本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種集光熱及化療于一體的納米脂質(zhì)體的制備方法及其用途。

背景技術(shù)：

惡性腫瘤依舊是引發(fā)全世界人口死亡的排前疾病，其主要治療方式是手術(shù)、放療、化療。然而，手術(shù)治療和放療、化療對病人損傷較大，且化療普遍面臨著多藥耐藥的問題。因此，尋找一種非侵入的病人能耐受的腫瘤治療方法是臨床研究的熱點。

熱療是通過各種方法使全身和(或)局部組織加熱至有效治療的溫度范圍并維持一定時間來殺滅腫瘤細胞的一種方法。熱療本身對腫瘤細胞有直接的殺傷作用，熱療能使癌細胞的線粒體膜、溶酶體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜發(fā)生破壞，并且由于溶酶體酸性水解酶的大量釋放，導(dǎo)致胞膜破裂，胞漿外溢；造成dna損傷的增加及抑制dna的合成；影響相關(guān)基因促進腫瘤細胞凋亡。

激光熱療相較于手術(shù)、放療、化療，有著無創(chuàng)或微創(chuàng)，恢復(fù)時間短，并發(fā)癥少的優(yōu)點。但由于腫瘤內(nèi)部熱分布不均勻，尤其是在大血管周邊區(qū)域，熱量隨著血液循環(huán)消散，單純熱療很難殺死所有腫瘤細胞，治療結(jié)果差異大。因此，仍需要聯(lián)合其他治療方法來提高熱療的療效，臨床研究表明，熱療-化療的聯(lián)合治療可以明顯增強抗腫瘤療效。

光熱療法(photothermaltherapy，ptt)是一種新出現(xiàn)的非侵入性的腫瘤治療方法。它是利用各種致熱源的熱效應(yīng)，在光照條件下將腫瘤加熱至有效治療溫度并維持一定的時間以將腫瘤細胞殺死的治療策略。其中光熱劑在近紅外(nir)區(qū)有吸收特性，可將光能轉(zhuǎn)換成熱能并局部升溫，最終導(dǎo)致不可逆的細胞損傷(腫瘤細胞凋亡和凝固性壞死)。近紅外激光誘導(dǎo)的ptt相較于傳統(tǒng)的手術(shù)治療和化療有著明顯的優(yōu)勢，包括無創(chuàng)，恢復(fù)時間短，并發(fā)率低，以及治療過程可隨時監(jiān)測。然而，由于腫瘤內(nèi)熱分布不均勻，單獨光熱治療不足以殺死所有的腫瘤細胞，導(dǎo)致腫瘤消融不完全、腫瘤復(fù)發(fā)等結(jié)果。聯(lián)合治療可以提高治療的療效同時降低副作用，已成為一種重要的腫瘤治療策略。

迄今為止，已有多種聯(lián)合熱療的治療方法，其中以ptt聯(lián)合化療在各聯(lián)合治療中最有前景。臨床研究表明，熱療化療的聯(lián)合治療可以明顯增強抗腫瘤療效，主要由于熱療在殺死癌細胞的同時，有助于化療藥物進入腫瘤細胞和增加化療藥物的細胞毒性。ptt和化療藥物有著不同的治療機制。前者主要通過高熱來殺死腫瘤細胞，是一種物理治療方式。近紅外光的波長范圍在700至1100nm之間，生物體對近紅外光的吸收很小，導(dǎo)致近紅外光對機體的穿透能力很強，可有效地滲透到生物組織并在ptt制劑的條件下選擇性地加熱。激光照射后光熱制劑將光能轉(zhuǎn)化為熱能，局部升溫從而造成腫瘤細胞的不可逆損傷。后者，化療是多種腫瘤的治療中最常用的治療方法之一。熱療和化療有著各自作用機制和細胞毒性，熱療聯(lián)合化療藥物通常產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。

當(dāng)前，納米技術(shù)的迅猛發(fā)展，納米材料由于其納米尺度所固有的獨特物理性質(zhì)為熱療聯(lián)合化療提供了一個有效的平臺，新型納米系統(tǒng)的熱療化療聯(lián)合治療研究正成為腫瘤治療的研究熱點。進來多種多功能的籠、金納米棒、cus納米籠、硅納米粒等。這些載藥系統(tǒng)所發(fā)揮的協(xié)同效用已經(jīng)被體外及在體實驗所證明，但是這些材料的缺點在于藥物釋放緩慢，且不可控制。在腫瘤的周邊區(qū)域或是臨近大血管的區(qū)域，熱療后溫度在41℃-45℃，不足以破壞這些納米載體從而釋放藥物。

溫度敏感脂質(zhì)體藥物載體(temperature-sensitive-liposomes,tsl)是一種能攜載藥物并且在高溫條件下有效地釋放藥物的脂質(zhì)體。當(dāng)溫度達到脂質(zhì)材料的相變溫度時，脂質(zhì)體雙分子膜在由“凝膠”態(tài)轉(zhuǎn)變到“液晶”態(tài)結(jié)構(gòu)時，其磷脂的脂酰鏈紊亂度及活動度增加，膜的流動性增大，所包封的藥物迅速釋放。在熱療的高溫不足以殺死所有腫瘤細胞的情況下，熱療產(chǎn)生的高熱已經(jīng)足以導(dǎo)致溫度敏感性脂質(zhì)體發(fā)生相變，并在瘤內(nèi)釋藥。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有的惡性腫瘤治療存在的不足，本發(fā)明目的在于提供一種集光熱及化療于一體的納米脂質(zhì)體的制備方法及其用途。

本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：

本發(fā)明的集光熱及化療于一體的納米脂質(zhì)體的制備方法的具體步驟如下：

將脂質(zhì)與ir-780混溶于氯仿中，邊渦旋邊氮氣吹干成均勻薄膜，真空抽去殘留氯仿，加入(nh4)2so4溶液，將脂質(zhì)薄膜溶解，在水浴中超聲振蕩至澄清，制成ir-780脂質(zhì)體，將已形成的脂質(zhì)體用擠出儀從聚碳酸酯膜中反復(fù)擠出，制備成粒徑均勻的脂質(zhì)體，將ir-780脂質(zhì)體裝于透析袋中，放入pbs溶液中透析，將脂質(zhì)體內(nèi)部的硫酸銨替換成pbs，將阿霉素溶液逐滴加入脂質(zhì)體中，邊加邊振蕩，利用硫酸銨梯度法將阿霉素載入脂質(zhì)體內(nèi)核，制得本發(fā)明的納米脂質(zhì)體。

所述的脂質(zhì)是由二棕櫚酰磷脂酰膽堿，單棕櫚酰磷脂酰膽堿和二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000組成，三者的摩爾比為86：10：4。

ir-780與脂質(zhì)的質(zhì)量比為1～10：100，優(yōu)選為5:100。

真空抽氯仿的時間為3h。

水浴溫度為65℃。

所述的聚碳酸酯膜為200nm(脂質(zhì)體直徑)。

pbs溶液中透析的時間為4h。

所述的阿霉素溶液的濃度為1mg/ml，阿霉素與脂質(zhì)的質(zhì)量比為1:10～30，優(yōu)選為1:20。

所述的硫酸銨梯度法是在制備空白脂質(zhì)體后，去除脂質(zhì)體外水相中的銨離子，內(nèi)水相中一個銨離子電離后形成一個氨分子和一個質(zhì)子，氨分子在跨膜擴散作用下同樣被除去，這就形成了內(nèi)外水相間的ph梯度，未載藥做好了準備，加入阿霉素溶液后，阿霉素分子在ph梯度的驅(qū)動下，跨膜進入脂質(zhì)體內(nèi)水相中，并和硫酸根離子成鹽，成鹽后形成膠態(tài)沉淀，聚集于內(nèi)水相中，另外阿霉素分子和質(zhì)子結(jié)合形成其離子態(tài)，從而失去膜通透性，而不會反向擴散出去。

本發(fā)明的方法制備的納米脂質(zhì)體可以用于制備治療腫瘤的藥物。

本發(fā)明的積極效果如下：

本發(fā)明將光敏劑ir-780包封于脂質(zhì)體雙側(cè)脂質(zhì)之間，同時將化療藥物阿霉素包封于脂質(zhì)體中心，制備成一種針對惡性腫瘤治療的ditsl。本發(fā)明的納米脂質(zhì)體性質(zhì)穩(wěn)定，粒徑分布均勻，在激光作用下可產(chǎn)生高溫，殺滅癌細胞，高溫還可使納米脂質(zhì)體殼膜溶解，釋放阿霉素，進一步滅活殘留的癌細胞。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的脂質(zhì)體的制備方法的示意圖。

圖2是本發(fā)明的方法制備的脂質(zhì)體的粒徑分布圖。

圖3是熱化療后的細胞活性定量圖；(a)加入pbs、空白脂質(zhì)體、dtsl、itsl和ditsl后細胞在有無激光輻照(0.6w/cm²,5min)下的生存率。熱化療組細胞生存率最低。(b)增強激光輻照強度后(0.8w/cm²,5min)，熱療組和熱化療組細胞存活率進一步減低。

圖4是各處理組治療21天后小鼠腫瘤圖，圈內(nèi)示腫瘤。

具體實施方式

下面的實施例是對本發(fā)明的進一步詳細描述。

實施例1

一、ditsl的制備及性質(zhì)檢測

1.方法

1.1dox(阿霉素)/ir-780溫度敏感性脂質(zhì)體的制備

取dppc，mppc，dspe-peg2000(摩爾比為86：10：4)，與ir-780(ir-780：脂質(zhì)＝5：100,質(zhì)量比)混溶于氯仿中，邊渦旋邊氮氣吹干成均勻薄膜，真空3h抽去殘留氯仿。加入250mm(nh4)2so4溶液，將脂質(zhì)薄膜溶解，在65℃水浴中超聲振蕩至澄清，制成ir-780脂質(zhì)體(itsl)。將已形成的脂質(zhì)體用擠出儀從200nm聚碳酸酯膜中反復(fù)擠出，制備成粒徑均勻的脂質(zhì)體。將ir-780脂質(zhì)體裝于透析袋中，放入pbs溶液中透析4h，將脂質(zhì)體內(nèi)部的硫酸銨替換成pbs。dox溶液(1mg/ml)逐滴加入脂質(zhì)體中，邊加邊振蕩，利用硫酸銨梯度法將dox載入脂質(zhì)體內(nèi)核。阿霉素脂質(zhì)體(dtsl)在成膜過程中只加入磷脂，其余制作方法如前所述。

1.2ditsl表征

各脂質(zhì)體的粒徑大小、粒徑分布、分散指數(shù)(pdi)、表面電位均由馬爾文zeta粒度儀在室溫下測得。dtsl，itsl和ditsl的吸收光譜由紫外-可見光光譜儀測得，dox在480nm激發(fā)，ir-780在780nm激發(fā)。dox和ir-780的包封率的測量方法如下：先用熒光分光光度計得出dox和ir-780的熒光值-濃度標準曲線。將制備好的各脂質(zhì)體放入超濾管，通過超速離心法(20,000r/min，30min)將脂質(zhì)體和游離的藥物分離出來，用熒光分光光度計結(jié)合dox和ir-780的熒光值-濃度標準曲線測得包封在脂質(zhì)體內(nèi)部的藥物濃度，再算出包封量。藥物包封率計算方法見公式(1)。

包封率(％)＝(包封的藥物量)/(初始加入量)×100。(1)

1.3ditsl在生物環(huán)境下的穩(wěn)定性

我們使用了不同的緩沖液來測試ditsl在不同生物環(huán)境下的穩(wěn)定性，包括pbs、30％血清、50％血清和90％血清緩沖液。ditsl懸浮液(1mm脂質(zhì))在上述緩沖液中在37℃孵育24h(ib)。以未經(jīng)孵育的ditsl作為空白對照(i0)，以1％tritonx-100處理過完全破裂的ditsl作為陽性對照(i100)。用熒光光譜儀測得各個條件下dox的熒光值，dox釋放率計算方法見公式(2)。ditsl的穩(wěn)定性以100％-dox釋放率來表示。

dox釋放率(％)＝(ib-i0)/(i100-i0)(2)

1.4激光誘導(dǎo)的體外升溫

pbs,dtsl(dox:15μg/ml),itsl(ir-780:15μg/ml),以及ditsl(ir-780:15μg/ml,dox:15μg/ml)各1ml加入小試管中。用近紅外激光(808nm,0.8w/cm²)對每個樣本各照射5min。在對樣本進行激光照射的同時，每隔30秒，用紅外熱像儀對各個脂質(zhì)體溶液的溫度進行測量并記錄。

1.5ditsl的溫度敏感性藥物釋放

將ditsl加入90％血清的pbs中，分別在37℃，42℃和50℃條件下進行金屬浴。分別于20s,40s,1min,2min,3min,4min,5min,10min和30min取樣，每次取樣后及時補充相同量的、相同溫度下的90％血清pbs。同時以未經(jīng)孵育的ditsl的熒光值作為空白對照(i0)，ditsl用1％tritonx-100破乳后測定脂質(zhì)體中dox的熒光值作為總量(i100)，每次取樣樣品的熒光值為it，依次累加，計算藥物在各個時間點各個溫度下的累計釋放率。

1.6激光控制的ditsl藥物釋放

激光控制的藥物釋放實驗方法如下：將ditsl和dtsl置入90％血清的pbs中,用近紅外激光(808nm,0.8w/cm²)分別照射20s,40s,1min,2min,3min,4min,和5min，測得輻照不同時間兩種脂質(zhì)體的dox釋放情況，此外，測相同時間點ditsl無激光輻照時的dox釋放量。

2.檢測結(jié)果

2.1脂質(zhì)體的制作與表征

各脂質(zhì)體的制作過程如圖1所示，先薄膜水化法制備itsl(綠色)，再經(jīng)過硫酸銨梯度法載入dox(紅色)，ditsl呈深棕色。由于ir-780與dox的親水性不同，ir-780溶在脂質(zhì)體脂質(zhì)雙層中，dox包封在脂質(zhì)體的親水內(nèi)核中。各載藥脂質(zhì)體的粒徑大小、分散指數(shù)(pdi)、表面電位及包封率見表1。ditsl粒徑在138.98nm左右，pdi約0.32。dtsl、itsl和空白脂質(zhì)體的粒徑稍小，分別約94.05nm,84.551nm和77.53nm。所有脂質(zhì)體略帶負電位，zeta電位約在-10左右。dox在ditsl的包封率約92.52％，ir-780在ditsl的包封率約94.47％。dtsl中dox的包封率約97.39％，itsl中ir-780的包封率約99.98％。

表1.空白脂質(zhì)體、itsl、dtsl和ditsl的表征

數(shù)據(jù)為均值±標準差，n＝3,；藥脂比為藥與脂質(zhì)的質(zhì)量比；pdi為多分散指數(shù)。

從紫外-可見分光光度計測得的脂質(zhì)體光學(xué)特性可見。itsl在793nm處有最大吸收峰，符合ir-780吸收特征，dtsl在492nm處有最大吸收，與dox吸收峰相似。ditsl同時在793nm和492nm有顯著吸收峰，ditsl在近紅外區(qū)的強烈吸收特性也證明了ir-780適合作為熱療試劑。

各脂質(zhì)體在不同生物條件下的穩(wěn)定性，在孵育12h以內(nèi)，ditsl藥物釋放較慢。在90％血清緩沖液37℃孵育24h后，ditsl中的dox全部釋放，在包30％血清和50％血清中，ditsl的穩(wěn)定性稍好，分別釋放約57％和53％的dox。而在pbs中釋放的很少(約23％)。結(jié)果表明tsl在pbs中穩(wěn)定性較好，但在高濃度血清中穩(wěn)定性較差。2.2激光誘導(dǎo)的體外升溫

為了評估ditsl的光熱轉(zhuǎn)換效率，我們用紅外熱像儀探測激光照射下ditsl的升溫情況。在0.8w/cm²激光照射五分鐘內(nèi)，ditsl和itsl溫度最高分別升到54.2℃和54.1℃。而dtsl和pbs組只升高了9.7℃和9.3℃，最終上升到34℃左右。在缺乏光熱制劑時，激光不能有效地轉(zhuǎn)化成熱能，所以dtsl和pbs組只有少量的溫度升高。而ditsl和itsl由于ir-780的存在溫度升高明顯且迅速。itsl和ditsl在溫度升高一段時間后，溫度會緩慢下降，這是由于ir-780光照一段時間后發(fā)生了分子之間的自猝滅。

2.3ditsl的藥物釋放特性

我們用不同溫度的金屬浴孵育ditsl，測試ditsl的溫度敏感釋放特性。ditsl中dox的釋放在體溫和高熱之間有著明顯的差別。dox的累計釋放率有兩個節(jié)點，一個是在1min內(nèi)，釋放最為迅速，在42℃加熱1min，ditsl釋放了約40％的藥物。第二個節(jié)點是在5min，恒溫在42℃時，加熱1min和5min之間dox的累積釋放率增加趨勢近乎線性，釋放迅速，從40％增加到70％。在加熱5min后，dox釋放稍減緩，加熱從5min到20min，累積釋放率從66.9％±4.0％增加到73.9％±3.9％。dox隨著加熱時間延長而持續(xù)釋放，在加熱30min后，ditsl釋放了78％的dox。在50℃時藥物1min內(nèi)釋放更快，釋放了約61％的dox，1min到30min的釋放趨勢與42℃時情況相仿，加熱30min后，dox的釋放率約90％。而其他條件相同的情況下，37℃時ditsl的釋藥速度和累計釋放率均明顯低于42℃和50℃，在30min最終釋放了約22.8％的dox。

接著我們測試了近紅外激光誘導(dǎo)的藥物釋放情況。如果沒有激光輻照，ditsl的藥物釋放率較低，5分鐘后釋放率約8.9％。dtsl在激光輻照下的藥物釋放率與ditsl無激光情況相仿，5分鐘后的藥物釋放率約11.2％。ditsl的藥物釋放率隨著激光輻照的時間而增加，在一分鐘內(nèi)增加迅速，達到了56.0％，而后增加稍減緩，在5分鐘后，藥物釋放率約80.1％，遠遠高出其他組。

二、ditsl熱化療治療乳腺癌的體外實驗

1.方法

1.1細胞培養(yǎng)

用dmem高糖培養(yǎng)基(加入10％胎牛血清以及1％青霉素和1％鏈霉素)于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4t1細胞，每3天更換培養(yǎng)基，0.25％胰蛋白酶消化傳代。

1.2體外細胞攝取

乳腺癌4t1細胞種植在6孔板(1.2×10⁶個/孔)，將孔板置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24h，待細胞完全貼壁后，更換為含藥量為5μg/ml、10μg/ml或20μg/mlditsl的新鮮培養(yǎng)基孵育1h、2h或3h，對照組中加入同等量的pbs溶液。孵育后pbs洗三次，洗去未被吞噬的脂質(zhì)體。胰酶消化并收集細胞，用流式細胞儀分析細胞內(nèi)ir-780和dox的熒光值。每個樣本選一萬個細胞，數(shù)據(jù)分析采用flowjo軟件。

為進一步觀察dtsl,itsl和ditsl在4t1的亞細胞定位，我們使用了激光共聚焦顯微鏡。取對數(shù)生長期的4t1乳腺癌細胞種于8孔激光共聚焦專用孔板中，每個板孔細胞數(shù)為2×10⁴，將孔板置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24h，待細胞完全貼壁后，更換分別含dtsl(10μg/mldox),itsl(10μg/mlir-780),和ditsl(10μg/mldox，10μg/mlir-780)的新鮮培養(yǎng)基。對照組中加入同等量的pbs溶液。在培養(yǎng)箱內(nèi)培育3h后，吸去上層培養(yǎng)液，pbs洗3次，4％多聚甲醛固定15min，避光條件下dapi細胞核染色5min，pbs洗3次。dapi能夠與dna強力結(jié)合，在熒光顯微鏡下發(fā)出藍色熒光。dapi可以透過完整的細胞膜，它可以用于活細胞和固定細胞的染色。將孔板置于激光共聚焦下檢測ditsl在4t1細胞的攝取情況。dapi的激發(fā)波長為340nm，發(fā)射波長為488nm，ir-780的激發(fā)波長為708nm，發(fā)射波長為760nm。

1.3細胞內(nèi)的藥物釋放

取對數(shù)生長期的4t1乳腺癌細胞種于8孔激光共聚焦專用孔板中，每個板孔細胞數(shù)為2×10⁴，將孔板置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24h，待細胞完全貼壁后，再用含ditsl(10μg/mldox，10μg/mlir-780)培養(yǎng)基培養(yǎng)1h，pbs洗3次后用dapi細胞核染色，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。再將染色后的細胞分為三組，分別激光照射(808nm,0.8w/cm²,5min)、37℃或42℃孵育5min，再次用激光共聚焦顯微鏡觀察不同處理情況下細胞內(nèi)dox釋放的情況。

1.4體外熱療、熱化療治療效果

取對數(shù)生長期的4t1細胞種在96孔板(4×10³個/孔)，細胞培養(yǎng)箱中孵育過夜。更換分別含空白脂質(zhì)體、dtsl、itsl和ditsl的pbs或只有pbs(每孔100μl)，保證最后各孔dox和ir-780的濃度在0或10μg/ml。37℃培養(yǎng)3h后，pbs洗3次。各組分別不加激光處理或激光照射5min(808nm,0.8w/cm²)，共計10組。以只加入pbs而無激光照射的組為空白對照組，以加入pbs后激光輻照的組為激光組，以加入dtsl組為化療組，以itsl+激光組為熱療組，以ditsl+激光組為熱化療組。培養(yǎng)2h后，每孔加入10μlcck-8試劑反應(yīng)1h，cck-8試劑中含有2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2h-四唑單鈉鹽，它在1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯(1-methoxypms)的作用下可被活細胞線粒體中的脫氫酶還原為黃色的甲臜產(chǎn)物(formazan)，而死細胞無此功能，甲臜物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比。在450nm波長處測定反應(yīng)產(chǎn)物的光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。各組根據(jù)其吸收值計算相對于空白組的細胞活性。

為了直觀觀察熱療、熱化療的治療效果，我們進行了直接的細胞染色。首先4t1細胞種在24孔板(7×10⁴個/孔)培養(yǎng)過夜，更換分別含dtsl、itsl和ditsl的pbs或只有pbs(每孔400μl)，最終dox和ir-780的濃度在0或10μg/ml。3小時后，部分處理組進行激光輻照，分組如下：pbs組(空白對照組)、pbs+激光組(激光組)、dtsl組(化療組)、itsl組、itsl+激光組(熱療組)、ditsl組、ditsl+激光組(熱化療組)。再培養(yǎng)2h后，細胞進行calcein-am/pi染色，顯微鏡下觀察。calcein-am的乙酸甲基酯親脂性很高，使其可透過細胞膜，通過活細胞內(nèi)的酯酶作用，calcein-am能脫去am基，產(chǎn)生的鈣黃綠素能發(fā)出強綠色熒光，因此calcein-am僅對活細胞染色。pi是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，pi能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。由于鈣黃綠素和pi都可被490nm激發(fā)，因此可用熒光顯微鏡同時觀察活細胞和死細胞。

2.結(jié)果

2.1體外細胞攝取

4t1經(jīng)不同濃度的ditsl處理不同的時間過后，流式細胞計數(shù)測的定量結(jié)果顯示：4t1細胞攝取dtsl和itsl有著劑量和時間依賴性。在同一時間點中(3h)細胞的熒光強度隨藥物濃度的增加而增強。同時，這些細胞在同一藥物濃度(10μg/ml)，隨著藥物培養(yǎng)時間的延長，細胞具有更強的熒光強度。腫瘤細胞對脂質(zhì)體的攝取呈時間依賴性。4t1對ditsl的攝取略有不同，在藥物濃度為5μg/ml、10μg/ml和15μg/ml時，藥物攝取量隨濃度增加，而20μg/ml時略有下降。同時在同一藥物濃度，1h、2h和3h時，4t1對藥物的攝取逐漸增加，而4h時略有下降。

各脂質(zhì)體在4t1的亞細胞定位結(jié)果顯示。itsl和ditsl孵育后的4t1細胞內(nèi)可見ir-780的熒光，ir-780均勻的分布在細胞的胞漿中，而在dtsl和ditsl處理過后，可見dox主要聚集在腫瘤細胞細胞核中。ditsl包裹的dox在4t1細胞的細胞質(zhì)和細胞核中同時存在。

2.2細胞內(nèi)的藥物釋放

我們用激光共聚焦顯微鏡進一步研究了藥物在細胞水平的釋放與細胞攝取。4t1細胞經(jīng)過ditsl孵育后，加入預(yù)熱的pbs并保持恒溫或者直接進行激光照射，來比較不同溫度和方式對細胞攝取和細胞內(nèi)藥物釋放的影響。激光照射5min后，細胞內(nèi)可見dox的熒光信號較室溫下明顯增強。相似的dox熒光信號增強情況在42℃恒溫5分鐘后也可見。而37℃恒溫5min后，細胞內(nèi)dox的熒光信號與室溫下差別很小。各組處理前后的dox熒光強度已量化處理，在激光照射后，阿霉素的熒光強度增加明顯，而在37℃恒溫5min后，阿霉素的熒光強度較處理前增加不明顯。

2.3體外化療、熱療、熱化療治療

為了評價體外情況下化療、熱療、熱化療的細胞殺傷情況，我們采用了cck-8法測細胞活性。圖3所示，脂質(zhì)體載體與pbs對照組比并無細胞毒性(p>0.05)。dtsl(10μg/mldox)化療后，細胞活性明顯減低，與pbs對照組相比活性約59.4％，dtsl化療同時激光照射后，細胞活性約53.3％，與單純化療后細胞活性無差別(p>0.05)。這是由于dtsl中不含有效的光熱制劑，激光照射后升溫不明顯，不能達到熱損傷的效果。itsl(10μg/mlir-780)孵育后，4t1細胞活性與對照組無差別，而itsl孵育后行激光照射的情況下，細胞活性顯著減低，下降到約43.6％。說明單獨熱療對細胞有一定的殺傷力。值得注意的是，在加入ditsl孵育并激光照射后，細胞活性減低至17.9％，較其他組細胞活性均低(p<0.01)。加大激光強度后(0.8w/cm²)，熱療組和熱化療組細胞活性進一步減低。熱化療組的細胞活性從17.8％降低到9.5％。

為了直觀觀察各處理方法的治療效率，細胞處理后進行calcein-am/pi染色，活細胞會被calcein-am染色，在熒光顯微鏡下呈綠色，而死亡/晚期凋亡的細胞可被pi染色，在顯微鏡下呈紅色。在單獨激光照射后，幾乎沒有細胞死亡，說明所使用的激光照射強度相對安全。dtsl化療后，死亡/晚期凋亡細胞數(shù)量增加，與ditsl處理后相似，說明在沒有激光照射的情況下，ditsl治療效果與單獨化療相似。而itsl在激光照射后，死亡/晚期凋亡細胞數(shù)量增加明顯。ditsl加激光照射后，由于熱殺傷和dox的迅速釋放，大部分細胞被殺死，可見整個視野呈紅色，只有少數(shù)細胞仍存活。各處理組結(jié)果與cck-8定量分析結(jié)果一致。熱化療組死亡細胞數(shù)較單純化療或熱療組明顯增加，說明了ditsl對4t1細胞的毒性可被激光輻照明顯增加，熱化療有著單獨治療難以比擬的治療效果。

三、ditsl對乳腺癌移植瘤的抑制效應(yīng)

1.方法

1.1瘤株及試驗動物

雌性spf級balb/c小鼠，鼠齡8～10周齡，體重18～22g，由廣東省動物中心提供(scxy[粵]2013-0002)，飼養(yǎng)在中科院深圳先進技術(shù)研究院spf級實驗室。飼料、飲水、墊料均經(jīng)高壓蒸汽滅菌121℃，20min滅菌處理，水和飼料自由飲食。

1.2細胞培養(yǎng)

用dmem高糖培養(yǎng)基(加入10％胎牛血清以及1％青霉素和1％鏈霉素)于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4t1細胞，每3天更換培養(yǎng)基，0.25％胰蛋白酶消化傳代。取對數(shù)生長期細胞進行試驗。

1.3皮下移植瘤模型建立

動物研究均通過中科院深圳先進技術(shù)研究動物愛護和使用委員會同意。小鼠右側(cè)腹部備皮，取對數(shù)期細胞，胰酶消化后離心3次洗去血清，制備成細胞數(shù)為1×10⁷個/ml的無血清細胞懸液，每只小鼠腹部皮下注入0.1ml的細胞懸液。每隔三天測量一次小鼠的體重和腫瘤體積，小鼠接種腫瘤細胞6天左右，待腫瘤體積長到約100mm³時進行治療，腫瘤體積計算見公式(3)。

腫瘤體積＝1/2×長徑×短徑²(3)

1.4實驗分組

各載藥脂質(zhì)體的制作方法以及脂質(zhì)體的特性如前所述。待腫瘤體積長到約100mm³開始實驗。隨機將荷瘤小鼠隨機分為七組：(1)空白對照組：每只小鼠瘤內(nèi)注射0.1ml0.9％的生理鹽水；(2)單純激光組：小鼠瘤內(nèi)注射0.1ml0.9％的生理鹽水后，將腫瘤區(qū)域置于激光范圍內(nèi)進行照射5min(808nm0.8w/cm²)；(3)化療組：每只小鼠腫瘤內(nèi)注射0.1ml400μg/ml的dtsl溶液；(4)itsl組：每只小鼠瘤內(nèi)注射0.1ml400μg/ml的itsl溶液。(5)熱療組：每只小鼠瘤內(nèi)注射0.1ml400μg/ml的itsl溶液后，再對腫瘤區(qū)域進行激光照射5min(808nm，0.8w/cm²)。(6)ditsl組：每只小鼠瘤內(nèi)注射0.1ml400μg/ml的ditsl溶液。(7)熱化療組：每只小鼠瘤內(nèi)注射0.1ml400μg/ml的itsl溶液后，再對腫瘤區(qū)域進行激光照射5min(808nm，0.8w/cm²)

1.5在體熱化療溫度監(jiān)測

激光參數(shù)：波長：808nm；功率：0.8w/cm²；超聲照射時間：5min。小鼠腫瘤體積長到約100mm³左右行腫瘤治療，治療方式如前所述。單純激光組、熱療組和熱化療組在對腫瘤區(qū)域進行激光照射的同時，每隔一分鐘，用紅外熱像儀對腫瘤區(qū)域的溫度進行測量并記錄。

1.6熱化療短期治療

采用蘇木精-伊紅染色的方法來評價各治療方式的短期療效。每組三只荷瘤小鼠，各組在治療48h后，處死小鼠取出腫瘤，用福爾馬林固定，經(jīng)脫水、透明、浸蠟包埋成蠟塊。于石蠟切片機上切片，切片厚度為6μm。

h&e染色觀察腫瘤組織形態(tài)學(xué)改變

h&e染色流程：

a切片在二甲苯中脫蠟15min。

b移入二甲苯和純酒精(1:1)混合液中15min。

c放入100％、95％、85％、70％酒精，時間各為5min。最后經(jīng)蒸餾水轉(zhuǎn)入染液。

d蘇木精染液染色5min。

e水洗玻片5min洗去多余染液，0.5～1％鹽酸酒精(70％酒精配制)分色片刻。

鏡檢控制，直至細胞核及核內(nèi)染色質(zhì)清晰為止，約數(shù)10s。

g蒸餾水短洗。

h0.1～0.5％伊紅染液染色1min。

i依次經(jīng)70％、85％、95％、100％酒精脫水，各級為2～3min，在95％以下濃度的酒精中伊紅易脫色，應(yīng)適當(dāng)縮短時間。

j二甲苯透明(二次)，共約30min。

k封片：擦去切片周圍多余二甲苯，滴加適量中性樹膠，加蓋玻片封固。鏡下觀察細胞形態(tài)改變。

為了檢測組織的凋亡情況，用tunel試劑檢測各組腫瘤組織中細胞的凋亡情況。tunel實驗原理：細胞在發(fā)生凋亡時，斷裂的dna暴露的3’-oh在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的催化下，和熒光素標記的dutp反應(yīng)。探針在熒光顯微鏡下藍光激發(fā)成綠光。其操作步驟：取出的腫瘤組織經(jīng)福爾馬林固定后制備成石蠟切片，切片厚度為8mm。制備好的石蠟切片脫蠟、水化后，取出樣本放入含有通透液(0.1％triton-x-100溶于0.1％枸櫞酸鈉溶液)的染色缸中，室溫，反應(yīng)時間8min。pbs清洗3次。將樣本放入含有抗原修復(fù)液(0.1m的檸檬酸+檸檬酸鈉緩沖液ph6.0)的染色缸中，92-98℃，反應(yīng)時間3-4min。pbs清洗3次。每個樣本加入50μltunel反應(yīng)液，陰性對照加入50μl的標記液，常溫避光潮濕環(huán)境下反應(yīng)60min。pbs清洗3次。滴加dba顯色液,于顯微鏡下監(jiān)控顯色程度,適時終止反應(yīng),自來水沖洗。蘇木素復(fù)染細胞核,顯微鏡下觀察胞核返藍后自來水沖洗。快速梯度乙醇、乙醇、無水乙醇脫水,二甲苯透明。

1.7體內(nèi)長期治療

小鼠腫瘤體積長到約100mm³左右行腫瘤治療，每組7只荷瘤小鼠，治療方式如前所述。小鼠治療當(dāng)天記為第0天，隨后每隔3天測量并記錄一次小鼠腫瘤體積。小方法為用電子游標卡尺測量腫瘤的長徑和短徑，計算腫瘤的體積。在測量腫瘤體積的同時對對鼠稱重，記錄小鼠體重的變化。腫瘤體積和小鼠體重的測量持續(xù)至治療后第30天，根據(jù)動物照護與使用計劃，小鼠腫瘤體積大于1000mm³對小鼠處以安樂死。以21天內(nèi)的小鼠腫瘤體積變化作為腫瘤治療后長期療效的評價，以30天內(nèi)小鼠生存情況作為治療后的生存評價依據(jù)。

1.8腫瘤血管免疫組化分析

為了檢測組織的微血管情況，用兔抗鼠cd31抗體進行免疫組化染色檢測各組腫瘤組織中細胞的凋亡情況。cd31是由血管內(nèi)皮細胞、血小板、單核細胞、中性粒細胞和t淋巴細胞表達的粘附分子，其結(jié)構(gòu)屬于免疫球蛋白超家族成員。

cd31染色步驟：

a石蠟切片于60℃烘箱內(nèi)烘干1h,充分融蠟。

b常規(guī)二甲苯脫蠟(二甲苯ⅰ、二甲苯ⅱ各15min)。

c梯度乙醇脫水，放入100％、95％、85％、70％酒精，時間各為5min，最后蒸餾水及pbs清洗。

d蛋白酶k工作液(10-20in10mmtris/hcl，ph7.4-8)在37℃抗原修復(fù)15-30min。隨后pbs清洗2次

e滴加兔抗鼠cd31單克隆抗體(1：200)，4℃孵育過夜后pbs清洗3次。

f滴加辣根酶標記的通用型二抗,37℃孵育20min,pbs清洗3次。熒光顯微鏡下觀察cd31綠色熒光染色情況。

cd31熒光圖像分析采用scnimage圖像分析軟件。

2.結(jié)果

2.1熱療和熱化療的體內(nèi)升溫作用

高溫在熱療和熱化療中起著重要作用，因此我們首先檢查了熱療和熱化療時腫瘤內(nèi)的溫度情況。小鼠在瘤內(nèi)注射itsl后，激光照射前兩分半鐘時，溫度呈線性上升，升高至61℃左右。后兩分半鐘溫度恒定在60℃左右。熱化療情況與熱療時相似，在激光照射前兩分鐘內(nèi)，瘤內(nèi)溫度快速上升，達到61.3℃左右，后三分鐘內(nèi)溫度略有下降，約在60℃上下。瘤內(nèi)注射pbs后，激光照射時溫度緩慢升高，最終達到37.3℃。

2.2體內(nèi)抗腫瘤作用

為了研究熱化療的抗腫瘤作用，各荷瘤小鼠分為七組，分別接受pbs、激光、化療、熱療、itsl、ditsl和熱化療的治療，分別評價抗腫瘤治療的短期療效和長期療效。

2.2.1腫瘤治療的短期治療效果

以組織學(xué)染色評價短期療效，治療48h后處死實驗鼠取出腫瘤組織制作石蠟切片。從h&e染色結(jié)果可見，空白對照組、單純激光組和itsl組在蘇木精染色下腫瘤細胞的細胞核清晰完整，細胞質(zhì)呈粉紅色，組織排列紊亂，細胞核增大，染色加深，呈明顯的腫瘤病理特征。ditsl組和ditsl的腫瘤組織切片中，由于腫瘤細胞壞死，切片中腫瘤細胞的細胞核數(shù)量明顯減少，熱療組腫瘤切片病理染色情況與化療組類似。而熱化療組切片可見，腫瘤細胞的細胞核碎裂、溶解，只有少量的細胞的細胞核仍可見，但大多數(shù)細胞已經(jīng)看不見細胞核，只剩粉紅色的細胞質(zhì)，腫瘤細胞大范圍壞死。熱化療法有明顯的殺腫瘤效果。

腫瘤組織石蠟切片進行tunel實驗檢測7個不同實驗處理后腫瘤組織的凋亡情況。本tunel染色中包含dab顯色，又經(jīng)過蘇木素復(fù)染，dab可將凋亡細胞染成棕色，蘇木素可將細胞核染成藍色，以此來檢測腫瘤組織的凋亡情況?？瞻讓φ战M、單純激光組和itsl組在蘇木精染色下組織排列紊亂，細胞核增大，形態(tài)不規(guī)則，呈明顯的腫瘤病理特征，凋亡細胞較少。ditsl組和ditsl的腫瘤組織切片中，由切片中可見棕色的腫瘤凋亡細胞散在分布，腫瘤凋亡增多。熱療組腫瘤免疫組化染色結(jié)果可見部分腫瘤細胞仍存活，腫瘤細胞凋亡數(shù)量增多。而熱化療組切片可見，藍色的細胞核明顯減少，而棕色的凋亡細胞明顯增多，整個視野范圍呈現(xiàn)棕色，只有少量的細胞的細胞核仍可見，大多數(shù)細胞已經(jīng)看不見細胞核，只剩棕色的凋亡細胞，腫瘤細胞大范圍凋亡。細胞凋亡情況與細胞病理學(xué)染色相符合，證明了熱化療的短期殺腫瘤效果明顯。

2.2.2長期腫瘤治療效果

本研究同時研究了熱化療的長期治療效果，以30天為限，同時監(jiān)測了小鼠腫瘤生長情況、生存情況情況。小鼠腫瘤體積變化情況。小鼠瘤內(nèi)注射pbs后，無論是否再行激光照射，腫瘤在九天內(nèi)生長情況與化療組和ditsl組相似，而在9天之后，腫瘤增長加速，與itsl組相似。小鼠瘤內(nèi)注射itsl后，腫瘤生長呈線性，生長迅速?？瞻讓φ战M、激光組與itsl組三者腫瘤生長情之間無統(tǒng)計學(xué)差別，說明單獨激光或者是itsl并無腫瘤抑制作用?；熃M和ditsl組由于dox的持續(xù)抗腫瘤作用，腫瘤的生長受到抑制，腫瘤體積呈緩慢增加的趨勢，其腫瘤體積與對照組有差別。熱療組在治療第3天腫瘤體積明顯縮小，然而在三天以后，腫瘤生長速度明顯加快，這是由于本研究只進行一次治療，在熱療后大部分腫瘤細胞被殺死，而剩下存活的腫瘤組織由于沒有后續(xù)的、持續(xù)的抗腫瘤治療，存活的腫瘤細胞會繼續(xù)增殖，最終導(dǎo)致腫瘤由于不完全消除而復(fù)發(fā)。由圖可見，熱化療后，腫瘤被完全消除，在后續(xù)的21天內(nèi)不再復(fù)發(fā)。即使ir-780的光熱治療不能完全殺死所有的腫瘤細胞，迅速釋放并聚集在腫瘤區(qū)域的dox會持續(xù)的抑制腫瘤生長。

各組治療21天后小鼠腫瘤圖片，從圖4可見，空白對照組、激光組和itsl組小鼠腫瘤體積較大，化療組、ditsl組腫瘤體積較小，熱療組由于腫瘤局部溫升過高，腫瘤區(qū)域表面皮膚結(jié)痂，殘余的腫瘤在痂皮附近復(fù)發(fā)。熱化療組在激光照射后腫瘤區(qū)域表面皮膚也會結(jié)痂，過9-15天，痂皮自然脫落，新生組織自然愈合，腫瘤不再復(fù)發(fā)。

各組小鼠生存率，根據(jù)動物照護與使用計劃，當(dāng)小鼠腫瘤體積大于1000mm³時，對小鼠處以安樂死，以30天為觀察節(jié)點?？瞻讓φ战M在第15天最先有一只小鼠腫瘤體積大于1000mm³，截止到30天，空白對照組、激光組和itsl組所有的小鼠腫瘤均大于1000mm³，化療組與ditsl組生存情況一致，熱化療組生存率為100％。

實施例2

本發(fā)明的集光熱及化療于一體的納米脂質(zhì)體的制備方法的具體步驟如下：

將脂質(zhì)與ir-780混溶于氯仿中，邊渦旋邊氮氣吹干成均勻薄膜，真空抽去殘留氯仿，加入(nh4)2so4溶液，將脂質(zhì)薄膜溶解，在水浴中超聲振蕩至澄清，制成ir-780脂質(zhì)體，將已形成的脂質(zhì)體用擠出儀從聚碳酸酯膜中反復(fù)擠出，制備成粒徑均勻的脂質(zhì)體，將ir-780脂質(zhì)體裝于透析袋中，放入pbs溶液中透析，將脂質(zhì)體內(nèi)部的硫酸銨替換成pbs，將阿霉素溶液逐滴加入脂質(zhì)體中，邊加邊振蕩，利用硫酸銨梯度法將阿霉素載入脂質(zhì)體內(nèi)核，制得本發(fā)明的納米脂質(zhì)體。

所述的脂質(zhì)是由二棕櫚酰磷脂酰膽堿，單棕櫚酰磷脂酰膽堿和二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000組成，三者的摩爾比為86∶10∶4。

ir-780與脂質(zhì)的質(zhì)量比為1∶100。

真空抽氯仿的時間為3h。

水浴溫度為65℃。

所述的聚碳酸酯膜為200nm。

pbs溶液中透析的時間為4h。

所述的阿霉素溶液的濃度為1mg/ml，阿霉素與脂質(zhì)的質(zhì)量比為1:10。

所述的硫酸銨梯度法是在制備空白脂質(zhì)體后，去除脂質(zhì)體外水相中的銨離子，內(nèi)水相中一個銨離子電離后形成一個氨分子和一個質(zhì)子，氨分子在跨膜擴散作用下同樣被除去，這就形成了內(nèi)外水相間的ph梯度，未載藥做好了準備，加入阿霉素溶液后，阿霉素分子在ph梯度的驅(qū)動下，跨膜進入脂質(zhì)體內(nèi)水相中，并和硫酸根離子成鹽，成鹽后形成膠態(tài)沉淀，聚集于內(nèi)水相中，另外阿霉素分子和質(zhì)子結(jié)合形成其離子態(tài)，從而失去膜通透性，而不會反向擴散出去。

實施例3

本發(fā)明的集光熱及化療于一體的納米脂質(zhì)體的制備方法的具體步驟如下：

將脂質(zhì)與ir-780混溶于氯仿中，邊渦旋邊氮氣吹干成均勻薄膜，真空抽去殘留氯仿，加入(nh4)2so4溶液，將脂質(zhì)薄膜溶解，在水浴中超聲振蕩至澄清，制成ir-780脂質(zhì)體，將已形成的脂質(zhì)體用擠出儀從聚碳酸酯膜中反復(fù)擠出，制備成粒徑均勻的脂質(zhì)體，將ir-780脂質(zhì)體裝于透析袋中，放入pbs溶液中透析，將脂質(zhì)體內(nèi)部的硫酸銨替換成pbs，將阿霉素溶液逐滴加入脂質(zhì)體中，邊加邊振蕩，利用硫酸銨梯度法將阿霉素載入脂質(zhì)體內(nèi)核，制得本發(fā)明的納米脂質(zhì)體。

所述的脂質(zhì)是由二棕櫚酰磷脂酰膽堿，單棕櫚酰磷脂酰膽堿和二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000組成，三者的摩爾比為86：10：4。

ir-780與脂質(zhì)的質(zhì)量比為10：100。

真空抽氯仿的時間為3h。

水浴溫度為65℃。

所述的聚碳酸酯膜為200nm。

pbs溶液中透析的時間為4h。

所述的阿霉素溶液的濃度為1mg/ml，阿霉素與脂質(zhì)的質(zhì)量比為1:30。

所述的硫酸銨梯度法是在制備空白脂質(zhì)體后，去除脂質(zhì)體外水相中的銨離子，內(nèi)水相中一個銨離子電離后形成一個氨分子和一個質(zhì)子，氨分子在跨膜擴散作用下同樣被除去，這就形成了內(nèi)外水相間的ph梯度，未載藥做好了準備，加入阿霉素溶液后，阿霉素分子在ph梯度的驅(qū)動下，跨膜進入脂質(zhì)體內(nèi)水相中，并和硫酸根離子成鹽，成鹽后形成膠態(tài)沉淀，聚集于內(nèi)水相中，另外阿霉素分子和質(zhì)子結(jié)合形成其離子態(tài)，從而失去膜通透性，而不會反向擴散出去。

實施例2和3制備的脂質(zhì)體也具有與實施例1制備的脂質(zhì)體同樣的抗腫瘤效果。

盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，可以理解在不脫離本發(fā)明的原理和精神的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求及其等同物限定。