本發(fā)明涉及中醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種清下瀉胰方劑。

背景技術(shù)：

中醫(yī)學(xué)根據(jù)主癥，將胰腺癌歸屬于“伏梁”、“痞塊”、“黃疸”、“積聚”的范疇。胰頭癌者，以黃疸為主要表現(xiàn)，癥見：身目黃染，食少腹脹，或脅肋疼痛，小便黃赤，大便干結(jié)，舌紅苔黃膩，脈弦滑或滑數(shù)?！端貑?wèn)?通評(píng)虛實(shí)論》曰：“消癉仆擊，偏枯痿厥，氣滿發(fā)逆，甘肥貴人，則高粱之疾也”，可見飲食不節(jié)導(dǎo)致脾胃損傷，運(yùn)化失常，濕熱阻滯；外加七情不節(jié)，情感抑郁不舒，臟腑功能失調(diào)，影響肝之氣機(jī)升降，常為本病病因。《素問(wèn)?玉機(jī)真臟論》曰：“肝傳之脾，病名曰脾風(fēng)，發(fā)癉，腹中熱，煩心，出黃。”故本病位居中焦，其發(fā)生與肝脾二臟功能失調(diào)密切相關(guān)。其病機(jī)為肝主疏泄，調(diào)暢氣機(jī)，協(xié)調(diào)脾胃升降，脾為后天之本，使氣血生化有源，肝體得養(yǎng)。反之，肝脾不調(diào)，則肝氣郁結(jié)，氣機(jī)不暢，故見脘腹不適、脹滿；脾虛生濕，濕郁化熱，膽熱液泄，與胃之濁氣共并，上不得越，下不得泄，熏蒸遏郁，則發(fā)為黃疸，小便赤黃；肝氣犯脾，脾氣虛弱，故見食少；證屬濕熱毒盛型。

隨著生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展，胰腺癌相關(guān)的機(jī)制研究、治療策略層出不窮，然從而從預(yù)防、診斷、治療到預(yù)后效果均不理想。中藥通過(guò)其獨(dú)特的配伍與現(xiàn)在醫(yī)學(xué)相結(jié)合，從抑癌、抗血管、改變微環(huán)境、提高免疫力等多種途徑，提高患者生活質(zhì)量，延長(zhǎng)帶瘤生存時(shí)間。然而現(xiàn)階段，有很多治療胰頭癌的中藥，但大多數(shù)具有治療效果差、癥狀緩解率低，生存期短等特點(diǎn)。因此中藥抗胰腺癌，挑戰(zhàn)與機(jī)遇并存。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

要解決的技術(shù)問(wèn)題：本發(fā)明的目的是提供一種清下瀉胰方劑，在經(jīng)過(guò)對(duì)藥物組分的大量篩選、重組、嘗試， 又通過(guò)大量體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究后，提供一種更為有效的抗胰頭癌藥物，該藥疏肝利膽、清熱利濕，破積散結(jié)，可用于胰頭癌的治療。

技術(shù)方案：一種清下瀉胰方劑，由以下成分制備而成：柴胡15-30g、黃芩6-12g、枳實(shí)6-12g、生大黃6-12g、芒硝6-12g、茵陳15-20g 、半枝蓮20-45g、木香10-30g、芍藥9-20g、半夏10-20g、白術(shù)9-20g、鬼臼3-6g、生姜 6-12g。

進(jìn)一步優(yōu)選的，所述的一種清下瀉胰方劑，由以下成分制備而成：柴胡18g、黃芩9g、枳實(shí)9g 、生大黃6g、芒硝6g、茵陳18g、半枝蓮30g、木香15g、芍藥9g、半夏10g、白術(shù)9g、鬼臼5g、生姜10g。

上述清下瀉胰方劑的制備方法包括以下步驟：

步驟1：將上述藥材混合，浸泡過(guò)夜，加8倍重量的水煮沸30-35 min，倒出藥液，再加8倍重量的水煮沸20-25 min，倒出藥液，再加5倍重量的水煮沸20-25min，倒出藥液；

步驟2：將3次獲得的藥液合并，經(jīng)真空抽濾器過(guò)濾，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，在80℃水浴下濃縮成100-110ml的藥液；

步驟3：冷卻后，用70%乙醇進(jìn)行醇沉，混勻后密封，置于4℃冰箱內(nèi)冷藏48 h后取出濾液；

步驟4：加20 ml蒸餾水，置于水浴鍋中蒸發(fā)乙醇，濃縮成1.4-1.6 g/ml的藥液。

一種清下瀉胰方劑，可制備成口服液、 顆粒劑、片劑或膠囊劑。

根據(jù)中醫(yī)藥史料記載，本發(fā)明所選用的中藥材具有如下藥理活性和功能主治：

方中柴胡疏肝解郁，黃芩清熱燥濕、瀉火解毒，兩者合為君藥，既可調(diào)肝膽之氣機(jī)，又可清泄內(nèi)蘊(yùn)之濕熱，共除少陽(yáng)之邪；枳實(shí)破氣消積除痞，大黃、芒硝通里攻下，三者相配可瀉陽(yáng)明實(shí)結(jié)。茵陳、半枝蓮清熱利濕化濁，茵陳得大黃通腑瀉熱之助，大黃得茵陳通尿利濕，利膽退黃之力，使全身內(nèi)外濕熱、瘀熱從二便解出。木香疏肝理氣；同時(shí)白芍養(yǎng)肝陰，助柴、芩以清肝膽；濕邪得去肝陽(yáng)易扶，肝氣得扶濕邪易去。半夏和胃降逆；佐白術(shù)健脾。腫塊形成，必有毒邪蘊(yùn)結(jié)，非攻不可中病，當(dāng)以鬼臼以毒攻毒，破積散結(jié)，同時(shí)輔以生姜解鬼臼之毒，同時(shí)增其功效，諸藥配伍，起到了疏肝利膽、清熱利濕、破積散結(jié)等功效。

本發(fā)明所選用的中藥材同時(shí)具有現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究機(jī)制：

柴胡、黃芩：柴胡皂苷是柴胡的主要生物活性成份；而黃芩的有效成分主要為黃酮類化合物，其中包括黃芩苷、黃芩素、漢黃芩?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，柴胡皂苷對(duì)多種腫瘤均有抑制作用，以消化道腫瘤為著；其可通過(guò)干擾腫瘤細(xì)胞S期DNA合成及蛋白質(zhì)代謝、抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。分子機(jī)制主要與下調(diào)腫瘤細(xì)胞黏附分子，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并下調(diào)Bcl-2表達(dá)，增加p53和p21/WAFI蛋白的表達(dá)，提高Fas及其mFasL、sFasL兩個(gè)配體表達(dá)有關(guān)。亦有報(bào)道稱，黃芩苷、黃芩素、漢黃芩可通過(guò)自噬途徑抑制人肝癌細(xì)胞株增殖，具體機(jī)制尚不清楚。此外，柴胡和黃芩對(duì)機(jī)體特異性和非特異性免疫功能具有多環(huán)節(jié)的調(diào)節(jié)作用，可增加巨噬細(xì)胞表面受體活性，提高c-fos基因轉(zhuǎn)錄，從而使細(xì)胞因子生成增加，同時(shí)調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞增殖，促進(jìn)抗體分泌，增強(qiáng)體液免疫。兩者在機(jī)制上有一定的共同性，即可直接殺傷腫瘤細(xì)胞，由可通過(guò)調(diào)節(jié)免疫，改變腫瘤微環(huán)境，共同抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。

枳實(shí)、生大黃、芒硝、茵陳、芍藥：慢性胰腺炎是有多種原因所致的胰腺?gòu)浡曰蚓窒扌匝装Y，被認(rèn)為是胰腺癌的危險(xiǎn)因素，但其機(jī)制仍然不明確。在慢性胰腺炎過(guò)程中，由于受到損傷因子的刺激，上皮細(xì)胞通過(guò)NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子及細(xì)胞因子等促進(jìn)促炎因子的分泌，激活生存和促生長(zhǎng)信號(hào)通路。枳實(shí)、生大黃、芒硝為大承氣湯中的主要成分，而大承氣湯治療胰腺炎由來(lái)已久，有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。多項(xiàng)研究表明，枳實(shí)、生大黃、芒硝可通過(guò)抑制NF-κB活性，下調(diào)TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10等炎癥因子表達(dá)，減輕胰腺炎癥反應(yīng)。此外，加用茵陳則為茵陳承氣湯的主要成分，亦是通過(guò)NF-κB途徑加強(qiáng)對(duì)胰腺炎癥的抑制作用。芍藥的主要活性成分為苷類化合物，研究表明，芍藥總苷通過(guò)阻斷Toll樣受體信號(hào)通路，抑制狀細(xì)胞的功能，減輕免疫介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)；芍藥苷對(duì)巨噬細(xì)胞功能產(chǎn)生負(fù)調(diào)控，包括抑制T細(xì)胞中巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子的表達(dá)，下調(diào)巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子-細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶-環(huán)氧化酶信號(hào)，及脂多糖誘導(dǎo)的TNF-α和NO，以減緩慢性炎癥。

半枝蓮、木香：半枝蓮為民間抗癌要藥，在臨床上可治療消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等多種腫瘤。目前已經(jīng)從半枝蓮中分離出一些化合物，主要為生物堿和黃酮類。近來(lái)研究表明，半枝蓮含藥血清可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的表達(dá)；半枝蓮黃酮類通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞分泌VEGF、NO等促血管生成因子，抑制內(nèi)皮細(xì)胞小管樣結(jié)構(gòu)形成。木香中木香烴內(nèi)酯、川木香內(nèi)酯通過(guò)引起線粒體通透性轉(zhuǎn)換（MPT）、細(xì)胞色素C釋放或破壞線粒體膜電位而誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞 HL-60 凋亡；去氫木香內(nèi)酯有抑制 Rb 蛋白和癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，其通過(guò)抑制CDK2激酶活性和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)阻止癌細(xì)胞增殖，通過(guò)阻止 HL-60 細(xì)胞中 I-κBα 蛋白的降解和磷酸化來(lái)抑制 NF-κB活化，并通過(guò)增強(qiáng) caspase-8 和caspase-3 活性使 HL-60 癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

半夏、白術(shù)：半夏提取物對(duì)多種實(shí)體瘤均有一定抑制作用，其中多糖具有較強(qiáng)的內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)激活活性，增強(qiáng)其吞噬和分泌功能，抑制腫瘤發(fā)生和增殖。白術(shù)中的芹烷二烯酮、蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)醋亦有抗腫瘤作用。

鬼臼、生姜：鬼臼含鬼臼多糖和鬼臼毒素，均為其主要活性成分，鬼臼多糖有抗腫瘤，調(diào)節(jié)免疫等作用，可促進(jìn)免疫功能低下小鼠的淋巴細(xì)胞增殖；而鬼臼毒素可直接抑制裸鼠移植瘤模型中腫瘤的生長(zhǎng)；生姜中的姜酚能抑制細(xì)胞因子的合成和緩釋，抑制炎癥反應(yīng)相關(guān)基因的誘導(dǎo)，而其中有些基因能表達(dá)細(xì)胞因子、細(xì)胞趨化因子和環(huán)氧化酶-2，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抑制腫瘤作用；其機(jī)制可能與抑制PGE2、TNF- α的合成，減少促炎細(xì)胞因子IL-12、IL-1 β的產(chǎn)生相關(guān)。臨床發(fā)現(xiàn)，生姜與鬼臼同煎，可增強(qiáng)鬼臼破積散結(jié)之功效，增強(qiáng)抑瘤作用。

有益效果：本發(fā)明的清下瀉胰方劑能夠疏肝利膽、清熱利濕，破積散結(jié)，可用于胰頭癌的治療，可誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，一定程度上抑制胰頭原位移植瘤的生長(zhǎng)，可減輕晚期胰腺癌患者的癥狀，降低腫瘤指標(biāo)CA199，提高化療的有效率。

附圖說(shuō)明

圖1是清下瀉胰方劑對(duì)裸鼠胰頭癌原位移植瘤生長(zhǎng)的影響。**P<0.01，相對(duì)于對(duì)照組有顯著性差異。#P<0.05，相對(duì)于對(duì)比例1有顯著性差異。

圖2是清下瀉胰方劑抑制裸鼠胰頭癌原位移植瘤中的TAM的浸潤(rùn)。**P<0.01，相對(duì)于對(duì)照組有顯著性差異。

圖3是清下瀉胰方劑含藥血清抑制胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。*P<0.05，相對(duì)于對(duì)照組有顯著性差異。

圖4是清下瀉胰方劑含藥血清抑制胰腺癌細(xì)胞誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型分化。**P<0.01，相對(duì)于對(duì)照組有顯著性差異。

圖5是清下瀉胰方劑含藥血清對(duì)M2型巨噬細(xì)胞分泌IL-6、IL-8、TGF-β能力的影響。**P<0.01，相對(duì)于對(duì)照組有顯著性差異。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

臨床治療案例

一種清下瀉胰方劑，由以下成分制備而成：柴胡18g、黃芩9g、枳實(shí)9g 、生大黃6g、芒硝6g、茵陳18g、半枝蓮30g、木香15g、芍藥9g、半夏10g、白術(shù)9g、鬼臼5g、生姜10g。

上述清下瀉胰方劑的制備方法為：

將上述藥材混合，加水2000ml，自動(dòng)煎藥機(jī)煎取120ml各兩袋，每日早晚各服1袋。

收集老年胰腺腺導(dǎo)管腺癌患者30例，通過(guò)細(xì)胞病理學(xué)確診，年齡大于60歲，男性18例，女性12例，腫瘤部位：胰頭部，均為晚期無(wú)手術(shù)指征。首發(fā)癥狀為身目黃染，食少腹脹，或脅肋疼痛，小便黃赤，大便干結(jié)，舌紅苔黃膩，脈弦滑或滑數(shù)。證屬濕熱毒盛型。隨機(jī)分為2組，每組各15例，對(duì)照組吉西他濱單藥化療，治療組吉西他濱聯(lián)合中藥治療，化療療程為4周期，同步口服中藥，每2個(gè)周期CT評(píng)估患者腫瘤大小，CA199，黃疸指數(shù)，藥物毒副反應(yīng)（消化道反應(yīng)、神經(jīng)末梢反應(yīng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重反應(yīng)）。對(duì)照組治療有效率為35.2%，實(shí)驗(yàn)組為43.5%；治療組CA199下降幅度為38.9%，對(duì)照組為31.9%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在治療有效的患者中，治療組黃疸緩解率為40.7%，對(duì)照組為31.6%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組消化道、神經(jīng)末梢副反應(yīng)相仿，均未見嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)副反應(yīng)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜上所述，中藥聯(lián)合化療可減輕晚期胰腺癌患者的癥狀，降低腫瘤指標(biāo)CA199，提高化療的有效率，安全有效。

實(shí)施例2

一種清下瀉胰方劑，由以下成分制備而成：柴胡18g、黃芩9g、枳實(shí)9g 、生大黃6g、芒硝6g、茵陳18g、半枝蓮30g、木香15g、芍藥9g、半夏10g、白術(shù)9g、鬼臼5g、生姜10g。

上述清下瀉胰方劑的制備方法為：

步驟1：將上述藥材混合，浸泡過(guò)夜，加8倍重量的水煮沸30 min，倒出藥液，再加8倍重量的水煮沸20 min，倒出藥液，再加5倍重量的水煮沸20min，倒出藥液；

步驟2：將3次獲得的藥液合并，經(jīng)真空抽濾器過(guò)濾，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，在80℃水浴下濃縮成100ml的藥液；

步驟3：冷卻后，用70%乙醇進(jìn)行醇沉，混勻后密封，置于4℃冰箱內(nèi)冷藏48 h后取出濾液；

步驟4：加20 ml蒸餾水，置于水浴鍋中蒸發(fā)乙醇，濃縮成1.5 g/ml的藥液。

裸鼠胰腺原位移植瘤模型的建立

①將1×10⁷個(gè)胰腺癌細(xì)胞系PANC-1，重懸于DMEM培養(yǎng)液中，調(diào)整體積為100μL，細(xì)胞密度為1×10⁷/100μL，再與100μL Matrigel等體積混合，得到細(xì)胞懸液，至于冰上備用，

②采用胰島素注射器，將50μL細(xì)胞懸液注射入裸鼠胰頭部胰腺包膜下，即得裸鼠胰頭原位移植瘤模型。

驗(yàn)證清下瀉胰方劑對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響

按《中藥藥理研究方法學(xué)》人鼠等效劑量進(jìn)行劑量換算，按0.14 ml/10 g體重計(jì)算用量，進(jìn)行裸鼠灌胃，每日一次，共干預(yù)3周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，摘取移植瘤，測(cè)量腫瘤大小并稱重。

如圖1所示，實(shí)施例2可抑制裸鼠胰頭癌原位移植瘤的生長(zhǎng)，具有顯著的抑制腫瘤作用。

驗(yàn)證清下瀉胰方劑對(duì)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）浸潤(rùn)的影響

采用免疫組化，檢測(cè)腫瘤組織標(biāo)本中CD163（TAM表面標(biāo)志物）陽(yáng)性細(xì)胞的浸潤(rùn)程度。

如圖2所示，清下瀉胰方劑處理組，腫瘤中浸潤(rùn)的CD163陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目顯著減少，提示清下瀉胰方劑可抑制裸鼠胰頭癌原位移植瘤中的TAM的浸潤(rùn)。

實(shí)施例3

一種清下瀉胰方劑，由以下成分制備而成：柴胡30g、黃芩12g、枳實(shí)12g、生大黃12g、芒硝12g、茵陳20g 、半枝蓮45g、木香30g、芍藥20g、半夏20g、白術(shù)20g、鬼臼6g、生姜 12g。

上述清下瀉胰方劑的制備方法為：

步驟1：將上述藥材混合，浸泡過(guò)夜，加8倍重量的水煮沸35 min，倒出藥液，再加8倍重量的水煮沸25 min，倒出藥液，再加5倍重量的水煮沸25min，倒出藥液；

步驟2：將3次獲得的藥液合并，經(jīng)真空抽濾器過(guò)濾，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，在80℃水浴下濃縮成110ml的藥液；

步驟3：冷卻后，用70%乙醇進(jìn)行醇沉，混勻后密封，置于4℃冰箱內(nèi)冷藏48 h后取出濾液；

步驟4：加20 ml蒸餾水，置于水浴鍋中蒸發(fā)乙醇，濃縮成1.5 g/ml的藥液。

清下瀉胰方劑含藥血清的制備

①SD大鼠：雄性，體重250g±20g，清潔級(jí)。

②按《中藥藥理研究方法學(xué)》人鼠等效劑量進(jìn)行劑量換算，按0.14 ml/10 g體重計(jì)算用量，進(jìn)行裸鼠灌胃，每日2次，連續(xù)3天。第3天上午給藥1h后腹主動(dòng)脈取血。末次給藥前12h禁食不禁水。

③所采動(dòng)脈血室溫靜置3h后，3500r/min，10min離心，收集血清，將同組血清混合于同一離心管內(nèi)，56℃水浴鍋內(nèi)水浴30min以滅活，0.2um小濾器過(guò)濾。過(guò)濾后的血清分裝于1.5ml無(wú)菌離心管中，1ml/管，封口膜密封后標(biāo)記保存于-80℃冰箱。

④每只大鼠采血8ml，離心后所得血清為淡黃色澄清透明，分裝標(biāo)記為空白血清和清下瀉胰方劑含藥血清。

MTT法檢測(cè)清下瀉胰方劑含藥血清對(duì)胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

①取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胰腺癌細(xì)胞PANC-1，調(diào)整細(xì)胞密度接種96孔板，每孔接種細(xì)胞0.5×104個(gè)，12小時(shí)后加清下瀉胰方劑含藥血清進(jìn)行處理。

②處理24、48、72、96、120小時(shí)后，每孔加入5 mg/ml的MTT 50 μl，37℃孵育4小時(shí)。棄盡培養(yǎng)液，每孔加DMSO 800 μl震蕩至紫色結(jié)晶完全消失。用全自動(dòng)酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔的吸光度(A490)值，并繪制生長(zhǎng)曲線。

如圖3所示，清下瀉胰方劑含藥血清處理組，細(xì)胞生長(zhǎng)速度顯著低于對(duì)照組。

實(shí)施例4

一種清下瀉胰方劑，由以下成分制備而成：柴胡18g、黃芩9g、枳實(shí)9g 、生大黃6g、芒硝6g、茵陳18g、半枝蓮30g、木香15g、芍藥9g、半夏10g、白術(shù)9g、鬼臼5g、生姜10g。

上述清下瀉胰方劑的制備方法為：

步驟1：將上述藥材混合，浸泡過(guò)夜，加8倍重量的水煮沸30 min，倒出藥液，再加8倍重量的水煮沸20 min，倒出藥液，再加5倍重量的水煮沸20min，倒出藥液；

步驟2：將3次獲得的藥液合并，經(jīng)真空抽濾器過(guò)濾，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，在80℃水浴下濃縮成100ml的藥液；

步驟3：冷卻后，用70%乙醇進(jìn)行醇沉，混勻后密封，置于4℃冰箱內(nèi)冷藏48 h后取出濾液；

步驟4：加20 ml蒸餾水，置于水浴鍋中蒸發(fā)乙醇，濃縮成1.5 g/ml的藥液。

清下瀉胰方劑含藥血清的制備

①SD大鼠：雄性，體重250g±20g，清潔級(jí)。

②按《中藥藥理研究方法學(xué)》人鼠等效劑量進(jìn)行劑量換算，按0.14 ml/10 g體重計(jì)算用量，進(jìn)行裸鼠灌胃，每日2次，連續(xù)3天。第3天上午給藥1h后腹主動(dòng)脈取血。末次給藥前12h禁食不禁水。

③所采動(dòng)脈血室溫靜置3h后，3500r/min，10min離心，收集血清，將同組血清混合于同一離心管內(nèi)，56℃水浴鍋內(nèi)水浴30min以滅活，0.2um小濾器過(guò)濾。過(guò)濾后的血清分裝于1.5ml無(wú)菌離心管中，1ml/管，封口膜密封后標(biāo)記保存于-80℃冰箱。

④每只大鼠采血6ml，離心后所得血清為淡黃色澄清透明，分裝標(biāo)記為空白血清和清下瀉胰方劑含藥血清。

建立人巨噬細(xì)胞、人胰腺癌細(xì)胞共培養(yǎng)體系

①人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系U937接種于Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)（Corning公司）上室，并經(jīng)PMA誘導(dǎo)成M0型巨噬細(xì)胞（可進(jìn)一步分化為M1或M2型巨噬細(xì)胞）

②Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)下室接種胰腺癌細(xì)胞系PANC-1。

③共培養(yǎng)系統(tǒng)中加入清下瀉胰方劑含藥血清，對(duì)照組加入空白血清。共培養(yǎng)14天。期間更換培養(yǎng)液3次。

④實(shí)驗(yàn)完畢，消化上室中的巨噬細(xì)胞，經(jīng)多聚甲醛固定1h后，采用CD68（巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志）、CD163（M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志）、CD206（M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志）抗體標(biāo)記，于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)M2型巨噬細(xì)胞的比例。

如圖4所示，清下瀉胰方劑含藥血清處理組，巨噬細(xì)胞中CD163陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著減少，提示清下瀉胰方劑可抑制胰腺癌細(xì)胞誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型分化。

實(shí)施例5

一種清下瀉胰方劑，由以下成分制備而成：柴胡15g、黃芩6g、枳實(shí)6g、生大黃6g、芒硝6g、茵陳15g 、半枝蓮20g、木香10g、芍藥9g、半夏10g、白術(shù)9g、鬼臼3g、生姜 6g。

上述清下瀉胰方劑的制備方法為：

步驟1：將上述藥材混合，浸泡過(guò)夜，加8倍重量的水煮沸30 min，倒出藥液，再加8倍重量的水煮沸20 min，倒出藥液，再加5倍重量的水煮沸20min，倒出藥液；

步驟2：將3次獲得的藥液合并，經(jīng)真空抽濾器過(guò)濾，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，在80℃水浴下濃縮成100ml的藥液；

步驟3：冷卻后，用70%乙醇進(jìn)行醇沉，混勻后密封，置于4℃冰箱內(nèi)冷藏48 h后取出濾液；

步驟4：加20 ml蒸餾水，置于水浴鍋中蒸發(fā)乙醇，濃縮成1.5 g/ml的藥液。

清下瀉胰方劑含藥血清的制備

①SD大鼠：雄性，體重250g±20g，清潔級(jí)。

②按《中藥藥理研究方法學(xué)》人鼠等效劑量進(jìn)行劑量換算，按0.14 ml/10 g體重計(jì)算用量，進(jìn)行裸鼠灌胃，每日2次，連續(xù)3天。第3天上午給藥1h后腹主動(dòng)脈取血。末次給藥前12h禁食不禁水。

③所采動(dòng)脈血室溫靜置3h后，3500r/min，10min離心，收集血清，將同組血清混合于同一離心管內(nèi)，56℃水浴鍋內(nèi)水浴30min以滅活，0.2um小濾器過(guò)濾。過(guò)濾后的血清分裝于1.5ml無(wú)菌離心管中，1ml/管，封口膜密封后標(biāo)記保存于-80℃冰箱。

④每只大鼠采血6ml，離心后所得血清為淡黃色澄清透明，分裝標(biāo)記為空白血清和清下瀉胰方劑含藥血清。

制備M2型巨噬細(xì)胞

①人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系U937接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中。

②加MCSF誘導(dǎo)成M2型巨噬細(xì)胞。

清下瀉胰方劑含藥血清對(duì)M2型巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的影響

①M(fèi)2型巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中加入清下瀉胰方劑含藥血清

②ELISA檢測(cè)培養(yǎng)液中M2型巨噬細(xì)胞細(xì)胞分泌的促腫瘤細(xì)胞因子IL-6、IL-8、TGF-β分泌水平。

如圖5所示，清下瀉胰方劑含藥血清處理組，M2型巨噬細(xì)胞分泌的IL-6、IL-8、TGF-β顯著下降。

對(duì)比例1

一種清下瀉胰方劑，由以下成分制備而成：柴胡18g、黃芩9g、枳實(shí)9g 、生大黃6g、芒硝6g、茵陳18g、半枝蓮30g、木香15g、芍藥9g、半夏10g、白術(shù)9g。

上述清下瀉胰方劑的制備方法為：

步驟1：將上述藥材混合，浸泡過(guò)夜，加8倍重量的水煮沸30 min，倒出藥液，再加8倍重量的水煮沸20 min，倒出藥液，再加5倍重量的水煮沸20min，倒出藥液；

步驟2：將3次獲得的藥液合并，經(jīng)真空抽濾器過(guò)濾，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，在80℃水浴下濃縮成100ml的藥液；

步驟3：冷卻后，用70%乙醇進(jìn)行醇沉，混勻后密封，置于4℃冰箱內(nèi)冷藏48 h后取出濾液；

步驟4：加20 ml蒸餾水，置于水浴鍋中蒸發(fā)乙醇，濃縮成1.5 g/ml的藥液。

裸鼠胰腺原位移植瘤模型的建立

①將1×10⁷個(gè)胰腺癌細(xì)胞系PANC-1，重懸于DMEM培養(yǎng)液中，調(diào)整體積為100μL，細(xì)胞密度為1×10⁷/100μL，再與100μL Matrigel等體積混合，得到細(xì)胞懸液，至于冰上備用，

②采用胰島素注射器，將50μL細(xì)胞懸液注射入裸鼠胰頭部胰腺包膜下，即得裸鼠胰頭原位移植瘤模型。

驗(yàn)證清下瀉胰方劑對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響

按《中藥藥理研究方法學(xué)》人鼠等效劑量進(jìn)行劑量換算，按0.14 ml/10 g體重計(jì)算用量，進(jìn)行裸鼠灌胃，每日一次，共干預(yù)3周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，摘取移植瘤，測(cè)量腫瘤大小并稱重。

如圖1所示，對(duì)比例1可抑制裸鼠胰頭癌原位移植瘤的生長(zhǎng)，但效果較實(shí)施例2差，說(shuō)明清下瀉胰方劑中加入藥鬼臼和生姜可顯著提高方劑的抗腫瘤作用。

對(duì)比例2

一種清下瀉胰方劑，由以下成分制備而成：鬼臼5g、生姜10g。

上述清下瀉胰方劑的制備方法為：

步驟1：將上述藥材混合，浸泡過(guò)夜，加8倍重量的水煮沸30 min，倒出藥液，再加8倍重量的水煮沸20 min，倒出藥液，再加5倍重量的水煮沸20min，倒出藥液；

步驟2：將3次獲得的藥液合并，經(jīng)真空抽濾器過(guò)濾，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，在80℃水浴下濃縮成100ml的藥液；

步驟3：冷卻后，用70%乙醇進(jìn)行醇沉，混勻后密封，置于4℃冰箱內(nèi)冷藏48 h后取出濾液；

步驟4：加20 ml蒸餾水，置于水浴鍋中蒸發(fā)乙醇，濃縮成1.5 g/ml的藥液。

裸鼠胰腺原位移植瘤模型的建立

①將1×10⁷個(gè)胰腺癌細(xì)胞系PANC-1，重懸于DMEM培養(yǎng)液中，調(diào)整體積為100μL，細(xì)胞密度為1×10⁷/100μL，再與100μL Matrigel等體積混合，得到細(xì)胞懸液，至于冰上備用，

②采用胰島素注射器，將50μL細(xì)胞懸液注射入裸鼠胰頭部胰腺包膜下，即得裸鼠胰頭原位移植瘤模型。

驗(yàn)證清下瀉胰方劑對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響

按《中藥藥理研究方法學(xué)》人鼠等效劑量進(jìn)行劑量換算，按0.14 ml/10 g體重計(jì)算用量，進(jìn)行裸鼠灌胃，每日一次，共干預(yù)3周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，摘取移植瘤，測(cè)量腫瘤大小并稱重。

如圖1所示，對(duì)比例2對(duì)腫瘤生長(zhǎng)抑制作用不明顯。