本發(fā)明屬于生化制藥領(lǐng)域，具體涉及一種源自苦瓜的天然降糖藥物，特別涉及苦瓜多組分提取物的復(fù)合制劑。
背景技術(shù)：
糖尿病是一種慢性病，難以根治并引發(fā)多種并發(fā)癥，例如臨床上常見的糖尿病并發(fā)腎病、糖尿病并發(fā)心臟病、非創(chuàng)傷性下肢切除、以及失明等。糖尿病分為I型和II型，其中II型糖尿病最常見，一般認(rèn)為II型糖尿病是由于機(jī)體不能產(chǎn)生足夠量的胰島素或者對(duì)胰島素的敏感度降低導(dǎo)致的新陳代謝疾病。除了注射胰島素外，目前已經(jīng)有幾種臨床上用于治療胰島素的藥物，例如雙胍類、葡萄糖苷酶抑制劑類、磺脲類等，然而上述藥物都具有一定的缺陷，長(zhǎng)期服用副作用明顯或產(chǎn)生抗藥性。
苦瓜(Momordica charantia L.)為葫蘆科苦瓜屬植物，現(xiàn)代藥理研究結(jié)果表明，苦瓜具有降血糖、抗腫瘤、抗病毒、抗菌、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性，其中降血糖活性最為顯著?？喙显诓溉閯?dòng)物模型和人體中的降血糖活性已經(jīng)得到證實(shí)，但其中的降血糖成分及作用機(jī)理還不完全清楚。關(guān)于苦瓜在降血糖中的用途，目前主要是以苦瓜為原料，利用水提、醇提等方法制備含有降血糖活性的提取物，也有一些研究利用苦瓜酶解物制備膳食纖維用于調(diào)節(jié)血糖。然而按照通常的研究方法從苦瓜中提取、純化降糖活性成分時(shí)，往往發(fā)現(xiàn)相對(duì)單一的提取物或純的成分喪失了降糖功能。例如，目前從苦瓜中成功分離純化的活性成分——苦瓜苷雖有清熱、解毒、利尿的功效，但降血糖的效果并不穩(wěn)定。
苦瓜膳食纖維對(duì)糖尿病有一定的治療作用，現(xiàn)有技術(shù)膳食纖維的提取通常是化學(xué)法和兩步酶解法?；瘜W(xué)法不可避免的導(dǎo)致提取的膳食纖維殘留有化學(xué)藥物，帶來(lái)潛在的食品安全隱患；兩步酶解法步驟復(fù)雜，成本高，提取效率不高，目前兩步酶法提取膳食纖維主要使用木瓜蛋白酶及淀粉酶，特別是對(duì)于具有降糖活性的可溶性膳食纖維提取率通常僅在10％左右。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明針對(duì)苦瓜單組分提取物降糖效果不佳的技術(shù)問(wèn)題，將現(xiàn)代藥材活性成分提取技術(shù)和傳統(tǒng)中藥復(fù)配原則相結(jié)合，一方面，根據(jù)基于目前已有的研究和不同的提取方法，優(yōu)化提取條件，提取苦瓜中不同的降血糖活性組分。另一方面，根據(jù)苦瓜中各種降糖活性組分的天然含量，對(duì)提取的降糖活性組分進(jìn)行復(fù)配，使復(fù)配后的復(fù)合制劑最大程度的接近各組分在苦瓜中的天然比例。本發(fā)明以苦瓜中各降糖組分的天然含量為配比依據(jù)，從而使各活性成分達(dá)到協(xié)同降糖的作用。蝸牛酶是一種從蝸牛內(nèi)臟中提取的一種復(fù)合酶系，本發(fā)明將蝸牛酶用于處理苦瓜渣生產(chǎn)膳食纖維，提高了可溶性膳食纖維的產(chǎn)量。
一方面，本發(fā)明提供一種苦瓜降糖提取物復(fù)合制劑，降糖活性成分包括活性肽提取物、耐熱活性提取物、可溶性膳食纖維提取物，其特征在于所述復(fù)合制劑中活性肽提取物、耐熱活性提取物和可溶性膳食纖維提取物三者的比例與苦瓜中三種組分的天然含量一致。
本發(fā)明所述苦瓜降糖提取物復(fù)合制劑，其中活性肽提取物：耐熱活性提取物：可溶性膳食纖維提取物按干物質(zhì)含量計(jì)為1∶5-10∶500-1000。
本發(fā)明所述的苦瓜降糖提取物復(fù)合制劑，其中所述活性肽提取物的制備方法包括：取新鮮苦瓜，洗凈，加入5-10倍生理鹽水4℃勻漿，勻漿液15000×g離心30min，上清液依次經(jīng)過(guò)4層紗布過(guò)濾、watman濾紙、0.22μm濾膜三級(jí)過(guò)濾，0.22μm過(guò)濾的濾液過(guò)10kDa的截留膜，取分子量小于10kDa的級(jí)分濃縮，得活性肽。
本發(fā)明所述的苦瓜降糖提取物復(fù)合制劑，其中耐熱活性提取物的制備方法包括：將水浸提法制備苦瓜活性肽產(chǎn)生的沉淀和濾渣合并用5-10倍體積50-90％的乙醇加熱回流提取3次，每次提取時(shí)間為0.5-4小時(shí)，過(guò)濾取上清，合并上清液，減壓濃縮，得耐熱活性提取物。
本發(fā)明所述的苦瓜降糖提取物復(fù)合制劑，其中可溶性膳食纖維提取物的制備方法包括：將經(jīng)過(guò)水提取、醇提取后產(chǎn)生的苦瓜渣烘干，加入pH4-6.5的醋酸緩沖溶液中，然后加入0.4-1％重量份的蝸牛酶37℃恒溫水浴酶解1-3h，酶解完成后加熱至100℃滅酶5min，抽濾取濾液，向?yàn)V液中加入2-5倍體積的無(wú)水乙醇、攪拌均勻、靜置過(guò)夜，離心取沉淀，得可溶性苦瓜膳食纖維。
第二方面，本發(fā)明提供所述苦瓜降糖提取物復(fù)合制劑在制備治療糖尿病藥物中的應(yīng)用，例如，所述苦瓜降糖提取物復(fù)合制劑在制備降低空腹血糖藥物中的應(yīng)用、所述苦瓜降糖提取物復(fù)合制劑在制備提高糖耐量藥物中的應(yīng)用。
第三方面，本發(fā)明提供一種綜合利用苦瓜生產(chǎn)降糖復(fù)合提取物的方法，特征在于包括以下步驟：
(1)取新鮮苦瓜，洗凈，加入5-10倍生理鹽水4℃勻漿，勻漿液15000×g離心30min，上清液依次經(jīng)過(guò)4層紗布過(guò)濾、watman濾紙、0.22μm濾膜三級(jí)過(guò)濾，將離心沉淀與濾渣合并，0.22μm過(guò)濾的濾液過(guò)10kDa的截留膜，取分子量小于10kDa的級(jí)分濃縮，得活性肽；
(2)將步驟(1)中離心沉淀與過(guò)濾濾渣的混合物用5-10倍體積50-90％的乙醇加熱回流提取3次，每次提取時(shí)間為0.5-4小時(shí)，過(guò)濾取上清，合并上清液，減壓濃縮，得耐熱活性提取物；
(3)將步驟(2)中過(guò)濾后的苦瓜渣烘干，加入pH4-6.5的醋酸緩沖溶液中，然后加入0.2-1％(w/w)蝸牛酶酶解1-3h，酶解完成后加熱至100℃滅酶5min，抽濾取濾液，向?yàn)V液中加入2-5倍體積的無(wú)水乙醇、攪拌均勻、靜置過(guò)夜，離心取沉淀，得可溶性膳食纖維；
(4)將活性肽、耐熱活性提取物、可溶性膳食纖維按干物質(zhì)含量計(jì)以1∶5-10∶500-1000的量混合得苦瓜活性提取物。
本發(fā)明所述綜合利用苦瓜生產(chǎn)降糖復(fù)合提取物的方法，其特征在于步驟(3)中酶解條件為酶解溫度50℃，pH為5.5，料液比為1∶30，蝸牛酶添加量為0.4％，酶解時(shí)間為1.5h。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明取得了以下有益的技術(shù)效果：
1、提高了苦瓜的利用率，除了無(wú)藥理活性的植物纖維(包括木質(zhì)素、難以降解的纖維素)以外，對(duì)苦瓜中各種活性成分幾乎都進(jìn)行了充分利用。
2、根據(jù)苦瓜中各降糖組分的天然含量，將各組分進(jìn)行復(fù)配取得了降糖的協(xié)同作用。
3、現(xiàn)有技術(shù)中苦瓜可溶性膳食纖維的提取效率不高，通常低于原料干重的10％，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)蝸牛酶能充分釋放苦瓜渣中可溶性膳食纖維，進(jìn)一步通過(guò)優(yōu)化提取條件，使苦瓜SDF提取率占原料干重13.5％，同時(shí)提高了SDF的品質(zhì)。
4、無(wú)需對(duì)提取物中的活性成分進(jìn)行成本高昂的提取和純化，工藝簡(jiǎn)單、對(duì)設(shè)備要求低、成本投入小、易產(chǎn)業(yè)化。
附圖說(shuō)明
圖1為苦瓜渣SDF溶解性曲線。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。
實(shí)施例1：苦瓜熱不穩(wěn)定活性成分的提取
將新鮮成熟的苦瓜果實(shí)洗凈，加入5-10倍生理鹽水4℃勻漿，勻漿液用鹽酸調(diào)pH值至1.5靜置30min，15000×g離心10min，上清液依次經(jīng)過(guò)4層紗布、watman濾紙、0.22μm濾膜三級(jí)過(guò)濾，經(jīng)過(guò)三級(jí)過(guò)濾后的濾液再過(guò)10kDa的截留膜，取分子量小于10kDa的級(jí)分，真空濃縮，得熱不穩(wěn)定活性提取物。將離心產(chǎn)生的沉淀和三級(jí)過(guò)濾產(chǎn)生的濾渣合并，備用。所述水浸提的熱不穩(wěn)定活性提取物中主要成分為苦瓜活性肽，也含有部分水溶性多糖或寡糖。
實(shí)施例2：耐熱活性組分的提取
將實(shí)施例1所述苦瓜水溶性熱不穩(wěn)定活性成分的提取工藝中產(chǎn)生的離心沉淀和過(guò)濾濾渣合并，第一次加入5倍濕重的90％乙醇，攪拌混勻，加熱回流提取2小時(shí)；第二次加入3倍濕重的90％乙醇，加熱回流提取1.5小時(shí)；第三次加入2倍濕重的90％乙醇，加熱回流提取1小時(shí)。將乙醇提取液過(guò)濾取上清，合并上清液，減壓濃縮，得耐熱活性提取物。收集乙醇提取液過(guò)濾產(chǎn)生的苦瓜渣備用。
實(shí)施例3：木瓜可溶性膳食纖維的提取
將經(jīng)過(guò)實(shí)施例1所述水提取、實(shí)施例2所述醇提取后產(chǎn)生的苦瓜渣烘干，按照料液比1∶30加入pH5.5的醋酸緩沖溶液中，然后加入苦瓜渣干重0.4％重量份的蝸牛酶50℃恒溫水浴酶解1.5小時(shí)，酶解完成后加熱至100℃滅酶5min，抽濾取濾液，向?yàn)V液中加入4倍體積的無(wú)水乙醇、攪拌均勻、靜置過(guò)夜，10000×g離心10min取沉淀，加適量的水復(fù)溶即得可溶性苦瓜膳食纖維。
實(shí)施例4：蝸牛酶提取SDF工藝的優(yōu)化
在蝸牛酶酶解單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步選取酶解溫度、料液比、蝸牛酶添加量和酶解時(shí)間四因素，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，以SDF提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)化蝸牛酶的酶解工藝。正交實(shí)驗(yàn)因素水平表如表1所示。
表1正交試驗(yàn)因素水平表
按照以下公式計(jì)算SDF提取率
SDF提取率/％＝得到的SDF的質(zhì)量(g)/果肉渣總質(zhì)量(g)×100
采用SPSS19.0軟件處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，多組間比較使用方差分析。
表2 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果
表3正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析
正交試驗(yàn)結(jié)果如表2、3所示，影響蝸牛酶法提取苦瓜渣中膳食纖維得率各因素主次順序?yàn)槊附鉁囟?、酶解時(shí)間、料液比和蝸牛酶添加量。因素A的P值＜0.01，且極差R值大于其他三因素，說(shuō)明酶解溫度對(duì)指標(biāo)影響最大。各主次指標(biāo)最高水平，組成較優(yōu)工藝條件為A1B2C1D2，即酶解溫度50℃、料液比1∶30，蝸牛酶添加量0.4％，酶解時(shí)間1.5h。
酶解溫度50℃、pH為5.5、料液比1∶30，蝸牛酶添加量0.4％，酶解時(shí)間1.5h時(shí)進(jìn)行3次平行試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，苦瓜渣膳食纖維得率為13.44％、13.56％和13.48％，平均得率為13.49％，因此確定酶解條件為酶解溫度50℃、pH為5.5、料液比1∶30，蝸牛酶添加量0.4％，酶解時(shí)間1.5h。
實(shí)施例5
蝸牛酶提取法獲得苦瓜SDF理化性質(zhì)
1.持水力測(cè)定
稱取4g樣品于50mL的離心管中，加入30mL蒸餾水，室溫?cái)嚧?0min，2500r/min離心10min，棄去上清液并用濾紙吸干離心管壁殘留水分，稱重，按以下公式計(jì)算持水力。
持水力/(g·g-1)＝(樣品濕重-樣品干重)/樣品干重
2.膨脹力測(cè)定
準(zhǔn)確稱取0.3g樣品，置于10mL量筒中，移液管準(zhǔn)確移取5.00mL蒸餾水加入其中。振蕩均勻后室溫(203℃)放置24h，讀取液體中膳食纖維的體積，按以下公式計(jì)算持水力。
膨脹力/(mL·g-1)＝[(膨脹后的體積(mL)-干品體積(mL)]/樣品干重(g)
3.黏度的測(cè)定
稱取適量的樣品，加入蒸餾水，配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)10％的溶液，用黏度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。
表4 SDF持水力、膨脹力和粘度測(cè)定結(jié)果
注：★與苦瓜原渣相比P＜0.05；★★與苦瓜原渣相比，P＜0.01
苦瓜原渣和SDF持水力、膨脹力和粘度測(cè)定結(jié)果如表4所示，SDF持水力和膨脹力較苦瓜原渣分別呈上升趨勢(shì)，黏度在27℃、溶液濃度為10％的條件下呈下降趨勢(shì)，由此可得知蝸牛酶可以增加膳食纖維持水力和膨脹力，降低膳食纖維溶液的表觀黏度。
4.溶解性測(cè)定
準(zhǔn)確稱取2.5g樣品，加入50mL蒸餾水，用磁力攪拌器分散均勻轉(zhuǎn)入250mL容量瓶并定容，將容量瓶置于恒溫水溶鍋中保溫20min，趁熱抽濾，準(zhǔn)確移取50mL濾液于恒重的100mL燒杯中，60℃下干燥5h后，再于105℃干燥至恒重得m2，計(jì)算得樣品的溶解度。
圖1表明，常溫下SDF的溶解度較高，可達(dá)65.5％，隨著溫度升高，溶解度不斷增大，其中在70℃之前，曲線上升趨勢(shì)明顯，當(dāng)升高至70℃后，曲線上升趨勢(shì)緩慢，溶解性基本保持在97％左右穩(wěn)定不變，提示由蝸牛酶提取苦瓜渣得到的SDF溶解性好，適于制藥。
實(shí)施例6
小鼠造模、分組和給藥
選取健康昆明種小鼠80只，雌雄各半，適應(yīng)性飼養(yǎng)5d后腹腔注射四氧嘧啶160mg/kg給藥7d后禁食3～5h，眼眶取血測(cè)血糖值，選取50只血糖值10～25mmol/L小鼠為病理模型。將50只糖尿病小鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組、陽(yáng)性藥物對(duì)照組、活性肽提取物組、耐熱組分的提取物組、膳食纖維提取物組、以及提取物復(fù)配組。實(shí)驗(yàn)期間給予各組小鼠普通飼料喂養(yǎng)，陽(yáng)性藥物對(duì)照組每天灌胃吡格列酮8mg/kg(以片重計(jì))，活性肽提取物組每天給藥10mg/kg體重，耐熱組分的提取物組每天給藥50mg/kg體重，膳食纖維組每天給藥1g/kg體重；復(fù)配組每天給藥2mg/kg體重的活性肽提取物+10mg/kg體重的耐熱組分提取物+500mg/kg體重的SDF。連續(xù)4周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)禁食12h，測(cè)定小鼠空腹血糖值。測(cè)定空腹血糖后經(jīng)口灌胃2.0g/kg葡萄糖，分別測(cè)定小鼠服糖后0、0.5、2h的血糖值。曲線下面積計(jì)算法：S(mol/L)＝1/4(A+4B+3C)(A、B、C分別為給藥后0、0.5、2.0h的血糖值)血糖曲線下面積越大，表面小鼠糖耐量越高。
表5對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病小鼠空腹血糖的影響
注：★與模型組相比P＜0.05；★★與模型組相比，P＜0.01；#與陽(yáng)性藥物對(duì)照物組相比，P＜0.05；##與陽(yáng)性藥物對(duì)照物組相比，P＜0.01。
表6對(duì)糖尿病小鼠糖耐量的影響
注：★與模型組相比P＜0.05；★★與模型組相比，P＜0.01；#與陽(yáng)性藥物對(duì)照物組相比，P＜0.05；##與陽(yáng)性藥物對(duì)照物組相比，P＜0.01。
表5、6的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，活性肽、耐熱成分、SDF單一提取物對(duì)于降低糖尿病小鼠空腹血糖、提高糖耐量均有一定的應(yīng)用潛力，而復(fù)配組在大幅度降低三種提取物用藥量的情況下，卻顯著的提高了降低空腹血糖、提高糖耐量的效果。說(shuō)明三種提取物按照上述比例復(fù)配對(duì)于降低空腹血糖、提高糖耐量取得了協(xié)同作用。
上述說(shuō)明并非對(duì)本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不限于上述舉例。本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍內(nèi)，作出的變化、改型、添加或替換，也應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書為準(zhǔn)。