本發(fā)明涉及一種藥物組合，所述組合包含式(I)的2-甲酰胺環(huán)氨基尿素衍生化合物和熱激蛋白90的抑制劑，以及涉及這種組合在治療增生性疾病，更特別PI3K依賴性疾病，更特別PI3K-α依賴性疾病中的應(yīng)用。

發(fā)明背景

PI3K/Akt/mTOR通路就正常細(xì)胞而言是重要、嚴(yán)格調(diào)控的存活通路。磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)是廣泛表達(dá)的脂激酶，其催化磷酸轉(zhuǎn)移至肌醇脂質(zhì)的D-3'位置以產(chǎn)生磷酸肌醇-3-磷酸(PIP)、磷酸肌醇-3,4-二磷酸(PIP₂)和磷酸肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP₃)。這些PI3K催化反應(yīng)的產(chǎn)物用作第二信使，且在關(guān)鍵的細(xì)胞過程，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、運(yùn)動(dòng)、增殖和存活中發(fā)揮重要作用。

所述兩種1類PI3K中，1A類PI3K是由p110催化亞單位(α,β,δ同種型)與調(diào)節(jié)亞單位組成型相聯(lián)組成的異二聚體，所述調(diào)節(jié)亞單位可以是p85α、p55α、p50α、p85β或p55γ。1B亞類具有一個(gè)家族成員，即由p110γ催化亞單位與2個(gè)調(diào)節(jié)亞單位p101或p84之一相聯(lián)組成的異二聚體(Fruman等,Annu Rev.Biochem.67:481(1998)；Suire等,Curr.Biol.15:566(2005))。

許多情況中，PIP2和PIP3將AKT募集至質(zhì)膜，其在該處用作許多對(duì)生長(zhǎng)和存活重要的胞內(nèi)信號(hào)通路的節(jié)點(diǎn)(Fantl等,Cell 69:413-423(1992)；Bader等,Nature Rev.Cancer 5:921(2005)；Vivanco和Sawyer,Nature Rev.Cancer 2:489(2002))。PI3K的異常調(diào)節(jié)通常經(jīng)AKT激活而增加存活，這是人類癌癥中最普遍的事件之一且已顯示在多個(gè)水平發(fā)生。腫瘤抑制基因PTEN使肌醇環(huán)3'位的磷酸肌醇去磷酸化并由此拮抗PI3K活性，該基因在多種腫瘤中功能缺失。在其它腫瘤中，p110α同種型PIK3CA和AKT的基因被擴(kuò)增，并且已在數(shù)種人類癌癥中證實(shí)其基因產(chǎn)物的蛋白表達(dá)增加。此外，已在廣泛多樣化的人類癌癥中以相當(dāng)高頻率描述了激活下游信號(hào)通路的PIK3CA的體細(xì)胞錯(cuò)義突變(Kang等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:802(2005)；Samuels等,Science 304:554(2004)；Samuels等,Cancer Cell 7:561-573(2005))。因此，已知PI3Kα抑制劑在治療增殖性疾病和其它病癥中具有特殊價(jià)值。

此外，熱激蛋白90(Hsp90)被認(rèn)為是一種抗癌靶標(biāo)。Hsp90是一種高豐度且必需的蛋白，其用作分子伴侶以確?？蛻舻鞍椎臉?gòu)象穩(wěn)定性、形狀和功能。Hsp90伴侶家族由4個(gè)成員組成：均位于細(xì)胞溶質(zhì)的Hsp90α和Hsp90β，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的GRP94，和位于線粒體的TRAP1。Hsp90是構(gòu)成約1％-2％總蛋白的豐富細(xì)胞伴侶。

Hsp90在所述應(yīng)激蛋白中是獨(dú)特的，因?yàn)槠洳粸榇蟛糠侄嚯牡纳春铣伤枰sp90與原癌蛋白(稱為“客戶蛋白”)形成復(fù)合體，所述蛋白是在生長(zhǎng)控制、細(xì)胞存活和組織發(fā)育中起關(guān)鍵作用的構(gòu)象上不穩(wěn)定的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子。這種結(jié)合防止這些客戶蛋白降解。Hsp90客戶蛋白亞組如Raf、AKT、磷酸化AKT、CDK4和EGFR家族(包括ErbB2)是關(guān)鍵性參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和調(diào)亡的致癌信號(hào)分子，這些是在癌細(xì)胞中的所有重要過程。抑制Hsp90的固有ATP酶活性破壞了Hsp90-客戶蛋白相互作用，導(dǎo)致其通過泛素蛋白酶體途徑降解。

在其N末端結(jié)構(gòu)域有保守ATP結(jié)合位點(diǎn)的Hsp90伴侶屬于小ATP酶亞族，稱為DNA旋轉(zhuǎn)酶、Hsp90、組氨酸激酶和MutL(GHKL)亞族。Hsp90的伴侶(折疊)活性取決于其ATP酶活性，該活性對(duì)于經(jīng)分離酶而言是弱的。然而，已顯示Hsp90與稱作共伴侶的蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，其ATP酶活性增強(qiáng)。因此，在體內(nèi)，Hsp90蛋白作為大的、動(dòng)態(tài)蛋白復(fù)合體的亞單位。Hsp90對(duì)于真核細(xì)胞存活是必需的，且其在許多腫瘤中過度表達(dá)。

盡管對(duì)于增生性疾病患者而言有許多治療選擇，仍需要有效且安全的治療劑和需要其在聯(lián)合治療中的優(yōu)選應(yīng)用。意外發(fā)現(xiàn)式(I)的特異性2-甲酰胺環(huán)氨基尿素衍生化合物與Hsp90抑制劑聯(lián)用時(shí)引發(fā)強(qiáng)烈抗增殖活性和體內(nèi)抗腫瘤應(yīng)答，所述化合物已在WO 2010/029082中描述。用Hsp90抑制劑和PI3K抑制劑(特別是式(I)的高特異性PI3Kα抑制劑化合物)共治療癌細(xì)胞特別有效，因?yàn)槠浣M合近端通路組分如受體酪氨酸激酶(主要通過Hsp90抑制來靶向)與也在信號(hào)級(jí)聯(lián)頂端附近作用的另一抑制劑(PI3K抑制劑)。Hsp90抑制的額外益處可源自其對(duì)PI3K/Akt/mTOR通路內(nèi)其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)組分的影響，例如對(duì)AKT和pAKT的影響，和其對(duì)許多客戶蛋白的廣泛影響。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及一種藥物組合，所述組合包括(a)式(I)的化合物，

其中

A代表選自下組的雜芳基：

R¹代表下列取代基之一：(1)未取代或取代的，優(yōu)選取代的C₁-C₇-烷基，其中所述取代基獨(dú)立選自一個(gè)或多個(gè)，優(yōu)選1-9個(gè)下列部分：氘、氟，或者1-2個(gè)下列部分C₃-C₅-環(huán)烷基中的；(2)可選地，取代的C₃-C₅-環(huán)烷基，其中所述取代基獨(dú)立選自一個(gè)或多個(gè)，優(yōu)選1-4個(gè)下列部分：氘、C₁-C₄-烷基(優(yōu)選甲基)、氟、氰基、氨基羰基；(3)可選地，取代的苯基，其中所述取代基獨(dú)立選自一個(gè)或多個(gè)，優(yōu)選1-2個(gè)下列部分：氘、鹵基、氰基、C₁-C₇-烷基、C₁-C₇-烷基氨基、二(C₁-C₇-烷基)氨基、C₁-C₇-烷氨基羰基、二(C₁-C₇-烷基)氨基羰基、C₁-C₇-烷氧基；(4)可選地，單或雙取代胺；其中所述取代基獨(dú)立選自下列部分：氘、C₁-C₇-烷基(未取代或取代有一個(gè)或多個(gè)選自氘、氟、氯、羥基的取代基)、苯磺?；?未取代或取代有一個(gè)或多個(gè)，優(yōu)選一個(gè)C₁-C₇-烷基、C₁-C₇-烷氧基、二(C₁-C₇-烷基)氨基-C₁-C₇-烷氧基)；(5)取代的磺酰基；其中所述取代基選自下列部分：C₁-C₇-烷基(未取代或取代有一個(gè)或多個(gè)選自氘、氟的取代基)、吡咯烷基(未取代或取代有一個(gè)或多個(gè)選自氘、羥基、氧代的取代基；特別是一個(gè)氧代)；(6)氟、氯；

R²代表氫；

R³代表(1)氫，(2)氟、氯，(3)可選地，取代的甲基，其中所述取代基獨(dú)立選自一個(gè)或多個(gè)，優(yōu)選1-3個(gè)下列部分：氘、氟、氯、二甲氨基；

除了(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({5-[2-(叔丁基)-嘧啶-4-基]-4-甲基-噻唑-2-基}-酰胺)，

或其藥學(xué)上可接受鹽；和(b)至少一種Hsp90抑制劑或其藥學(xué)上可接受鹽。所述組合可用于在治療增生性疾病中的同步、分開或順序應(yīng)用。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的藥物組合包括選自(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)(“化合物A”)的式(I)化合物或其藥學(xué)上可接受鹽。

本發(fā)明的藥物組合包括至少一種靶向，減少或抑制Hsp90的固有ATP酶活性和/或通過泛素蛋白酶體通路降解、靶向、減少或抑制Hsp90客戶蛋白的化合物。這類化合物稱為“熱激蛋白90抑制劑”或“Hsp90抑制劑”。適用于本發(fā)明的Hsp90抑制劑示例包括但不限于格爾德霉素衍生物、坦螺旋霉素(Tanespimycin)(17-烯丙氨基-17-脫甲氧基格爾德霉素)(也稱為KOS-953和17-AAG)；根赤殼菌素；6-氯-9-(4-甲氧基-3,5-二甲基吡啶-2-基甲基)-9H-嘌呤-2-胺甲磺酸鹽(也稱為CNF2024)；IPI504；SNX5422；5-(2,4-二羥基-5-異丙基-苯基)-4-(4-嗎啉-4-基甲基-苯基)-異惡唑-3-羧酸乙酰胺(AUY922)；和(R)-2-氨基-7-[4-氟-2-(6-甲氧基-吡啶-2-基)-苯基]-4-甲基-7,8-二氫-6H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-5-酮(HSP990)。

本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，所述組合物包含式(I)化合物或其藥學(xué)上可接受鹽和至少一種Hsp90抑制劑或其藥學(xué)上可接受鹽。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的藥物組合物用于治療增生性疾病。

本發(fā)明還涉及藥物組合物在制備治療增生性疾病的藥物中的應(yīng)用，所述組合物包含式(I)化合物或其藥學(xué)上可接受鹽和至少一種Hsp90抑制劑或其藥學(xué)上可接受鹽。

本發(fā)明還涉及在有此需要的對(duì)象中治療增生性疾病的方法，所述方法包括給予所述對(duì)象治療有效量的式(I)化合物或其藥學(xué)上可接受鹽、和至少一種Hsp90抑制劑或其藥學(xué)上可接受鹽。根據(jù)本發(fā)明，式(I)化合物和Hsp90抑制劑可作為單一藥物組合物、作為分開的組合物、或順序給予。

本發(fā)明還涉及一種藥盒，所述藥盒包含權(quán)利要求1所述的式(I)化合物或其藥學(xué)上可接受鹽和至少一種Hsp90抑制劑或其藥學(xué)上可接受鹽。

附圖說明

圖1顯示化合物A針對(duì)PIK3CA突變胃癌細(xì)胞系HGC-27的抗腫瘤活性。

圖2顯示攜帶HGC-27的小鼠中載劑和化合物A處理組的平均體重。

對(duì)于圖1和2中的體內(nèi)測(cè)試，攜帶HGC-27皮下異種移植物的雌性無胸腺小鼠用化合物A(Cmpd A)或載劑按所示劑量和方案處理。處理在腫瘤細(xì)胞移植后12天開始，且連續(xù)12天。統(tǒng)計(jì)腫瘤體積變化，用單因素方差分析，事后鄧尼特(post hoc Dunnett’s)來進(jìn)行(*p<0.05相比載劑對(duì)照)。

圖3顯示以下物質(zhì)針對(duì)PIK3CA突變胃癌細(xì)胞HGC-27的抗腫瘤活性：載劑，12.5mg/kg每日一次口服(qd)的單一試劑化合物A，50mg/kg每周二次靜脈給予(2qw)的單一試劑AUY922，化合物A與AUY922的組合。數(shù)值表示為均值±SEM；樣本大小(n＝10只小鼠/組)。(*p<0.05，相較載劑對(duì)照組和單一試劑治療有顯著抑制(曼-懷氏等級(jí)和檢驗(yàn)，事后學(xué)生紐曼-科伊爾斯檢驗(yàn)(Mann-Whitney Rank Sum Test post hoc Student Newman Kuels test))。

圖4顯示攜帶PIK3CA突變胃癌細(xì)胞系HGC-27的小鼠中，載劑、12.5mg/kg化合物A、50mg/kg AUY922和25mg/kg化合物A與50mg/kg AUY922的組合處理組的平均校正體重變化(由關(guān)于各單獨(dú)動(dòng)物的以百分比表示的測(cè)量日體重和第12天初始體重間的比例來表示[二者都通過減去原發(fā)性腫瘤重量來校正])。

圖5顯示以下物質(zhì)針對(duì)PIK3CA突變胃癌細(xì)胞HGC-27的抗腫瘤活性：載劑，25mg/kg每日一次口服的單一試劑化合物A，50mg/kg每周二次靜脈給予的單一試劑AUY922，化合物A與AUY922的組合。數(shù)值表示為均值±SEM；樣本大小(n＝10只小鼠/組)。(*p<0.05，相較載劑對(duì)照組和單一試劑治療有顯著抑制(曼-懷氏等級(jí)和檢驗(yàn)，事后鄧恩檢驗(yàn))。

圖6顯示攜帶PIK3CA突變胃癌細(xì)胞系HGC-27的小鼠中，載劑、25mg/kg化合物A、50mg/kg AUY922和25mg/kg化合物A與50mg/kg AUY922的組合處理組的平均校正體重變化(由關(guān)于各單獨(dú)動(dòng)物的以百分比表示的測(cè)量日體重和第12天初始體重間的比例來表示[二者都通過減去原發(fā)性腫瘤重量來校正])。

圖7顯示以下物質(zhì)針對(duì)PIK3CA突變胃癌細(xì)胞HGC-27的抗腫瘤活性：載劑，50mg/kg每日一次口服的單一試劑化合物A，50mg/kg每周二次靜脈給予的單一試劑AUY922，化合物A與AUY922的組合。數(shù)值表示為均值±SEM；樣本大小(n＝10只小鼠/組)。(*p<0.05，相較載劑對(duì)照組和單一試劑治療有顯著抑制(曼-懷氏等級(jí)和檢驗(yàn)，事后學(xué)生紐曼-科伊爾斯檢驗(yàn))。

圖8顯示攜帶PIK3CA突變胃癌細(xì)胞系HGC-27的小鼠中，載劑、50mg/kg化合物A、50mg/kg AUY922和50mg/kg化合物A與50mg/kg AUY922的組合處理組的平均校正體重變化(由關(guān)于各單獨(dú)動(dòng)物的以百分比表示的測(cè)量日體重和第12天初始體重間的比例來表示[二者都通過減去原發(fā)性腫瘤重量來校正])。

圖9顯示以下物質(zhì)針對(duì)A375黑素瘤腫瘤細(xì)胞系的(a)腫瘤生長(zhǎng)分?jǐn)?shù)和(b)平均體重變化：載劑/安慰劑(n＝5)，40mg/kg每日一次口服的單一試劑化合物A(n＝7)，50mg/kg每周二次靜脈給予的單一試劑AUY922(n＝8)，和40mg/kg每日一次口服化合物A與50mg/kg AUY922的組合(n＝5)。

發(fā)明詳述

提供下列一般定義以更好理解本發(fā)明：

“鹵素”(或“鹵基”)表示氟、溴、氯或碘，特別是氟、氯。鹵素取代的基團(tuán)和部分如由鹵素取代的烷基(鹵烷基)可以是單、多或全鹵化的。

“雜原子”是碳和氫以外的原子，優(yōu)選氮(N)、氧(O)或硫(S)，特別是氮。

“含碳基團(tuán)”、部分或分子包含1-7，優(yōu)選1-6，更優(yōu)選1-4，最優(yōu)選1或2個(gè)碳原子。碳原子大于1個(gè)的任何非環(huán)含碳基團(tuán)或部分是直鏈或支鏈。

前綴“低級(jí)”或“C₁-C₇”表示有多至且包括最多7個(gè)，特別是多至且包括最多4個(gè)碳原子的基團(tuán)，所討論的基團(tuán)為線性或者有一個(gè)或多個(gè)分支的支鏈。

“烷基”指直鏈或支鏈烷基，優(yōu)選代表直鏈或支鏈C_1-12烷基，特別優(yōu)選代表直鏈或支鏈C_1-7烷基；例如甲基，乙基，正或異丙基，正、異、仲或叔丁基，正戊基，正己基，正庚基，正辛基，正壬基，正癸基，正十一基，正十二基，特別優(yōu)選甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基和異丁基。烷基可以未被取代或取代的。示例性取代基包括但不限于氘、羥基、烷氧基、鹵基和氨基。經(jīng)取代烷基的示例是三氟甲基。環(huán)烷基也可以是烷基的取代基。這種情況的一個(gè)示例是部分(烷基)-環(huán)丙基或烷二基(alkandiyl)-環(huán)丙基，如–CH₂-環(huán)丙基。C₁-C₇-烷基優(yōu)選是具有從1個(gè)(且包括1個(gè))到多至7個(gè)(且包括7個(gè))，優(yōu)選從1個(gè)(且包括1個(gè))到4個(gè)(且包括4個(gè))碳原子的烷基，且為線性或分支的；低級(jí)烷基優(yōu)選是丁基如正丁基、仲丁基、叔丁基，丙基如正丙基或異丙基，乙基或優(yōu)選甲基。

其他基團(tuán)如“烷氧基”、“烷氧基烷基”、“烷氧基羰基”、“烷氧基-羰基烷基”、“烷基磺酰基”、“烷基砜(alkylsulfoxyl)”、“烷基氨基”、“鹵烷基”的各烷基部分應(yīng)具有與上述“烷基”定義中所述相同的含義。

“烷二基”指通過2個(gè)不同碳原子結(jié)合所述部分的直鏈或支鏈烷二基，其優(yōu)選代表直鏈或支鏈C_1-12烷二基，特別優(yōu)選代表直鏈或支鏈C_1-6烷二基；例如甲烷二基(-CH₂-)、1,2-乙烷二基(-CH₂-CH₂-)、1,1-乙烷二基((-CH(CH₃)-)、1,1-,1,2-,1,3-丙烷二基和1,1-,1,2-,1,3-,1,4-丁烷二基，特別優(yōu)選甲烷二基、1,1-乙烷二基、1,2-乙烷二基、1,3-丙烷二基、1,4-丁烷二基。

“烯二基”指通過2個(gè)不同碳原子結(jié)合所述分子的直鏈或支鏈烯二基，其優(yōu)選代表直鏈或支鏈C_2-6烯二基；例如-CH＝CH-、-CH＝C(CH₃)-、-CH＝CH-CH₂-、-C(CH₃)＝CH-CH₂-、-CH＝C(CH₃)-CH₂-、-CH＝CH-C(CH₃)H-、-CH＝CH-CH＝CH-、-C(CH₃)＝CH-CH＝CH-、-CH＝C(CH₃)-CH＝CH-，特別優(yōu)選-CH＝CH-CH₂-、-CH＝CH-CH＝CH-。烯二基可被取代或未取代。

“環(huán)烷基”指飽和或部分飽和、單環(huán)、稠合多環(huán)或螺多環(huán)狀碳環(huán)，每一碳環(huán)具有3至12個(gè)環(huán)原子。環(huán)烷基的示例性實(shí)例包括以下部分：環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基和環(huán)己基。環(huán)烷基可未被取代或取代；示例性取代基在烷基的定義中提供，且還可包括烷基本身(如甲基)。部分如–(CH₃)環(huán)丙基視作取代的環(huán)烷基。

“芳基”指具有6個(gè)或更多碳原子的芳族同素環(huán)系統(tǒng)(即僅碳作為環(huán)形成原子)；芳基優(yōu)選是具有6-14個(gè)環(huán)碳原子，更優(yōu)選6-10個(gè)環(huán)碳原子的芳族部分，如苯基或萘基，優(yōu)選苯基。芳基可以未取代或取代有一個(gè)或多個(gè)，優(yōu)選多至3個(gè)，更優(yōu)選多至2個(gè)取代基，所述取代基獨(dú)立選自下述未取代或取代的雜環(huán)基，特別是吡咯烷基，如吡咯烷，氧代吡咯烷基，如氧代-吡咯烷，C₁-C₇-烷基-吡咯烷基，2,5-二-(C₁-C₇烷基)吡咯烷基，如2,5-二-(C₁-C₇烷基)-吡咯烷，四氫呋喃、苯硫基，C₁-C₇-烷基吡唑烷基，吡啶基、C₁-C₇-烷基哌啶基、哌啶、經(jīng)氨基或N-單-或N,N-二-[低級(jí)烷基、苯基、C₁-C₇-烷?；?或苯基-低級(jí)烷基)-氨基取代的哌啶、未取代或經(jīng)環(huán)碳原子結(jié)合的N-低級(jí)烷基取代的哌啶基、哌嗪、低級(jí)烷基哌嗪、嗎啉代、硫嗎啉代、S-氧-硫嗎啉代或S,S-二氧硫嗎啉代；C₁-C₇-烷基、氨基-C₁-C₇-烷基、N-C₁-C₇-烷?；被?C₁-C₇-烷基、N-C₁-C₇-鏈烷磺酰基-氨基-C₁-C₇-烷基、氨甲酰-C₁-C₇-烷基、[N-單-或N,N-二-(C₁-C₇-烷基)-氨甲酰]-C₁-C₇-烷基、C₁-C₇-鏈烷亞磺?；?C₁-C₇-烷基、C₁-C₇-鏈烷磺?；?C₁-C₇-烷基、苯基、萘基、單-到三-[C₁-C₇-烷基、鹵基和/或氰基]-苯基或者單-到三-[C₁-C₇-烷基、鹵基和/或氰基]-萘基；C₃-C₈-環(huán)烷基、單-到三-[C₁-C₇-烷基和/或羥基]-C₃-C₈-環(huán)烷基；鹵基、羥基、低級(jí)烷氧基、低級(jí)烷氧基-低級(jí)烷氧基、(低級(jí)烷氧基)-低級(jí)烷氧基-低級(jí)烷氧基、鹵代-C₁-C₇-烷氧基、苯氧基、萘氧基、苯基-或萘基-低級(jí)烷氧基；氨基-C₁-C₇-烷氧基、低級(jí)鏈烷酰氧基、苯甲酰氧基、萘甲酰氧基、甲酰(CHO)、氨基、N-單-或N,N-二-(C₁-C₇-烷基)-氨基、C₁-C₇-鏈烷酰氨基、C₁-C₇-鏈烷磺酰氨基、羧基、低級(jí)烷氧基羰基，例如：苯基-或萘基-低級(jí)烷氧基羰基，如芐氧羰基；C₁-C₇-鏈烷?；?，如乙?；?、苯甲?；?、萘甲酰基、氨甲?；?、N-單-或N,N-二取代氨甲?；?，如N-單-或N,N-二取代氨甲?；?，其中所述取代基選自低級(jí)烷基、(低級(jí)烷氧基)-低級(jí)烷基和羥基-低級(jí)烷基；脒基、胍基、脲基、巰基、低級(jí)烷基硫代、苯基-或萘基硫代、苯基-或萘基-低級(jí)烷基硫代、低級(jí)烷基-苯基硫代、低級(jí)烷基-萘基硫代、鹵代-低級(jí)烷基巰基、硫代(-SO₃H)、低級(jí)鏈烷磺酰、苯基-或萘基-磺酰、苯基-或萘基-低級(jí)烷磺?；?、烷基苯磺酰、鹵代-低級(jí)烷磺酰基，如三氟甲烷磺酰；磺酰胺基、苯并磺酰胺基、疊氮基、疊氮-C₁-C₇-烷基，特別是疊氮甲基、C₁-C₇-鏈烷磺酰、氨磺酰、N-單-或N,N-二-(C₁-C₇-烷基)-氨磺酰、嗎啉磺?；?、硫代嗎啉磺酰、氰基和硝基；其中上述作為取代烷基(以及本文提及的取代芳基、雜環(huán)基等)的取代基或部分取代基的各苯基或萘基(也在苯氧基或萘氧基中)本身未取代或取代有一個(gè)或多個(gè)，例如多至3個(gè)，優(yōu)選1或2個(gè)獨(dú)立選自以下的取代基：鹵基、鹵代-低級(jí)烷基如三氟甲基、羥基、低級(jí)烷氧基、疊氮基、氨基、N-單–或N,N-二-(低級(jí)烷基和/或C₁-C₇-烷?；?-氨基、硝基、羧基、低級(jí)烷氧基羰基、氨甲?；?、氰基和/或氨磺酰。

“雜環(huán)基”指雜環(huán)基團(tuán)，其為不飽和(＝環(huán)中攜帶最高可能數(shù)的共軛雙鍵)、飽和或部分飽和且優(yōu)選為單環(huán)或在本發(fā)明更廣泛方面為二環(huán)、三環(huán)或螺環(huán)；具有3-24個(gè)，更優(yōu)選4-16個(gè)，最優(yōu)選5-10個(gè)且最優(yōu)選5或6個(gè)環(huán)原子；其中一個(gè)或多個(gè)，優(yōu)選1-4個(gè)，尤其1或2個(gè)環(huán)原子是雜原子(因而剩余環(huán)原子是碳)。該鍵合環(huán)(即連接分子的環(huán))優(yōu)選具有4-12個(gè)，尤其5-7個(gè)環(huán)原子。術(shù)語雜環(huán)基還包括雜芳基。雜環(huán)基團(tuán)(雜環(huán)基)可未取代或取代有一個(gè)或多個(gè)，尤其1-3個(gè)取代基，所述取代基獨(dú)立選自上文對(duì)于取代烷基所定義的取代基和/或選自一個(gè)或多個(gè)以下取代基：氧代(＝O)、硫代羰基(＝S)、亞氨基(＝NH)、亞氨基-低級(jí)烷基。此外，雜環(huán)基特定是選自下組的雜環(huán)基團(tuán)：環(huán)氧乙烷基、氮雜環(huán)丙烯基(azirinyl)、氮丙啶基、1,2-氧硫雜環(huán)戊基、噻吩基(＝苯硫基)、呋喃基、四氫呋喃基、吡喃基、硫代吡喃基、噻蒽基、異苯并呋喃基、苯并呋喃基、色烯基、2H-吡咯基、吡咯基、吡咯啉基、吡咯烷基、咪唑基、咪唑烷基、苯并咪唑基、吡唑基、吡嗪基、吡唑烷基、噻唑基、異噻唑基、二噻唑基、惡唑基、異惡唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哌啶基、哌嗪基、噠嗪基、嗎啉基、硫代嗎啉基、(S-氧或S,S-二氧)-硫代嗎啉基、吲嗪基、氮雜環(huán)庚烷基(azepanyl)、二氮雜環(huán)庚烷基，特別是1,4-二氮雜環(huán)庚烷基、異吲哚基、3H-吲哚基、吲哚基、苯并咪唑基、香豆基、吲唑基、三唑基、四唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、異喹啉基、喹啉基、四氫喹啉基、四氫異喹啉基、十氫喹啉基、八氫異喹啉基、苯并呋喃基、二苯并呋喃基、苯并噻吩基、二苯并噻吩基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、喹唑啉基、喹唑啉基、噌啉基、蝶啶基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、萘嵌間二氮雜苯基、菲羅啉基、呋吖基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩惡嗪基、色烯基、異苯并二氫吡喃基、苯并二氫吡喃基、苯并[1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基和2,3-二氫-苯并[1,4]二氧雜環(huán)己烯-6-基，這些基團(tuán)中的每一個(gè)未取代或取代有一個(gè)或多個(gè)，優(yōu)選多至3個(gè)取代基，所述取代基選自上文就取代芳基所提及的那些和/或選自一個(gè)或多個(gè)以下取代基：氧代(＝O)、硫代羰基(＝S)、亞氨基(＝NH)、亞氨基-低級(jí)烷基。

“芳基烷基”指經(jīng)烷基如甲基或乙基結(jié)合分子的芳基，優(yōu)選苯乙基或芐基，特別是芐基。類似地，環(huán)烷基-烷基和雜環(huán)基-烷基代表經(jīng)烷基結(jié)合分子的環(huán)烷基或經(jīng)烷基結(jié)合分子的雜環(huán)基。各情況中，芳基、雜環(huán)基、環(huán)烷基和烷基可如上所述被取代。

“鹽”(以“其鹽”表示)可單獨(dú)或以與游離化合物如式(I)化合物的混合物形式存在，且優(yōu)選為藥學(xué)上可接受鹽。從有堿性氮原子的式(I)化合物，優(yōu)選使用有機(jī)或無機(jī)酸式來形成(I)化合物的所述鹽，例如作為酸加成鹽。例如，合適的無機(jī)酸是氫鹵酸，如鹽酸、硫酸或磷酸。例如，合適的有機(jī)酸是羧酸或磺酸，如富馬酸或甲磺酸。出于分離或純化目的，還能使用藥學(xué)上不可接受的鹽，例如苦味酸鹽或高氯酸鹽。對(duì)于治療應(yīng)用，僅使用藥學(xué)上可接受鹽或游離化合物(在可以藥物制品形式應(yīng)用時(shí))，因此這些是優(yōu)選的?？紤]到游離形式的新型化合物與采用其鹽形式的那些化合物，包括例如在純化或鑒定新型化合物中能用作中間體的那些鹽之間的密切關(guān)系，應(yīng)理解上下文中提及游離化合物也指對(duì)應(yīng)鹽(在適當(dāng)和有利時(shí))。式(I)化合物的鹽優(yōu)選藥學(xué)上可接受鹽；合適的形成反離子的藥學(xué)上可接受鹽在本領(lǐng)域已知。

“組合”指一個(gè)單位劑型的固定組合，或聯(lián)合給藥的非固定組合，后者中式(I)化合物和組合伴侶(如下述另一藥物，也稱為“治療劑”或“助劑”)可同時(shí)獨(dú)立給藥或在時(shí)間間隔內(nèi)分開給藥，特別是當(dāng)這些間隔使組合伴侶能顯示合作如協(xié)同效應(yīng)時(shí)。本文所用的術(shù)語“聯(lián)合給藥”等意在涵蓋向單個(gè)有此需要的對(duì)象(如患者)給予選定組合伴侶，旨在包括試劑不必需通過相同給藥途徑或同時(shí)給藥的治療方案。術(shù)語“固定組合”指活性成分如式(I)化合物和組合伴侶，均以單個(gè)實(shí)體或劑量形式同時(shí)給予患者。術(shù)語“非固定組合”或“多組分藥盒(kit of parts)”指活性成分如式(I)化合物和組合伴侶，均作為分不開的實(shí)體同步、同時(shí)或順序(無特定時(shí)間限制)給予患者，其中所述給藥在患者體內(nèi)提供治療有效水平的所述2種化合物。后者還用于雞尾酒療法，例如給予3種或更多活性成分。

“治療”包括預(yù)防(防止)和治療性處理以及延遲疾病或病癥進(jìn)展。術(shù)語“預(yù)防”指防止涉及增生性疾病的疾病發(fā)生或復(fù)發(fā)。本文所用的術(shù)語“延遲進(jìn)展”指將所述組合給予處于待治療增生性疾病前期或早期的患者，其中患者診斷為例如相應(yīng)疾病的預(yù)形式，或患者處于例如醫(yī)學(xué)治療中的某一狀態(tài)，或由意外導(dǎo)致的狀態(tài)，在該狀態(tài)下可能相應(yīng)疾病會(huì)發(fā)展。

“對(duì)象”意在包括動(dòng)物。對(duì)象示例包括哺乳動(dòng)物，例如人、狗、牛、馬、豬、綿羊、山羊、貓、小鼠、兔、大鼠和轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物。在某些實(shí)施方式中，所述對(duì)象是人，例如患有、有風(fēng)險(xiǎn)患有、或潛在能患有腦腫瘤疾病的人。特別優(yōu)選所述對(duì)象是人。

“藥物制品”或“藥物組合物”指含有至少一種待給予哺乳動(dòng)物如人的治療化合物的混合物或溶液，從而防止、治療或控制影響哺乳動(dòng)物的特定疾病或病癥。

“共給予”、“共給藥”或“聯(lián)合給藥”等意在涵蓋向單一患者給予選定治療劑，旨在包括試劑不必需通過相同給藥途徑或同時(shí)給藥的治療方案。

“藥學(xué)上可接受”指在合理醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)的那些化合物、物質(zhì)、組合物和/或劑型，其適合接觸哺乳動(dòng)物特別是人的組織，而不引起過度毒性、刺激、過敏反應(yīng)和其他問題并發(fā)癥，與合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比相稱。

“治療有效”優(yōu)選涉及針對(duì)增生性疾病進(jìn)展的治療有效量，或更廣泛意義上，預(yù)防有效量。

“單一藥物組合物”指配制用于將有效量的2種治療劑遞送給患者的單個(gè)載體或載劑。單個(gè)載劑設(shè)計(jì)成遞送有效量的各試劑，以及藥學(xué)上可接受載體或賦形劑。在一些實(shí)施方式中，所述載劑是片劑、膠囊劑、丸劑或貼劑。在其他實(shí)施方式中，所述載劑是溶液或混懸液。

“劑量范圍”指特定試劑可接受變化量的上限和下限。通常，采用指定范圍內(nèi)任何量的試劑劑量能給予接受治療的患者。

術(shù)語“約”或“大致”通常指給定值或范圍的20％以內(nèi)，更優(yōu)選10％以內(nèi)，最優(yōu)選仍在5％以內(nèi)。或者，特別是在生物學(xué)系統(tǒng)中，術(shù)語“約”指給定值的大致對(duì)數(shù)范圍(即數(shù)量級(jí))內(nèi)，優(yōu)選因子2。

本發(fā)明涉及一種藥物組合，所述組合包括(a)下述式(I)化合物，或其藥學(xué)上可接受鹽；和(b)至少一種Hsp90抑制劑或其藥學(xué)上可接受鹽。所述組合可同時(shí)、分開或順序用于治療增生性疾病。

適用于本發(fā)明的特定2-甲酰胺環(huán)氨基尿素衍生化合物、其制備和包含其的合適藥物制劑描述于WO 2010/029082且包括式(I)化合物

其中

A代表選自下組的雜芳基：

R¹代表下列取代基之一：(1)未取代或取代的，優(yōu)選取代的C₁-C₇-烷基，其中所述取代基獨(dú)立選自一個(gè)或多個(gè)，優(yōu)選1-9個(gè)下列部分：氘、氟，或者1-2個(gè)下列部分C₃-C₅-環(huán)烷基；(2)可選地，取代的C₃-C₅-環(huán)烷基，其中所述取代基獨(dú)立選自一個(gè)或多個(gè)，優(yōu)選1-4個(gè)下列部分：氘、C₁-C₄-烷基(優(yōu)選甲基)、氟、氰基、氨基羰基；(3)可選地，取代的苯基，其中所述取代基獨(dú)立選自一個(gè)或多個(gè)，優(yōu)選1-2個(gè)下列部分：氘、鹵基、氰基、C₁-C₇-烷基、C₁-C₇-烷基氨基、二(C₁-C₇-烷基)氨基、C₁-C₇-烷氨基羰基、二(C₁-C₇-烷基)氨基羰基、C₁-C₇-烷氧基；(4)可選地，單或雙取代胺；其中所述取代基獨(dú)立選自下列部分：氘、C₁-C₇-烷基(未取代或取代有一個(gè)或多個(gè)選自氘、氟、氯、羥基的取代基)、苯磺酰基(未取代或取代有一個(gè)或多個(gè)，優(yōu)選一個(gè)C₁-C₇-烷基、C₁-C₇-烷氧基、二(C₁-C₇-烷基)氨基-C₁-C₇-烷氧基)；(5)取代的磺?；?；其中所述取代基選自下列部分：C₁-C₇-烷基(未取代或取代有一個(gè)或多個(gè)選自氘、氟的取代基)、吡咯烷基(未取代或取代有一個(gè)或多個(gè)選自氘、羥基、氧代的取代基；特別是一個(gè)氧代)；(6)氟、氯；

R²代表氫；

R³代表(1)氫，(2)氟、氯，(3)可選地，取代的甲基，其中所述取代基獨(dú)立選自一個(gè)或多個(gè)，優(yōu)選1-3個(gè)下列部分：氘、氟、氯、二甲氨基；

除了(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({5-[2-(叔丁基)-嘧啶-4-基]-4-甲基-噻唑-2-基}-酰胺)。

式(I)化合物定義中所用的基團(tuán)和符號(hào)具有WO 2010/029082中所公開的含義，所述專利通過引入全文納入。

如WO2010/029082所公開，發(fā)現(xiàn)這些式(I)的2-甲酰胺環(huán)氨基尿素衍生化合物對(duì)磷脂酰肌醇3-激酶(或PI3K)有顯著抑制活性。這些式(I)的化合物具有作為PI3K抑制劑的有利藥理學(xué)性質(zhì)，且相較β和/或δ和/或γ亞型，顯示出對(duì)PI3-激酶α亞型的高選擇性。

用于本發(fā)明的優(yōu)選式(I)化合物是WO2010/029082特定描述的化合物。本發(fā)明的特別優(yōu)選化合物是(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)(化合物A)或其藥學(xué)上可接受鹽。(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)的合成描述于WO2010/029082的實(shí)施例15。

本發(fā)明的藥物組合包括至少一種靶向，減少或抑制Hsp90的固有ATP酶活性和/或通過泛素蛋白酶體通路降解、靶向、減少或抑制Hsp90客戶蛋白的化合物。這類化合物稱為“熱激蛋白90抑制劑”或“Hsp90抑制劑”。

合適的Hsp90抑制劑包括但不限于：

(a)格爾德霉素衍生物、坦螺旋霉素(17-烯丙氨基-17-脫甲氧基格爾德霉素)(也稱為KOS-953和17-AAG)，可獲自LLC(密蘇里州圣路易斯)的西格瑪奧德里奇公司(Sigma-Aldrich Co)，并公開于美國(guó)專利號(hào)4,261,989，出版日期1981年4月14日，所述專利通過引用納入本申請(qǐng)，和其他格爾德霉素相關(guān)化合物；

(b)根赤殼菌素，可獲自LLC(密蘇里州圣路易斯)的西格瑪奧德里奇公司；

(c)6-氯-9-(4-甲氧基-3,5-二甲基吡啶-2-基甲基)-9H-嘌呤-2-胺甲磺酸鹽(也稱為CNF2024)(康?，斨委煿?Conforma Therapeutics Corp.))；

(d)IPI504；

(e)SNX5422；

(f)5-(2,4-二羥基-5-異丙基-苯基)-4-(4-嗎啉-4-基甲基-苯基)-異惡唑-3-羧酸乙酰胺(AUY922)，其結(jié)構(gòu)和生產(chǎn)過程公開于PCT申請(qǐng)?zhí)朩O04/072051，2004年8月26日發(fā)表，所述申請(qǐng)通過引用在此納入本申請(qǐng)；和

(g)(R)-2-氨基-7-[4-氟-2-(6-甲氧基-吡啶-2-基)-苯基]-4-甲基-7,8-二氫-6H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-5-酮(HSP990)，其結(jié)構(gòu)和生產(chǎn)過程公開于美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)2007-0123546，2007年5月31日發(fā)表，所述申請(qǐng)通過引用在此納入本申請(qǐng)；

和其藥學(xué)上可接受鹽。

用于本發(fā)明的優(yōu)選Hsp90抑制劑是5-(2,4-二羥基-5-異丙基-苯基)-4-(4-嗎啉-4-基甲基-苯基)-異惡唑-3-羧酸乙酰胺(AUY922)和(R)-2-氨基-7-[4-氟-2-(6-甲氧基-吡啶-2-基)-苯基]-4-甲基-7,8-二氫-6H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-5-酮(HSP990)或其藥學(xué)上可接受鹽。

如同其藥學(xué)上可接受鹽，也包括上述化合物的對(duì)應(yīng)外消旋物、非對(duì)映異構(gòu)體、對(duì)映體、互變異構(gòu)體以及對(duì)應(yīng)晶型變型(存在時(shí))，例如其中公開的溶劑合物、水合物和多晶型物。用作本發(fā)明組合物中活性成分的化合物可如所引用文獻(xiàn)所述分別制備和給予。本發(fā)明還包括多于2種上述單獨(dú)活性成分的組合，即本發(fā)明范圍內(nèi)的藥物組合能包括3種活性成分或更多。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述藥物組合包括(I)化合物即(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其藥學(xué)上可接受鹽，和選自下組的至少一種Hsp90抑制劑：5-(2,4-二羥基-5-異丙基-苯基)-4-(4-嗎啉-4-基甲基-苯基)-異惡唑-3-羧酸乙酰胺(AUY922)、(R)-2-氨基-7-[4-氟-2-(6-甲氧基-吡啶-2-基)-苯基]-4-甲基-7,8-二氫-6H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-5-酮(HSP990)，或其藥學(xué)上可接受鹽。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述藥物組合包括(I)化合物即(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其藥學(xué)上可接受鹽，和至少一種Hsp90抑制劑5-(2,4-二羥基-5-異丙基-苯基)-4-(4-嗎啉-4-基甲基-苯基)-異惡唑-3-羧酸乙酰胺(AUY922)或其藥學(xué)上可接受鹽。

現(xiàn)在意外發(fā)現(xiàn)所述式(I)化合物(α-特異性PI3K抑制劑)和至少一種Hsp90抑制劑的組合具有有益治療特性，使其能特別用于治療增生性疾病，特別是癌癥。

一方面，本發(fā)明提供一種藥物組合，所述組合包括(a)式(I)化合物，特別是化合物(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其藥學(xué)上可接受鹽，和(b)至少一種Hsp90抑制劑或其藥學(xué)上可接受鹽，用于治療增生性疾病，特別是癌癥。

一方面，本發(fā)明提供藥物組合在制備治療增生性疾病的藥物中的應(yīng)用，所述組合包括式(I)化合物或其藥學(xué)上可接受鹽和至少一種Hsp90抑制劑或其藥學(xué)上可接受鹽。

一方面，本發(fā)明還涉及在有此需要的對(duì)象中治療增生性疾病的方法，所述方法包括給予所述對(duì)象治療有效量的式(I)化合物或其藥學(xué)上可接受鹽、和至少一種Hsp90抑制劑或其藥學(xué)上可接受鹽。根據(jù)本發(fā)明，式(I)化合物和Hsp90抑制劑可作為單一藥物組合物、作為分開的組合物、或順序給予。

本發(fā)明優(yōu)選用于治療患有增生性疾病如癌的哺乳動(dòng)物，特別是人。

為證明式(I)化合物和至少一種Hsp90抑制劑的組合特別適合有效治療增生性疾病，具有良好治療范圍和其他優(yōu)勢(shì)，臨床試驗(yàn)?zāi)芤约夹g(shù)人員已知的方式實(shí)施。

合適的臨床研究是例如在增生性疾病患者中的開放標(biāo)簽、劑量遞增研究。這些研究特別證明本發(fā)明組合中活性成分的協(xié)同作用。所述有益效果能通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的這些研究結(jié)果直接確定。這類研究特別適于比較使用活性成分的單一療法與本發(fā)明組合的效果。優(yōu)選地，試劑(a)的劑量上升直至達(dá)到最大耐受劑量，試劑(b)用固定劑量給藥?；蛘撸噭?a)以固定劑量給藥而試劑(b)劑量上升。各患者每日或間歇性接受試劑(a)的劑量。所述治療功效能在這類研究中確定，如12、18或24周后每6周評(píng)估癥狀評(píng)分。

給予本發(fā)明的藥物組合不僅產(chǎn)生有益效果，如協(xié)同治療效果，例如涉及緩解、延遲疾病進(jìn)展或抑制癥狀，還產(chǎn)生進(jìn)一步令人驚訝的有益效果，如與僅應(yīng)用本發(fā)明組合中所用試劑(a)或試劑(b)之一的單一療法相比，副作用更少、生命質(zhì)量改善或發(fā)病率降低。

另一益處是能使用更低劑量的本發(fā)明組合的活性成分，例如不僅所需劑量通常更小，而且應(yīng)用頻率更低，這可能減少副作用發(fā)生率或嚴(yán)重程度。這與待治療患者的期望和要求一致。

本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供一種藥物組合物，所述組合物包含對(duì)靶向或預(yù)防增生性疾病共同治療有效的量的本發(fā)明各組合伴侶試劑(a)和試劑(b)。一方面，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，所述組合物包含式(I)化合物或其藥學(xué)上可接受鹽和至少一種Hsp90抑制劑或其藥學(xué)上可接受鹽。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的藥物組合物用于治療增生性疾病。根據(jù)本發(fā)明，試劑(a)和試劑(b)可在單一藥物組合物中共同給予，或在一個(gè)聯(lián)合單位劑型或二個(gè)分開的單位劑型中分開給予，或順序給予。所述單位劑型還可以是固定組合。

本發(fā)明的用于分開給予試劑(a)和試劑(b)或以固定組合(即含至少2個(gè)組合伴侶(a)和(b)的單一蓋侖制劑組合物)給予的藥物組合物可以本身已知的方式制備并且適合經(jīng)腸例如口服或直腸、局部、和胃腸外給予對(duì)象，包括哺乳動(dòng)物(溫血?jiǎng)游?，如人，包括治療有效量的至少一個(gè)單獨(dú)藥理活性組合伴侶，如上所示，或者聯(lián)合一種或多種藥學(xué)上可接受載體或稀釋劑，特別適于經(jīng)腸或胃腸外應(yīng)用。合適的藥物組合物包含例如約0.1％-約99.9％，優(yōu)選約1％-約60％的活性成分。

用于經(jīng)腸或胃腸外給藥的聯(lián)合治療所用藥物組合物是例如采用單位劑型的那些，如糖衣片劑、片劑、膠囊或栓劑、安瓶、注射溶液或注射混懸液。局部給藥是例如給予皮膚或眼睛，如采用洗劑、凝膠、軟膏劑或乳膏形式，或者經(jīng)鼻或栓劑形式。除非另有說明，這些以本身已知的方式制備，例如通過常規(guī)混合、?；?、包糖衣、溶解或凍干工藝。應(yīng)理解單獨(dú)劑量的各劑型所含試劑(a)或試劑(b)的單位內(nèi)容物本身不需形成有效量，因?yàn)樗栌行Я磕芡ㄟ^給予多個(gè)劑量單位來達(dá)到。

藥物組合物可包括一種或多種藥學(xué)上可接受載體或稀釋劑，且可通過混合1種或2種組合伴侶與藥學(xué)上可接受載體或稀釋劑用常規(guī)方式生產(chǎn)。藥學(xué)上可接受稀釋劑的示例包括但不限于乳糖、右旋糖、甘露醇、和/或甘油、和/或潤(rùn)滑劑和/或聚乙二醇。藥學(xué)上可接受粘合劑的示例包括但不限于硅酸鎂鋁、淀粉如玉米、小麥或米淀粉、明膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮，如需要，藥學(xué)上可接受崩解劑包括但不限于淀粉、瓊脂、藻酸或其鹽如藻酸鈉、和/或泡騰混合物、或吸附劑、染料、增味劑和甜味劑。還可能使用可胃腸外給藥形式或輸液形式的本發(fā)明化合物。所述藥物組合物可以無菌和/或可包括賦形劑例如防腐劑、穩(wěn)定劑、潤(rùn)濕劑和/或乳化劑、增溶劑、調(diào)節(jié)滲透壓的鹽和/或緩沖液。

特定地，治療有效量的本發(fā)明組合的各組合伴侶可同時(shí)或順序或以任何順序給藥，所述組分可單獨(dú)或作為固定組合給藥。例如，本發(fā)明的預(yù)防或治療增生性疾病的方法可包括：同時(shí)或以任何順序依序，以共同治療有效量，優(yōu)選以協(xié)同有效量，例如以對(duì)應(yīng)于本文所述的量的每日或間歇性劑量(i)給予采用游離或藥學(xué)上可接受鹽形式的第一試劑(a)；和(ii)給予采用游離或藥學(xué)上可接受鹽形式的試劑(b)。本發(fā)明組合的各組合伴侶可在治療過程中的不同時(shí)間分開給藥，或以分開或單一組合形式同時(shí)給藥。此外，術(shù)語“給藥”還包括使用在體內(nèi)如此轉(zhuǎn)變成組合伴侶的組合伴侶前藥。因此，應(yīng)理解本發(fā)明包括所有這類同步或交替治療的方案且也可相應(yīng)地解釋術(shù)語“給藥”。

本發(fā)明組合所用各組合伴侶試劑(a)或試劑(b)的有效劑量可根據(jù)所用特定化合物或藥物組合物、給藥模式、待治療病癥、待治療病癥的嚴(yán)重程度而變化。因此，本發(fā)明組合的劑量方案根據(jù)多種因素進(jìn)行選擇，所述因素包括患者的類型、物種、年齡、重量、性別和醫(yī)學(xué)狀況；待治療病癥的嚴(yán)重程度；給藥途徑；患者的腎和肝功能；和所用特定化合物。掌握普通技術(shù)的醫(yī)師、臨床醫(yī)生或獸醫(yī)能容易確定和處方防止、對(duì)抗或阻滯病癥發(fā)展所需的有效量藥物。在產(chǎn)生功效范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)藥物濃度的最優(yōu)精度需要基于藥物對(duì)靶位點(diǎn)可用性動(dòng)力學(xué)的方案。這包括考慮藥物的分布、平衡和清除。

出于本發(fā)明目的，治療有效劑量一般是以單一或分開劑量給予用藥對(duì)象的每日總劑量。式(I)化合物給予用藥對(duì)象的日劑量范圍可為例如約0.05-約50mg/kg接受者體重，優(yōu)選約0.1-25mg/kg接受者體重，更優(yōu)選約0.5-10mg/kg接受者體重。對(duì)于70kg人的給藥，式(I)化合物的劑量范圍最優(yōu)選每日約35-700mg。試劑(b)給予用藥對(duì)象的日劑量范圍可為例如約0.001-1000mg/kg接受者體重，更優(yōu)選約1.0-30mg/kg接受者體重。劑量單位組合物可包含所述量的其約數(shù)以補(bǔ)足日劑量。

另一益處是能使用更低劑量的本發(fā)明組合的活性成分，例如不僅所需劑量通常更小，而且應(yīng)用頻率更低，或能用于減少副作用發(fā)生率。這與待治療患者的期望和要求一致。

式(I)化合物和HSP90抑制劑的組合能單獨(dú)使用或與至少一種其他藥學(xué)活性化合物聯(lián)用于這些病癥。這些活性化合物能與相同藥物制劑聯(lián)合或采用“多組分藥盒”聯(lián)合制劑的形式，在此意義上，所述組合伴侶可獨(dú)立給藥或通過使用有不同組合伴侶量的不同固定組合，即同時(shí)或在不同時(shí)間點(diǎn)給藥。于是，多組分藥盒的部分能例如同時(shí)或按時(shí)間順序交錯(cuò)給藥，即在不同時(shí)間點(diǎn)和對(duì)于多組分藥盒的任何部分具有相等或不同的時(shí)間間隔。可引用與式(I)化合物和至少一種HSP90抑制劑的組合聯(lián)用的化合物非限制性例子是細(xì)胞毒性化療藥物，如阿那曲唑、鹽酸阿霉素、氟他胺、地塞米松、多西他賽、順鉑、紫杉醇等。此外，嘧啶基氨基苯甲酰胺化合物和HSP90抑制劑的組合能聯(lián)合其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑或其他癌基因靶向藥物，預(yù)期會(huì)產(chǎn)生顯著協(xié)同作用。

本發(fā)明的組合特別用于治療增生性疾病。術(shù)語“增生性疾病”包括但不限于癌癥、腫瘤、增生、再狹窄、心臟肥厚、免疫紊亂和炎癥。

可用本發(fā)明組合治療的增生性疾病示例是例如癌癥，包括例如肉瘤；肺癌；支氣管癌；前列腺癌；乳腺癌(包括散發(fā)性乳腺癌和Cowden病患者)；胰腺癌；胃腸癌或胃癌；結(jié)腸癌；直腸癌；結(jié)直腸腺瘤；甲狀腺癌；肝癌；肝內(nèi)膽道癌；肝細(xì)胞癌；腎上腺癌；胃癌；膠質(zhì)瘤；成膠質(zhì)細(xì)胞瘤；子宮內(nèi)膜癌；腎癌；腎盂癌；膀胱癌；子宮體癌；子宮頸癌；陰道癌；卵巢癌；多發(fā)性骨髓瘤；食道癌；白血病；急性骨髓性白血??；慢性骨髓性白血??；淋巴細(xì)胞性白血??；骨髓性白血??；腦癌；口腔及咽部癌；喉癌；小腸癌；非霍奇金淋巴瘤；黑素瘤；結(jié)腸絨毛腺瘤；瘤形成；上皮性瘤形成；淋巴瘤；乳腺癌；基底細(xì)胞癌；鱗狀細(xì)胞癌；光化性角化??；頸部或頭部腫瘤；真性紅細(xì)胞增多癥；原發(fā)性血小板增多癥；骨髓纖維化伴髓樣化生；和瓦爾登-施特倫病(Walden stroem disease)。

其他示例包括真性紅細(xì)胞增多癥、原發(fā)性血小板增多癥、骨髓纖維化伴髓樣化生、哮喘、COPD、ARDS、呂弗勒綜合癥、嗜酸性粒細(xì)胞肺炎、寄生蟲(特別是后生動(dòng)物)感染(包括熱帶嗜酸粒細(xì)胞增多癥)、支氣管肺曲菌病、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎(包括變應(yīng)性肉芽腫性血管炎)、嗜酸細(xì)胞肉芽腫、影響藥物反應(yīng)引起的氣道的嗜酸性粒細(xì)胞相關(guān)疾病、牛皮癬、接觸性皮炎、特應(yīng)性皮炎、斑禿、多形性紅斑、皰疹樣皮炎、硬皮病、白癜風(fēng)、超敏性血管炎、蕁麻疹、大皰性類天皰瘡、紅斑狼瘡、天皰瘡、獲得性大皰性表皮松解、自身免疫血液病(如溶血性貧血、再生障礙性貧血、純紅細(xì)胞貧血和特發(fā)性血小板減少)、全身性紅斑狼瘡、多軟骨炎、硬皮病、韋格納肉芽腫病、皮肌炎、慢性活動(dòng)性肝炎、重癥肌無力、史蒂芬強(qiáng)森癥候群、特發(fā)性口炎性腹瀉、自身免疫性炎癥性腸病(如潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩氏病)、內(nèi)分泌眼病、格雷夫斯病、肉狀瘤病,肺泡炎、慢性過敏性肺炎、多發(fā)性硬化、原發(fā)性膽汁性肝硬化、葡萄膜炎(前葡萄膜炎和后葡萄膜炎)、間質(zhì)性肺纖維化、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、腎小球性腎炎、心血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、深靜脈血栓形成、中風(fēng)、心肌梗塞、不穩(wěn)定型心絞痛、血栓栓塞,肺栓塞、溶血栓性病、急性動(dòng)脈缺血、外周血栓性閉塞、和冠狀動(dòng)脈疾病、再灌注損傷、視網(wǎng)膜病如糖尿病視網(wǎng)膜病變或高壓氧誘發(fā)的視網(wǎng)膜病變、表征為高眼內(nèi)壓或眼房水分泌的病癥，如青光眼。

在一個(gè)實(shí)施方式中，由本發(fā)明組合治療的增生性疾病是能通過抑制HSP90和/或PI3K來有益治療的癌癥，包括例如胃癌、肺癌和支氣管癌；前列腺癌；乳腺癌；胰腺癌；結(jié)腸癌；直腸癌；甲狀腺癌；肝癌和肝內(nèi)膽道癌；腎癌和腎盂癌；膀胱癌；子宮體癌；子宮頸癌；卵巢癌；多發(fā)性骨髓瘤；食道癌；急性骨髓性白血?。宦怨撬栊园籽?；淋巴細(xì)胞性白血病；骨髓性白血??；腦癌；口腔及咽部癌；喉癌；小腸癌；非霍奇金淋巴瘤；黑素瘤；和結(jié)腸絨毛腺瘤。

在一個(gè)實(shí)施方式中，由本發(fā)明組合治療的增生性疾病是食道癌、胃腸癌或胃癌。

提及腫瘤、腫瘤疾病、肉瘤、癌或癌癥時(shí)，也任選地或另外暗指在原器官或組織和/或任何其他位置的轉(zhuǎn)移，而無論腫瘤和/或轉(zhuǎn)移的位置如何。

本發(fā)明組合特別用于治療增生性疾病，特別是癌癥和其他惡性腫瘤，其由磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)尤其是PI3K的α亞基、和/或Hsp90(或取決于PI3K或Hsp90的那些)介導(dǎo)。增生性疾病可包括顯示PI3Kα過表達(dá)或擴(kuò)增、PIK3CA體細(xì)胞突變或者PTEN種系突變或體細(xì)胞突變或者p85突變和易位(用于上調(diào)p85-p110復(fù)合體)的那些。

在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及治療增生性疾病的方法，所述方法包括給予所述對(duì)象治療有效量的以下物質(zhì)：選自(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)的式(I)化合物(化合物A)或其藥學(xué)上可接受鹽，和選自下組的至少一種Hsp90抑制劑：格爾德霉素衍生物、坦螺旋霉素(17-烯丙氨基-17-脫甲氧基格爾德霉素)(也稱為KOS-953和17-AAG)；根赤殼菌素；6-氯-9-(4-甲氧基-3,5-二甲基吡啶-2-基甲基)-9H-嘌呤-2-胺甲磺酸鹽(也稱為CNF2024)；IPI504；SNX5422；5-(2,4-二羥基-5-異丙基-苯基)-4-(4-嗎啉-4-基甲基-苯基)-異惡唑-3-羧酸乙酰胺(AUY922)；和(R)-2-氨基-7-[4-氟-2-(6-甲氧基-吡啶-2-基)-苯基]-4-甲基-7,8-二氫-6H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-5-酮(HSP990)或其藥學(xué)上可接受鹽。

本發(fā)明還涉及一種藥盒，所述藥盒包括式(I)化合物，特別是(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其藥學(xué)上可接受鹽，和至少一種Hsp90抑制劑或其藥學(xué)上可接受鹽，以及藥品說明書或其他標(biāo)簽，其包括治療增生性疾病的指導(dǎo)。

本發(fā)明還涉及一種藥盒，所述藥盒包括式(I)化合物，特別是(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其藥學(xué)上可接受鹽，和藥品說明書或其他標(biāo)簽，其包括通過共給予至少一種Hsp90抑制劑或其藥學(xué)上可接受鹽來治療增生性疾病的指導(dǎo)。

下列實(shí)施例闡明上述發(fā)明；然而，它們不意在以任何方式限制本發(fā)明。本發(fā)明藥物組合的有益效果還能通過相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他測(cè)試模型來確定。

實(shí)施例1–化合物A在雌性無胸腺裸小鼠的HGC-27胃癌異種移植物模型中的效果

在雌性Hsd:無胸腺Nude-FoxN1^nu裸小鼠中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，治療開始時(shí)約為8-12周齡。所有動(dòng)物購自哈倫公司(Harlan，馬薩諸賽州南伊斯頓)且在優(yōu)化衛(wèi)生條件下飼養(yǎng)于頂部過濾微隔離籠內(nèi)(每籠最多5只動(dòng)物)，可隨意獲得食物和水。

HGC-27細(xì)胞是有PIK3CA突變(c1624G>A,p.E542K)和PTEN缺失的人胃癌細(xì)胞，所述細(xì)胞在含1％非必需氨基酸、有10％熱滅活FCS的MEM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，并在5％CO₂加濕空氣中37℃孵育。細(xì)胞培養(yǎng)試劑購自英杰公司(Invitrogen，加利福尼亞州卡爾斯巴德)。

通過將處于200μl(100μl PBS+100μl基質(zhì)膠)中的5x10⁶細(xì)胞(產(chǎn)品貨號(hào)354234,馬薩諸塞州貝德福德的BD生物科學(xué)(BD Bioscience))皮下注入動(dòng)物右側(cè)腋下來體內(nèi)建立HGC-27腫瘤。當(dāng)腫瘤達(dá)到約230mm³的平均大小時(shí)(細(xì)胞注射后第12天)開始功效實(shí)驗(yàn)。

化合物A在0.5％甲基纖維素(MC)中配制。將80mg化合物A加入16ml 0.5％MC，隨后攪拌/渦旋并在浴槽式超聲發(fā)生器中超聲處理1h以獲得5mg/ml均勻懸液。0.5％MC用于稀釋5mg/ml溶液至2.5mg/ml和1.25mg/ml以給藥。化合物A或載劑以10ml/kg體積口服給藥。此懸液在室溫穩(wěn)定一周。

AUY922甲磺酸鹽在D5水中配制。游離堿化合物的校正因子是1.21。為制備50mg/kg游離堿AUY922，將60.5mg AUY922甲磺酸鹽加入5.0ml D5水，隨后在水浴超聲發(fā)生器中超聲處理直到該溶液清澈。AUY922以5ml/kg體積每周二次靜脈給藥(i.v.)。每次新鮮制備AUY922。

腫瘤體積用卡尺測(cè)量并根據(jù)下式確定：長(zhǎng)度x直徑²x π/6。抗腫瘤活性表示為T/C％，其根據(jù)下式確定：(所治療動(dòng)物的平均腫瘤體積變化/對(duì)照動(dòng)物的平均腫瘤體積變化)x 100。消退(％)根據(jù)下式計(jì)算：((治療結(jié)束時(shí)的平均腫瘤體積-治療開始時(shí)的平均腫瘤體積)/治療開始時(shí)的平均腫瘤體積)x100。每周二次記錄體重和腫瘤體積。

適當(dāng)時(shí)，數(shù)據(jù)表示為均值±SEM。對(duì)于所有測(cè)試，顯著性水平設(shè)為p<0.05。對(duì)于腫瘤體積，治療組和載劑對(duì)照組之間的比較用單因素方差分析然后鄧尼特檢驗(yàn)完成。治療組之間的腫瘤體積比較用克羅斯考爾-瓦里斯單因素方差分析事后學(xué)生紐曼-科伊爾斯檢驗(yàn)或鄧恩檢驗(yàn)完成。第一實(shí)驗(yàn)中，化合物A以12.5mg/kg、25mg/kg和50mg/kg劑量每日口服給予HGC-27皮下異種移植物、腫瘤攜帶裸小鼠。載劑對(duì)照由接受每日口服給藥10ml/kg 0.5％MC和每周二次靜脈給藥5ml/kg D5W的動(dòng)物組成。

以12.5mg/kg、25mg/kg和50mg/kg每日一次口服給予的化合物A分別產(chǎn)生39.4％、35.5％和7.1％的T/C％(圖1)。以50mg/kg游離堿劑量每周二次給予的AUY922產(chǎn)生60.5％的T/C％(圖3)。12.5mg/kg化合物A和50mg/kg游離堿的AUY922的組合產(chǎn)生16.6％的T/C％(圖3)。25mg/kg化合物A和50mg/kg游離堿的AUY922的組合引起29.48％腫瘤消退(圖5)；50mg/kg化合物A和50mg/kg游離堿的AUY922的組合引起85.1％腫瘤消退(圖7)。第23天是腫瘤測(cè)量的最后一天。

相較載劑治療組，50mg/kg劑量的化合物A產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)上顯著的抗腫瘤效果(p<0.05,ANOVA,事后鄧尼特檢驗(yàn))。(見圖1)。以12.5、25和50mg/kg每日一次口服給予的化合物A相較載劑(1309±169mm³的平均腫瘤體積變化)分別產(chǎn)生515±85mm³、465±111mm³、和93±77mm³的平均腫瘤體積變化(p<0.05,ANOVA和事后鄧尼特檢驗(yàn))(見圖1)。AUY922產(chǎn)生792.2±159mm³的平均腫瘤體積變化。

以12.5、25和50mg/kg每日一次口服給予的化合物A與以50mg/kg每周二次給予的AUY922的組合分別產(chǎn)生217±68mm³(p<0.05，相較載劑和2種單一試劑，通過克羅斯考爾-瓦里斯ANOVA事后學(xué)生紐曼-科伊爾斯檢驗(yàn))、-68±36mm³(p<0.05，相較載劑和AUY922治療組，通過克羅斯考爾-瓦里斯單因素方差分析事后鄧恩檢驗(yàn))和-196±21mm³(p<0.05，相較載劑和2種單一試劑，通過克羅斯考爾-瓦里斯單因素方差分析事后學(xué)生紐曼-科伊爾斯檢驗(yàn))的平均腫瘤體積變化(見圖3、5和7)。

化合物A在12.5、25和50mg/kg劑量下耐受良好，如載劑治療組(7.8±1.4％)和化合物A治療組(分別為5.3±1.4％、2.2±1.1％、和-1.1±1.6％)的體重變化所證明。AUY922治療組引起6.6±2.6％的體重變化。

以12.5、25和50mg/kg每日一次口服給予的化合物A與以50mg/kg每周二次給予的AUY922的組合在所有劑量下可耐受(0.9±1.5％、-3.0±2.4％、8.06±2.4％)(見圖4、6和8)。

實(shí)施例2-化合物A在雌性無胸腺裸小鼠的HGC-27胃癌異種移植物模型中的效果

遵循實(shí)施例1所述過程，有以下修改：

在500萬HCG-27細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞移植后第20天開始治療，此時(shí)平均腫瘤體積為316mm³(164-485mm³)。向動(dòng)物給予以下物質(zhì)：(a)載劑對(duì)照，其由接受每日口服給藥10ml/kg 0.5％MC和每周二次靜脈給藥5ml/kg D5W的動(dòng)物組成；(b)每周二次靜脈給藥的50mg/kg AUY922，(c)以25mg/kg或50mg/kg每天一次口服給藥的化合物A，(d)以50mg/kg每周二次靜脈給藥的AUY922和以25mg/kg每天一次口服給藥的化合物A的組合，或(e)以50mg/kg每周二次靜脈給藥的AUY922和以50mg/kg每天一次口服給藥的化合物A的組合。治療持續(xù)14天。

此實(shí)驗(yàn)中，25和50mg/kg的化合物A引起顯著腫瘤生長(zhǎng)抑制，分別產(chǎn)生11％T/C(p<0.05相比載劑)和10％T/C(p<0.05相比載劑)。50mg/kg AUY922產(chǎn)生57％T/C，其相較載劑治療組不顯著。25和50mg/kg化合物A與50mg/kg AUY922的組合分別產(chǎn)生-11％T/T0(p<0.05相比載劑或AUY922治療組)和-57％T/T0(p<0.05分別相比載劑、AUY922或化合物A治療組)。

實(shí)施例3-化合物A在雌性無胸腺裸小鼠的NCI-N87胃癌異種移植物模型中的效果

在雌性Hsd:無胸腺Nude-nu CPB小鼠中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，治療開始時(shí)約為10-12周齡。所有動(dòng)物獲自哈倫公司(德國(guó)溫克爾曼)且在優(yōu)化衛(wèi)生條件下飼養(yǎng)于Makrolon III型籠內(nèi)(每籠最多5只動(dòng)物)，可隨意獲得食物和水。

NCI-N87細(xì)胞是人胃癌細(xì)胞，在增補(bǔ)有以下物質(zhì)的含4.5g/l葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)：10％熱滅活FCS、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸鈉。所述細(xì)胞在5％CO₂加濕空氣中37℃孵育。細(xì)胞用胰蛋白酶(0.25％w/v)-EDTA(0.53mM)收獲，重懸于培養(yǎng)基(有添加劑)并用系統(tǒng)計(jì)數(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)試劑購自百康特(BioConcept，瑞士阿爾施維爾)。

通過用23號(hào)針皮下注射8x 10⁶-1x 10⁷細(xì)胞(處于含50％v/v基質(zhì)膠的HBSS)來建立NCI-N87腫瘤。當(dāng)腫瘤確立且達(dá)到180-210mm³時(shí)，動(dòng)物隨機(jī)分入治療組并開始治療。

化合物A在NMP/PEG300/Solutol HS15/水(10:30:20:40％體積/體積)中配制。所述化合物首先充分溶于NMP，臨給予動(dòng)物前立即加入水?；衔顰和載劑以10ml/kg的體積給予。此懸液在室溫穩(wěn)定一周。

AUY922甲磺酸鹽在D5水(含5％葡萄糖的水)中配制。所有AUY922劑量指游離堿等同物。AUY922以10ml/kg體積每周二次靜脈給藥。

適當(dāng)時(shí)，數(shù)據(jù)表示為均值±SEM。對(duì)于所有測(cè)試，顯著性水平設(shè)為p<0.05。對(duì)于腫瘤體積，治療組和載劑對(duì)照組之間的比較用單因素方差分析然后鄧尼特檢驗(yàn)完成。成對(duì)比較用單因素方差分析然后圖基檢驗(yàn)完成。治療期開始和結(jié)束之間組內(nèi)體重變化的顯著性水平用配對(duì)t檢驗(yàn)測(cè)定。治療和載劑對(duì)照組之間的Δ體重比較通過單因素方差分析然后事后鄧尼特檢驗(yàn)進(jìn)行。計(jì)算用GraphPad Prism 4for windows(GraphPad軟件公司(GraphPad Software Inc.))進(jìn)行。

另外，藥物相互作用的粗略估算用Clarke R.,“Issues in experimental design and endpoint analysis in the study of experimental cytotoxic agents in vivo in breast cancer and other models(乳腺癌和其他模型中體內(nèi)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞毒劑研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和終點(diǎn)分析問題)”,Breast Cancer Res.Treat.,46,255-78(1997)所述方法完成。這適用于ΔTV(腫瘤體積)。

治療組之間的腫瘤體積比較用克羅斯考爾-瓦里斯單因素方差分析事后學(xué)生紐曼-科伊爾斯檢驗(yàn)或鄧恩檢驗(yàn)完成。

第一實(shí)驗(yàn)：

雌性無胸腺裸小鼠用50mg/kg化合物A每日一次口服單獨(dú)，或與每周二次靜脈給藥的50mg/kg AUY922組合治療。載劑對(duì)照由接受每日口服給藥NMP/PEG300/Solutol HS15/水(10:30:20:40％體積/體積)混合物與靜脈給藥10ml/kg 5％葡萄糖水溶液的動(dòng)物組成。

作為單一試劑，化合物A產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)上顯著抗腫瘤效果，T/C為4.2％(p<0.05,單因素方差分析,事后鄧尼特檢驗(yàn))且平均腫瘤體積變化(mm³±SEM)為-15.1±21.4。用作單一試劑的AUY922(50mg/kg)產(chǎn)生7％腫瘤消退，與化合物A聯(lián)合時(shí)產(chǎn)生72.3％消退。2種效果都與載劑對(duì)照顯著不同(p<0.05,ANOVA)。

載劑對(duì)照產(chǎn)生248.9±20.4的平均腫瘤體積變化(mm³±SEM)。用作單一試劑的AUY922(50mg/kg)產(chǎn)生-15.1±21.4的平均腫瘤體積變化(mm³±SEM)，用作單一試劑的化合物A產(chǎn)生1.4±18.8的平均腫瘤體積變化(mm³±SEM)。AUY922和化合物A的組合產(chǎn)生-155.8±14.7的平均腫瘤體積變化(mm³±SEM)。另外，用所述組合治療的組與化合物A和AUY922都作為單一試劑給藥顯著不同(p<0.05,單因素方差分析,事后圖基檢驗(yàn))。

此外，用Clarke R.(1997)所述方法分析可能的化合物相互作用指示用AUY922和化合物A組合的協(xié)同抗腫瘤效果：

對(duì)于化合物A、B或組合AB(有載劑對(duì)照組C)，當(dāng)計(jì)算AB/C>A/C x B/C，累加效應(yīng)：AB/C＝A/C x B/C時(shí)，則預(yù)測(cè)拮抗作用，當(dāng)AB/C<A/C x B/C時(shí)，則預(yù)測(cè)協(xié)同相互作用。

治療期間所有組內(nèi)的體重變化在統(tǒng)計(jì)上顯著(p<0.05，配對(duì)t檢驗(yàn))，除了用單一試劑化合物A治療的組。所述聯(lián)合化療組的體重變化與載劑組的體重變化顯著不同(單因素方差分析,事后鄧尼特檢驗(yàn))。

第二實(shí)驗(yàn)：

第二功效實(shí)驗(yàn)中，腫瘤模型建立如同第一實(shí)驗(yàn)，使用相同治療組，加入一個(gè)用12.5mg/kg劑量單一試劑化合物A治療的組，和另一用相同劑量化合物A與AUY922組合(50mg/kg，每周二次靜脈內(nèi))治療的組。

作為單一試劑的AUY922產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)上顯著的抗腫瘤效果，T/C為4.7％(p<0.05,ANOVA)。作為單一試劑，化合物A在低(12.5mg/kg,T/C＝30.3％)劑量不產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)上顯著的抗腫瘤效果，但所述效果在高(50mg/kg)劑量變得顯著，產(chǎn)生1.2％消退(p<0.05,ANOVA)。與AUY922(50mg/kg)聯(lián)用時(shí)，低(12.5mg/kg)和高(50mg/kg)劑量的化合物A產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)上顯著的抗腫瘤效果，分別有17.5和59.6％消退。比較所述組合組與單一試劑治療時(shí)，發(fā)現(xiàn)以12.5mg/kg給藥的化合物A與所述組合組之間有顯著差異。

載劑對(duì)照產(chǎn)生378.5±57.5的平均腫瘤體積變化(mm³±SEM)。用作單一試劑的AUY922(50mg/kg)產(chǎn)生17.9±11.0的平均腫瘤體積變化(mm³±SEM)。用作單一試劑的化合物A在12.5mg/kg劑量下產(chǎn)生的平均腫瘤體積變化(mm³±SEM)為114.9±43.9(統(tǒng)計(jì)上不顯著)，50mg/kg劑量下為-2.3±15.2。AUY922和化合物A(12.5mg/kg)的組合產(chǎn)生-34.8±19.5的平均腫瘤體積變化(mm³±SEM)。AUY922和化合物A(50mg/kg)的組合產(chǎn)生-116.2±8.3的平均腫瘤體積變化(mm³±SEM)。另外，高劑量組合組(以50mg/kg給藥的化合物A)與這2種單一試劑都顯著不同(p<0.05,ANOVA)。

化合物相互作用分析用Clarke所述方法(公式細(xì)節(jié)參見表3-1)進(jìn)行并顯示2種組合中都發(fā)生協(xié)同相互作用，如下所示：

-以12.5mg/kg給藥的化合物A的Clarke組合指數(shù)＝-0.11，

-以50mg/kg給藥的化合物A的組合指數(shù)＝-0.31。

治療期間載劑、化合物A治療(12.5mg/kg)和所述組合(以50mg/kg給藥化合物A)的組內(nèi)體重變化在統(tǒng)計(jì)上顯著(p<0.05，配對(duì)t檢驗(yàn))?；衔顰(50mg/kg)治療組和所述組合組的體重變化與載劑組的體重變化顯著不同(單因素方差分析,事后鄧尼特檢驗(yàn))。

第三實(shí)驗(yàn)：

第三功效實(shí)驗(yàn)中，腫瘤模型建立如同第二實(shí)驗(yàn)。

此實(shí)驗(yàn)中，AUY922作為單一試劑給藥，產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)上顯著的抗腫瘤效果，T/C為14％(p<0.05,ANOVA)。2種劑量的化合物A(12.5和50mg/kg，每日一次口服)都產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)上顯著的抗腫瘤效果，分別引起37.8％的T/C和6.4％消退(p<0.05,ANOVA)。所述2個(gè)組合組中也獲得顯著效果，分別以12.5和50mg/kg給藥的化合物A以及50mg/kg AUY922引起37.4和63.1％消退。

載劑對(duì)照產(chǎn)生195.4±22.9的平均腫瘤體積變化(mm³±SEM)。用作單一試劑的AUY922(50mg/kg)產(chǎn)生27.4±10.2的平均腫瘤體積變化。用作單一試劑的化合物A在12.5mg/kg劑量下產(chǎn)生的平均腫瘤體積變化(mm³±SEM)為73.9±17.6，50mg/kg劑量下為-13.3±6.7。AUY922和化合物A(12.5mg/kg)的組合產(chǎn)生-78.4±7.4的平均腫瘤體積變化(mm³±SEM)。AUY922和化合物A(50mg/kg)的組合產(chǎn)生-132.0±7.9的平均腫瘤體積變化(mm³±SEM)。2個(gè)組合組還都與2個(gè)單一試劑組顯著不同(p<0.05,ANOVA事后圖基檢驗(yàn))，但所述單一試劑彼此沒有差異。

化合物相互作用分析用Clarke1997所述方法進(jìn)行并顯示2種組合中的協(xié)同相互作用，如下所示：

-以12.5mg/kg給藥的化合物A的Clarke組合指數(shù)＝-0.45，

-以50mg/kg給藥的化合物A的組合指數(shù)＝-0.67。

治療期間載劑、化合物A治療(12.5mg/kg)和所述組合(以50mg/kg給藥化合物A)的組內(nèi)體重變化在統(tǒng)計(jì)上顯著(p<0.05，配對(duì)t檢驗(yàn))。2個(gè)組合化療組中以及化合物A(50mg/kg)治療組中的體重變化與載劑組的體重變化顯著不同(單因素方差分析,事后鄧尼特檢驗(yàn))。

實(shí)施例4-化合物A在雌性無胸腺裸小鼠的KYSE-70食管鱗狀細(xì)胞癌異種移植物模型中的效果

在雌性Hsd:無胸腺Nude-nu CPB小鼠中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，治療開始時(shí)約為10-12周齡。通過用23號(hào)針將含7.5x 10⁶KYSE-70細(xì)胞(其為食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞)的100μl細(xì)胞懸液皮下注入小鼠右側(cè)腋下來建立KYSE-70腫瘤。移植后十(10)天，出現(xiàn)腫瘤。當(dāng)腫瘤在移植后約10天確立且達(dá)到約156mm³時(shí)(最小86mm³，最大218mm³)，選擇48只動(dòng)物并隨機(jī)分入6個(gè)治療組(n＝8)。

安慰劑對(duì)照配制為10ml/kg的250μl NMP、750μl PEG300、500μl Solutol HS15和1000μl水，用于每日一次口服遞送(安慰劑1)，配制為10ml/kg的2.5ml葡萄糖，用于每周二次靜脈遞送(安慰劑2)。

化合物A在NMP/PEG300/Solutol HS15/水(10:30:20:40％體積/體積)中配制。所述化合物首先充分溶于NMP，臨給予動(dòng)物前立即加入水?；衔顰或載劑以10ml/kg體積口服給藥。此懸液在室溫穩(wěn)定一周。

AUY922甲磺酸鹽在D5水(含5％葡萄糖的水)中配制。所有AUY922劑量指游離堿等同物。AUY922以10ml/kg體積每周二次靜脈給藥。

各組小鼠用以下治療之一處理24天：(a)安慰劑1和安慰劑2(組1)，(b)12.5mg/kg化合物A每日一次口服給藥(組2)，(c)50mg/kg化合物A每日一次口服給藥(組3)，(d)50mg/kg AUY922每周二次靜脈給藥(組4)，(e)12.5mg/kg化合物A每日一次口服給藥和50mg/kg AUY922每周二次靜脈給藥的組合(組5)，或(f)50mg/kg化合物A每日一次口服給藥和50mg/kg AUY922每周二次靜脈給藥的組合(組6)。

抗腫瘤活性表示為T/C％，根據(jù)下式確定：(所治療動(dòng)物的平均腫瘤體積變化/對(duì)照動(dòng)物的平均腫瘤體積變化)x 100。

下列抗腫瘤活性數(shù)據(jù)通過遵循上述實(shí)驗(yàn)操作而獲得：

實(shí)施例5-化合物A在雌性無胸腺裸小鼠的A375黑素瘤細(xì)胞癌異種移植物模型中的效果

在重約20-25g的雌性Harlan Hsd:Npa無胸腺裸小鼠中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。通過在小鼠背部皮下注射4x 10⁶ A375細(xì)胞(黑素瘤細(xì)胞)來建立A375腫瘤。移植后十(10)天，出現(xiàn)腫瘤。移植后約30天，選擇32只動(dòng)物并隨機(jī)分入4個(gè)治療組(n＝8)。

安慰劑對(duì)照配制為1％羧甲基纖維素(CMC)，用于每日一次口服遞送(安慰劑1)，配制為10ml/kg的2.5ml葡萄糖，用于每周二次靜脈或腹膜內(nèi)遞送(安慰劑2)。

化合物A通過溶于含5％(v/v)吐溫-80的1％(w/v)羧甲基纖維素(CMC)而配制為40mg/kg劑量的化合物A?；衔顰或載劑以10mg/ml體積每日一次口服給藥。

AUY922在D5水(含5％葡萄糖的水)中配制。所有AUY922劑量指游離堿等同物。AUY922以10mg/ml體積和50mg/kg劑量每周二次靜脈給藥。

各組小鼠用以下治療之一處理11天：(a)安慰劑1和安慰劑2(組1)，(b)40mg/kg化合物A每日一次口服給藥(組2)，(c)50mg/kg AUY922每周二次靜脈給藥(組3)，(e)40mg/kg化合物A每日一次口服給藥和50mg/kg AUY922每周二次靜脈給藥的組合(組4)。

適當(dāng)時(shí)，數(shù)據(jù)表示為均值±SEM。對(duì)于所有測(cè)試，顯著性水平設(shè)為p<0.05。治療組之間的腫瘤體積比較用克羅斯考爾-瓦里斯單向方差分析秩檢驗(yàn)或圖基檢驗(yàn)完成。

遵循上述實(shí)驗(yàn)過程，所治療小鼠的平均腫瘤生長(zhǎng)分?jǐn)?shù)和平均體重變化示于圖9。

實(shí)施例6-化合物A在雌性無胸腺裸小鼠的A375黑素瘤細(xì)胞癌異種移植物模型中的效果

在重約20-25g的雌性Harlan Hsd:Npa無胸腺裸小鼠中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。通過在小鼠背部皮下注射4x 10⁶A375細(xì)胞(黑素瘤細(xì)胞)來建立A375腫瘤。移植后十(10)天，出現(xiàn)腫瘤。移植后約30天，選擇32只動(dòng)物并隨機(jī)分入4個(gè)治療組(n＝8)。

安慰劑對(duì)照配制為1％羧甲基纖維素(CMC)，用于每日一次口服遞送(安慰劑1)，配制為10ml/kg的2.5ml葡萄糖，用于每周二次靜脈或腹膜內(nèi)遞送(安慰劑2)。

化合物A通過溶于含5％(v/v)吐溫-80的1％(w/v)羧甲基纖維素(CMC)而配制為40mg/kg劑量的化合物A?；衔顰或載劑以10mg/ml體積每日一次口服給藥。

AUY922在D5水(含5％葡萄糖的水)中配制。所有AUY922劑量指游離堿等同物。AUY922以10mg/ml體積和50mg/kg劑量每周二次靜脈給藥。

各組小鼠用以下治療之一處理11天：(a)安慰劑1和安慰劑2(組1)，(b)40mg/kg化合物A每日一次口服給藥(組2)，(c)50mg/kg AUY922每周二次靜脈給藥(組3)，(d)40mg/kg化合物A每日一次口服給藥和50mg/kg AUY922每周二次靜脈給藥的組合(組4)。

適當(dāng)時(shí)，數(shù)據(jù)表示為均值±SEM。對(duì)于所有測(cè)試，顯著性水平設(shè)為p<0.05。治療組之間的腫瘤體積比較用克羅斯考爾-瓦里斯單向方差分析秩檢驗(yàn)或圖基檢驗(yàn)完成。

遵循上述實(shí)驗(yàn)過程，所治療小鼠的平均腫瘤生長(zhǎng)分?jǐn)?shù)和平均體重變化示于圖9。