本發(fā)明屬于醫(yī)用高分子材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種含絲素蛋白的復合多孔支架的制備方法。

背景技術(shù)：

關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復一直是臨床醫(yī)師面臨的難題，因為軟骨細胞幾乎無遷徙能力，不能迅速地聚到創(chuàng)傷部位。目前，采用組織工程多孔支架修復軟骨缺損已成為熱點，有文獻報道， 以聚乳酸(po lylactic acid, PLA) 為代表的聚酯類生物降解材料是目前組織工程研究中最常用的移植細胞的支架材料之一。但單純PLA支架存在很多缺點，如PLA的疏水特性，其生物及細胞的相容性在許多條件下都不能滿足組織工程支架材料的要求。近年來采用PLA與天然材料復合制備支架又成為新的熱點。國內(nèi)外的學者對PLA與天然材料復合支架進行了大量研究，比如采用骨髓間充質(zhì)干細胞復合消旋PLA/明膠修復兔膝關(guān)節(jié)全層軟骨缺損，修復組織細胞為透明軟骨樣細胞；采用PLA與殼聚糖復合制備多孔支架實驗證實其具有良好的生物相容性，可以作為細胞支架植入體內(nèi)；采用明膠/PLLA多孔海綿狀結(jié)構(gòu)作為修復材料，其生物活性降解時間、孔徑大小和材料硬度均較之單純PLA支架更符合軟骨細胞的生長要求。

隨著組織工程研究的深入，對于天然材料的研究也逐漸深入，蠶絲經(jīng)過脫膠制得的絲素蛋白具有無毒、無刺激、良好的生物相容性等優(yōu)點，在生物醫(yī)學領(lǐng)域有著廣闊的應用前景。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

解決的技術(shù)問題：本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種含絲素蛋白的復合多孔支架的制備方法，所得復合多孔支架具有優(yōu)良的生物相容性，可以作為支架材料植入體內(nèi)。

技術(shù)方案：一種含絲素蛋白的復合多孔支架的制備方法，包括以下步驟：

步驟1，取蠶蛹，洗凈、烘干，破碎成粉末；

步驟2，將步驟1所得粉末加至1.5-2倍重量的水中，高壓蒸煮，放冷，得到蒸煮液；

步驟3，在蒸煮液中加入3-5wt.%纖維素酶，調(diào)節(jié)pH至4-5，進行酶解反應，得到酶解液；

步驟4，將酶解液過濾，濾液中加入5-7倍體積的30-40wt.%氯化鈣溶液，置于沸水浴加熱攪拌，冷卻后經(jīng)透析得到絲素蛋白水溶液；

步驟5，將絲素蛋白水溶液濃縮至原體積的15-20%，加入20-30wt.%聚乳酸、3-8wt.%殼聚糖、0.5-1.2wt.%卵磷脂、0.3-0.7wt.%檸檬酸鈉，分散后靜置，經(jīng)噴霧干燥后即得復合多孔支架。

進一步地，步驟1中粉末粒度在20-40目。

進一步地，步驟2中高壓蒸煮的壓力為0.15-0.25MPa、溫度為110-130℃、時間為20-30min。

進一步地，步驟3中采用10-20v/v%稀硫酸調(diào)節(jié)pH。

進一步地，步驟3中酶解反應的溫度為35-45℃、時間為3-5h。

進一步地，步驟5中分散條件為300-500rpm，靜置時間為12-24h。

有益效果： 本發(fā)明的復合多孔支架符合ISO-10993標準，具有優(yōu)良的生物相容性，可以作為支架材料植入體內(nèi)。

具體實施方式

實施例1

一種含絲素蛋白的復合多孔支架的制備方法，包括以下步驟：

步驟1，取蠶蛹，洗凈、烘干，破碎成粉末；

步驟2，將步驟1所得粉末加至1.5-2倍重量的水中，高壓蒸煮，放冷，得到蒸煮液；

步驟3，在蒸煮液中加入3wt.%纖維素酶，調(diào)節(jié)pH至4，進行酶解反應，得到酶解液；

步驟4，將酶解液過濾，濾液中加入5倍體積的40wt.%氯化鈣溶液，置于沸水浴加熱攪拌，冷卻后經(jīng)透析得到絲素蛋白水溶液；

步驟5，將絲素蛋白水溶液濃縮至原體積的15%，加入20wt.%聚乳酸、3wt.%殼聚糖、0.5wt.%卵磷脂、0.3wt.%檸檬酸鈉，分散后靜置，經(jīng)噴霧干燥后即得復合多孔支架。

其中，步驟1中粉末粒度在20目；步驟2中高壓蒸煮的壓力為0.15MPa、溫度為110℃、時間為30min；步驟3中采用10v/v%稀硫酸調(diào)節(jié)pH，酶解反應的溫度為35℃、時間為5h；步驟5中分散條件為300rpm，靜置時間為24h。

實施例2

一種含絲素蛋白的復合多孔支架的制備方法，包括以下步驟：

步驟1，取蠶蛹，洗凈、烘干，破碎成粉末；

步驟2，將步驟1所得粉末加至1.5-2倍重量的水中，高壓蒸煮，放冷，得到蒸煮液；

步驟3，在蒸煮液中加入4wt.%纖維素酶，調(diào)節(jié)pH至4，進行酶解反應，得到酶解液；

步驟4，將酶解液過濾，濾液中加入6倍體積的30wt.%氯化鈣溶液，置于沸水浴加熱攪拌，冷卻后經(jīng)透析得到絲素蛋白水溶液；

步驟5，將絲素蛋白水溶液濃縮至原體積的18%，加入25wt.%聚乳酸、4wt.%殼聚糖、0.8wt.%卵磷脂、0.5wt.%檸檬酸鈉，分散后靜置，經(jīng)噴霧干燥后即得復合多孔支架。

其中，步驟1中粉末粒度在40目；步驟2中高壓蒸煮的壓力為0.18MPa、溫度為120℃、時間為30min；步驟3中采用15v/v%稀硫酸調(diào)節(jié)pH，酶解反應的溫度為40℃、時間為4h；步驟5中分散條件為400rpm，靜置時間為15h。

實施例3

一種含絲素蛋白的復合多孔支架的制備方法，包括以下步驟：

步驟1，取蠶蛹，洗凈、烘干，破碎成粉末；

步驟2，將步驟1所得粉末加至1.5-2倍重量的水中，高壓蒸煮，放冷，得到蒸煮液；

步驟3，在蒸煮液中加入3wt.%纖維素酶，調(diào)節(jié)pH至5，進行酶解反應，得到酶解液；

步驟4，將酶解液過濾，濾液中加入6倍體積的35wt.%氯化鈣溶液，置于沸水浴加熱攪拌，冷卻后經(jīng)透析得到絲素蛋白水溶液；

步驟5，將絲素蛋白水溶液濃縮至原體積的17%，加入22wt.%聚乳酸、7wt.%殼聚糖、0.9wt.%卵磷脂、0.4wt.%檸檬酸鈉，分散后靜置，經(jīng)噴霧干燥后即得復合多孔支架。

其中，步驟1中粉末粒度在20目；步驟2中高壓蒸煮的壓力為0.15MPa、溫度為125℃、時間為20min；步驟3中采用15v/v%稀硫酸調(diào)節(jié)pH，酶解反應的溫度為40℃、時間為3h；步驟5中分散條件為400rpm，靜置時間為15h。

實施例4

一種含絲素蛋白的復合多孔支架的制備方法，包括以下步驟：

步驟1，取蠶蛹，洗凈、烘干，破碎成粉末；

步驟2，將步驟1所得粉末加至1.5-2倍重量的水中，高壓蒸煮，放冷，得到蒸煮液；

步驟3，在蒸煮液中加入5wt.%纖維素酶，調(diào)節(jié)pH至5，進行酶解反應，得到酶解液；

步驟4，將酶解液過濾，濾液中加入7倍體積的30wt.%氯化鈣溶液，置于沸水浴加熱攪拌，冷卻后經(jīng)透析得到絲素蛋白水溶液；

步驟5，將絲素蛋白水溶液濃縮至原體積的20%，加入30wt.%聚乳酸、8wt.%殼聚糖、1.2wt.%卵磷脂、0.7wt.%檸檬酸鈉，分散后靜置，經(jīng)噴霧干燥后即得復合多孔支架。

其中，步驟1中粉末粒度在40目；步驟2中高壓蒸煮的壓力為0.25MPa、溫度為130℃、時間為20min；步驟3中采用20v/v%稀硫酸調(diào)節(jié)pH，酶解反應的溫度為45℃、時間為3h；步驟5中分散條件為500rpm，靜置時間為12h。

將實施例1至4所得復合多孔支架按ISO-10993標準分別進行溶血實驗、動態(tài)凝血時間實驗、細胞毒性實驗、刺激實驗和熱原實驗。

刺激實驗顯示所得復合多孔支架均未引起動物皮膚明顯刺激，符合標準；

熱原實驗顯示所得復合多孔支架引起動物體溫升高均<0.2℃，并且體溫升高總度數(shù)<1.0℃；

溶血實驗顯示所得復合多孔支架的溶血率均<5% (P =0.000)；

動態(tài)凝血時間實驗顯示所得復合多孔支架動態(tài)凝血時間在35min-40min；

細胞毒性實驗表明，細胞能在所得復合多孔支架表面很好地生長，符合標準。