甘青青蘭有效部位及其制備方法和應(yīng)用，屬于植物提取物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

甘青青蘭（Dracocephalum tanguticum Maxim.）又名唐古特青蘭，藏名譯音知羊高、知羊故，屬唇形科青蘭屬多年生草本植物，生于海拔1900m~4000 m干燥河谷之谷岸、山野、草灘或高山草地及松林緣，分布于西藏東南部、青海東部、四川西部及甘肅西南部[參見：①廖敬禮,顧健,李婧,張亮亮,鐘鋒,姚峰. 唐古特青蘭提取物齊墩果酸的藥代動(dòng)力學(xué)研究[J]. 時(shí)珍國醫(yī)國藥,2010,11:2893-2894. ②宗露,盧曉琳,馬逾英,楊瑩,張福卓. 甘青青蘭的形態(tài)組織學(xué)研究[J]. 華西藥學(xué)雜志,2012,03:337-338.]。甘青青蘭具有清肝熱、止血、愈瘡、干黃水功效，用于治療胃炎、肝炎、頭暈、神疲、關(guān)節(jié)炎和疥瘡等[參見：[3] CHINA PHARMA COPOEIA COMMITTEE. Tibetan Medicine Standard of Ministry of Public Health of China （中華人民共和國衛(wèi)生部藏藥標(biāo)準(zhǔn)）[S]. 1995,13.]。

腫瘤是危害人類健康的重大疾病之一，惡性腫瘤的防治已成為醫(yī)學(xué)界所關(guān)注的重要課題。惡性腫瘤就是人們所說的癌癥，惡性腫瘤的防治已成為醫(yī)學(xué)界所關(guān)注的重要課題。癌癥是危害人類健康的重大疾病之一，惡性癌細(xì)胞的防治已成為醫(yī)學(xué)界所關(guān)注的重要課題。癌癥作為目前人類死亡的首要原因，對(duì)其治療仍局限于癌癥疾病的多樣性及反復(fù)性。然而，盡管不同的癌癥的致癌原因可能不盡相同，但其組織觀察均表現(xiàn)出相似的細(xì)胞周期紊亂以及迅速不可控制的細(xì)胞生長及轉(zhuǎn)移。因此，對(duì)參與細(xì)胞周期調(diào)控的一些家族蛋白的研究在推動(dòng)癌癥治療中成為重要因素。組蛋白去乙?；福℉DAC）是一類蛋白酶，對(duì)染色體的結(jié)構(gòu)修飾和基因表達(dá)調(diào)控發(fā)揮著重要的作用。一般情況下，組蛋白的乙?；欣贒NA與組蛋白八聚體的解離，核小體結(jié)構(gòu)松弛，從而使各種轉(zhuǎn)錄因子和協(xié)同轉(zhuǎn)錄因子能與DNA結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合，激活基因的轉(zhuǎn)錄。在癌細(xì)胞中，HDAC的過度表達(dá)導(dǎo)致去乙?；饔玫脑鰪?qiáng)，通過恢復(fù)組蛋白正電荷， 從而增加DNA與組蛋白之間的引力， 使松弛的核小體變得十分緊密， 不利于特定基因的表達(dá)， 包括一些腫瘤抑制基因。組蛋白去乙?；敢种苿╤istone deacetylase inhibitors，HDAC1）則可通過提高染色質(zhì)特定區(qū)域組蛋白乙?；?，從而調(diào)控細(xì)胞凋亡及分化相關(guān)蛋白的表達(dá)和穩(wěn)定性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及分化，成為一類新的抗腫瘤藥物。HDAC1不僅對(duì)多種血液系統(tǒng)腫瘤和實(shí)體瘤具有良好的治療作用，而且具有腫瘤細(xì)胞相對(duì)較高選擇性和低毒的優(yōu)點(diǎn)。

申請人在研究中發(fā)現(xiàn)：目前抗腫瘤藥物的原料較少，特別是用于制備抑制HDAC1酶藥物的中藥原料較為匱乏。甘青青蘭植物含有生物堿類、多糖、黃酮化合物等多種化學(xué)成分，現(xiàn)有技術(shù)中主要有清肝熱、止血、愈瘡、干黃水之功。目前，尚未見到關(guān)于甘青青蘭抑制HDAC1酶的活性方面的研究和應(yīng)用的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供甘青青蘭有效部位及其制備方法和應(yīng)用，該甘青青蘭有效部位能有效抑制HDAC1酶的活性，用于制備抑制HDAC1酶藥物，具有較好的抗腫瘤作用。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：該甘青青蘭有效部位，其特征在于：選自甘青青蘭乙酸乙酯部位、甘青青蘭正丁醇部位、甘青青蘭水相萃取部位中的一種或兩種以上的任意質(zhì)量比的混合物。

該甘青青蘭有效部位，其特征在于：選自甘青青蘭正丁醇部位，或者甘青青蘭正丁醇部位和甘青青蘭水相萃取部位任意質(zhì)量比的混合物。

該甘青青蘭有效部位的制備方法，其特征在于，包括下述步驟：將甘青青蘭全草粉碎，加入質(zhì)量百分比濃度65%~95%乙醇溶液回流提取，將所得提取液濃縮、干燥，得浸膏；將浸膏加蒸餾水分散，得浸膏分散液，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇作為溶劑萃取浸膏分散液，揮去溶劑后得甘青青蘭石油醚部位、甘青青蘭乙酸乙酯部位、甘青青蘭正丁醇部位；將萃取后的浸膏分散液濃縮、干燥，得甘青青蘭水相萃取部位。

本制備方法中石油醚、乙酸乙酯和正丁醇的萃取順序非常重要，在萃取順序被顛倒的情況下得到的有效部位對(duì)抑制HDAC1酶的活性并不明顯。發(fā)明人分析，因三種萃取劑所能萃取的成份有一些是相互包含的，只有在本發(fā)明萃取順序下，利用上述萃取劑依次萃取同一浸膏分散液，前萃取步驟將浸膏分散液內(nèi)本相互抑制的成份萃取出其中的一種后，下一步萃取才能得到具有一直HDAC1酶的活性的有效部位。

優(yōu)選的，所述的回流提取為超聲波輔助回流提取，超聲波輔助回流提取的具體操作為：將粉碎后的甘青青蘭全草加入質(zhì)量百分比濃度65%~95%乙醇溶液超聲波提取0.5~3小時(shí)，過濾，濾渣加入質(zhì)量百分比濃度65%~95%乙醇溶液回流提取1~3次，合并提取液，即得。

該甘青青蘭有效部位的應(yīng)用，其特征在于：在制備抑制HDAC1酶藥物方面的應(yīng)用。

所述抑制HDAC1酶藥物是通過甘青青蘭乙酸乙酯部位、甘青青蘭正丁醇部位、甘青青蘭水相萃取部位中的一種或兩種以上的任意質(zhì)量比的混合物，與藥用輔料混合制成的口服制劑或注射制劑。

所述的注射制劑為脂質(zhì)體注射劑、納米粒注射劑或微球注射劑。

所述的口服制劑為散劑、片劑、顆粒劑、膠囊劑或溶液劑。

對(duì)于本發(fā)明的說明如下：

現(xiàn)有技術(shù)中，甘青青蘭常規(guī)用途為清肝熱、止血、愈瘡、干黃水，未見其有抗腫瘤功效的相關(guān)報(bào)道。申請人通過大量研究發(fā)現(xiàn)：甘青青蘭中的部分提取物還具有抗腫瘤的作用，但是其功效不明顯，不能確定其具體的有效部位。因此通過怎樣的溶劑、采用怎樣制備方法，才能獲得抑制HDAC1酶活性效果最好的有效部位，是必須要解決的問題。申請人通過研究發(fā)現(xiàn)：采用本發(fā)明制備方法，篩選出的甘青青蘭乙酸乙酯部位、甘青青蘭正丁醇部位和甘青青蘭水相萃取部位，其抑制HDAC1酶效果較好。

制備方法中，具體的，超聲波提取后，過濾獲得提取液和濾渣，向?yàn)V渣中加質(zhì)量百分比濃度65%~95%乙醇溶液回流提取1~3次，合并超聲波提取和回流提取所得提取液。浸膏為粗提取物，采用不同的溶劑萃取浸膏分散液，指的是依次將石油醚加入浸膏分散液萃取分離獲得石油醚萃取液、將乙酸乙酯加入浸膏分散液萃取分離獲得乙酸乙酯萃取液、將正丁醇加入浸膏分散液萃取分離獲得正丁醇萃取液；取乙酸乙酯萃取液和正丁醇萃取液分別揮發(fā)去除溶劑后，所得即甘青青蘭乙酸乙酯部位和甘青青蘭正丁醇部位；將萃取后剩余的浸膏分散液（溶劑為水），揮發(fā)去除溶劑即得甘青青蘭水相萃取部位。溶劑的部位指的是該溶劑的萃取物，水相萃取部位也可以稱作水相萃取物，水相萃取部位易溶于水；而相對(duì)的，石油醚、乙酸乙酯和正丁醇為有機(jī)相，石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位對(duì)應(yīng)易溶于石油醚、乙酸乙酯和正丁醇。其中，甘青青蘭石油醚部位含有游離脂肪酸類化合物；甘青青蘭乙酸乙酯部位含有游離生物堿、黃酮類化合物；甘青青蘭正丁醇部位含有苷類和酚類化合物；甘青青蘭水相萃取部位含有多糖和有機(jī)酸類化合物。揮去溶劑即揮發(fā)去除溶劑。揮去溶劑可以采用常壓加熱使溶劑（即石油醚、乙酸乙酯和正丁醇）揮發(fā)。優(yōu)選的，揮去溶劑采用減壓濃縮，該方法效率高，并且能避免熱敏性成分因高溫喪失藥性。

優(yōu)選的，制備的抑制HDAC1酶藥物，為口服制劑或注射制劑。口服制劑和注射制劑為最佳給藥途徑，此處所述口服制劑為經(jīng)腸胃道給藥制劑，優(yōu)選的，口服制劑為緩釋、控釋型口服制劑。也可以為非腸胃給藥的其他制劑，如呼吸道給藥制劑（噴霧劑、氣霧劑、粉霧劑）；皮膚給藥制劑（外用溶液劑、洗劑、搽劑、軟膏劑、硬膏劑、糊劑、貼劑）；膜給藥制劑（滴眼劑、 滴鼻劑、眼用軟膏、含漱劑、舌下片劑）；腔道給藥制劑（栓劑）。注射制劑可以為常規(guī)注射制劑。根據(jù)藥物傳遞系統(tǒng)進(jìn)行分類，優(yōu)選的，本發(fā)明的注射制劑為脂質(zhì)體注射劑、納米粒注射劑或微球注射劑；其他的，本發(fā)明的注射劑還可以為微囊注射劑、聚合物膠束注射劑、微乳或亞微乳注射劑、亞微粒注射劑或凝膠注射劑，以上藥物傳遞系統(tǒng)的注射劑能延長藥物載體在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間、延長載藥微粒在吸收部位的停留時(shí)間、控制藥物在釋放初期的突釋效應(yīng)。藥用輔料包括藥物載體，以及溶劑、增溶劑、助溶劑、乳化劑、助懸劑、澄清劑、反絮凝劑、矯味劑、著色劑、防腐劑、化學(xué)滅菌劑、吸附劑、助濾劑、抗氧劑、pH調(diào)節(jié)劑、等滲調(diào)節(jié)劑、稀釋劑、粘合劑、潤濕劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑、抗粘著劑、緩釋劑、控釋劑、包衣材料、成膜材料、膠囊材料中的一種或多種。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的甘青青蘭有效部位及其制備方法和應(yīng)用所具有的有益效果是：

1、該甘青青蘭有效部位能有效抑制HDAC1酶的活性，用于制備抑制HDAC1酶藥物，具有較好的抗腫瘤作用。申請人經(jīng)大量研究確定現(xiàn)有技術(shù)中具有清肝熱、止血、愈瘡、干黃水之功的甘青青蘭，還具有抗腫瘤的功效。申請人通過研究確定其所抑制的酶的種類，設(shè)計(jì)制備方法并首次在HDAC1酶上進(jìn)行藥效篩選，通過大量研究確定甘青青蘭乙酸乙酯部位、甘青青蘭正丁醇部位、甘青青蘭水相萃取部位中的一種或兩種以上的任意質(zhì)量比的混合物均具有較好的抑制HDAC1酶活性，其HDAC1酶存活率16.25%~27.51%，適宜開發(fā)成抗腫瘤藏藥新藥。綜上所述，申請人研究發(fā)現(xiàn)甘青青蘭的新功效，通過研究確定其所抑制的酶的種類，設(shè)計(jì)制備方法并最終獲得對(duì)HDAC1酶均具有較好抑制效果的有效部位，以上過程是付出了大量的創(chuàng)造性勞動(dòng)的。

2、該甘青青蘭有效部位的制備方法提取方便，提取效率高。制備方法中，申請人設(shè)計(jì)加入質(zhì)量百分比濃度65%~95%乙醇溶液進(jìn)行超聲波輔助回流提取，提高了提取效率；萃取中，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇作為溶劑萃取浸膏分散液，采用以上溶劑萃取順序所得的甘青青蘭乙酸乙酯部位、甘青青蘭正丁醇部位和甘青青蘭水相萃取部位具有較好的抑制HDAC1酶的效果。

3、本發(fā)明拓展了抑制HDAC1酶藥物的原料渠道，擴(kuò)大了甘青青蘭的用途，使甘青青蘭發(fā)展成為抑制HDAC1酶藥物的新原料，可顯著提高甘青青蘭的附加值。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1~3是本發(fā)明的甘青青蘭有效部位及其制備方法和應(yīng)用的具體實(shí)施方式，其中實(shí)施例1為最佳實(shí)施例。

實(shí)施例1

制備方法，包括下述步驟：將甘青青蘭全草粉碎，采用質(zhì)量百分比濃度75%~85%乙醇溶液超聲波提取1小時(shí)，然后過濾得超聲波提取液和濾渣，濾渣加質(zhì)量百分比濃度75%~85%乙醇溶液回流提取3次，每次0.5小時(shí)，得回流提取液，合并超聲波提取液和回流提取液、濃縮干燥得浸膏；將浸膏加蒸餾水分散，得浸膏分散液，然后依次采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇作為溶劑萃取浸膏分散液，揮去溶劑后得到甘青青蘭乙酸乙酯部位、甘青青蘭正丁醇部位；將萃取后剩余的浸膏分散液將萃取后剩余的浸膏分散液濃縮、干燥，得甘青青蘭水相萃取部位。

實(shí)施例2

制備方法，包括下述步驟：將甘青青蘭全草粉碎，采用質(zhì)量百分比濃度85%~95%乙醇溶液超聲波提取3小時(shí)，然后過濾得超聲波提取液和濾渣，濾渣加質(zhì)量百分比濃度85%~95%乙醇溶液回流提取2次，每次1小時(shí)，得回流提取液，合并超聲波提取液和回流提取液、濃縮干燥得浸膏；將浸膏加蒸餾水分散，得浸膏分散液，然后依次采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇作為溶劑萃取浸膏分散液，揮去溶劑后得到甘青青蘭乙酸乙酯部位、甘青青蘭正丁醇部位；將萃取后剩余的浸膏分散液將萃取后剩余的浸膏分散液濃縮、干燥，得甘青青蘭水相萃取部位。

實(shí)施例3

制備方法，包括下述步驟：將甘青青蘭全草粉碎，采用質(zhì)量百分比濃度65%~75%乙醇溶液超聲波提取0.5小時(shí)，然后過濾得超聲波提取液和濾渣，濾渣加質(zhì)量百分比濃度65%~75%乙醇溶液回流提取2次，每次2小時(shí)，得回流提取液，合并超聲波提取液和回流提取液、濃縮干燥得浸膏；將浸膏加蒸餾水分散，得浸膏分散液，然后依次采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇作為溶劑萃取浸膏分散液，揮去溶劑后得到甘青青蘭乙酸乙酯部位、甘青青蘭正丁醇部位；將萃取后剩余的浸膏分散液將萃取后剩余的浸膏分散液濃縮、干燥，得甘青青蘭水相萃取部位。

將實(shí)施例1~3萃取所得的石油醚萃取液揮發(fā)去除溶劑，濃縮干燥，得甘青青蘭石油醚部位，留作后續(xù)性能測試使用。

性能測試

分別各取0.4mg干燥后的甘青青蘭乙酸乙酯部位、甘青青蘭正丁醇部位、甘青青蘭水相萃取部位，各自溶解于100μL的二甲基亞砜（DMSO）中形成DMSO溶液，超聲5分鐘。再分別取1μL溶解樣品的DMSO溶液，各加入緩沖液99μL，分別得到用于檢測的甘青青蘭乙酸乙酯部位的緩沖溶液、甘青青蘭正丁醇部位的緩沖溶液和甘青青蘭水相萃取部位的緩沖溶液。緩沖液的配方為：50mM/L的Tris-HCl、0.137 mM/L的NaCl、2.7mM/L的KCl、1mM/L的 MgCl₂、0.01%吐溫20，調(diào)緩沖液pH 8.0。

一、抑制HDAC1酶實(shí)驗(yàn)。

以實(shí)施例1得到的甘青青蘭各部位為受試藥物，檢測甘青青蘭各部位抑制HDAC1酶的活性。

其方法是：分別另取4μL的甘青青蘭乙酸乙酯部位的緩沖溶液（標(biāo)號(hào)E）、甘青青蘭正丁醇部位的緩沖溶液（標(biāo)號(hào)F）和甘青青蘭水相萃取部位的緩沖溶液（標(biāo)號(hào)G），分別進(jìn)行如下操作：將所取的4μL緩沖溶液（E、F、G）置于96孔板中，再分別加入2μL HDAC1酶，室溫條件下反應(yīng)5min，加入4μL H3（1-21）K9底物，37℃，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60分鐘。加入5μL SA-XL665 和5μL H3K9me0 抗體，665nm測值，得實(shí)驗(yàn)組吸光度。

將4 μL的緩沖液置于96孔板中，再分別加入2 μL HDAC1酶，室溫條件下反應(yīng)5min，加入4μL H3（1-21）K9底物，37℃，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60分鐘。加入5μL SA-XL665和5μL H3K9me0 抗體，665nm測值，得對(duì)照組吸光度。計(jì)算HDAC1酶存活率：存活率（%）=實(shí)驗(yàn)組吸光度/對(duì)照組吸光度×100%。

表1 甘青青蘭有效部位抑制HDAC1酶的活性測試結(jié)果

表1中* P＜0.01，通過表1可以看出：甘青青蘭乙酸乙酯部位、甘青青蘭正丁醇部位、甘青青蘭水相萃取部位對(duì)于HDAC1酶均有較好的抑制效果。

二、抗腫瘤活性測試。

利用MTT法測定甘青青蘭有效部位對(duì)人腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。分別取實(shí)施例1所得甘青青蘭的浸膏、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水相萃取部位適量，DMSO溶解后，利用MTT法分別測定對(duì)人結(jié)腸癌HCT-8、人肝癌Bel7402細(xì)胞、人胃癌BGC-803細(xì)胞、人肺腺癌A549細(xì)胞和人卵巢癌A-2780細(xì)胞生長的抑制率。

實(shí)驗(yàn)方法：將對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，用0.25%胰酶-EDTA消化后，配制成一定濃度的單細(xì)胞懸液，根據(jù)細(xì)胞生長速度的差異，按800~2000個(gè)/孔接種于96孔板，每孔加入細(xì)胞懸液100 μL。24 h后，加入含不同濃度化合物及相應(yīng)溶劑對(duì)照的新鮮培養(yǎng)基，每孔加100 μL（DMSO終濃度<0.1%），每種受試化合物設(shè)5~7個(gè)劑量組，每組至少設(shè)3個(gè)平行孔，于37℃繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，棄上清液，每孔加入100 μL新鮮配制的含0.5mg/mL MTT的無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液后，每孔加入200 μL DMSO溶解MTT甲簪沉淀，微型振蕩器振蕩混勻，用酶標(biāo)儀在參考波長450 nm，檢測波長570 nm條件下測定光密度值（OD），以溶劑對(duì)照處理的腫瘤細(xì)胞為對(duì)照組，用以下公式計(jì)算化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率，并按中效方程計(jì)算IC₅₀：抑制率=（對(duì)照組平均OD值－給藥組平均OD值）÷對(duì)照組平均OD值×100%。將制備方法中的浸膏、以及甘青青蘭石油醚部位、甘青青蘭乙酸乙酯部位、甘青青蘭正丁醇部位、甘青青蘭水相萃取部位進(jìn)行體外腫瘤細(xì)胞毒活性篩選，結(jié)果見表2。

表2 體外腫瘤細(xì)胞毒活性篩選結(jié)果

注：1）、 HCT-8為人結(jié)腸癌細(xì)胞，Bel-7402為人肝癌細(xì)胞，BGC-823為人胃癌細(xì)胞，A549為人肺癌細(xì)胞，A2780為人卵巢癌細(xì)胞。2）、>50表明不具有抗細(xì)胞毒活性。通過表2可看出：甘青青蘭乙酸乙酯部位、甘青青蘭正丁醇部位、甘青青蘭水相萃取部位確實(shí)有較好的抗腫瘤的效果。

三、體外S₁₈₀荷瘤小鼠抗腫瘤實(shí)驗(yàn)。

1、實(shí)施例1各部位的S₁₈₀荷瘤小鼠抗腫瘤實(shí)驗(yàn)方法如下：

a）5~6周齡昆明小鼠，隨機(jī)選鼠分組，每組30只，每組雌雄各半（分籠飼養(yǎng)）；分組名稱為：空白對(duì)照組，環(huán)磷酰胺組，給藥組；給藥組包括：甘青青蘭石油醚部位低、中、高劑量組，甘青青蘭乙酸乙酯部位低、中、高劑量組，甘青青蘭正丁醇部位低、中、高劑量組，甘青青蘭水相萃取部位低、中、高劑量組，甘青青蘭乙酸乙酯部位和甘青青蘭水相萃取部位按質(zhì)量比1:1混合的低、中、高劑量組；對(duì)每只小鼠進(jìn)行皮膚消毒；

b）于右前肢皮下接種S₁₈₀瘤液0.2ml（S₁₈₀瘤細(xì)胞數(shù)在2.0×10⁶~2.2×10⁶范圍內(nèi)）；

c）步驟b）接種24小時(shí)后給藥；空白對(duì)照組灌胃給藥10mL/kg注射用生理鹽水；環(huán)磷酰胺組腹腔注射環(huán)磷酰胺20mg/kg；給藥組采用灌胃給藥實(shí)施例1制得的甘青青蘭乙酸乙酯部位、甘青青蘭正丁醇部位和甘青青蘭水相萃取部位；首次給藥后，隔日稱小鼠首次體重；每組每天給藥1次，每次給藥劑量詳見下表，連續(xù)給藥14天；

d）末次給藥1小時(shí)后，處死小鼠，稱小鼠末次體重，剝瘤塊稱重，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率=（空白對(duì)照組平均瘤重－給藥組平均瘤重）÷空白對(duì)照組平均瘤重×100%，將抑瘤率計(jì)算結(jié)果錄入表3。

表3 實(shí)施例1各部位對(duì)小鼠S₁₈₀實(shí)體瘤的影響

2、實(shí)施例2各部位的S₁₈₀荷瘤小鼠方法同實(shí)施例1，數(shù)據(jù)錄入表4。

表4 實(shí)施例2各部位對(duì)小鼠S₁₈₀實(shí)體瘤的影響

3、實(shí)施例3各部位的S₁₈₀荷瘤小鼠抗腫瘤實(shí)驗(yàn)的方法同實(shí)施例1，數(shù)據(jù)錄入表5。

表5實(shí)施例3各部位對(duì)小鼠S₁₈₀實(shí)體瘤的影響

經(jīng)申請人統(tǒng)計(jì)：給藥組與空白對(duì)照組相比，小鼠體重變化無顯著性差異（P>0.05）。表3~5中：S₁₈₀是指小鼠腹水瘤細(xì)胞，表3~5中S₁₈₀抑瘤率數(shù)值越大表示抗腫瘤效果越好。由表3~5可以看出：首先，實(shí)施例1~3均有較好的抗腫瘤效果，實(shí)施例1~3中相同部位相同劑量時(shí)，各組間的抗腫瘤效果無明顯差別。其次，與空白對(duì)照組相比，甘青青蘭乙酸乙酯部位中、高劑量組，甘青青蘭正丁醇中、高劑量組，甘青青蘭水相萃取部位中、高劑量組，甘青青蘭乙酸乙酯部位和甘青青蘭水相萃取部位按質(zhì)量比1:1混合中、高劑量組，環(huán)磷酰胺化療組，均可顯著抑制S₁₈₀腫瘤的生長。其中甘青青蘭乙酸乙酯部位和甘青青蘭水相萃取部位按質(zhì)量比1:1混合具有協(xié)同增效的效果。

實(shí)施例4

將甘青青蘭有效部位制備為片劑，采用如下步驟：將甘青青蘭乙酸乙酯部位300mg和淀粉100mg混勻，加質(zhì)量百分比濃度10%的淀粉糊40mg制成軟材，過篩得濕顆粒，干燥得干顆粒，整粒，加硬脂酸鎂4 mg混勻、壓片，即得。

實(shí)施例5

沖劑的制備方法：按重量份配比將甘青青蘭水相萃取部位5份、蔗糖1份、糊精3份混勻，加入適量質(zhì)量百分比95%乙醇溶液2~5份，邊加邊攪拌，制得軟材，將軟材干燥、過16目篩，分裝即得。

實(shí)施例6

微丸膠囊由以下重量份原料組成：甘青青蘭乙酸乙酯部位30份、卵磷脂5份、牛黃膽酸鈉5份、微晶纖維素30份；

微丸膠囊的制備方法：按配比將甘青青蘭乙酸乙酯部位、卵磷脂、牛黃膽酸鈉和微晶纖維素混均，倒入乙醇水溶液攪勻獲得軟材，將軟材倒入擠出機(jī)中擠出，經(jīng)滾圓獲得顆粒，擠出轉(zhuǎn)速250r/min，滾圓轉(zhuǎn)速800r/min，滾圓時(shí)間20min，干燥、過24~30目篩獲得微丸，將微丸灌裝入膠囊殼內(nèi)，即得。

實(shí)施例7

脂質(zhì)體注射劑的制備方法：1）在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將50g膽固醇琥珀酸酯、250g二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、40g大豆卵磷脂、50g泊洛沙姆-188、和10g甘青青蘭正丁醇部位溶解于1500ml體積比為1:1的乙醇和正丁醇的有機(jī)溶劑中，攪拌使其溶解獲得混懸液；將混懸液通過減壓濃縮揮去有機(jī)溶劑，獲得磷脂膜；

2）在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，向磷脂膜中加入8000ml pH為6.8的磷酸鹽緩沖溶液，攪拌，使磷脂膜洗脫并充分溶脹水合，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，得甘青青蘭正丁醇部位的脂質(zhì)體；

3）在無菌條件下，向甘青青蘭正丁醇部位的脂質(zhì)體中，加入100g海藻糖，攪拌均勻，超聲波處理0.5~1小時(shí)，加注射用水定容，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，灌裝，即得甘青青蘭正丁醇部位的脂質(zhì)體注射劑。

實(shí)施例8

納米粒注射劑的制備方法：取25g甘青青蘭正丁醇部位和100g泊洛沙姆407用3000ml 無水乙醇溶解，加入30ml 1mol/L氯化鋅的乙醇溶液，攪拌混合，超聲波處理0.5~1小時(shí)使其溶解，獲得混合液；將混合液減壓濃縮揮去溶劑，放入-20℃冰箱冷凍2小時(shí)；取出加注射用水定容，超聲波處理0.5~1小時(shí)，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，灌裝，即得甘青青蘭正丁醇部位的納米粒注射劑。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非是對(duì)本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實(shí)施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍。