本發(fā)明屬于光遺傳技術(shù)光刺激和顯微成像領(lǐng)域，特別涉及任意位置多點光聚焦及光斑優(yōu)化的方法與系統(tǒng)，并應(yīng)用于顯微成像。

背景技術(shù)：

光遺傳學(xué)(optogenetics)技術(shù)——將激活信號通路的光敏蛋白基因編碼，用自定義的動作電位激勵模式代替內(nèi)源的電活動——是一種將光學(xué)方法和遺傳學(xué)方法相結(jié)合從而精確控制細(xì)胞活動的方法。光遺傳學(xué)技術(shù)帶來的神經(jīng)學(xué)上的革命轉(zhuǎn)變了我們研究神經(jīng)回路的方法，神經(jīng)科學(xué)研究者能夠通過對神經(jīng)元地直接操縱來來直觀地研究各個神經(jīng)元、多個核團(tuán)之間的關(guān)系與內(nèi)在的相互作用，從而進(jìn)一步直觀地闡明大腦神經(jīng)環(huán)路的結(jié)構(gòu)、功能和行為。利用光遺傳學(xué)技術(shù)對大腦神經(jīng)環(huán)路地研究，神經(jīng)科學(xué)研究者能夠結(jié)合動物模型探究如帕金森綜合癥、阿爾茨海默病、抑郁癥等神經(jīng)性疾病，研究其病理與治療方法。

自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)最早被用于天體物理，利用波前傳感器實時測量并補(bǔ)償各種干擾引起的光學(xué)系統(tǒng)的波前畸變，然后通過波前校正器如變形鏡、空間光調(diào)制器等對畸變進(jìn)行補(bǔ)償。本世紀(jì)初隨著其它領(lǐng)域?qū)ψ赃m應(yīng)光學(xué)的逐漸增長的興趣，其應(yīng)用范圍開始擴(kuò)展，并逐步應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)成像中，以校正生物樣品深層成像時樣品散射特性帶來的光學(xué)畸變，以增加光學(xué)成像技術(shù)在生物樣品中的成像深度。

雙光子鈣離子成像技術(shù)被用來測量活體小鼠神經(jīng)元單細(xì)胞層面的興奮及其與行為相關(guān)的活動，但傳統(tǒng)的商用雙光子成像系統(tǒng)只能對單一區(qū)域進(jìn)行刺激與顯微成像。然而，用于感覺和運動的神經(jīng)元通常分布在腦區(qū)的多個區(qū)域之中，這極大地限制了神經(jīng)環(huán)路尤其是多腦區(qū)間相互作用的研究。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于利用針對現(xiàn)有光遺傳學(xué)刺激方案只能對單一區(qū)域進(jìn)行刺激的局限，通過將空間光調(diào)制器和自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)相結(jié)合，提供了一種任意位置多點光聚焦及光斑優(yōu)化的方法與系統(tǒng)。

本發(fā)明采用技術(shù)方案是：

一、一種任意位置多點光聚焦及光斑優(yōu)化的方法：

1)不加載樣品，激光器發(fā)射出光束，經(jīng)過準(zhǔn)直擴(kuò)束后，再經(jīng)過帶有初始分區(qū)的梯度分布的基底相位的空間光調(diào)制器調(diào)制，然后經(jīng)過聚焦透鏡聚焦，在焦平面處得到多個理想聚焦光斑，并用成像透鏡在工業(yè)相機(jī)上記錄其光斑分布；

2)加載樣品，激光器發(fā)射出光束，經(jīng)過準(zhǔn)直擴(kuò)束后，再經(jīng)過帶有梯度分布的基底相位的空間光調(diào)制器調(diào)制，然后經(jīng)過聚焦透鏡聚焦到散射介質(zhì)，在位于散射介質(zhì)內(nèi)部的焦平面處得到多個畸變散射光斑，并用成像透鏡在工業(yè)相機(jī)上記錄其光斑分布；

3)將空間光調(diào)制器的圖像進(jìn)行分區(qū)，對每個分區(qū)依次分別加載相位，激光器多次發(fā)射出光束經(jīng)過準(zhǔn)直擴(kuò)束后，再經(jīng)過相位校正后的空間光調(diào)制器調(diào)制，然后經(jīng)過聚焦透鏡聚焦到散射介質(zhì)，在位于散射介質(zhì)內(nèi)部的焦平面處得到一系列多個校正散射光斑，用成像透鏡在工業(yè)相機(jī)上記錄并處理其光斑分布，完成一次校正循環(huán)，得到新的調(diào)制相位分布；

4)激光器多次發(fā)射出光束經(jīng)過準(zhǔn)直擴(kuò)束后，經(jīng)過加載有步驟3)獲得的新的調(diào)制相位分布的空間光調(diào)制器調(diào)制，然后經(jīng)過聚焦透鏡聚焦，聚焦光束進(jìn)入散射介質(zhì)，在散射介質(zhì)內(nèi)部的焦平面處得到校正循環(huán)后的多個校正光斑并用成像透鏡在工業(yè)相機(jī)上記錄，然后將得到的校正循環(huán)后的多個校正光斑與步驟1)中所得到的多個理想聚焦光斑進(jìn)行互相關(guān)計算，得到校正循環(huán)后的互相關(guān)系數(shù)并記錄；

5)重復(fù)步驟3)到4)，迭代進(jìn)行多次循環(huán)校正，直到校正循環(huán)后的互相關(guān)系數(shù)大于預(yù)設(shè)系數(shù)閾值，則停止處理，最后一次得到的空間光調(diào)制器中各分區(qū)的相位作為最終成像系統(tǒng)的相位，最后一次得到的校正循環(huán)后的多個校正光斑作為最終光斑，并用成像透鏡在工業(yè)相機(jī)上記錄。

所述步驟3)具體是指：

3.1)將空間光調(diào)制器的圖像像素點以n×n方式均勻分區(qū)，激光器多次發(fā)射出光束經(jīng)過準(zhǔn)直擴(kuò)束后，再經(jīng)過相位校正后的空間光調(diào)制器調(diào)制，然后經(jīng)過聚焦透鏡聚焦到散射介質(zhì)，在位于散射介質(zhì)內(nèi)部的焦平面處得到多個校正散射光斑；

3.2)將得到的校正散射光斑與理想聚焦光斑進(jìn)行互相關(guān)計算，得到m個相關(guān)系數(shù)；

3.3)記錄相關(guān)系數(shù)最大時分區(qū)的相位值，并以該相位值固定賦予添加到所對應(yīng)分區(qū)的基底相位上；

3.4)空間光調(diào)制器從第一個分區(qū)開始到最后一個分區(qū)重復(fù)上述步驟，每個分區(qū)依次進(jìn)行相位變化，完成所有分區(qū)后獲得最終一次校正循環(huán)后的相位分布，作為新的調(diào)制相位分布。

所述步驟3.1)中空間光調(diào)制器是采用以下方式調(diào)制：將一分區(qū)內(nèi)所有像素點從2π/m到2π進(jìn)行相位值的依次間隔掃描，掃描間隔為2π/m，m表示相關(guān)系數(shù)的總數(shù)，可由用戶自定義，其他分區(qū)的相位保持不變，每個相位值下進(jìn)行一次，從而獲得一組需校正損耗光斑。

所述的散射介質(zhì)采用活體生物組織、離體生物組織、毛玻璃和帶非熒光小球的瓊脂等其中的一種。

所述步驟1)中空間光調(diào)制器帶有梯度分布的基底相位，空間光調(diào)制器分區(qū)，每個分區(qū)的相位不相同形成梯度的相位分布，其分區(qū)與步驟3)的分區(qū)可相同也可不相同，根據(jù)所需聚焦點數(shù)量進(jìn)行合理分區(qū)。

優(yōu)選地，所述步驟1)中的空間光調(diào)制器初始的分區(qū)的梯度分布的基底相位的分區(qū)是將空間光調(diào)制器的圖像進(jìn)行分區(qū)，對每個分區(qū)依次分別加載相位，以邊相鄰的兩個分區(qū)的相位值不同，以角相鄰的兩個分區(qū)的相位值可不同可相同。

所述步驟1)中的空間光調(diào)制器各個分區(qū)的相位分布是：比如以對角連接的所有分區(qū)相位值相同(如國際象棋棋盤的黑白分隔方式)，由此形成兩種不同的相位分布，從而產(chǎn)生兩個聚焦光斑。例如若所需為兩個聚焦點，可將空間光調(diào)制以2×2分區(qū)，左上和右下區(qū)負(fù)責(zé)第一個聚焦點，左下和右上負(fù)責(zé)第二個聚焦點。抑或可將空間光調(diào)制器以1×2或2×1分區(qū)，左右或上下各負(fù)責(zé)一個聚焦點。抑或可將空間光調(diào)制以N×N交錯式分區(qū)(N為若干值)，其中每間隔一個分區(qū)的所有子區(qū)負(fù)責(zé)其中一個聚焦點，其余的所有子區(qū)負(fù)責(zé)另一個聚焦點乃至更多聚焦點(依據(jù)用戶要求，可參考國際象棋棋盤的黑白分隔方式)，基底相位梯度分布分區(qū)應(yīng)包括類似或相仿的所有分區(qū)方式。

棋盤式的初始分區(qū)和n×n校正時的分區(qū)是獨立的不同分區(qū)方法，并只在步驟1)中作為初始值給予空間光調(diào)制器，用于產(chǎn)生多個聚焦光斑；棋盤式初始分區(qū)的每個子區(qū)不是一個統(tǒng)一值而是分布，比如由左到右增大的這樣。

二、一種任意位置多點光聚焦及光斑優(yōu)化的系統(tǒng)：

系統(tǒng)包括激光器、擴(kuò)束模塊、空間光調(diào)制器和聚焦透鏡，擴(kuò)束模塊布置在激光器出射端的前方，激光器發(fā)射出光束經(jīng)擴(kuò)束模塊平行擴(kuò)束后入射到空間光調(diào)制器，空間光調(diào)制器出射端的前方依次置有聚焦透鏡，聚焦透鏡前方設(shè)有散射介質(zhì)，散射介質(zhì)位于聚焦透鏡的焦平面上；激光器發(fā)射出光束依次經(jīng)第一光束準(zhǔn)直擴(kuò)束模塊透鏡、第一光束準(zhǔn)直擴(kuò)束模塊透鏡平行擴(kuò)束后入射到空間光調(diào)制器，空間光調(diào)制器反射光經(jīng)聚焦透鏡聚焦到散射介質(zhì)內(nèi)部的焦平面上。

所述的擴(kuò)束模塊包括第一光束準(zhǔn)直擴(kuò)束模塊透鏡和第一光束準(zhǔn)直擴(kuò)束模塊透鏡，第一光束準(zhǔn)直擴(kuò)束模塊透鏡和第一光束準(zhǔn)直擴(kuò)束模塊透鏡平行依次布置在激光器出射端的前方，激光器發(fā)射出光束依次經(jīng)第一光束準(zhǔn)直擴(kuò)束模塊透鏡、第一光束準(zhǔn)直擴(kuò)束模塊透鏡平行擴(kuò)束后入射到空間光調(diào)制器。

還包括依次置于聚焦透鏡前方的成像透鏡和CMOS相機(jī)，散射介質(zhì)置于聚焦透鏡和成像透鏡之間，聚焦到散射介質(zhì)內(nèi)部的焦平面的光斑經(jīng)成像透鏡入射到CMOS相機(jī)接收。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明利用空間光調(diào)制器實現(xiàn)了多聚焦點的光刺激，突破了現(xiàn)有光遺傳學(xué)光刺激系統(tǒng)的局限，為相關(guān)領(lǐng)域研究人員探究大腦神經(jīng)環(huán)路多區(qū)域間的關(guān)聯(lián)與整體性研究提供了技術(shù)支持，擺脫了以往同一時刻只能在單一區(qū)域中研究大腦神經(jīng)環(huán)路的困境。

本發(fā)明同時通過自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)，校正了多聚焦點在深層組織內(nèi)部的散射畸變，優(yōu)化散射光斑分布，從而在更大深度下實現(xiàn)多點光刺激，相較于現(xiàn)有手段可以在大腦內(nèi)部更大深度下進(jìn)行光刺激，并應(yīng)用于腦組織大深度下的顯微成像。

并且本發(fā)明可方便地與已有的各種顯微成像技術(shù)相結(jié)合，實現(xiàn)同步的光刺激與顯微成像，有利于行為學(xué)與神經(jīng)環(huán)路等面向大腦不同區(qū)域的研究。

附圖說明

圖1為本發(fā)明系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為理想兩個聚焦光斑分布圖；

圖3為經(jīng)過散射介質(zhì)內(nèi)部的畸變兩個散射光斑分布圖；

圖4為第一次校正循環(huán)的兩個校正光斑分布圖；

圖5為第五次校正循環(huán)的兩個校正光斑分布圖；

圖6為五次校正循環(huán)得到的互相關(guān)系數(shù)曲線圖；

圖7為產(chǎn)生2個聚焦光斑的初始分區(qū)的梯度分布的基底相位圖。

圖8為產(chǎn)生4個聚焦光斑的初始分區(qū)的梯度分布的基底相位圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明。

如圖1所示，本發(fā)明系統(tǒng)包括激光器1、第一光束準(zhǔn)直擴(kuò)束模塊透鏡2、第一光束準(zhǔn)直擴(kuò)束模塊透鏡3、空間光調(diào)制器4、聚焦透鏡5、成像透鏡7和CMOS相機(jī)8，第一光束準(zhǔn)直擴(kuò)束模塊透鏡2和第一光束準(zhǔn)直擴(kuò)束模塊透鏡3平行依次布置在激光器1出射端的前方，激光器發(fā)射出光束經(jīng)第一光束準(zhǔn)直擴(kuò)束模塊透鏡2和第一光束準(zhǔn)直擴(kuò)束模塊透鏡3平行擴(kuò)束后入射到空間光調(diào)制器4，空間光調(diào)制器4出射端的前方依次置有聚焦透鏡5、成像透鏡7和CMOS相機(jī)8，散射介質(zhì)6置于聚焦透鏡5和成像透鏡7之間，散射介質(zhì)6位于聚焦透鏡5的焦平面上。

激光器發(fā)射出光束依次經(jīng)第一光束準(zhǔn)直擴(kuò)束模塊透鏡2、第一光束準(zhǔn)直擴(kuò)束模塊透鏡3平行擴(kuò)束后入射到空間光調(diào)制器4，空間光調(diào)制器4反射光經(jīng)聚焦透鏡5聚焦到散射介質(zhì)6內(nèi)部的焦平面上，焦平面的光斑經(jīng)成像透鏡7入射到CMOS相機(jī)8接收。

本發(fā)明的實施例及其具體過程如下：

1)激光器發(fā)射出的經(jīng)過準(zhǔn)直擴(kuò)束的平行光束，經(jīng)過帶有初始的分區(qū)的基底相位梯度分布的空間光調(diào)制器調(diào)制，然后經(jīng)過聚焦透鏡聚焦，在焦平面處得到理想的多個聚焦光斑分布并用成像透鏡在工業(yè)相機(jī)上記錄，如圖2所示，在算法中通過將激光器發(fā)射出的經(jīng)過準(zhǔn)直擴(kuò)束的平行光束設(shè)為一個圓內(nèi)為1圓外為0的N×N入射光束矩陣(N為若干值，在本具體實施案例中選取為1024)，乘以基底相位矩陣作為虛部，再乘以透鏡的相位矩陣得到聚焦光束矩陣，聚焦光束矩陣在頻域乘以菲涅爾衍射脈沖響應(yīng)的方式的得到多個聚焦光斑分布。其中第一次校正前賦給空間光調(diào)制器的初始的基底相位梯度分布根據(jù)所需聚焦點數(shù)量進(jìn)行合理分區(qū)，例如若所需為兩個聚焦點，可將空間光調(diào)制以2×2分區(qū)，左上和右下區(qū)負(fù)責(zé)第一個聚焦點，左下和右上負(fù)責(zé)第二個聚焦點；抑或可將空間光調(diào)制器以1×2或2×1分區(qū)，左右或上下各負(fù)責(zé)一個聚焦點；抑或可將空間光調(diào)制以N×N交錯式分區(qū)(N為若干值)，其中每間隔一個分區(qū)的所有子區(qū)負(fù)責(zé)其中一個聚焦點，其余的所有子區(qū)負(fù)責(zé)另一個聚焦點乃至更多聚焦點(依據(jù)用戶要求，可參考國際象棋棋盤的黑白分隔方式，如圖8所示4個聚焦點的分區(qū)方式)，以及其他類似或相仿的分區(qū)方式。在本具體實施案例中選取第一種2×2分區(qū)方式，如圖7所示。

2)激光器發(fā)射出的經(jīng)過準(zhǔn)直擴(kuò)束的平行光束，經(jīng)過帶有基底相位梯度分布的空間光調(diào)制器調(diào)制，然后經(jīng)過聚焦透鏡聚焦，聚焦光束進(jìn)入具有一定厚度的散射介質(zhì)內(nèi)部，在散射介質(zhì)內(nèi)部的焦平面處得到畸變的多個散射光斑分布并用成像透鏡在工業(yè)相機(jī)上記錄，在算法中通過將激光器發(fā)射出的經(jīng)過準(zhǔn)直擴(kuò)束的平行光束設(shè)為一個圓內(nèi)為1圓外為0的N×N入射光束矩陣(N為若干值)，乘以基底相位矩陣作為虛部，再乘以透鏡的相位矩陣得到聚焦光束矩陣，聚焦光束矩陣在頻域乘以菲涅爾衍射脈沖響應(yīng)并在光到達(dá)樣品內(nèi)部后額外逐層累乘一層散射介質(zhì)相位分布(在算法中將散射介質(zhì)劃分成一定厚度的若干層，每一層相位分布視作沿光軸不變)的方式的得到畸變的多個散射光斑分布，如圖3所示，在本具體實施案例中對畸變的散射光斑進(jìn)行了互相關(guān)系數(shù)計算得到校正前的互相關(guān)系數(shù)為0.012；

3)將空間光調(diào)制器分區(qū)，對第一個分區(qū)進(jìn)行一定相位變化范圍，一定相位間隔的相位劃分得到若干個校正相位值，取劃分出的第一個校正相位值，其他分區(qū)相位保持不變，將得到的相位分布加上分區(qū)的基底相位梯度分布，從而得到校正相位分布，然后將校正相位分布重新加載到空間光調(diào)制器上；

4)激光器發(fā)射出的經(jīng)過準(zhǔn)直擴(kuò)束的平行光束，經(jīng)過帶有校正相位分布的空間光調(diào)制器調(diào)制，然后經(jīng)過聚焦透鏡聚焦，聚焦光束進(jìn)入具有一定厚度的散射介質(zhì)內(nèi)部，在散射介質(zhì)內(nèi)部的焦平面處得到校正的多個散射光斑分布并用成像透鏡在工業(yè)相機(jī)上記錄，在算法中通過將激光器發(fā)射出的經(jīng)過準(zhǔn)直擴(kuò)束的平行光束設(shè)為一個圓內(nèi)為1圓外為0的N×N入射光束矩陣(N為若干值)，乘以校正相位矩陣作為虛部，再乘以透鏡的相位矩陣得到聚焦光束矩陣，聚焦光束矩陣在頻域乘以菲涅爾衍射脈沖響應(yīng)并在光到達(dá)樣品內(nèi)部后額外逐層累乘一層散射介質(zhì)相位分布(在算法中將散射介質(zhì)劃分成一定厚度的若干層，每一層相位分布視作沿光軸不變)的方式的得到校正的多個散射光斑分布；

5)將步驟(1)中所得到的理想的多個聚焦光斑分布與步驟(4)中所得到的校正的多個散射光斑分布進(jìn)行互相關(guān)計算，得到第一個分區(qū)的第一個校正相位值的互相關(guān)系數(shù)并記錄，如本具體實施案例中為0.026；

6)將空間光調(diào)制器第一個分區(qū)依次取劃分出的不同的校正相位值，重復(fù)步驟(3)到(5)得到一系列的互相關(guān)系數(shù)，取其中最大的互相關(guān)系數(shù),所對應(yīng)的校正相位值賦值給第一個分區(qū)并固定，如本具體實施案例中為第13個相位值：13π/50。

7)對剩余的分區(qū)依次重復(fù)(2)到(5)，得到所有分區(qū)的校正相位值并固定作為新的基底相位梯度分布，完成第一次校正循環(huán)，獲得的校正光斑分布如圖4所示；

8)激光器發(fā)射出的經(jīng)過準(zhǔn)直擴(kuò)束的平行光束，經(jīng)過帶有新的基底相位梯度分布的空間光調(diào)制器調(diào)制，然后經(jīng)過聚焦透鏡聚焦，聚焦光束進(jìn)入具有一定厚度的散射介質(zhì)內(nèi)部，在散射介質(zhì)內(nèi)部的焦平面處得到第一次校正循環(huán)的多個校正光斑分布并用成像透鏡在工業(yè)相機(jī)上記錄，在算法中通過將激光器發(fā)射出的經(jīng)過準(zhǔn)直擴(kuò)束的平行光束設(shè)為一個圓內(nèi)為1圓外為0的N×N入射光束矩陣(N為若干值)，乘以校正相位矩陣作為虛部，再乘以透鏡的相位矩陣得到聚焦光束矩陣，聚焦光束矩陣在頻域乘以菲涅爾衍射脈沖響應(yīng)并在光到達(dá)樣品內(nèi)部后額外逐層累乘一層散射介質(zhì)相位分布(在算法中將散射介質(zhì)劃分成一定厚度的若干層，每一層相位分布視作沿光軸不變)的方式的得到第一次校正循環(huán)的多個散射光斑分布，然后將得到的第一次校正循環(huán)的多個校正光斑分布與步驟(1)中所得到的理想的多個聚焦光斑分布進(jìn)行互相關(guān)計算，得到第一個分區(qū)的第一次校正循環(huán)的互相關(guān)系數(shù)并記錄，如本具體實施案例中為0.72；

9)重復(fù)步驟(2)到(8)，進(jìn)行一系列循環(huán)校正，直到第若干次校正循環(huán)的互相關(guān)系數(shù)大于用戶預(yù)設(shè)值，循環(huán)停止得到所有分區(qū)最終的校正相位值分布和最終的校正光斑分布并用成像透鏡在工業(yè)相機(jī)上記錄，如本具體實施案例中用戶預(yù)設(shè)值設(shè)定為0.785，在第5次循環(huán)校正后得到互相關(guān)系數(shù)為0.787，大于用戶預(yù)設(shè)值循環(huán)停止，如圖6所示，5次循環(huán)校正后獲得的校正光斑分布如圖5所示。

從結(jié)果數(shù)據(jù)可以看到，本發(fā)明將互相關(guān)系數(shù)低于0.05的兩個畸變的散射光斑通過一次校正，互相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.72，并通過多次循環(huán)校正接近0.8，基本接近于理想光斑。由此，本發(fā)明通過將空間光調(diào)制器和自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)相結(jié)合，利用空間光調(diào)制器分區(qū)實現(xiàn)多區(qū)域光聚焦，利用自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)校正了大腦內(nèi)部大深度下的散射畸變，優(yōu)化散射光斑分布，突破了現(xiàn)有光遺傳學(xué)光刺激與顯微成像方案只能對單一區(qū)域進(jìn)行刺激的局限，使得相關(guān)領(lǐng)域研究人員能夠在大腦內(nèi)部更大深度下同時進(jìn)行多區(qū)域光刺激和顯微成像。