本發(fā)明涉及生物醫(yī)用材料技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種膠原生物膜及其制備方法。

背景技術(shù)：

膠原(Collagen)作為一種生物高分子是動(dòng)物結(jié)締組織中的主要成分，也是哺乳動(dòng)物體內(nèi)含量最多、分布最廣的功能性蛋白，占蛋白質(zhì)總量的25％～30％。與組織的形成、成熟、細(xì)胞間信息的傳遞，以及關(guān)節(jié)潤(rùn)滑、傷口愈合、鈣化作用、血液凝固和衰老等有著密切的關(guān)系。膠原也是生物科技產(chǎn)業(yè)最具關(guān)鍵性的原材料之一，在醫(yī)學(xué)材料、化妝品、食品工業(yè)等均有著廣泛應(yīng)用。在空間結(jié)構(gòu)上，膠原顯示出特殊的三股螺旋纏繞的結(jié)構(gòu)，三條相互獨(dú)立的膠原蛋白肽鏈依靠甘氨酸之間形成的氫鍵維系三股螺旋相互纏繞的結(jié)構(gòu)。膠原這種特殊的三股螺旋結(jié)構(gòu)保證了它的機(jī)械強(qiáng)度。膠原纖維是膠原行使生理作用的基本形態(tài)，在生物體內(nèi)膠原纖維交織成富有機(jī)械強(qiáng)度和彈性的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)成為結(jié)締組織最基本的組成成分。

硬腦膜是保護(hù)腦組織的一道重要屏障，對(duì)于維護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)及功能活動(dòng)意義重大。手術(shù)修補(bǔ)硬膜、封閉硬膜下腔，可明顯減少或預(yù)防腦脊液漏、顱內(nèi)感染、癲瘸等癥狀。因此神經(jīng)外科手術(shù)后保持硬腦膜層完整是必要的。創(chuàng)傷、腫瘤侵蝕及手術(shù)過(guò)程硬腦膜皺縮等因素均可造成硬腦膜的缺損，使得原位關(guān)閉硬膜下腔無(wú)法完成，此外，神經(jīng)外科的減壓術(shù)通常需要擴(kuò)大膜下腔。此類情況通常需要使用硬腦膜替代材料完成硬膜修復(fù)。

天然材料及人工合成材料作為硬腦膜替代品分為可吸收材料和不可吸收材料，此類材料容易制成需要的形狀和大小，容易消毒，不擔(dān)心傳遞疾病的風(fēng)險(xiǎn)。

可吸收材料可在體內(nèi)最終降解、吸收，由生成的新腦膜替代修復(fù)腦膜缺損。膠原基質(zhì)通常提取于牛、豬等動(dòng)物的跟腱或皮膚，可作為硬腦膜修補(bǔ)材料，是一種可吸收的生物材料，與人硬膜主要成分類似，其主要成分是Ⅰ型膠原蛋白。腦膜替代品目前已經(jīng)以多種形態(tài)如膜、薄片、海綿進(jìn)行實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用。來(lái)自動(dòng)物的Ⅰ型膠原分子的尾肽經(jīng)酶處理去除后具有極低的免疫原性，并可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞粘附增生以及膜的血管化，從而加速植入材料自體化過(guò)程。從理論上講，膠原作為一種可吸收材料是最理想的腦膜替代材料。

因此，需要高質(zhì)量的膠原生物膜作為硬腦膜和脊柱膜等的替代品。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種膠原生物膜及其制備方法。技術(shù)方案如下：

在第一方面，本發(fā)明提供了一種膠原生物膜，膠原生物膜中的膠原具有三股螺旋結(jié)構(gòu)；膠原生物膜的厚度為0.2-0.9cm，具有三維孔徑結(jié)構(gòu)，孔徑的大小為60-300mm。

在第二方面，本發(fā)明提供了上述膠原生物膜的制備方法，包括以下步驟，

將膠原與水混合，向其中加入乳酸溶液和/或鹽酸溶液，使膠原均勻分散，制成漿液；

調(diào)節(jié)所述漿液的pH值至5.5-6.5，之后對(duì)所述漿液真空脫泡，然后進(jìn)行冷凍干燥；

采用物理和/或化學(xué)方法交聯(lián)，即獲得膠原生物膜。

在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述膠原在所述漿液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3％-1.5％。

在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述漿液的pH值為2.8-3.8。

在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述冷凍干燥為在真空度為120-250毫托的條件下，4-10℃保持40min，-45--35℃保持120-210min，0℃保持20-24h，20-25℃保持2-9h。

在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述物理交聯(lián)方法為：采用254nm的紫外線照射7-13h，或者所述物理交聯(lián)方法為：在真空條件下100-120℃脫水處理2-3天，之后降溫至50℃以下；所述化學(xué)交聯(lián)方法為：采用甲醛氣體交聯(lián)。

在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述膠原由以下步驟制得：

先對(duì)牛跟腱進(jìn)行切片；

再將切片的牛跟腱浸泡在無(wú)花果蛋白酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.005％-0.2％的磷酸鹽緩沖液中，在4-15℃下保持12-24h；

然后向所述磷酸鹽緩沖液中加入氧化劑，用水沖洗所述切片的牛跟腱；所述氧化劑選自亞氯酸鹽和過(guò)氧化氫中的至少一種；

最后將所述切片的牛跟腱浸泡在氫氧化鈉摩爾濃度為1-2mol/L的鹽溶液中，在4-15℃下保持1-4天，之后調(diào)節(jié)所述鹽溶液的pH值為4-7，收集產(chǎn)物，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行反復(fù)清洗，脫水處理，獲得膠原。

在本發(fā)明的一種更優(yōu)選實(shí)施方式中，所述無(wú)花果蛋白酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05％-0.1％；所述磷酸鹽緩沖溶液的pH值為5-7，磷酸根的摩爾濃度為0.01-0.1mol/L。

在本發(fā)明的一種更優(yōu)選實(shí)施方式中，所述氧化劑的加入體積為所述磷酸鹽緩沖液的1‰-5‰；所述氧化劑為過(guò)氧化氫。

在本發(fā)明的一種更優(yōu)選實(shí)施方式中，基于所述鹽溶液的總質(zhì)量，所述鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％-30％；所述鹽溶液中的鹽選自氯化鈉、硫酸鈉、碳酸鈉中的至少一種。

在本發(fā)明的一種更優(yōu)選實(shí)施方式中，在對(duì)牛跟腱進(jìn)行切片之前，先對(duì)所述牛跟腱進(jìn)行預(yù)處理；所述預(yù)處理為用水對(duì)牛跟腱進(jìn)行反復(fù)沖洗，之后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20％-75％乙醇溶液漂洗15-45min，用水反復(fù)沖洗。

本發(fā)明實(shí)施例提供的技術(shù)方案的有益效果是：本發(fā)明提供的膠原生物膜不但保持了膠原的生物學(xué)優(yōu)良性能，即三股螺旋結(jié)構(gòu)，機(jī)械強(qiáng)度高，而且可吸收，免疫原性低，有助于組織生長(zhǎng)，促進(jìn)修復(fù)，降解可控等優(yōu)點(diǎn)，可作為硬腦膜和脊柱膜等的替代品。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為本發(fā)明一示例性實(shí)施例示出的膠原生物膜的掃描電鏡圖；

圖2為本發(fā)明一示例性實(shí)施例示出的膠原生物膜的制備方法中膠原的SDS-PAGE電泳圖；

圖3為本發(fā)明一示例性實(shí)施例示出的膠原生物膜的制備方法中膠原的紅外光譜圖；

圖4為本發(fā)明一示例性實(shí)施例示出的膠原生物膜的制備方法中膠原的紫外光譜圖。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明的技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明實(shí)施方式作進(jìn)一步地詳細(xì)描述。

在第一方面，如圖1所示，本發(fā)明提供了一種膠原生物膜，膠原生物膜中的膠原具有三股螺旋結(jié)構(gòu)；膠原生物膜的厚度為0.2-0.9cm，優(yōu)選地，膠原生物膜的厚度為0.5cm；具有三維孔徑結(jié)構(gòu)，孔徑的大小為60-300mm，優(yōu)選地，孔徑的大小為120-250mm。

本發(fā)明提供的膠原生物膜不但保持了膠原的生物學(xué)優(yōu)良性能，即三股螺旋結(jié)構(gòu)，機(jī)械強(qiáng)度高，而且可吸收，免疫原性低，有助于組織生長(zhǎng)，促進(jìn)修復(fù)，降解可控等優(yōu)點(diǎn)，可作為硬腦膜和脊柱膜等的替代品。

在第二方面，本發(fā)明提供了一種膠原生物膜的制備方法，包括以下步驟，

將膠原與水混合，向其中加入乳酸溶液和/或鹽酸溶液，使膠原均勻分散，制成漿液；

調(diào)節(jié)所述漿液的pH值至5.5-6.5，之后對(duì)所述漿液真空脫泡，然后冷凍干燥；

采用物理和/或化學(xué)方法交聯(lián)，即獲得膠原生物膜。

本發(fā)明的膠原生物膜的制備方法，將膠原與水混合，向其中加入乳酸溶液和/或鹽酸溶液，使膠原呈現(xiàn)細(xì)長(zhǎng)纖維狀，漿液呈現(xiàn)透明的狀態(tài)；將漿液的pH調(diào)至5.5-6.5是為了凍干后形成的膠原海綿的pH值近中性，接近于人體的pH值；選擇乳酸和鹽酸溶解膠原，即便乳酸和鹽酸在膠原生物膜上有殘留，由于乳酸是人體自身代謝物質(zhì)，鹽酸能生成氯化鈉，所以二者的殘留對(duì)人體無(wú)礙。因此，本發(fā)明的膠原生物膜的制備方法符合人體的需要。不僅如此，利用本發(fā)明提供的膠原生物膜的制備方法制備的膠原生物膜，保持了膠原原有的三股螺旋結(jié)構(gòu)，具有機(jī)械強(qiáng)度高，而且可吸收，免疫原性低，有助于組織生長(zhǎng)，促進(jìn)修復(fù)，降解可控等優(yōu)點(diǎn)，可作為硬腦膜和脊柱膜等的替代品。此外，該制備方法過(guò)程簡(jiǎn)單。

在實(shí)際應(yīng)用中，本發(fā)明提供的膠原生物膜的制備方法的膠原可以來(lái)源于牛、豬等動(dòng)物的跟腱或皮膚，優(yōu)選為牛跟腱。

還有，在實(shí)際應(yīng)用中，可以使用低濃度氫氧化鈉溶液，如0.5mol/L的氫氧化鈉將漿液的pH值調(diào)節(jié)至5.5-6.5，在該pH范圍內(nèi)，冷凍干燥后形成的膠原海綿的pH值近中性，即接近人體的pH值。

再有，將膠原均勻分散到乳酸溶液和/或鹽酸溶液中，若發(fā)現(xiàn)有不溶物質(zhì)，可以過(guò)濾處理，具體可以利用40目的不銹鋼的濾布過(guò)濾兩次。

作為本發(fā)明的一種改進(jìn)的實(shí)施方式，所述膠原在所述漿液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3％-1.5％。所述乳酸溶液中乳酸的摩爾濃度為0.01-0.05mol/L；所述鹽酸溶液中鹽酸的摩爾濃度為0.05-0.1mol/L。優(yōu)選地，所述漿液的pH值為2.8-3.8，在此pH值范圍內(nèi)，漿液澄清透明度高，而且在后續(xù)調(diào)節(jié)pH值時(shí)，減少堿的用量，即鹽離子的用量和殘留，獲得高純度的免疫原性更低的膠原生物膜。

作為本發(fā)明的另一種改進(jìn)的實(shí)施方式，所述冷凍干燥為在真空度為120-250毫托的條件下，4-10℃保持40min，-45--35℃保持120-210min，0℃保持20-24h，20-25℃保持2-9h。此冷凍干燥條件有利于膠原生物膜保持膠原具有三股螺旋結(jié)構(gòu)，并且更好的控制膠原生物膜的厚度和三維孔徑結(jié)構(gòu)。

在具體的實(shí)施方式中，優(yōu)選地，所述物理交聯(lián)方法為：采用254nm的紫外線照射7-13h，或者所述物理交聯(lián)方法為：在真空條件下100-120℃脫水處理2-3天，之后降溫至50℃以下。真空干燥這種重度脫水的方法可以提高膠原的穩(wěn)定性，防止組織膠原基質(zhì)塌陷，通過(guò)脫水，縮短了膠原活性基之間的距離，導(dǎo)致膠原分子之間發(fā)生交聯(lián)，提高了變性溫度，降低了其自由氨基酸的含量，從而提高了膠原的機(jī)械強(qiáng)度。

在具體的實(shí)施方式中，優(yōu)選地，所述化學(xué)交聯(lián)方法為：采用甲醛氣體交聯(lián)。

在實(shí)際應(yīng)用中，可以采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％-30％的甲醛溶液發(fā)揮出的甲醛氣體對(duì)凍干后的膠原進(jìn)行交聯(lián)改性，通常時(shí)間為3-5h。

采用本發(fā)明提供的物理或化學(xué)交聯(lián)方法改性后，有利于提高膠原材料的拉伸強(qiáng)度及抗降解能力，降低其膨脹率，改善膠原的抗水性等。

作為本發(fā)明的再一種改進(jìn)的實(shí)施方式，所述膠原由以下步驟制得：

先對(duì)牛跟腱進(jìn)行切片；

再將切片的牛跟腱浸泡在無(wú)花果蛋白酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.005％-0.2％的磷酸鹽緩沖液中，在4-15℃下保持12-24h；

然后向所述磷酸鹽緩沖液中加入氧化劑，用水沖洗所述切片的牛跟腱；所述氧化劑選自亞氯酸鹽和過(guò)氧化氫中的至少一種；

最后將所述切片的牛跟腱浸泡在氫氧化鈉摩爾濃度為1-2mol/L的鹽溶液中，在4-15℃下保持1-4天，之后調(diào)節(jié)所述鹽溶液的pH值為4-7，收集產(chǎn)物，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行反復(fù)清洗，脫水處理，獲得膠原。

本發(fā)明提供的一種膠原生物膜的制備方法，先將牛跟腱切成薄片，使膠原容易從牛跟腱中釋放出來(lái)，再用無(wú)花果蛋白酶進(jìn)行酶水解，使緊致的切片的牛跟腱變得松散，對(duì)其中的膠原進(jìn)行初步提取，無(wú)花果蛋白酶是植物來(lái)源的蛋白酶不但具有很好的提取膠原的效果，人體對(duì)其不具有排異性，而且相對(duì)于動(dòng)物來(lái)源的蛋白酶避免了免疫原干擾。磷酸鹽緩沖溶液為無(wú)花果蛋白酶的活性提供適宜條件。然后用氫氧化鈉進(jìn)行堿水解，一定濃度的氫氧化鈉可以去除牛跟腱自身攜帶的朊病毒等致病因素，并能進(jìn)一步使膠原從牛跟腱中解離出來(lái)，一定濃度的鹽溶液使解離出的膠原處于不溶狀態(tài)，并容易與其它雜質(zhì)和溶液分離，而且有效地防止膠原水解成膠原蛋白。將溫度嚴(yán)格控制在4-15℃是為了防止高溫時(shí)膠原降解。對(duì)產(chǎn)物反復(fù)清洗是除去膠原上的各種離子，再脫水，獲得高純度的三股螺旋結(jié)構(gòu)完整的膠原。

需要說(shuō)明的是，在堿水解疏松的牛跟腱的過(guò)程中可以輕微振蕩或晃動(dòng)，但不能用力攪拌，防止機(jī)械外力使膠原的肽鏈斷裂。

需要進(jìn)一步說(shuō)明的是，將鹽溶液的pH值調(diào)節(jié)至4-7，優(yōu)選為6-7，具體操作，向鹽溶液中滴加酸來(lái)調(diào)節(jié)pH值，摩爾濃度為0.05-2mol/L的硫酸溶液、鹽酸溶液或乙酸溶液等。

在實(shí)際應(yīng)用中，先對(duì)牛跟腱進(jìn)行切片，再用水反復(fù)沖洗，去除水分。將牛跟腱切片是為了更容易提取其中的膠原。用水反復(fù)沖洗，是為了進(jìn)一步去除切片牛跟腱含有的雜質(zhì)。

還有，在對(duì)牛跟腱進(jìn)行切片之前，先對(duì)牛跟腱進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理的步驟具體可以為：用水對(duì)牛跟腱進(jìn)行反復(fù)沖洗，之后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20％-75％乙醇溶液漂洗15-45min，用水反復(fù)沖洗。對(duì)整根的牛跟腱初步進(jìn)行除雜，洗去表面的血污塵土等雜質(zhì)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20％-75％乙醇溶液對(duì)血污去除效果比較好，并且還能消毒殺菌，優(yōu)選為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65％-75％的乙醇溶液，更優(yōu)選為質(zhì)量分?jǐn)?shù)75％的乙醇溶液。經(jīng)過(guò)漂洗，牛跟腱會(huì)變得更白，后續(xù)獲得的膠原也會(huì)更白更純。

再有，切片可以為冷凍切片，將牛跟腱于-20℃冷凍過(guò)夜，大致為7-12h，更容易將牛跟腱切成薄片，具體可以使用切片機(jī)將牛跟腱切成厚度為1-3mm的薄片。

此外，亞氯酸鹽優(yōu)選為亞氯酸鈉。亞氯酸鈉更容易在后續(xù)水洗過(guò)程中去掉。

為了增強(qiáng)無(wú)花果蛋白酶的水解效果，同時(shí)減少試劑成本，優(yōu)選地，無(wú)花果蛋白酶在磷酸鹽緩沖液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05％-0.1％。

為了進(jìn)一步增強(qiáng)無(wú)花果蛋白酶的水解效果，為無(wú)花果蛋白酶發(fā)揮其酶水解作用提供更適宜的條件和環(huán)境，磷酸鹽緩沖溶液的pH值為5-7，優(yōu)選為pH值5.8-6.5，更優(yōu)選為pH值6.4；磷酸根的摩爾濃度為0.01-0.1mol/L，更優(yōu)選為0.02-0.06，更優(yōu)選為0.03mol/L。磷酸鹽緩沖液可以由磷酸二氫鉀、磷酸一氫鉀、磷酸二氫鈉和磷酸一氫鈉中的至少一種配制而成。

作為本發(fā)明的一種改進(jìn)的實(shí)施方式，氧化劑優(yōu)選為過(guò)氧化氫。過(guò)氧化氫是一種氧化性很強(qiáng)的氧化劑，可將無(wú)花果蛋白酶滅活，同時(shí)分解成氧氣和水，不會(huì)向膠原中引入其他離子。

作為本發(fā)明的一種進(jìn)一步改進(jìn)的實(shí)施方式，氧化劑的加入體積為磷酸鹽緩沖液的1‰-5‰。此加入量即可使無(wú)花果蛋白酶完全滅活。

作為本發(fā)明的另一種改進(jìn)的實(shí)施方式，基于所述鹽溶液的總質(zhì)量，所述鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％-30％。此濃度范圍，更有利于膠原從鹽溶液中析出，防止膠原發(fā)生水解而生成膠原蛋白。

作為本發(fā)明的再一種改進(jìn)的實(shí)施方式，鹽溶液中的鹽選自氯化鈉、硫酸鈉、碳酸鈉中的至少一種。

對(duì)本發(fā)明提供的膠原生物膜進(jìn)行包裝滅菌。低溫環(huán)氧乙烷消毒滅菌具體：冷凍干燥的海綿按照要求的規(guī)格大小裁剪后雙層包裝，100％環(huán)氧乙烷滅菌處理；預(yù)真空為-50--60Kpa；滅菌濕度為55-74％RH；滅菌溫度為35-39℃；換氣次數(shù)為10次，滅菌時(shí)間3-9h，優(yōu)化的滅菌時(shí)間4-8h；滅菌結(jié)束后測(cè)定無(wú)菌和環(huán)氧乙烷殘留，確認(rèn)樣品無(wú)菌并且環(huán)氧乙烷殘留符合規(guī)定要求。

需要說(shuō)明的是，本發(fā)明所使用的水均為醫(yī)藥行業(yè)所用的純化水，滿足藥典標(biāo)準(zhǔn)。

試劑和儀器

試劑均市售可得。

實(shí)施例1-4提取膠原

實(shí)施例1

選取新鮮的牛跟腱組織1kg，水沖洗6次，75％酒精漂洗20min；用剪刀剔除筋膜和雜質(zhì)，水洗后，-20℃冷凍過(guò)夜；切片機(jī)切片至約1mm，備用；

稱取100g腱片，純化水沖洗5次；5L的純化水室溫浸泡5h；純化水沖洗5次，濾干水分備用；

清洗后的腱片(即切片的牛跟腱)浸泡在含有0.05％無(wú)花果蛋白酶的pH值為6的0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液中，在4℃下浸泡24小時(shí)后；向其中加入體積為磷酸鹽緩沖液體積的3‰的過(guò)氧化氫混勻后靜置4h滅活無(wú)花果蛋白酶，純化水沖洗；然后在4℃條件下，1M的氫氧化鈉的氯化鈉溶液中浸泡4天，靜置中間輕輕晃動(dòng)；滴加0.05mol/L的鹽酸，調(diào)整pH至6；過(guò)濾收集膠原沉淀；純化水沖洗膠原5次，4000轉(zhuǎn)/min離心20min，得到膠原樣品。

如圖2所示，十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)檢測(cè)膠原的分子量約為30萬(wàn)道爾頓。

實(shí)施例2

選取新鮮的牛跟腱組織1kg，水沖洗9次，45％酒精漂洗30min；用剪刀剔除筋膜和雜質(zhì)，水洗后，-20℃冷凍過(guò)夜；切片機(jī)切片至約2mm，備用；

稱取100g腱片，純化水沖洗5次；5L的純化水室溫浸泡3h；純化水沖洗5次，濾干水分備用；

清洗后的腱片(即切片的牛跟腱)浸泡在含有0.005％無(wú)花果蛋白酶的pH值為5的0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液中，在4℃下浸泡24小時(shí)后；向其中加入體積為磷酸鹽緩沖液體積的1‰的亞氯酸鈉混勻后靜置4h滅活無(wú)花果蛋白酶，純化水沖洗；然后在4℃條件下，1.5M的氫氧化鈉的氯化鈉溶液中浸泡4天，靜置中間輕輕晃動(dòng)；滴加0.05mol/L的鹽酸，調(diào)整pH至5；過(guò)濾收集膠原沉淀；純化水沖洗膠原9次，4000轉(zhuǎn)/min離心20min，得到膠原樣品。

十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)檢測(cè)膠原的分子量約為30萬(wàn)道爾頓。

實(shí)施例3

選取新鮮的牛跟腱組織1kg，水沖洗3次，20％酒精漂洗40min；用剪刀剔除筋膜和雜質(zhì)，水洗后，-20℃冷凍過(guò)夜；切片機(jī)切片至約3mm，備用；

稱取100g腱片，純化水沖洗5次；5L的純化水室溫浸泡3h；純化水沖洗5次，濾干水分備用；

清洗后的腱片(即切片的牛跟腱)浸泡在含有0.1％無(wú)花果蛋白酶的pH值為5的0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液中，在15℃下浸泡24小時(shí)后；向其中加入體積為磷酸鹽緩沖液體積的4‰的過(guò)氧化氫混勻后靜置5h滅活無(wú)花果蛋白酶，純化水沖洗；然后在15℃條件下，1.5M的氫氧化鈉的氯化鈉溶液中浸泡4天，靜置中間輕輕晃動(dòng)；滴加0.05mol/L的硫酸，調(diào)整pH至4；過(guò)濾收集膠原沉淀；純化水沖洗膠原10次，4000轉(zhuǎn)/min離心20min，得到膠原樣品。

十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)檢測(cè)膠原的分子量約為30萬(wàn)道爾頓。

實(shí)施例4

選取新鮮的牛跟腱組織1kg，水沖洗3次，65％酒精漂洗25min；用剪刀剔除筋膜和雜質(zhì)，水洗后，-20℃冷凍過(guò)夜；切片機(jī)切片至約3mm，備用；

稱取100g腱片，純化水沖洗5次；5L的純化水室溫浸泡3h；純化水沖洗5次，濾干水分備用；

清洗后的腱片(即切片的牛跟腱)浸泡在含有0.2％無(wú)花果蛋白酶的pH值為7的0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液中，在10℃下浸泡24小時(shí)后；向其中加入體積為磷酸鹽緩沖液體積的5‰的過(guò)氧化氫混勻后靜置5h滅活無(wú)花果蛋白酶，純化水沖洗；然后在10℃條件下，2M的氫氧化鈉的氯化鈉溶液中浸泡4天，靜置中間輕輕晃動(dòng)；滴加0.05mol/L的硫酸，調(diào)整pH至7；過(guò)濾收集膠原沉淀；純化水沖洗膠原8次，4000轉(zhuǎn)/min離心20min，得到膠原樣品。

十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)檢測(cè)膠原的分子量約為30萬(wàn)道爾頓。

實(shí)施例5膠原的結(jié)構(gòu)檢測(cè)

圖3為實(shí)施例1提取的膠原樣品的紅外光譜圖。從圖3可知，1653.9cm^-1為酰胺I帶的C＝O伸縮振動(dòng)吸收峰，說(shuō)明樣品中都存在形成三股螺旋內(nèi)氫鍵的C＝O；1552.6cm^-1為酰胺II帶的N-H彎曲振動(dòng)吸收峰；1239.1cm^-1為酰胺III帶的N-H變形峰；1239.1cm^-1～1452.2cm^-1范圍存在的吸收峰表明膠原三螺旋結(jié)構(gòu)的完整性；3422.8cm^-1為膠原的N-H伸縮振動(dòng)峰，說(shuō)明肽鏈間氫鍵的存在；1239.1cm^-1與1452.4cm^-1的吸收峰強(qiáng)度比值為1.02，非常接近膠原特征值1.0。由此可見(jiàn)，本發(fā)明所制備的膠原主要為Ⅰ型膠原，Ⅰ型膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu)是保持較完整的。本發(fā)明提供的一種從牛跟腱中提取膠原的方法可保持膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu)的完整。

實(shí)施例6膠原的純度檢測(cè)

圖4為實(shí)施例1提取的I型膠原樣品的紫外吸收光譜圖。從圖4中可以看出，純化得樣品在波長(zhǎng)217nm處有紫外光譜最大吸收峰值，峰面積為0.375。

由上述實(shí)施例可知，膠原三股螺旋結(jié)構(gòu)完整性好，純度高，并且膠原的提取方法簡(jiǎn)單，無(wú)需高端設(shè)備，提取成本低。

實(shí)施例7至實(shí)施例11膠原生物膜的制備

實(shí)施例7

將膠原加入到水中，并滴加0.01M(mol/L)乳酸溶液，調(diào)節(jié)pH為3.0，乳化泵6000rpm，高速混勻5min，制成漿液，膠原在漿液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3％；40目不銹鋼濾布過(guò)濾兩次，去除不溶的物質(zhì)；緩慢滴加低濃度(0.5M)的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)液體的pH至5.5；過(guò)濾并真空脫泡，將制備好的漿液倒入托盤，在真空度為120毫托的條件下，10℃保持40min，-45℃保持150min，0℃保持20h，20℃保持5h進(jìn)行冷凍干燥，得到膠原海綿。

用化學(xué)方法交聯(lián)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的甲醛溶液所揮發(fā)的甲醛中保持4h，得到成品，即膠原生物膜。

實(shí)施例8

將膠原加入到水中，并滴加0.03M(mol/L)乳酸溶液，調(diào)節(jié)pH為3.0，乳化泵8000rpm，高速混勻5min，制成漿液，膠原在漿液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5％；40目不銹鋼濾布過(guò)濾兩次，去除不溶的物質(zhì)；緩慢滴加低濃度(0.5M)的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)液體的pH至6；過(guò)濾并真空脫泡，將制備好的漿液倒入托盤在真空度為120毫托的條件下，10℃保持40min，-35℃保持120min，0℃保持22h，25℃保持9h進(jìn)行冷凍干燥，得到膠原海綿。

用化學(xué)方法交聯(lián)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的甲醛溶液所揮發(fā)的甲醛中保持5h，得到成品。

實(shí)施例9

將膠原加入到水中，并滴加0.05M(mol/L)乳酸溶液，調(diào)節(jié)pH為3.8，乳化泵8000rpm高速混勻5min，制成漿液，膠原在漿液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0％；40目不銹鋼濾布過(guò)濾兩次，去除不溶的物質(zhì)；緩慢滴加低濃度(0.5M)的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)液體的pH至6.5；過(guò)濾并真空脫泡，將制備好的漿液倒入托盤，在真空度為220毫托的條件下，6℃保持40min，-38℃保持180min，0℃保持24h，24℃保持7h進(jìn)行冷凍干燥，得到膠原海綿。

用化學(xué)方法交聯(lián)，氣體交聯(lián)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的甲醛溶液揮發(fā)的甲醛氣體中保持5h，得到成品(如圖1所示)。

實(shí)施例10

將膠原加入到水中，并滴加0.03M(mol/L)鹽酸溶液，調(diào)節(jié)pH為3.0，乳化泵8000rpm，高速混勻5min，制成漿液，膠原在漿液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5％；40目不銹鋼濾布過(guò)濾兩次，去除不溶的物質(zhì)；緩慢滴加低濃度(0.5M)的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)液體的pH至5.8；過(guò)濾并真空脫泡，將制備好的漿液倒入托盤，在真空度為150毫托的條件下，10℃保持40min，-45℃保持150min，0℃保持20h，20℃保持5h進(jìn)行冷凍干燥，得到膠原海綿。

用物理方法交聯(lián)，120℃，真空48h，得到成品。

實(shí)施例11

將膠原加入到水中，并滴加0.05M(mol/L)乳酸溶液，調(diào)節(jié)pH為2.8，乳化泵8000rpm，高速混勻5min，制成漿液，膠原在漿液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0％；40目不銹鋼濾布過(guò)濾兩次，去除不溶的物質(zhì)；緩慢滴加低濃度(0.5M)的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)液體的pH至6.2；過(guò)濾并真空脫泡，將制備好的漿液倒入托盤冷凍，在真空度為150毫托的條件下，10℃保持40min，-45℃保持150min，0℃保持24h，25℃保持8h進(jìn)行干燥得到膠原海綿。

用物理方法交聯(lián)，100℃，真空72h，得到成品。

對(duì)實(shí)施例7至實(shí)施例11所制備的膠原生物膜進(jìn)行電鏡掃描檢測(cè)，結(jié)果如表1所示。

表1實(shí)施例7至11的膠原生物膜的電鏡掃描結(jié)果

由表1和圖1可知，膠原生物膜厚度約為0.2-0.9厘米，具有三維孔徑結(jié)構(gòu)，孔徑大小為60-300微米。

實(shí)施例12動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

將新西蘭兔分隨機(jī)分為a、b、c，3組，每組12只，于冠狀縫后，中線右側(cè)用電鉆磨1骨窗，暴露硬腦膜并人為造成硬腦膜缺損，a、b、c，三組中的4只兔應(yīng)用實(shí)施例9制備的膠原生物膜，4只兔應(yīng)用上市產(chǎn)品(integra，作為對(duì)照)進(jìn)行硬膜缺損修補(bǔ)，4只不予修補(bǔ)。a、b、c三組分別于術(shù)后30天、90天、180天處死。術(shù)前及處死前采集各組靜脈血lml進(jìn)行白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)。術(shù)后對(duì)動(dòng)物進(jìn)行臨床觀察至預(yù)定日期處死，然后擴(kuò)展開(kāi)窗，連同硬腦膜、修補(bǔ)材料和腦組織取下，進(jìn)行標(biāo)本大體觀察，并判斷修補(bǔ)材料內(nèi)表面與腦組織粘連程度。將標(biāo)本一部分固定于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的福爾馬林中1周，石蠟包埋，切片行蘇木素—伊紅染色，行組織學(xué)檢查，對(duì)比觀察植入材料局部細(xì)胞浸潤(rùn)情況觀察局部蛛網(wǎng)膜、硬膜下腔、及腦皮質(zhì)情況。

結(jié)論：臨床觀察各組動(dòng)物除未進(jìn)行修補(bǔ)的樣品外無(wú)腦脊液漏發(fā)生，未發(fā)現(xiàn)動(dòng)物出現(xiàn)術(shù)后并發(fā)癥，我們的產(chǎn)品與對(duì)照樣品有相似的修補(bǔ)性能。各組動(dòng)物術(shù)前、處死前的白細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)無(wú)顯著差異(P>0.05)。術(shù)后30天、90天180天兩種腦膜腦粘連差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組病理檢查移植物無(wú)變性、包裹、鈣化；各組動(dòng)物硬膜修補(bǔ)局部均可見(jiàn)不同程度硬膜下腔及蛛網(wǎng)膜病理改變，各組植入材料(膠原生物膜)局部炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)無(wú)顯著差異(P>0.05)。

以上所述僅是為了便于本領(lǐng)域的技術(shù)人員理解本發(fā)明的技術(shù)方案，并不用以限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。