骨髓來源的間充質(zhì)干細胞

BMD：骨礦密度

CFU-F：集落形成單位-成纖維細胞

DFSC：牙囊干細胞

DPSC：牙髓干細胞

DSS：葡聚糖硫酸鈉

FACS：熒光輔助的細胞分選

GMSC：牙齦來源的間充質(zhì)干細胞

GvHD：移植物抗宿主疾病

HE：蘇木精和曙紅

HA/TCP：羥基磷灰石磷酸三鈣

MSC：間充質(zhì)干細胞

nM：納摩爾

OESC：口腔上皮祖細胞/干細胞

PDLSC：牙周韌帶干細胞

PSC：骨膜來源的干細胞

SCAP：來自根尖牙乳頭的干細胞

SGSC：唾液腺來源的干細胞

SHED：來自人脫落乳牙的干細胞

SLE：全身性紅斑狼瘡

TGPC：牙胚祖細胞

UV：紫外線

μm：微米

本公開涉及凋亡小體。本公開具體地涉及一種包含凋亡小體的組合物。本公開還涉及由干細胞制備凋亡小體。本公開還涉及包括使用包含凋亡小體的組合物的醫(yī)學治療。

凋亡小體可以是直徑大約0.5-10μm的囊泡，并且由經(jīng)歷程序性細胞死亡(稱為細胞凋亡)的細胞產(chǎn)生，細胞凋亡可用細胞收縮和核染色質(zhì)的凝聚引發(fā)，接著是膜起泡。細胞器、凝聚的染色質(zhì)及其片段可被封裝在質(zhì)膜中以形成凋亡小體?？赏ㄟ^連續(xù)離心從凋亡細胞中收集凋亡小體，如實施例3中所公開。凋亡小體可被表征為在表面膜上的磷脂酰絲氨酸暴露，其可用膜聯(lián)蛋白V染色和其他表面標記物(諸如TSP-1)進行檢測。約10％的凋亡小體可含有可用Hoechst 33342標記的遺傳物質(zhì)。

本公開還涉及凋亡小體療法(或凋亡小體治療)。凋亡小體治療可包括但不限于，診斷、治療、治愈、愈合、減輕或預(yù)防哺乳動物的疾病或損傷和/或美容治療。所述哺乳動物可以是人。所述哺乳動物可以是非人動物，諸如非人靈長類動物、馬、綿羊、牛、豬、狗、貓和山羊。

本公開還涉及在腫瘤和炎性和/或自身免疫性疾病的治療中使用包含凋亡小體的組合物的方法(“治療方法”)。所述腫瘤的實例可以是肝細胞癌和多發(fā)性骨髓瘤。此類疾病的實例是移植物抗宿主疾病(GvHD)、糖尿病、類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、自身免疫性腦脊髓炎、全身性紅斑狼瘡(SLE)、多發(fā)性硬化癥(MS)、牙周炎、炎性腸病(IBD)、由化學療法或放射療法誘導(dǎo)的消化道粘膜炎、結(jié)腸炎和敗血癥。所述治療方法的另一個實例可以是治療由卵巢切除術(shù)引起的骨丟失。

本公開還涉及在BMMSC的改善中使用包含凋亡小體的組合物的方法(“改善方法”)。改善BMMSC的此類用途的實例包括，用于改善骨髓間充質(zhì)干細胞在體內(nèi)或體外的集落形成、改善骨髓間充質(zhì)干細胞在體內(nèi)或體外的骨生成、改善骨髓間充質(zhì)干細胞在體內(nèi)或體外的脂肪形成、改善骨髓間充質(zhì)干細胞在體內(nèi)或體外的免疫調(diào)節(jié)以及其組合的用途。

適用于治療的組合物可包含凋亡小體。所述組合物可包含可通過干細胞的細胞凋亡制備的凋亡小體。在一個實例中，凋亡小體可包含凋亡干細胞。所述凋亡干細胞可以是通過干細胞的細胞凋亡制備的干細胞。在本公開的所有實施方案中，優(yōu)選凋亡小體由多潛能干細胞或多能干細胞、而不是全能干細胞制備。更優(yōu)選地，凋亡小體由多潛能干細胞、而不是多能干細胞或全能干細胞制備。

在本公開中，所述干細胞可以是哺乳動物的干細胞。所述哺乳動物可以是人。所述哺乳動物可以是非人動物，諸如非人靈長類動物、馬、綿羊、牛、豬、狗、貓和山羊。

在本公開中，人的干細胞可用于制備凋亡干細胞。此類人來源的凋亡干細胞可用于治療人受試者。

本公開涉及組合物。所述組合物可包含凋亡小體。所述組合物可包含含有凋亡小體的細胞培養(yǎng)物。所述組合物可以是藥物或生物制劑。所述組合物可用于凋亡小體治療。

在本公開中，所述組合物可包含含有凋亡干細胞的凋亡小體。

適用于制備示例性組合物的干細胞可以是任何哺乳動物的任何干細胞。例如，所述干細胞可以是經(jīng)歷治療(即，包括使用包含凋亡自體干細胞的凋亡小體的凋亡小體治療，“自體凋亡小體治療”)的哺乳動物的干細胞?；蛘?，所述干細胞可以是除經(jīng)歷治療(即，包括使用包含凋亡同種異體干細胞的凋亡小體的同種異體小體治療，“同種異體凋亡小體治療”)的哺乳動物以外的哺乳動物的干細胞。

以下是適用于制備包含凋亡干細胞的凋亡小體的干細胞的實例。

所述干細胞可以是任何干細胞。干細胞的實例可以是胚胎干細胞、胎兒干細胞、成體干細胞、羊膜干細胞、臍帶血干細胞、誘導(dǎo)的多能干細胞或其組合。

干細胞的實例可包括間充質(zhì)干細胞(MSC)。間充質(zhì)干細胞的實例可包括骨髓來源的間充質(zhì)細胞(BMMSC)、牙髓干細胞(DPSC)、人脫落乳牙干細胞(SHED)、牙周韌帶干細胞(PDLSC)、牙囊干細胞(DFSC)、牙胚祖細胞(TGPC)、根尖牙乳頭干細胞(SCAP)、口腔上皮祖細胞/干細胞(OESC)、牙齦來源的間充質(zhì)干細胞(GMSC)、骨膜來源的干細胞(PSC)、唾液腺來源的干細胞(SGSC)以及其組合。

關(guān)于此類干細胞、適合于此類干細胞的收獲的組織、從此類組織中分離此類干細胞的方法、此類干細胞的擴增以及此類干細胞用于治療的施用方法的詳細公開內(nèi)容，參見，例如，Egusa等“Stem Cells in Dentistry–Part I:Stem Cell Sources”J.Prosthodontic Res.(212)v56,p151-165；Shi等“A composition of stem cells having highly expressed Fas ligand,”WO2015038665A1；Atsuta等“Mesenchymal stem cells inhibit multiple myeloma cells via the Fas/Fas ligand pathway”Stem Cell Research&Therapy,2013,4:111；Le等“Gingiva Derived Stem Cell and Its Application in Immunomodulation and Reconstruction”，U.S.2012/0128636A1；Shi等“A Composition of Mesenchymal Stem Cells”，WO2014210037；Shi等“Compositions and Treatment Methods for Mesenchymal Stem Cell-Induced Immunoregulation,”US20150104428A1；Shi等“High Telomerase Activity Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,Methods of Producing the Same and Pharmaceuticals and Treatment Methods Based Thereon,”US20130330300A1；以及Shi等“Methods and Compositions for Improved Tissue Regeneration by Suppression of Interferon-Gamma and Tumor Necrosis Factor-Alpha,”US20140154220A1。這些出版物各自的全部內(nèi)容以引用的方式并入本文。

在另一個實例中，培養(yǎng)的和/或未培養(yǎng)的MSC可用于制備凋亡小體。在另一個實例中，可使用未培養(yǎng)的和/或培養(yǎng)的GMSC、DPSC或其組合。然而，在另一個實例中，可使用培養(yǎng)的和/或未培養(yǎng)的BMMSC。而且，在另一個實例中，可使用這些未培養(yǎng)的和/或培養(yǎng)的干細胞的組合。

凋亡干細胞由此可由所述干細胞制備。因此，此類凋亡干細胞的實例可以是凋亡間充質(zhì)干細胞、凋亡胚胎干細胞、凋亡胎兒干細胞、凋亡成體干細胞、凋亡羊膜干細胞、凋亡臍帶血干細胞、凋亡誘導(dǎo)多能干細胞以及其組合。例如，所述凋亡干細胞可以是凋亡骨髓來源的間充質(zhì)細胞、凋亡牙髓干細胞、來自人脫落乳牙的凋亡干細胞、凋亡牙周韌帶干細胞、凋亡牙囊干細胞、凋亡牙胚祖細胞、來自根尖牙乳頭的凋亡干細胞、凋亡口腔上皮祖細胞/干細胞、凋亡牙齦來源的間充質(zhì)干細胞、凋亡骨膜來源的干細胞、凋亡唾液腺來源的干細胞或其組合。在其他實例中，所述凋亡干細胞可包括來源于培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞的凋亡小體、來源于未培養(yǎng)的牙齦來源的間充質(zhì)干細胞的凋亡小體、凋亡牙髓干細胞、凋亡骨髓來源的干細胞或其組合。

干細胞的細胞凋亡可通過使用多種方法來實現(xiàn)。例如，凋亡干細胞可通過誘導(dǎo)干細胞的細胞凋亡來制備。干細胞細胞凋亡方法的實例可包括干細胞饑餓法、紫外線照射法、熱應(yīng)力法、星形孢菌素法以及其組合。

細胞凋亡可通過使用多種方法進行檢測。所述檢測方法的實例可以是通過使用光學顯微鏡的檢測、通過使用流式細胞術(shù)的檢測以及其組合。

凋亡小體可通過離心進行收集。

凋亡小體可通過熒光顯微術(shù)技術(shù)、流式細胞術(shù)技術(shù)和/或離心技術(shù)來鑒定、定量和/或純化。

本公開還涉及制備的方法(“制備方法”)。所述制備方法可例如包括獲得(或收獲)包含干細胞的組織，使用所述包含干細胞的組織制備凋亡小體，以及制備包含凋亡小體的組合物。在另一個實例中，所述制備方法可包括獲得(或收獲)包含干細胞的組織，將所述組織分離成細胞，從所述細胞中分選干細胞，使用所述分選的干細胞制備凋亡小體，以及制備包含所述凋亡小體的組合物。然而，在另一個實例中，所述制備方法可包括獲得(或收獲)包含干細胞的組織，將所述組織分離成細胞，從所述細胞中分選干細胞，擴增所述干細胞，使用所述擴增的干細胞制備凋亡小體，以及制備包含所述凋亡小體的組合物。所述制備方法還可包括在分選干細胞之前培養(yǎng)分離的細胞。所述制備方法還可包括分離干細胞。

本公開還涉及施用包含凋亡小體的組合物的方法(“施用方法”)。所述施用方法可包括適合于細胞或組織的施用的任何方法?？梢愿鞣N方式施用(或遞送)包含適合于治療目的的凋亡小體的組合物。例如，它們可輸注、在各個部位注射或手術(shù)植入。

合適的組合物包括，例如，在液體(優(yōu)選水性)培養(yǎng)基中的凋亡小體(或細胞)懸浮液，以及有或無固體支撐物或封裝材料的聚集形式的凋亡小體。所述液體培養(yǎng)基可以是藥學上可接受的液體培養(yǎng)基。所述液體培養(yǎng)基可適合于注射。合適的液體培養(yǎng)基通常是熟知的，并且包括，例如，生理鹽水(有或無葡萄糖和/或鉀)、林格氏溶液、乳酸林格氏溶液和哈特曼氏溶液。

所述組合物可以有效治療哺乳動物的量施用。所述組合物的凋亡小體量(或劑量)可以是有效治療哺乳動物的量。可選擇組合物中凋亡小體的量和/或濃度以提供一定量(的對所治療的哺乳動物來說可接受的組合物)的方便施用。例如，含有高濃度的凋亡小體的液體組合物適合于將相對小體積注射到固體組織中，而含有較低濃度的凋亡小體的液體組合物可有利于通過靜脈內(nèi)輸注施用。合適的液體組合物可含有，例如，約1×10¹個凋亡小體/mL至約1×10¹⁰個凋亡小體/mL、或約1×10⁵個凋亡小體/mL至約1×10⁷個凋亡小體/mL或約1×10⁶個凋亡小體/mL至5×10⁶個凋亡小體/mL。聚集組合物或固體組合物可含有，例如，約1×10¹個凋亡小體/mg至約1×10¹⁰個凋亡小體/g。

所述組合物還可包含載體。所述載體可適合于凋亡小體的宿主。所述載體的實例可呈基質(zhì)、組織、纖維、珠?；蚱渌牧系男问健?/p>

出于治療目的，可將有效量的組合物施用至有需要的哺乳動物。在施用條件下產(chǎn)生所需作用的量的“有效量”是例如，足以抑制炎癥、抑制免疫應(yīng)答或自身免疫應(yīng)答、抑制骨丟失、抑制腫瘤生長或轉(zhuǎn)移、促進傷口愈合、或促進BMMSC的集落形成、骨生成或脂肪形成的量。

通常，所述有效量可包括每次施用約1×10¹個凋亡小體至約1×10¹⁰個凋亡小體、或約1×10⁵個凋亡小體至約1×10⁷個凋亡小體、或約1×10⁶個凋亡小體至5×10⁶個凋亡小體。待施用的凋亡細胞的精確劑量可取決于多種因素，包括哺乳動物的年齡、體重和性別，所治療的疾病及其程度和嚴重性。普通技術(shù)的臨床醫(yī)生可基于這些和其他考慮來確定適當?shù)膭┝亢褪┯梅椒ā?/p>

在本公開中，凋亡干細胞可通過由饑餓法、紫外線照射法、熱應(yīng)力法、星形孢菌素法或其組合誘導(dǎo)的干細胞的細胞凋亡來獲得。這些方法可在無血清培養(yǎng)基中進行。

例如，為了通過饑餓法誘導(dǎo)細胞凋亡，可通過將干細胞在無血清培養(yǎng)基中孵育1小時至1,000小時范圍內(nèi)、或10小時至100小時范圍內(nèi)的時間段來獲得凋亡干細胞。

例如，為了通過熱應(yīng)力法誘導(dǎo)細胞凋亡，可通過在預(yù)定溫度下加熱干細胞持續(xù)預(yù)定時間段來獲得凋亡干細胞。例如，為了通過熱應(yīng)力法誘導(dǎo)細胞凋亡，可通過在30℃至100℃范圍內(nèi)、或40℃至70℃范圍內(nèi)的溫度下加熱干細胞持續(xù)1分鐘至1,000分鐘范圍內(nèi)、或10分鐘至100分鐘范圍內(nèi)的時間段來獲得凋亡干細胞。熱應(yīng)力法可在無血清培養(yǎng)基中進行。

例如，為了通過星形孢菌素法誘導(dǎo)細胞凋亡，可通過用預(yù)定量的星形孢菌素處理干細胞持續(xù)預(yù)定時間段來獲得凋亡干細胞。例如，可通過用1nm星形孢菌素至10,000nM星形孢菌素范圍內(nèi)的量、或1nm星形孢菌素至10,000nM星形孢菌素范圍內(nèi)的量的星形孢菌素處理干細胞持續(xù)1小時至1,000小時范圍內(nèi)、或5小時至100小時范圍內(nèi)的時間段來獲得凋亡干細胞。星形孢菌素法可在無血清培養(yǎng)基中進行。

例如，為了通過紫外線(UV)法誘導(dǎo)細胞凋亡，可在預(yù)定波長下照射干細胞持續(xù)預(yù)定時間段。例如，可在100nm至400nm范圍內(nèi)的波長下照射干細胞0.1分鐘至1,000分鐘范圍內(nèi)、或1分鐘至100分鐘范圍內(nèi)的時間段。UV照射法可在無血清培養(yǎng)基中進行。

還可進行和遵循本文所述的產(chǎn)品(諸如包含凋亡小體的組合物)、包含含有凋亡干細胞的凋亡小體的組合物、其制備方法及其使用方法的任何組合。

本公開的其他實施例如下。

實施例1.誘導(dǎo)細胞凋亡的程序。

細胞凋亡可通過使用多種方法來實現(xiàn)。

例如，在饑餓法中，將基本上包含匯合MSC的細胞在無血清培養(yǎng)基中孵育約72小時以誘導(dǎo)細胞凋亡。在此方法中，所述細胞可包含接近100％匯合的MSC。

在UV照射法中，即另一種示例性方法中，可用UV燈處理培養(yǎng)的MSC持續(xù)5分鐘至10分鐘范圍內(nèi)的時間段以誘導(dǎo)細胞凋亡。UV燈可在約110V、約50Hz和約180W下操作。

在熱應(yīng)力法中，即另一種示例性方法中，可將培養(yǎng)的MSC在45℃至50℃范圍內(nèi)變化的溫度下孵育40分鐘至60分鐘范圍內(nèi)的時間段以誘導(dǎo)細胞凋亡。

在星形孢菌素法中，即另一種示例性方法中，將基本上包含匯合MSC的細胞在無血清培養(yǎng)基中用約250nM星形孢菌素處理約15小時以誘導(dǎo)細胞凋亡。在此方法中，所述細胞可包含接近100％匯合的MSC。

上述方法可進行組合以誘導(dǎo)細胞凋亡。例如，饑餓法可與UV照射法和/或熱應(yīng)力組合以誘導(dǎo)細胞凋亡。

實施例2.細胞凋亡檢測。

細胞凋亡可通過使用多種方法進行檢測。例如，可通過使用光學顯微鏡來檢測細胞收縮和固縮。此外，可使用流式細胞術(shù)分析檢測膜聯(lián)蛋白V和7-AAD雙陽性凋亡細胞。

在一個實施例中，通過星形孢菌素誘導(dǎo)細胞凋亡。通過使用光學顯微鏡和流式細胞術(shù)分析來檢測細胞凋亡。結(jié)果示于圖1中?？稍诠鈱W顯微鏡下觀察到來自培養(yǎng)皿的未附著細胞和收縮。與對照組相比，星形孢菌素處理后，7AAD+或膜聯(lián)蛋白V+或雙陽性凋亡細胞群體從3.3％增加至96.8％。

實施例3.凋亡小體收集。

將來自誘導(dǎo)的凋亡細胞的培養(yǎng)基收集在無菌離心管中(在約50ml管中約15ml)。首先，通過在約800g下離心約10分鐘除去死細胞和細胞碎片。然后，將上清液轉(zhuǎn)移到約1.5ml EP管中。將上清液在約16,000g下進一步離心約30分鐘以獲得作為沉淀的凋亡小體。為了消除培養(yǎng)基中的試劑或血清作用，將沉淀重新懸浮并通過PBS洗滌，且在約16,000g下再離心約30分鐘。此實施例示意性地示于圖2中。

實施例4.凋亡小體鑒定。

在此實施例中，通過使用熒光顯微術(shù)技術(shù)來鑒定凋亡小體。結(jié)果示于圖3中。如制造商的說明書中所述，將凋亡小體的膜用PKH26標記并且將遺傳物質(zhì)用Hoechst 33342標記。凋亡小體的直徑在0.5μm至10μm的范圍內(nèi)變化，平均大小為約3.014±1.1093μm。少于10％的凋亡小體含有遺傳物質(zhì)。凋亡小體的表面標記物膜聯(lián)蛋白V、7-AAD和TSP可通過流式細胞術(shù)分析來鑒定。

實施例5.凋亡小體定量和純化。

相對計數(shù)法用于凋亡小體定量。首先，將已知量的熒光染料標記的珠粒(“計數(shù)珠粒”)添加到凋亡小體懸浮液中。然后，通過使用流式細胞術(shù)分析來檢測凋亡小體和計數(shù)珠粒的相對比率。此方法示意性地示于圖4中。根據(jù)下式基于已知量的計數(shù)珠粒來計算凋亡小體的數(shù)目：

凋亡小體對細胞的收獲率在5至10的范圍內(nèi)變化。

實施例6.通過流式細胞純化進行的凋亡小體純化。

在此實施例中，通過使用流式細胞分選技術(shù)進一步純化凋亡小體。這些純化的凋亡小體可用于制備本公開的組合物，其中所述凋亡小體可以是純化的凋亡小體。

通過作為流式細胞分選的標記物的DRAQ5標記凋亡小體中的遺傳物質(zhì)。將凋亡小體分成兩個群體。結(jié)果示于圖5A-B中。DRAQ5陽性群體含有具有遺傳物質(zhì)的凋亡小體，而DRAQ5陰性群體含有無遺傳物質(zhì)的凋亡小體?？煞诌x出3.8％具有遺傳物質(zhì)的凋亡小體，同時可在流式細胞分選期間收集43.13％無遺傳物質(zhì)的凋亡小體。

實施例7.通過差速離心進行的凋亡小體純化。

在此實施例中，通過使用差速離心技術(shù)進一步純化凋亡小體。所述凋亡小體的純化方法示意性地示于圖6中。這些純化的凋亡小體可用于制備本公開的組合物，其中所述凋亡小體可以是純化的凋亡小體。

基于不同的沉降速率，使用低離心力分離較大大小的凋亡小體。首先，用PBS重新懸浮沉淀的凋亡小體，并且然后在約4,000g下離心約5分鐘。沉淀的凋亡小體的直徑在4μm至10μm的范圍內(nèi)變化，并且超過80％的凋亡小體含有遺傳物質(zhì)。結(jié)果示于圖6中。

實施例8.凋亡小體提高體內(nèi)BMMSC集落形成數(shù)目。

C3H小鼠在第0天和第2天進行凋亡小體的全身輸注。每次全身輸注的劑量是5×10⁶個凋亡小體細胞。在第7天從小鼠中收獲BMMSC。如通過甲苯胺藍染色所示，輸注凋亡小體的小鼠比野生型(wt)小鼠產(chǎn)生更高數(shù)目的BMMSC CFU-F。凋亡小體處理組的CFU-F數(shù)目從42個集落/100萬個細胞增加至57個集落/100萬個細胞。參見圖7A-B。這些實驗結(jié)果證明凋亡小體可提高體內(nèi)BMMSC集落形成數(shù)目。

實施例9.凋亡小體提高體外BMMSC集落形成數(shù)目。

在此實施例中，用凋亡小體處理BMMSC，并通過并入BrdU測定進行分析。據(jù)發(fā)現(xiàn)當與未處理的BMMSC相比時，BrdU陽性(BrdU⁺)細胞的數(shù)目在用凋亡小體處理的BMMSC中顯著增加。參見圖8A-B。這些實驗結(jié)果證明凋亡小體可提高體外BMMSC集落形成數(shù)目。

實施例10.凋亡小體改善體外BMMSC的骨生成。

在此實施例中，在體外用凋亡小體處理BMMSC。在成骨誘導(dǎo)后6周，通過茜素紅染色評估BMMSC的成骨分化潛力。就礦化結(jié)節(jié)而言，茜素紅陽性(茜素紅+)面積被計算為總面積的百分比。免疫印跡分析揭示OCN的表達水平具有相同的趨勢。實驗結(jié)果示于圖9A-B中。

與未處理的BMMSC和用低劑量的凋亡小體處理的BMMSC相比，用高劑量的凋亡小體處理的BMMSC形成顯著增加量的礦化結(jié)節(jié)。這些實驗結(jié)果證明，BMMSC的成骨分化潛力可通過體外凋亡小體處理改善。這些實驗結(jié)果還證明，這種改善潛力可通過增加凋亡小體的劑量而增加。

實施例11.凋亡小體改善體內(nèi)BMMSC的骨生成。

在此實施例中，通過使用羥基磷灰石磷酸三鈣(HA/TCP)作為載體將在體外用凋亡小體處理的BMMSC皮下移植到免疫受損的小鼠中。圖10A-B中所示的實驗結(jié)果表明，當與未處理的BMMSC相比時，用凋亡小體處理的BMMSC形成更多的礦化組織。這些實驗結(jié)果證明，BMMSC的礦化組織形成潛力可通過用凋亡小體體內(nèi)處理BMMSC而改善。

實施例12.凋亡小體改善體外BMMSC的脂肪形成。

在此實施例中，在體外用凋亡小體處理BMMSC。在脂肪形成誘導(dǎo)后4周，通過油紅O染色評估BMMSC的脂肪形成潛力。油紅O陽性(油紅-O+)細胞的數(shù)目被計算為總細胞的百分比。圖11A-B中所示的實驗結(jié)果表明，用凋亡小體處理的BMMSC具有升高的分化成脂肪細胞的潛力。免疫印跡測定表明脂肪細胞特異性分子LPL和PPARγ2的表達水平具有相同的趨勢。這些實驗結(jié)果表明，BMMSC的脂肪形成潛力可通過用凋亡小體體外處理BMMSC而改善。

實施例13.凋亡小體改善體外BMMSC的免疫調(diào)節(jié)。

BMMSC可直接誘導(dǎo)活性T細胞凋亡作為免疫調(diào)節(jié)特性。BMMSC/T細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)顯示，當與未處理的BMMSC相比時，凋亡小體處理的BMMSC具有顯著提高的誘導(dǎo)膜聯(lián)蛋白V+7AAD+雙陽性凋亡T細胞的能力。實驗結(jié)果示于圖12A-B中。

實施例14.凋亡小體對誘導(dǎo)性結(jié)腸炎小鼠具有治療作用。

在此實施例中，用5×10⁶個凋亡小體的劑量輸注具有DSS誘導(dǎo)的實驗性結(jié)腸炎的第一組小鼠(“AB輸注”)。對于陽性對照，用5×10⁵個BMMSC的劑量輸注具有DSS誘導(dǎo)的實驗性結(jié)腸炎的第二組小鼠(“MSC輸注”)。具有DSS誘導(dǎo)的實驗性結(jié)腸炎的第三組小鼠未經(jīng)處理(“結(jié)腸炎”)。第一和第二小鼠組在誘導(dǎo)結(jié)腸炎后輸注3天。從誘導(dǎo)結(jié)腸炎開始，在10天的時間段內(nèi)記錄三個小鼠組的重量損失。結(jié)果示于圖13A-D中。

與結(jié)腸炎組相比，凋亡小體處理在結(jié)腸中發(fā)揮更顯著的疾病表型、體重損失的恢復(fù)和組織學活性指數(shù)的降低。與結(jié)腸炎組相比，凋亡小體處理在結(jié)腸炎誘導(dǎo)后10天在小鼠中顯示在降低Th17細胞水平方面的顯著作用。這些實驗結(jié)果證明，凋亡小體可用于治療免疫障礙疾病如結(jié)腸炎。

實施例15.凋亡小體對切除卵巢的小鼠具有治療作用。

在此實施例中，用5×10⁶個凋亡小體的劑量輸注第一組切除卵巢的小鼠(“OVX+AB”)。對于陽性對照，用5×10⁵個BMMSC的劑量輸注第二組切除卵巢的小鼠(“OVX+MSC”)。第三組切除卵巢的小鼠未經(jīng)處理(“OVX”)。第四組未切除卵巢的小鼠也未經(jīng)處理(“假”)。第一和第二小鼠組在誘導(dǎo)卵巢切除術(shù)后兩周進行輸注。結(jié)果示于圖14A-I中。

蘇木精和曙紅(HE)染色顯示BMMSC和凋亡小體處理均顯著挽救了切除卵巢的小鼠的骨丟失。與未處理的切除卵巢的小鼠相比，凋亡小體處理顯著提高股骨BV/TV中的骨礦物質(zhì)密度(BMD)。此外，凋亡小體輸注挽救了OVX來源的骨髓MSC的CFU-F數(shù)目、群體倍增、骨生成能力和脂肪形成能力。同時，凋亡小體輸注降低了Th1和Th17t細胞的水平。

實施例16.凋亡小體對全身性紅斑狼瘡(SLE)小鼠具有治療作用。

在此實施例中，MRL/lpr小鼠用作全身性紅斑狼瘡模型。用凋亡小體輸注第一組MRL/lpr小鼠(“Lpr+AB”)。對于陽性對照，用BMMSC輸注第二組MRL/lpr小鼠(“Lpr+MSC”)。第三組MRL/lpr小鼠未經(jīng)處理(“l(fā)pr”)。第四組C3H小鼠也未經(jīng)處理(“C3H”)。結(jié)果示于圖15A-G中。

凋亡小體輸注挽救了間充質(zhì)干細胞(MSC)功能缺陷并且重建了MRL/lpr小鼠的小梁骨結(jié)構(gòu)。與未處理的MRL/lpr小鼠相比，凋亡小體輸注顯著提高股骨BV/TV中的骨礦物質(zhì)密度(BMD)。凋亡小體輸注降低了自身抗體水平并且改善了MRL/lpr小鼠的腎功能。與未處理的組相比，外周血中C3、抗dsDNA的水平在凋亡小體輸注組中降低，而白蛋白水平得到挽救。凋亡小體輸注降低了Th17T細胞水平并且恢復(fù)了Treg/Th17比率。

實施例17.凋亡小體對腫瘤具有治療作用。

在實體瘤和造血系統(tǒng)腫瘤中評價凋亡小體的治療作用。對于此評價，建立了肝細胞癌和多發(fā)性骨髓瘤的小鼠腫瘤模型。

對于肝細胞癌的小鼠模型，通過肌內(nèi)注射HepG2細胞來產(chǎn)生肝細胞癌的異種移植物。簡言之，在重量匹配的約8周齡雌性NOD/SCID小鼠(Jackson Lab,Bar Harbor,ME,USA)中實施所述小鼠模型。將HepG2肝細胞癌細胞(ATCC,Manassas,VA,USA)在補充有約10％胎牛血清(Summit Biotechnology,Fort Collins,CO,USA)和抗生素(Invitrogen Co.,Carlsbad,CA,USA)的杜氏改良的伊格爾氏培養(yǎng)基(Invitrogen Co.,Carlsbad,CA,USA)中在約37℃、約5％CO₂下培養(yǎng)。°將懸浮在PBS中的HepG2細胞(約1×10⁶個細胞/10克體重)肌內(nèi)注射到NOD/SCID小鼠的后腿中，并且PBS注射充當陰性對照。

為了測試凋亡小體對原位癌的作用，將二乙基亞硝胺作為致癌物注射到B6C3F1小鼠中以用于誘導(dǎo)原位肝細胞癌。簡言之，使用約4周齡B6C3F1雄性小鼠來產(chǎn)生癌模型。向小鼠腹膜內(nèi)施用單一劑量的二乙基亞硝胺(約100mg/克體重)。

對于多發(fā)性骨髓瘤模型，將從親本鼠5T33(IgG2bκ)多發(fā)性骨髓瘤的非基質(zhì)依賴性細胞系亞克隆的5TGM1MM細胞系在具有約10％胎牛血清和抗生素的伊斯科夫氏改良的杜氏培養(yǎng)基(Invitrogen Co.,Carlsbad,CA,USA)中的長期懸浮培養(yǎng)物中生長。在重量匹配的約10周齡雌性NOD/SCID小鼠中實施5TGM1多發(fā)性骨髓瘤模型。將小鼠圈養(yǎng)于隔離籠中，并且任意提供高壓滅菌的食物和酸化水。通過尾靜脈靜脈內(nèi)接種約200μl PBS中的5TGM1細胞(約6×10⁶個/10克體重)來誘導(dǎo)彌散性多發(fā)性骨髓瘤。

如下在體內(nèi)遞送凋亡小體。將具有肝細胞癌和多發(fā)性骨髓瘤的異種移植腫瘤的小鼠隨機分為處理組和對照組。在腫瘤細胞接種約1周后，經(jīng)由尾靜脈注射遞送單一劑量的凋亡小體(約3×10⁶個/10克體重)(治療組)，并且PBS注射充當對照。

對于原位肝細胞癌的小鼠模型，經(jīng)由尾靜脈向小鼠每月施用凋亡小體(約3×10⁶個/10克體重)。

如下評估凋亡小體的治療作用。在腫瘤接種后約4周，手術(shù)收獲肝細胞癌的異種移植腫瘤。通過下式測量腫瘤的體積來評估凋亡小體的治療作用：體積＝長度×寬度²×0.52。為了揭示有或無凋亡小體處理的腫瘤的組織學，將組織在約4％多聚甲醛中固定約48小時，并且隨后包埋于石蠟中用于蘇木精(Hematoxyin)-曙紅染色。

對于評估凋亡小體在多發(fā)性骨髓瘤模型中的治療作用，對不同組中的小鼠的8周存活率進行了比較。通過卡普蘭-邁耶存活法分析結(jié)果。

如下測定凋亡小體對腫瘤細胞的體內(nèi)細胞毒性。將HepG2肝細胞癌細胞以約1×10⁵個細胞/孔的濃度接種在24孔板中。在細胞接種后約12小時，通過凋亡小體(約1×10⁶個凋亡小體/孔)或PBS處理細胞，并且在細胞培養(yǎng)物中施用不同濃度的凋亡小體以用于評價細胞毒性。在凋亡小體處理后約2天，通過自動細胞計數(shù)器(Bio-rad,Hercules,CA,USA)測定細胞存活，并且通過臺盼藍(Invitrogen Co.,Carlsbad,CA,USA)染色排除死細胞。

腫瘤的凋亡處理的結(jié)果如下。肌內(nèi)接種HepG2細胞成功地在NOD/SCID小鼠中產(chǎn)生了腫瘤生長。為了測試在腫瘤模型中的治療作用，將凋亡小體全身輸注到具有異種移植腫瘤的小鼠中。腫瘤體積測量的結(jié)果顯示，接受凋亡小體處理的小鼠中的腫瘤顯著小于無所述處理的小鼠中的腫瘤(圖16A)。通過進行性腫瘤細胞生長填充了由HepG2細胞產(chǎn)生的異種移植腫瘤，并且在凋亡小體處理后，腫瘤被具有大面積壞死的造血細胞浸潤(圖16B)。為了證實治療作用，體外共培養(yǎng)測定表明了凋亡小體對HepG2細胞的明顯細胞毒性，其呈劑量依賴性方式(圖17A)。全基因表達模式的比較表明，在凋亡小體處理后，腫瘤細胞經(jīng)歷增強的細胞凋亡和溶酶體功能(圖17B)。

在多發(fā)性骨髓瘤的小鼠模型中，接受全身凋亡小體輸注的小鼠比對照小鼠存活顯著更長，從而表明所述治療有效地抑制疾病進展(圖18)。

實施例18.凋亡小體腸內(nèi)輸注改善結(jié)腸炎。

如圖19中所示，凋亡小體(AB)輸注改善了DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎。由于DSS輸注可在小鼠中誘導(dǎo)結(jié)腸炎，所以在DSS誘導(dǎo)后約3天腸內(nèi)輸注約1×10⁷個AB或骨髓間充質(zhì)干細胞(MSC)，并且在DDS誘導(dǎo)后約10天收獲樣品以評價AB的治療作用，并使用MSC腸內(nèi)輸注作為陽性對照(圖19A)。在挽救體重方面凋亡小體處理顯示出與MSC組相比的顯著治療作用(圖19B)。凋亡小體處理還顯示了結(jié)腸中組織學活性指數(shù)的降低(圖19C)。與結(jié)腸炎組相比，AB處理在結(jié)腸炎誘導(dǎo)后約10天在小鼠中顯示在降低Th1和Th17細胞水平方面的顯著作用(圖19D-E)。這些實驗結(jié)果證明AB輸注可用作治療免疫病癥(諸如結(jié)腸炎)的新方法。

實施例19.凋亡小體輸注改善傷口愈合。

如圖20A-C中所示，AB輸注改善小鼠耳打孔模型中的傷口愈合。將約5×10⁶個AB在耳打孔之前或之后輸注到小鼠中(圖20A)。在耳打孔后約7天，當與未處理的對照組相比時，AB處理組的耳孔面積顯著減小(圖20B-C)。

還可進行和遵循本文所述的產(chǎn)品(諸如包含凋亡小體的組合物)、其制備方法及其使用方法的任何組合。

已討論的部件、步驟、特征、目的、益處和優(yōu)點僅是說明性的。其中的任何一個或與其相關(guān)的討論均不意圖以任何方式限制保護范圍。還預(yù)期許多其他實施方案。這些其他實施方案包括具有更少的、另外的和/或不同的部件、步驟、特征、目的、益處和優(yōu)點的實施方案。這些其他實施方案還包括將部件和/或步驟不同地布置和/或排序的實施方案。

除非另外說明，否則在本說明書中(包括在以下權(quán)利要求書中)所闡述的所有測量值、值、等級、位置、量值、大小及其他規(guī)范均為近似的，而不是準確的。它們意圖具有合理的范圍，這個范圍與它們相關(guān)的功能一致并且與它們所屬領(lǐng)域中的習慣一致。

在本公開中提到的所有文章、專利、專利申請和其他出版物以引用的方式并入本文。

在本公開中，不定冠詞“一個”和短語“一個或多個”以及“至少一個”是同義的并且意思是“至少一個”。

諸如“第一”和“第二”等關(guān)系性術(shù)語僅僅可以用來將一個實體或動作與另一個實體或動作區(qū)分開，而沒有必要要求或暗示它們之間的任何實際關(guān)系或順序。術(shù)語“包括(comprises/comprising)”和其任何其他變型在結(jié)合說明書或權(quán)利要求書中的要素列表使用時意圖指示所述列表不是排他的并且可包括其他要素。類似地，在沒有進一步約束的情況下，前面有“一個”的要素并不排除存在相同類型的另外的要素。

提供摘要來幫助讀者快速確定技術(shù)性公開的本質(zhì)。應(yīng)理解，所提交的摘要不是用來解釋或限制權(quán)利要求書的范圍或含義。此外，在上文詳細描述中的各種特征在各種實施方案中被分組在一起以精簡本公開。這種公開的方法不應(yīng)被解釋為需要所要求保護的實施方案需要比每個權(quán)利要求中所明確表述的特征更多的特征。相反，如以下權(quán)利要求書所反映的，本發(fā)明的主題存在于單個所公開實施方案的少于所有特征中。因此，以下權(quán)利要求書因此并入詳述中，其中每項權(quán)利要求自身可作為單獨要求保護的主題。