本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2012年2月3日、申請(qǐng)?zhí)枮?01280015807.1、發(fā)明名稱“免疫原性支氣管炎博德特氏菌組合物”的專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，特別地涉及免疫原性和疫苗組合物領(lǐng)域。更具體而言，本公開涉及包含與百日咳桿菌粘附素聯(lián)合的支氣管炎博德特氏菌(bordetellabronchiseptica)制劑的組合物，用于在犬中治療或預(yù)防呼吸疾病。
背景技術(shù)：
支氣管炎博德特氏菌是寄居于犬呼吸道中并引發(fā)支氣管炎或“犬舍咳”的革蘭陰性菌。hawkins,e.c.,veterinaryinternalmedicine(1995),pp.767-811。支氣管炎博德特氏菌使犬易受其他呼吸劑(respiratoryagent)的影響并且經(jīng)常與其同時(shí)存在。迄今為止，很多疫苗可用于治療由支氣管炎博德特氏菌引起的支氣管炎，包括
然而，大部分現(xiàn)有的商業(yè)疫苗需要棘手的鼻內(nèi)施用以及添加佐劑，這可導(dǎo)致有害副作用，諸如燒灼感和刺激。vierascheibneretal.,nexusdec2000(vol8,no1)。由于其在疫苗施用期間相對(duì)易怒動(dòng)物而具有的自身風(fēng)險(xiǎn)，鼻內(nèi)疫苗在獸醫(yī)醫(yī)師中并不受歡迎。已經(jīng)對(duì)亞單位疫苗(諸如涉及應(yīng)用支氣管炎博德特氏菌(百日咳桿菌粘附素)的p68蛋白質(zhì)的那些疫苗)進(jìn)行了研究，但是迄今為止，可能由于免疫原性、反應(yīng)性和/或制劑穩(wěn)定性不足，其未包括在任何商業(yè)犬用疫苗中。
支氣管炎博德特氏菌是犬傳染性呼吸系統(tǒng)疾病中的重要因素，其是擁擠條件(諸如救助中心和圍板或訓(xùn)練犬舍)下居住的犬中常見的高度接觸性傳染病。cirdc的發(fā)病機(jī)理被認(rèn)為是多因素的，涉及若干病毒和細(xì)菌。已知的作為cirdc的病原體的傳染原除細(xì)菌支氣管炎博德特氏菌(bemisetal.,lab.anim.sci.,29:48-52,1977)之外還包括犬呼吸道冠狀病毒(crcov)(erlesetal.,virology,310(2):216-223,2003)、犬流感病毒(civ)(crawfordetal.,science,310(5747):482-485,2005)、犬副流感病毒(cpiv)(binnetal.,exp.biol.med.,126:140-145,1967)、犬支原體(chalkeretal.,microbiology,150:3491-3497,2004)和犬腺病毒血清型2(cav-2)(ditchfieldetal.,can.vet.j.,3:238-247,1962)。迄今為止，還沒(méi)出現(xiàn)可對(duì)抗所有或大部分前述病原體的綜合性組合疫苗。
因此，對(duì)能夠安全腸胃外施用于犬的免疫原性組合物存在需求，其對(duì)支氣管炎博德特氏菌提供長(zhǎng)效免疫保護(hù)，而沒(méi)有有害副作用或干擾組合疫苗中的其他抗原或者對(duì)獸醫(yī)造成風(fēng)險(xiǎn)。本公開滿足這些及其他相關(guān)需求。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供免疫原性組合物，其包含支氣管炎博德特氏菌和分離的百日咳桿菌粘附素抗原及其它。在另一實(shí)施方式中，所述百日咳桿菌粘附素抗原是重組蛋白質(zhì)。在另一實(shí)施方式中，所述百日咳桿菌粘附素抗原來(lái)自支氣管炎博德特氏菌。在另一實(shí)施方式中，所述百日咳桿菌粘附素抗原是p68。在另一實(shí)施方式中，所述組合物還包含經(jīng)分離的bsp22抗原。
在另一實(shí)施方式中，支氣管炎博德特氏菌組分是菌苗或細(xì)菌提取物(bacterialextract)。在另一實(shí)施方式中，所述組合物是不含佐劑的。在另一實(shí)施方式中，所述組合物還包含佐劑。
在另一實(shí)施方式中，所述百日咳桿菌粘附素抗原以約1μg至約30μg存在。更具體而言，所述百日咳桿菌粘附素以約5μg至約20μg存在，仍更具體，以約7μg至約15μg存在，甚至更具體，以約5μg、10μg、15μg或20μg存在。優(yōu)選地，所述百日咳桿菌粘附素抗原通過(guò)將百日咳桿菌粘附素包含體溶解于脲中并任選通過(guò)柱色譜法純化來(lái)制備。所述百日咳桿菌粘附素抗原是可溶性的并且優(yōu)選基本不含聚集體(aggregates)。
另一實(shí)施方式提供了免疫原性組合物，其包含多種重組p68百日咳桿菌粘附素抗原，其中所述組合物基本不含p68聚集體。更具體而言，所述多種重組p68百日咳桿菌粘附素抗原通過(guò)將百日咳桿菌粘附素包含體溶解于脲中并任選通過(guò)柱色譜法純化來(lái)制備。本發(fā)明還提供了通過(guò)將百日咳桿菌粘附素包含體溶解于脲中并任選通過(guò)柱色譜法純化來(lái)制備p68百日咳桿菌粘附素抗原的方法。
在另一實(shí)施方式中，所述組合物配制用于腸胃外施用，這樣其還包含稀釋劑或賦形劑，用于腸胃外施用于犬。
在另一實(shí)施方式中，所述組合物還包含來(lái)自選自下述的犬呼吸系統(tǒng)病原體的抗原：犬副流感病毒(cpiv)、犬腺病毒-2(cav-2)、犬呼吸道冠狀病毒(crcov)和犬流感病毒(civ)。在更具體的實(shí)施方式中，所述組合物包含至少兩種、三種或四種來(lái)自犬呼吸系統(tǒng)病原體的抗原。
在另一實(shí)施方式中，本文所述的免疫原性組合物不包含非呼吸系統(tǒng)抗原。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式提供了如本文所述的組合物，條件是其不含非呼吸系統(tǒng)抗原。非呼吸系統(tǒng)抗原不在對(duì)象中引發(fā)呼吸系統(tǒng)疾病。此類非呼吸系統(tǒng)抗原的非限定性實(shí)例包括狂犬病毒、犬細(xì)小病毒、犬胃腸炎病毒、鉤端螺旋體屬(leptospiraspecies)和博氏疏螺旋體(borreliaburgdorferi)。
在另一實(shí)施方式中，所述抗原來(lái)自犬呼吸道冠狀病毒(crcov)。在另一實(shí)施方式中，所述抗原來(lái)自犬流感病毒(civ)。在另一實(shí)施方式中，所述抗原來(lái)自犬副流感病毒(cpiv)。在另一實(shí)施方式中，所述抗原來(lái)自犬腺病毒-2(cav-2)。在另一實(shí)施方式中，所述抗原來(lái)自犬副流感病毒(cpiv)和犬腺病毒-2(cav-2)。
在另一實(shí)施方式中，所述組合物包含來(lái)自犬副流感病毒(cpiv)、犬腺病毒-2(cav-2)、犬呼吸道冠狀病毒(crcov)和犬流感病毒(civ)的抗原。
在另一實(shí)施方式中，所述組合物誘導(dǎo)對(duì)支氣管炎博德特氏菌和犬副流感病毒(cpiv)、犬腺病毒-2(cav-2)、犬呼吸道冠狀病毒(crcov)和犬流感病毒(civ)中至少一種的免疫反應(yīng)。
本發(fā)明的另一實(shí)施方式提供了一種免疫原性組合物，其包含犬呼吸道冠狀病毒(crcov)、支氣管炎博德特氏菌制劑和犬流感病毒(civ)。更具體而言，所述組合物包含分離的百日咳桿菌粘附素抗原。
本發(fā)明的另一實(shí)施方式提供了上述任一種實(shí)施方式的免疫原性組合物用于在犬中治療或預(yù)防來(lái)自犬呼吸道病原體的感染的方法或用途。在另一實(shí)施方式中，所述組合物在所述犬中預(yù)防來(lái)自所述犬呼吸道病原體的感染達(dá)6個(gè)月或更長(zhǎng)的時(shí)期。在另一實(shí)施方式中，所述組合物在所述犬中預(yù)防來(lái)自所述犬呼吸道病原體的感染達(dá)1年的時(shí)間。
在另一實(shí)施方式中，犬呼吸道病原體為支氣管炎博德特氏菌。在另一實(shí)施方式中，犬呼吸道病原體還包含下述中的至少一種、兩種、三種或四種：犬副流感病毒(cpiv)、犬腺病毒-2(cav-2)、犬呼吸道冠狀病毒(crcov)和犬流感病毒(civ)。
本發(fā)明的另一實(shí)施方式提供了提供了上述任一種實(shí)施方式的免疫原性組合物用于治療或預(yù)防犬傳染性呼吸道疾病綜合征(cirdc)的方法或用途，其中所述組合物治療或預(yù)防來(lái)自多種犬呼吸道病原體的感染。另一實(shí)施方式提供了腸胃外施用如本文所述的免疫原性組合物的用途或方法。
另一實(shí)施方式提供了包含用于在犬中治療或預(yù)防來(lái)自犬呼吸道病原體的感染的免疫原性組合物的藥物制備。
本發(fā)明的這些和其他實(shí)施方式、特征以及優(yōu)勢(shì)根據(jù)下面所述的詳細(xì)描述和所附權(quán)利要求將是顯而易見的。應(yīng)理解，上述和下述各實(shí)施方式可結(jié)合成單一實(shí)施方式。
具體實(shí)施方式
下述定義適用本公開。其取代本文中通過(guò)參考引入的各單獨(dú)參考文獻(xiàn)所含的任何相反性定義。未限定的詞語(yǔ)具有本領(lǐng)域技術(shù)人員通常使用的含義。此外，除非上下文另外要求，單數(shù)術(shù)語(yǔ)將包括多個(gè)和復(fù)數(shù)形式，而且多個(gè)和復(fù)數(shù)形式將包括單數(shù)。
“約”或“近似”當(dāng)與可測(cè)量的數(shù)值變量結(jié)合使用時(shí)，是指該變量所示的值，以及在該所示值的實(shí)驗(yàn)誤差內(nèi)的該變量的所有值(例如，在平均值的95％置信區(qū)間內(nèi))，或者在所示值的百分之十內(nèi)的該變量的所有值，無(wú)論如何更大者。如果用“約”指以周計(jì)的時(shí)間間隔，“約3周”指17-25日，而“約2至約4周”指10-40日。
如本文所用，“佐劑”是指用作免疫反應(yīng)的非特異性刺激物的任何物質(zhì)。關(guān)于佐劑的進(jìn)一步描述，見下述。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)"動(dòng)物”包括易于感染支氣管炎博德特氏菌和/或犬呼吸道疾病癥候群的任何動(dòng)物，包括家養(yǎng)和野生的哺乳動(dòng)物。優(yōu)選地，本文所述的動(dòng)物指犬或人類。
如本文所用，“抗體”為保護(hù)抗原結(jié)合部位的任何多肽，無(wú)論來(lái)源、制備方法或其他特征。其是指由于對(duì)抗原的免疫反應(yīng)而特異性與該抗原結(jié)合的沒(méi)有球蛋白分子或其片段。免疫球蛋白是由具有“恒定”區(qū)和“可變”區(qū)的“輕”和“重”多肽鏈組成的血清蛋白，并且基于恒定區(qū)的組成對(duì)其進(jìn)行分類(例如，iga、igd、ige、igg和igm)。對(duì)給定抗原具有“特異性”的抗體表示該抗體的可變區(qū)專門識(shí)別特異性抗原并與其結(jié)合。如本文所用，所示術(shù)語(yǔ)包括但不限于：多克隆抗體、單克隆抗體、單一特異性抗體、多特異性抗體、人源化抗體、四聚體抗體、四價(jià)抗體、多重特異性抗體、單鏈抗體、結(jié)構(gòu)域特異性抗體、單域抗體、結(jié)構(gòu)域刪除抗體(domain-deletedantibody)、融合蛋白、scfc融合蛋白、單鏈抗體、嵌合抗體、合成抗體、重組抗體、嵌合抗體、突變抗體和cdr移植抗體?？贵w可以是源自天然來(lái)源或源自重組來(lái)源的完整的免疫球蛋白，或者可以是完整的免疫球蛋白的免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)?！翱贵w”可轉(zhuǎn)換為抗原結(jié)合蛋白質(zhì)，其包括但不限于抗體片段，所述抗體片段包括但不限于：fab、f(ab')2、fab'片段、fv片段、單鏈fv(scfv)片段、fd片段、dab片段、雙體、cdr3肽、約束fr3-cdr3-fr4肽、納米抗體、二價(jià)納米抗體、小模塊免疫藥物(smallmodularimmunopharmaceutical、smips)和微抗體(minibody)，以及任意上述片段及其化學(xué)或遺傳操作的配體(counterpart)，以及保留抗原結(jié)合功能的其他抗體片段。通常，此類片段將包含抗原結(jié)合域。如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的，任何此類粉絲可進(jìn)行工程化(例如“種系化(germlined)”)，以便降低其免疫原性，增加其親和性，改變其特異性或?qū)崿F(xiàn)其他目的。
如本文所用，“抗原”或“免疫原”是指含一種或多種表位(線性表位、構(gòu)象表位或兩者)的分子，所述表位在暴露于對(duì)象之后將誘導(dǎo)對(duì)該抗原具有特異性的免疫反應(yīng)。表位是與t-細(xì)胞受體或特異性抗體結(jié)合的抗原的特異位點(diǎn)，且通常包含約3個(gè)氨基酸殘基至約20個(gè)氨基酸殘基。如本文所用，術(shù)語(yǔ)抗原是指亞單位抗原—從本質(zhì)上與所述抗原相關(guān)的完整生物體分開并分離的抗原—以及殺死、減毒或滅活細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲或其他微生物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)還指抗體，諸如抗-個(gè)體遺傳型抗體或其片段，以及指能夠模仿抗原或抗原決定簇(表位)的合成肽模擬位。如本文所用，術(shù)語(yǔ)抗原還指在體內(nèi)表達(dá)抗原或抗原決定簇的寡核苷酸或多核苷酸，諸如在dna免疫接種應(yīng)用中。
如本文所用，“抗原性”是指蛋白質(zhì)或多肽與針對(duì)該蛋白質(zhì)或多肽而培養(yǎng)的抗體免疫專一性結(jié)合的能力。
術(shù)語(yǔ)“支氣管炎博德特氏菌(bordetellabronchiseptica或b.bronchiseptica)”是指：支氣管炎博德特氏菌的活的減毒細(xì)菌、支氣管炎博德特氏菌的被殺死的全細(xì)胞提取物(菌苗)或者支氣管炎博德特氏菌的細(xì)胞細(xì)菌提取物。
“緩沖液”指防止另一化學(xué)物質(zhì)的濃度變化的化學(xué)體系。質(zhì)子給體和受體體系用作緩沖液，其防止氫離子濃度(ph)的顯著變化。緩沖液的其他實(shí)例包是含弱酸及其鹽(共軛堿)或弱堿及其鹽(共軛酸)的溶液。
如本文所用，“犬”包括通常被稱為狗者，但也包括犬科家族的其他成員。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞系”或“宿主細(xì)胞”指病毒在其中可以復(fù)制或維持的原核或真核細(xì)胞。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“培養(yǎng)物(culture)”指在缺乏其他種或類型時(shí)生長(zhǎng)的細(xì)胞或微生物種群。
“劑量”是指給予對(duì)象的疫苗或免疫原性組合物。“第一劑量”或“啟動(dòng)劑量(primingdose)”是指在第0日所給予的此種組合物的劑量?！暗诙┝俊被颉暗谌齽┝俊被颉澳陝┝俊笔侵冈诘谝粍┝恐笏o予的此類組合物的量，其可以是但不必是與第一劑量相同的疫苗或免疫原性組合物。
“表位”是與t-細(xì)胞受體或特異性抗體結(jié)合的抗原的特異位點(diǎn)，且通常包含約3個(gè)氨基酸殘基至約20個(gè)氨基酸殘基。
如本文所用，“賦形劑”是指疫苗或免疫原性組合物的不反應(yīng)的載體組分，其不是抗原。優(yōu)選的賦形劑是本領(lǐng)域已知的用于腸胃外注射的那些。
“片段”是指蛋白質(zhì)或基因的截短部分?！肮δ苄云巍焙汀吧锘钚云巍笔侵副Ａ袅送暾鞍踪|(zhì)或基因的生物性能的片段。
“同源性”或“同源性百分比”是指在比對(duì)序列并且(如果必要)引入間隙以實(shí)現(xiàn)最大百分比序列同源性以及還考慮作為序列同源性一部分的任何保守置換之后，在候選序列中與比較序列中的殘基相同或類似的核苷酸或氨基酸殘基的百分比。
“同源物”或“物種同源物”包括在兩種或更多種物種中發(fā)現(xiàn)的基因，其具備大量的多核苷酸序列同源性，并具備相同或相似的生物功能和/或性質(zhì)。優(yōu)選地，代表物種同源物的多核苷酸序列將在中等嚴(yán)格條件下雜交，如通過(guò)本文實(shí)施例所述，并且具有相同或類似的生物活性和/或性質(zhì)。在另一方面，代表物種同源物的多核苷酸將共享大于約60％的序列同源性、大于約70％的序列同源性、大于約80％的序列同源性、大于約90％的序列同源性、大于約95％的序列同源性、大于約96％的序列同源性、大于約97％的序列同源性、大于約98％的序列同源性或大于約99％的序列同源性。
“同一性”或“同一性百分比”是指在比對(duì)兩種序列并且(如果必要)引入間隙以實(shí)現(xiàn)最大百分比序列同一性但是不考慮作為序列同一性一部分的任何保守置換之后，在候選序列中與比較序列中的殘基相同的核苷酸或氨基酸殘基的百分比。
如本文所用，在對(duì)象中的“免疫反應(yīng)”是指對(duì)抗原發(fā)展的體液免疫反應(yīng)、細(xì)胞免疫反應(yīng)或者體液與細(xì)胞免疫反應(yīng)?！绑w液免疫反應(yīng)”是指至少部分被抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。“細(xì)胞免疫反應(yīng)”是通過(guò)t-淋巴細(xì)胞或其他白細(xì)胞或二者介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，而且其包括由激活的t-細(xì)胞、白細(xì)胞或二者產(chǎn)生的細(xì)胞因子、化學(xué)增活素和類似分子的生成。免疫反應(yīng)可利用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)免疫測(cè)定和中和測(cè)定來(lái)確定。
如本文所用，“免疫原性”是指蛋白質(zhì)或多肽引發(fā)特異性針對(duì)引起所述疾病的細(xì)菌或病毒的免疫反應(yīng)的能力。
"免疫原性組合物"是一種含免疫原的制劑，其包括例如蛋白質(zhì)，肽，全細(xì)胞，滅活的、亞單位或減毒病毒，或者多糖，或其組合，其被施用來(lái)刺激受體對(duì)存在于免疫原性組合物中一種或多種抗原的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。"免疫接種"是施用免疫原性組合物并在宿主中刺激對(duì)抗原的免疫或免疫原性反應(yīng)的過(guò)程。優(yōu)選的宿主為哺乳動(dòng)物，諸如犬。優(yōu)選地，免疫原性組合物為疫苗。
如本文所用?！懊庖弑Ｗo(hù)量”是有效地在受體在誘導(dǎo)免疫原應(yīng)答的抗原量，該量足以預(yù)防或改善疾病的體征或癥狀，包括不利的健康影響或其并發(fā)癥。體液免疫或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫或兩種免疫均可被誘導(dǎo)?？稍u(píng)價(jià)動(dòng)物對(duì)組合物的免疫原應(yīng)答，例如，間接通過(guò)測(cè)量抗體滴度、淋巴細(xì)胞增殖測(cè)定，或者直接通過(guò)監(jiān)控用野生株攻擊后的體征和癥狀。例如，可通過(guò)測(cè)量攻擊生物體的流出(shed)降低，臨床跡象的降低，諸如死亡率、發(fā)病率、溫度以及對(duì)象的總體身體健康情況、健康和表現(xiàn)，來(lái)評(píng)價(jià)組合物或疫苗所賦予的保護(hù)性免疫。免疫反應(yīng)可包括而不限于誘導(dǎo)細(xì)胞和/或體液免疫。取決于所使用的特定生物體，或者被治療或接種的動(dòng)物的狀況，治療有效的組合物或疫苗的量可變并可由獸醫(yī)確定。
如本文所用，“鼻內(nèi)”施用是指經(jīng)過(guò)或經(jīng)由鼻子將諸如疫苗或其他組合物的物質(zhì)引入對(duì)象體內(nèi)，并且其包括主要經(jīng)過(guò)鼻粘膜輸送物質(zhì)。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“分離的”是指處于基本純形式的物質(zhì)(例如，大于約95％純度)；或者以一定途徑從其自然環(huán)境純化或富集的物質(zhì)。提及“分離的百日咳桿菌粘附素”表示從其自然環(huán)境中被移出的百日咳桿菌粘附素蛋白質(zhì)，諸如從宿主動(dòng)物/犬中移出，位于菌種生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，或者從全細(xì)胞支氣管炎博德特氏菌制劑中純化，并且其隨后可被返回添加至含支氣管炎博德特氏菌提取物的組合物中(即，增添百日咳桿菌粘附素分離物)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“分離的”包括處于含其他物質(zhì)/稀釋劑/賦形劑/佐劑/蛋白質(zhì)的溶液中的免疫原。
“藥劑”是指用于預(yù)防、治愈或改善醫(yī)學(xué)狀況或者預(yù)防一些生理狀況或事件的任何物質(zhì)。
如本文所用，"單克隆抗體"是指通過(guò)單雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體，其全部定向于特定抗原上的一個(gè)表位。用于制備單克隆抗體的抗原可以病原體的分離蛋白或整體病原體來(lái)提供?！半s交瘤”是由通過(guò)骨髓瘤細(xì)胞融合形成的雜交細(xì)胞和特異性抗體產(chǎn)生細(xì)胞組成的克隆細(xì)胞系。一般而言，單克隆細(xì)胞具有小鼠起源。然而，單克隆抗體也指通過(guò)噬菌體展示技術(shù)或者等價(jià)于噬菌體展示的方法或非小鼠起源的雜交細(xì)胞而生產(chǎn)的針對(duì)抗原的特定表位制備的抗體的克隆種群。
如本文所用，“經(jīng)口”或“口服”施用是指通過(guò)或經(jīng)由口腔將諸如疫苗或其他組合物的物質(zhì)引入對(duì)象體內(nèi)，并且其包括經(jīng)過(guò)口腔黏膜的吞咽或輸送(例如，舌下或口腔吸收)或二者。氣管內(nèi)也經(jīng)口或口服施用的一種方式。
如本文所用，“口鼻”施用是指經(jīng)過(guò)或經(jīng)由鼻子和口腔將諸如組合物或疫苗的物質(zhì)引入對(duì)象體內(nèi)，例如，正如所發(fā)生的，通過(guò)將一滴或多滴滴劑置于鼻內(nèi)進(jìn)行。口鼻施用包括與經(jīng)口和經(jīng)鼻施用相關(guān)輸送過(guò)程。
如本文所用，“腸胃外施用”是指通過(guò)或經(jīng)由不包括消化道的途徑將諸如組合物或疫苗的物質(zhì)引入對(duì)象體內(nèi)。腸胃外施用包括皮下、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)和靜脈施用。為了本公開的目的，腸胃外施用不包括主要涉及經(jīng)由口腔、鼻子、器官和肺內(nèi)的粘膜組織來(lái)輸送物質(zhì)的給藥途徑。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“病原體”或“致病微生物”指能夠在其宿主動(dòng)物中誘導(dǎo)或引發(fā)疾病、病癥或異常狀態(tài)(優(yōu)選呼吸系統(tǒng)疾病，諸如cirdc)的微生物，例如cpiv、cav-2、crcov、犬支原體、civ或支氣管炎博德特氏菌。
如本文所用，“百日咳桿菌粘附素”是指博德特氏菌屬的外膜蛋白。優(yōu)選地。百日咳桿菌粘附素來(lái)自支氣管炎博德特氏菌，更優(yōu)選的來(lái)自“p68”，并且由基因prna編碼。百日咳桿菌粘附素可以其天然形式從支氣管炎博德特氏菌分離，或者其可重組產(chǎn)生。百日咳桿菌粘附素的序列和實(shí)例提供在美國(guó)專利號(hào)7,736,658中，該專利的內(nèi)容因此通過(guò)參考并入。本文采用的百日咳桿菌粘附素抗原包括蛋白質(zhì)的脂化形式。
“藥學(xué)上可接受的”是指在合理醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)適合用于與對(duì)象組織接觸但是沒(méi)有過(guò)分毒性、刺激、過(guò)敏反應(yīng)等的物質(zhì)，其與合理的收益/風(fēng)險(xiǎn)比相當(dāng)并有效用于其預(yù)期用途。
如本文所用，"多克隆抗體"是指針對(duì)特定病原體或抗原的混合抗體種群。一般而言，該種群含有多種抗體組，每組定向于該病原體或抗原的特定表位。為制備多克隆抗體，整體病原體或分離抗原通過(guò)接種到宿主中或感染宿主而引入，其誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對(duì)抗該病原體或抗原的抗體。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”指由在鏈中共價(jià)結(jié)合的核苷酸單體組成的有機(jī)聚合物分子。dna(脫氧核糖核酸)和rna(核糖核酸)是具有不同功能的多核苷酸的實(shí)例。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“多肽”指由兩個(gè)或更多個(gè)在鏈中結(jié)合的氨基酸組成的有機(jī)聚合物分子。
如本文所用，"預(yù)防感染"指預(yù)防或抑制引起所述疾病的細(xì)菌或病毒的復(fù)制，以便抑制細(xì)菌或病毒的傳播，從而阻止細(xì)菌或病毒自身在其宿主中建立，或者減輕由傳染引起的疾病的癥狀。如果存在細(xì)菌或病毒載量的減少，則認(rèn)為治療是治療性的。
如本文關(guān)于疫苗或其他組合物所用的“保護(hù)”、“保護(hù)的”、“保護(hù)性免疫”是指該疫苗或組合物預(yù)防或降低由衍生疫苗或組合物中所用的抗原的生物體引發(fā)的疾病癥狀。術(shù)語(yǔ)“保護(hù)”、“保護(hù)的”等還指所述疫苗或組合物可用于“治療”疾病或者已經(jīng)存在于對(duì)象中的所述疾病的一種或多種癥狀。
如本文所用，“呼吸作用”施用是指通過(guò)或經(jīng)由吸入噴霧(霧化)物質(zhì)而將疫苗或其他組合物的物質(zhì)引入對(duì)象體內(nèi)。在呼吸作用施用中，主要輸送機(jī)制涉及霧化物質(zhì)經(jīng)過(guò)氣管、支氣管和肺中的粘膜的吸收，因此其不同于鼻內(nèi)或口服施用。
術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合(specificbinding、specificallybinds)”等定義為兩個(gè)或更多個(gè)分子形成在生理或測(cè)定條件下可測(cè)量而且具有選擇性的復(fù)合物。如果在適當(dāng)選定的條件下，此類結(jié)合基本不被抑制，而同時(shí)非特異性結(jié)合被抑制，則抗體或其他抑制劑被稱為與蛋白質(zhì)“特異性結(jié)合”。特異性結(jié)合的特征在于高親和性以及對(duì)化合物或蛋白質(zhì)具有選擇性。非特異性結(jié)合通常具有低親和性。在igg抗體中的結(jié)合通常特征在于真實(shí)約10-7m或更高的親和性，諸如約10-8m或更高，或者至少約10-9m或更高，或者至少約10-10或更高，或者至少約10-11m或更高，或者至少約10-12m或更高。如本文所用，該術(shù)語(yǔ)也適用例如抗原結(jié)構(gòu)域?qū)ξ幢缓芏嗫乖瓟y帶的特定表位具有特異性的情況，在這種情況中，攜帶抗原結(jié)構(gòu)域的抗體通常不與其他抗原結(jié)合。
如本文所用，“特異性免疫原片段”是指這樣的序列蛋白質(zhì)，其僅由對(duì)該序列具有特異性的抗體或t細(xì)胞識(shí)別。
如本文所用，“對(duì)象”是指具有免疫系統(tǒng)的任何動(dòng)物，其包括動(dòng)物，諸如犬。
如本文所用，“基本相同的”是指至少約90％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％或至少約99％的序列同一性程度。
如本文所用，“亞單位疫苗”和“亞單位組合物”是指一類疫苗或組合物，其包括源自來(lái)自感興趣病原體(諸如病毒、細(xì)菌、寄生蟲或真菌)的抗原或與其同源的抗原(但并非全部抗原)。此類組合物或疫苗基本不含完整病原體細(xì)胞或致病顆粒，或者此類細(xì)胞或顆粒的溶解產(chǎn)物。因此，亞單位疫苗或亞單位組合物可從來(lái)自病原體或其類似物的至少部分純的或基本純的免疫原性多肽制備。獲得亞單位疫苗或亞單位組合物中的抗原或多種抗原的方法包括標(biāo)準(zhǔn)純化技術(shù)、重組生產(chǎn)或化學(xué)合成?！皝唵挝灰呙纭被颉皝唵挝唤M合物”因此指由病毒、細(xì)菌或其他免疫原的確定的抗原成分或多種抗原成分組成的疫苗或組合物。優(yōu)選地，本發(fā)明的亞單位組分重組產(chǎn)生，且最優(yōu)選地，其為百日咳桿菌粘附素(p68)。
“tcid50”是指“組織培養(yǎng)感染劑量”，并且其被定義為感染50％的給定批次的已接種細(xì)胞培養(yǎng)所需的病毒稀釋。各種方法可用于計(jì)算tcid50，包括spearman-karber方法，其用在通篇說(shuō)明書中。關(guān)于spearman-karber方法的描述，參見b.w.mahy&h.o.kangro,virologymethodsmanual25-46(1996)。
如本文所用，"治療劑"是指任何分子、混合物、病毒或治療劑，優(yōu)選病毒減毒的或滅殺的，或者亞單位或化合物，其有助于治療病毒、細(xì)菌、寄生蟲或真菌感染、因此引起的疾病或病癥。
如本文所用，“治療有效量”是指將在接受抗原或疫苗或組合物的對(duì)象(例如，犬)中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的抗原或疫苗或組合物的量，其適于預(yù)防或減輕由病原體(諸如病毒、細(xì)菌、寄生蟲或真菌)感染引起的疾病的體征或癥狀，包括不良的健康影響或其并發(fā)癥。體液免疫或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，或者體液免疫和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫兩種都被誘導(dǎo)。動(dòng)物對(duì)抗原、疫苗或組合物的免疫原應(yīng)答可間接通過(guò)測(cè)量抗體滴度、淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)，或者直接通過(guò)監(jiān)控用野生型菌株攻擊后的體征和癥狀來(lái)評(píng)價(jià)。由疫苗或組合物賦予的保護(hù)性免疫可通過(guò)測(cè)量攻擊生物體流出的降低和/或臨床癥狀(諸如死亡率、發(fā)病率、溫度以及對(duì)象的總體身體健康情況、健康和表現(xiàn))的降低來(lái)評(píng)價(jià)。取決于所使用的特定免疫原，或者對(duì)象的狀況，治療有效的疫苗或組合物的量可變并可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。
如本文所用，“治療(treatortreating)”是指逆轉(zhuǎn)、減輕、抑制此類術(shù)語(yǔ)所適用的病癥、狀況或疾病的進(jìn)程，或預(yù)防所述病癥、狀況或疾病，或者預(yù)防所述病癥、狀況或疾病一種或多種癥狀。
如本文所用，“治療”是指如上所定義的“治療”的行為。
如本文所用，“疫苗”或“疫苗組合物”是指選自病毒或細(xì)菌的免疫原性組合物，所述病毒或細(xì)菌或者為修飾活性的、減毒的或滅殺的，或者為亞單位疫苗，或者為上述的任意組合。向?qū)ο笫┯靡呙绠a(chǎn)生免疫反應(yīng)?？赏ㄟ^(guò)已知的給藥途徑將疫苗直接引入對(duì)象中，包括腸胃外、經(jīng)口等。該術(shù)語(yǔ)指預(yù)防或降低感染或者預(yù)防或降低感染的一種或多種體征或癥狀的組合物。疫苗組合物對(duì)抗病原體的保護(hù)作用通常通過(guò)在對(duì)象中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。通常而言，消除或降低的感染發(fā)病率、體征或癥狀的改善或者微生物從感染對(duì)象中加速消除均表示疫苗組合物的保護(hù)作用。本發(fā)明的疫苗組合物提供了抵抗由犬呼吸道疾病病原體引起的感染的保護(hù)作用。
如本文所用，“獸醫(yī)學(xué)可接受的”是指是指在合理醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)適合用于與獸醫(yī)對(duì)象組織接觸但是沒(méi)有過(guò)分毒性、刺激、過(guò)敏反應(yīng)等的物質(zhì)，其與合理的收益/風(fēng)險(xiǎn)比相當(dāng)并有效用于其預(yù)期用途。如本文所用，“獸醫(yī)學(xué)可接受的載體"是指不干擾有效成分的生物活性的效力并且對(duì)其所施用的獸醫(yī)對(duì)象無(wú)毒的載體介質(zhì)。
抗原、免疫原性組合物和疫苗
本公開基于下述預(yù)料不到的發(fā)現(xiàn)：與支氣管炎博德特氏菌制劑相結(jié)合的分離百日咳桿菌粘附素抗原的包含體產(chǎn)生充分改善的功效和安全性。即，在細(xì)菌攻擊之前腸胃外施用于犬時(shí)，所述組合物預(yù)防支氣管炎發(fā)作而且不會(huì)產(chǎn)生不良的副作用。
本發(fā)明還提供免疫原性組合物和疫苗，其包含一種或多種適合施用于犬以治療cirdc的病毒和細(xì)菌或亞單位。本發(fā)明所包括的犬呼吸道冠狀病毒(crcov)特征可為存在于患有傳染性呼吸道疾病的犬的呼吸道中的冠狀病毒。crcov在動(dòng)植物演化史上與下述最密切相關(guān)：牛冠狀病毒(bcov)、人類冠狀病毒(hcov)株oc43和血凝性腦脊髓炎病毒(hev)；腸道犬冠狀病毒(ccov)僅與crcov關(guān)系較遠(yuǎn)。適合用于本發(fā)明的crcov的代表性實(shí)例包括鑒定為crcov菌株4182的菌株(erlesetal.,virusres.,124:78-87,2007)。
本發(fā)明所包括的流感病毒抗原可以是來(lái)自鳥類或哺乳動(dòng)物的任何經(jīng)鑒定的流感病毒株，其包括但不限于：具有亞型h3血細(xì)胞凝集素和亞型n8神經(jīng)氨酸苷酶或者h(yuǎn)3n8亞型的流感病毒，其更經(jīng)常被稱為h3n8病毒。流感可具有任何哺乳動(dòng)物或鳥類起源，包括但不限于豬、馬或犬起源。在一個(gè)實(shí)施方式中，應(yīng)用犬流感抗原。在一個(gè)實(shí)施方式中，應(yīng)用馬流感抗原。在一個(gè)實(shí)施方式中，應(yīng)用具有亞型糖蛋白指定的h3或n8的菌株。在一個(gè)實(shí)施方式中，應(yīng)用具有亞型h3和n8糖蛋白的菌株。
本發(fā)明所包括的流感抗原可分離自馴養(yǎng)和野生的狗、馬、豬和家禽。選來(lái)用于樣品收集的動(dòng)物應(yīng)顯示急性和/或亞急性臨床癥狀，其可包括溫和至嚴(yán)重的呼吸道癥狀和發(fā)燒。動(dòng)物還可顯示厭食和昏睡的癥狀。病毒分離方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，包括：接種哺乳動(dòng)物或鳥類細(xì)胞培養(yǎng)物、用來(lái)自臨床標(biāo)本的鼻或喉粘膜樣本接種含胚卵、通過(guò)擦拭鼻腔通道或咽喉收集，或者通過(guò)收集諸如脾、肺、扁桃體和肝的組織及肺灌洗。可在細(xì)胞培養(yǎng)物中觀察到病毒的細(xì)胞病變效應(yīng)。可測(cè)試尿囊液或細(xì)胞溶解產(chǎn)物積聚人類、小雞、土雞或豚鼠紅細(xì)胞的能力，其為流感病毒存在的推定證據(jù)。
適用于本發(fā)明的犬流感病毒(civ)株的代表性實(shí)例包括鑒定為a/犬/iowa/9a1/b5/08/d12的菌株，其于2006年6月29日以pta-7694保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(atcc),10801universityboulevard,manassas,va20110-2209。civ抗原的典型菌株為商業(yè)疫苗civ病毒株，
本發(fā)明所包括的犬副流感病毒(cpiv)特征可為已知作為與犬舍咳相關(guān)的病原體的病毒之一。cpiv抗原的代表性菌株為商業(yè)疫苗的減毒cpi病毒株，
本發(fā)明所包括的犬腺病毒2型(cav-2)特征可為已知作為與犬舍咳相關(guān)的病原體的病毒之一。cav-2抗原的代表性菌株為商業(yè)疫苗的減毒cav-2病毒株，
本發(fā)明所包括的犬支原體(m.cynos)描述于chalkeretal.,microbiology,150:3491-3497,2004中并且是與呼吸系統(tǒng)疾病相關(guān)的常見的支原體種屬。抗犬支原體的免疫原性組合物描述于us2007/0098739中，其通過(guò)參考并入本文。
本發(fā)明所包括的支氣管炎博德特氏菌組分特征可為與犬舍咳相關(guān)的細(xì)菌病原體。本發(fā)明所包括的所述免疫原性組合物和疫苗可為下述中的一種或多種：活的減毒支氣管炎博德特氏菌、支氣管炎博德特氏菌菌苗或細(xì)菌提取物。另外，所述組合物優(yōu)選還包括支氣管炎博德特氏菌的分離的亞單位抗原。
在一個(gè)實(shí)施方式中，所述支氣管炎博德特氏菌作為通過(guò)柱色譜法純化的全細(xì)胞聲處理物(wholecellsonicate)制備，如在1984年10月12日提交的專利申請(qǐng)?zhí)杅r2571618中所提供的。支氣管炎博德特氏菌的另一代表性實(shí)例為細(xì)菌提取物bronchicinetmcae(pfizer)，其從提取自支氣管炎博德特氏菌細(xì)胞的抗原物制備。支氣管炎博德特氏菌的另一實(shí)例是以
另外，亞單位還優(yōu)選與支氣管炎博德特氏菌組分聯(lián)合存在(即，補(bǔ)充有支氣管炎博德特氏菌組分)。所述亞單位的代表性實(shí)例為分離的百日咳桿菌粘附素抗原，優(yōu)選為支氣管炎博德特氏菌p68抗原，特性是重組的支氣管炎博德特氏菌p68抗原，其被p68-特異性單克隆抗體bord2-7(描述于us7,736,658中，通過(guò)參考并入本文)識(shí)別，且在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，其具有如us7,736,658中所述的氨基酸序列或與其具有同源性。
重組p68百日咳桿菌粘附素抗原優(yōu)選以合適的形式制備，使得在處理過(guò)程中類天然結(jié)構(gòu)得以保存或恢復(fù)。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面提供基本不含(少于約80％、90％、95％甚或99％)聚集物的重組p68百日咳桿菌粘附素。在另一實(shí)施方式中，重組p68百日咳桿菌粘附素用脲溶解，優(yōu)先約0.1m、0.5m、1m、2m、3m或6m脲溶液。之后，諸如可通過(guò)柱色譜法純化p68抗原。一種此類溶解方法描述于surinderetal.,j.bioscienceandbioengineering,v.99(4),pgs303-310(2005)中。
本文使用的百日咳桿菌粘附素抗原包括脂化形式。脂化蛋白質(zhì)的制備實(shí)例提供于erdileetal.,infectionandimmunity,(1993)v.61(1)p.81-90中，該文獻(xiàn)通過(guò)參考并入。其中所公開的方法可用于制備含有附加的脂質(zhì)部分的翻譯后修飾的百日咳桿菌粘附素蛋白質(zhì)。
此外，在另一實(shí)施方式中，免疫原性組合物包含支氣管炎博德特氏菌和分離的bsp22抗原。在另一實(shí)施方式中，免疫原性組合物包含支氣管炎博德特氏菌、分離的百日咳桿菌粘附素抗原，還包含分離的bsp22抗原。bsp22抗原可如medhekaretal.,molecularmicrobiology(2009)71(2),492–504中所提供般制備。優(yōu)選地，分離的bsp22抗原與支氣管炎博德特氏菌提取物和分離的百日咳桿菌粘附素抗原(具體為重組p68)聯(lián)合存在(即，除支氣管炎博德特氏菌提取物和分離的百日咳桿菌粘附素抗原之外，還包括分離的bsp22抗原)?！癰sp22”還包括抗原的脂化形式。脂化蛋白質(zhì)的制備方法提供于erdileetal.,infectionandimmunity,(1993)v.61(1)p.81-90中，該文獻(xiàn)通過(guò)參考并入。其中所公開的方法可用于制備含有附加的脂質(zhì)部分的翻譯后修飾的bsp22蛋白質(zhì)。
本發(fā)明所包括的病毒可在細(xì)胞、細(xì)胞學(xué)和宿主細(xì)胞中繁殖。所述細(xì)胞、細(xì)胞學(xué)或宿主細(xì)胞例如可以是但不限于哺乳動(dòng)物細(xì)胞和非哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括昆蟲和植物細(xì)胞。本發(fā)明所包括的病毒可在其中繁殖的病毒細(xì)胞、細(xì)胞學(xué)和宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易知曉并得到的。
本發(fā)明所包括的細(xì)菌可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)和繁殖，包括肉湯培養(yǎng)基(液體)和瓊脂(固體；半固體)培養(yǎng)基。一些細(xì)菌還可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞或非哺乳動(dòng)物細(xì)胞中培養(yǎng)并繁殖。
本發(fā)明所包括的病毒和細(xì)菌在用于免疫原性組合物或疫苗中之前可以是減毒的或滅活的。減毒和滅活方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。減毒方法包括但不限于在細(xì)胞培養(yǎng)物中在合適的細(xì)胞系上連續(xù)傳代(病毒和一些細(xì)菌)、在肉湯培養(yǎng)物中連續(xù)傳代(細(xì)菌)、紫外線照射(病毒和細(xì)菌)和化學(xué)誘變(病毒和細(xì)菌)。病毒或細(xì)菌滅活方法包括但不限于用福爾馬林、β-丙內(nèi)酯(betapropriolactone,bpl)或二乙烯亞胺(bei)處理或者本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他方法。
通過(guò)福爾馬林滅活可通過(guò)使含微生物的懸浮液與37％甲醛混合而形成0.5％甲醛終濃度來(lái)進(jìn)行。通過(guò)在室溫下連續(xù)攪拌約24小時(shí)混合微生物-甲醛混合物。然后通過(guò)測(cè)定在合適的細(xì)胞系或肉湯培養(yǎng)上的生長(zhǎng)來(lái)測(cè)試滅活微生物混合物。
對(duì)于一些抗原，通過(guò)bei滅活可通過(guò)使含本發(fā)明微生物的懸浮液與0.1mbei(2-溴-乙胺，在0.175nnaoh中)混合至1mm的bei終濃度來(lái)進(jìn)行。對(duì)于其他抗原，bei終濃度為2mm。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉待使用的適宜濃度。通過(guò)室溫下持續(xù)攪拌約48小時(shí)然后添加1.0m硫代硫酸鈉至0.1mm終濃度，混合病毒-bei混合物?；旌侠^續(xù)進(jìn)行另外2小時(shí)。通過(guò)測(cè)定在合適的細(xì)胞系或肉湯培養(yǎng)上的生長(zhǎng)來(lái)測(cè)試含滅活微生物的混合物的殘留活病毒。
本發(fā)明所包括的免疫原性組合物和疫苗可包括一種或多種獸醫(yī)可接受的載體。如本文所用，"獸醫(yī)可接受的載體"包括任何溶劑、分散介質(zhì)、涂料、佐劑、穩(wěn)定劑、稀釋劑、防腐劑、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑、吸附延遲劑等。稀釋劑可包括水、鹽水、葡萄糖、乙醇、甘油等。等滲劑可包括氯化鈉、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他等滲劑。穩(wěn)定劑包括白蛋白以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他穩(wěn)定劑。防腐劑包括硫柳汞以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他防腐劑。
佐劑可以是可代謝的，是指佐劑由能夠通過(guò)靶標(biāo)生物代謝的成分組成，諸如植物油基佐劑?？纱x的佐劑可以是可代謝油?？纱x油為通常存在于植物和動(dòng)物中的脂肪和油，而且其通常主要由三?；视偷幕旌衔锝M成，也稱為甘油三酯或中性脂肪。這些非極性水不溶性物質(zhì)是甘油的脂肪酸三酯。甘油三酯根據(jù)其三個(gè)脂肪酸殘基或側(cè)鏈的身份和布置而不同。
佐劑還可以是不可代謝的，是指佐劑由不能通過(guò)乳劑所施用的動(dòng)物對(duì)象的身體代謝的成分組成。適用于本發(fā)明組合物的不可代謝油包括烷烴、烯烴、炔烴，以及其相應(yīng)的酸和醇、其醚和酯，及其混合物。優(yōu)選地，所述油的個(gè)體化合物是輕質(zhì)烴混合物，即，此類組分具有6-30個(gè)碳原子。所述油可合成制備或從石油產(chǎn)品純化。用于本文所述的組合物的優(yōu)選的不可代謝油例如包括礦物油、石蠟油和環(huán)烷烴。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"礦物油"是指作為經(jīng)蒸餾技術(shù)得自礦脂的液態(tài)烴混合物的不可代謝佐劑油。如本文所用，該術(shù)語(yǔ)"液化石蠟"、"液體石蠟"和"白礦油"同義。如本文所用，該術(shù)語(yǔ)也意圖包括"輕質(zhì)礦物油"，即，通過(guò)礦脂蒸餾類似得到的油，但是該油相比白礦油具有稍微較低的比重。礦物油得自各種商業(yè)來(lái)源，例如，j.t.baker(phillipsburg,pa)、usbcorporation(cleveland,oh)。輕質(zhì)礦物油以名稱商業(yè)可得
佐劑包括但不限于emulsigen佐劑體系(mvplaboratories；ralston,ne),ribi佐劑體系(ribiinc.；hamilton,mt)、明礬、氫氧化鋁凝膠、水包油乳劑、油包水乳劑(諸如例如，freund'scompleteandincompleteadjuvants)、嵌段聚合物(cytrx；atlanta,ga)、saf-m(chiron；emeryville,ca)、
可以使用的各種組合的其他非限定性實(shí)例包括三萜系化合物加甾醇類(例如，quila/膽固醇，也稱為qac)、三萜系化合物加甾醇類、免疫調(diào)節(jié)劑和聚合物(例如，quila/膽固醇/dda/
用于本發(fā)明上下文中的佐劑和添加劑的量和濃度可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括包含約20μg至約2000μg佐劑的免疫原性組合物和疫苗。在另一實(shí)施方式中，佐劑以約100μg至約1500μg、或約250μg至約1000μg、或約350μg至約750μg的量包含。在另一實(shí)施方式中，佐劑以約500μg/2ml免疫原性組合物或疫苗的量包含。
所述免疫原性組合物和疫苗還包括抗生素。此類抗生素包括但不限于選自氨基糖苷類、碳青霉烯類、頭孢菌素類、糖肽類、大環(huán)內(nèi)酯類、青霉素類、多肽、喹諾酮類、磺胺類和四環(huán)素類類別的那些抗生素。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括含約1μg/ml至約60μg/ml抗生素的免疫原性組合物和疫苗。在另一實(shí)施方式中，免疫原性組合物和疫苗包含約5μg/ml至約55μg/ml抗生素，或約10μg/ml至約50μg/ml抗生素，或約15μg/ml至約45μg/ml抗生素，或約20μg/ml至約40μg/ml抗生素，或約25μg/ml至約35μg/ml抗生素。在又一實(shí)施方式中，免疫原性組合物和疫苗包含小于約30μg/ml的抗生素。
本發(fā)明所包括的免疫原性組合物和疫苗可包括一種或多種編碼病毒或細(xì)菌或病毒或細(xì)菌蛋白質(zhì)的多核苷酸分子。dna或rna分子可用在所述免疫原性組合物或疫苗中。dna或rna分子可在其他物質(zhì)不存在的情況下施用，或者其可無(wú)語(yǔ)促進(jìn)細(xì)胞攝入的物質(zhì)(例如，脂質(zhì)體或陽(yáng)離子脂質(zhì)體)一起施用。免疫原性組合物或疫苗中的總多核苷酸通常在約0.1μg/ml至約5.0mg/ml之間。在另一實(shí)施方式中，免疫原性組合物或疫苗中的總多核苷酸為約1μg/ml至約4.0mg/ml，或約10μg/ml至約3.0mg/ml，或約100μg/ml至約2.0mg/ml。利用核酸(dna或mrna)的疫苗和接種程序在現(xiàn)有技術(shù)中充分描述，例如美國(guó)專利號(hào)5,703,055、美國(guó)專利號(hào)5,580,859、美國(guó)專利號(hào)5,589,466，所有專利均通過(guò)參考并入本文。
除上述病毒或細(xì)菌外，本發(fā)明所包括的免疫原性組合物和疫苗可包括其他額外的抗原?？乖梢允俏⑸锏臏缁钔暾虿糠种苿?，或者是通過(guò)遺傳過(guò)程技術(shù)或化學(xué)合成獲得的抗原分子。按照本發(fā)明適合應(yīng)用的其他抗原包括但不限于源自下述的那些：病原病毒，諸如犬瘟病毒、犬皰疹病毒、犬流感病毒、狂犬病病毒；病原菌，諸如布拉迪斯拉發(fā)鉤端螺旋體(leptospirabratislava)、犬鉤端螺旋體(leptospiracanicola)、感冒傷寒型鉤端螺旋體(leptospiragrippotyphosa)、黃疸出血鉤端螺旋體(leptospiraicterohaemorrhagiae)、波摩那鉤端螺旋體(leptospirapomona)、哈德焦鉤端螺旋體(leptospirahardjobovis)、卟啉單胞菌屬(porphyromonasspp.)、類桿菌屬(bacteriodesspp.)、疏螺旋體屬(borreliaspp.)、鏈球菌屬(streptococcusspp.)(包括馬鏈球菌亞種獸疫(streptococcusequisubspecieszooepidemicus))、埃里希氏體屬(ehrlichiaspp.)、支原菌屬(mycoplasmaspp.)(包括犬支原體(mycoplasmacynos))和小孢子菌(microsporumcanis)?？乖€可源自致病真菌，諸如念珠菌屬，源自原生動(dòng)物，諸如隱孢子蟲、新孢子蟲、弓形蟲、艾美球蟲屬、巴貝蟲屬、賈第蟲屬、利什曼原蟲屬，或寄生蟲，諸如絳蟲屬、黃蠅屬、棘球絳蟲屬和并殖吸蟲屬。
形式、劑量和給藥途徑
本發(fā)明所包括的免疫原性組合物和疫苗可施用于動(dòng)物，以誘導(dǎo)針對(duì)cirdc的有效免疫反應(yīng)。因此，本發(fā)明提供了通過(guò)向動(dòng)物施用本文所述的治療有效量的免疫原性組合物或疫苗而刺激有效免疫反應(yīng)的方法。
本文所述的免疫原性組合物和疫苗可施用于動(dòng)物，以便為動(dòng)物接種抗的cirdc疫苗。所述免疫原性組合物和疫苗可以施用于動(dòng)物，以在動(dòng)物中預(yù)防或治療cirdc。因此，本文所述的是針對(duì)cirdc為動(dòng)物接種的方法，以及預(yù)防或治療cirdc的方法，包括向所述動(dòng)物施用治療有效量的本文所述的免疫原性組合物或疫苗。
取決于給藥途徑，本發(fā)明所包括的免疫原性組合物和疫苗可以各種形式制備。例如，所述免疫原性組合物和疫苗可以適合注射應(yīng)用的無(wú)菌水溶液或分散體來(lái)制備，或者利用冷凍干燥技術(shù)以凍干形式制備。凍干的免疫原性組合物和疫苗通常保持在約4℃，并且可在含或不含佐劑的穩(wěn)定溶液(例如，鹽水或hepes)中重構(gòu)。所述免疫原性組合物和疫苗可以混懸劑或乳劑形式制備。
本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗包括治療有效量的一種或多種上述微生物。純化的病毒和/或細(xì)菌可直接用在免疫原性組合物或疫苗中，或者可進(jìn)一步減毒或滅活。通常，免疫原性組合物或疫苗含約1×102至約1×1012病毒或細(xì)菌顆粒，或者約1×103至約1×1011顆粒，或者約1×104至約1×1010顆粒，或者約1×105至約1×109顆粒，或者約1×106至約1×108顆粒。免疫原性組合物或疫苗中有效提高保護(hù)效應(yīng)的微生物的精確量可由本領(lǐng)域人員確定。
所述免疫原性組合物和疫苗通常包含獸醫(yī)學(xué)可接受的的載體，其體積為約0.5ml至約5ml。在另一實(shí)施方式中，載體的體積為約1ml至約4，或約2ml至約3ml。在另一實(shí)施方式中，載體的體積為約1ml，或約2ml，或約5ml。適合用于免疫原性組合物和疫苗中的獸醫(yī)學(xué)可接受載體可以是上文所述那些中的任一種。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定病毒或細(xì)菌是否需要在施用之前減毒或滅活。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，病毒或細(xì)菌可直接施用于動(dòng)物而無(wú)需額外減毒。治療有效的微生物量取決于所用的特定微生物、動(dòng)物的狀況和/或感染的程度可以變化，而且可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。
按照本發(fā)明的方法，可將單劑量施用給動(dòng)物，或者可選地，可間隔約兩周至約十周進(jìn)行兩次或多次接種?？尚枰訌?qiáng)方案，而且劑量方案可進(jìn)行調(diào)整以提供最佳免疫。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定最佳施用方案。
免疫原性組合物和疫苗可直接施用于血流中、肌內(nèi)、內(nèi)臟中或皮下。用于腸胃外施用的合適的方法包括靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、肌內(nèi)和皮下施用。用于腸胃外施用的合適的器械包括針(包括顯微操作針)注射器和無(wú)針注射器。
腸胃外制劑通常是水溶液，其可含諸如鹽、碳水化合物、蛋白質(zhì)和緩沖劑(優(yōu)選達(dá)到下述ph：約3至約9，約4至約8，或約5至約7.5，或約6至約7.5，或約7至約7.5)的賦形劑，但是在一些應(yīng)用中，其可更適合配制成無(wú)菌非水溶液或干燥形式，或者與合適的媒介物(無(wú)菌、無(wú)熱原的水或鹽水)結(jié)合使用。
通過(guò)例如凍干在無(wú)菌條件下制備腸胃外制劑可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)制藥技術(shù)容易地完成。
腸胃外溶液的制備中所用的材料的溶度可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適的配制技術(shù)來(lái)增加，諸如引入溶解增強(qiáng)劑，其包括緩沖劑、鹽、表面活性劑、脂質(zhì)體、環(huán)糊精等。
用于腸胃外施用的組合物可以配制成立即釋放或緩和釋放。緩和釋放制劑包括延遲的、持續(xù)的、脈沖的、受控的、定向的以及程序化釋放。因此，免疫原性組合物和疫苗可作為固體、半固體或觸變性液體配制，用于作為植入貯劑施用，提供所述免疫原性組合物和疫苗的緩和釋放。
免疫原性組合物或疫苗施用的其他方式包括通過(guò)顯微操作針或無(wú)針(例如，powderjecttm,biojecttm等)注射來(lái)遞送。
在利用皮下或肌內(nèi)注射的情況中，優(yōu)等滲制劑。一般而言，用于等滲性的添加劑可包括綠環(huán)、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖。在具體情況中，采用諸如磷酸鹽緩沖鹽水的等滲溶液。所述制劑還可包括諸惡u凝膠和白蛋白的穩(wěn)定劑。在一些實(shí)施方式中，將血管收縮劑添加至所述制劑中。根據(jù)本發(fā)明的藥物制劑通過(guò)配制成無(wú)菌且無(wú)熱原的。然而，對(duì)于任何犬疫苗、多肽(抗原)亞單位免疫原性組合物和疫苗、重組病毒載體疫苗和dna疫苗而言，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知藥學(xué)上可接受的載體的配方是美國(guó)農(nóng)業(yè)部或者等價(jià)的外國(guó)政府機(jī)關(guān)(諸如加拿大或墨西哥)或者任一歐洲國(guó)家公布的法規(guī)中所批準(zhǔn)的那些藥物載體。因此，用于免疫原性組合物或疫苗商業(yè)化生產(chǎn)的藥學(xué)上可接受的載體是已經(jīng)經(jīng)美國(guó)或外國(guó)的適宜政府機(jī)關(guān)批準(zhǔn)或者將要批準(zhǔn)的載體。所述免疫原性組合物和疫苗還可與藥學(xué)上可接受的佐劑相混合。在所述免疫原性組合物和疫苗的某些配制中，該免疫原性組合物或疫苗與其他犬免疫原性組合物或疫苗相結(jié)合，生產(chǎn)出能夠使犬免受他犬病原體引起的多種疾病的多價(jià)產(chǎn)品。
檢測(cè)和診斷方法
在動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的程度和性質(zhì)可通過(guò)利用各種技術(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)。例如，可從接種動(dòng)物收集血清并測(cè)試對(duì)免疫原具有特異性的抗體存在與否。通過(guò)諸如t細(xì)胞增殖的測(cè)定可實(shí)現(xiàn)對(duì)淋巴組織中的相應(yīng)細(xì)胞毒性t-淋巴細(xì)胞(ctls)的檢測(cè)，其表示誘導(dǎo)了細(xì)胞免疫反應(yīng)。現(xiàn)有技術(shù)中充分描述了相關(guān)技術(shù)。
試劑盒
由于可能期望結(jié)合其他組合物或混合物來(lái)施用免疫原性組合物或疫苗，例如目的是治療特定疾病或病癥，因此，免疫原性組合物或疫苗可適宜地包括在適合施用或共施用所述組合物的試劑盒形式中，或者結(jié)合到其中，這在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
因此，本發(fā)明所包括的試劑盒可包含一種或多種單獨(dú)的藥物組合物，其中至少一種是按照本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗；以及用于單獨(dú)保存所述組合物的裝置，諸如容器、分隔瓶或分隔的箔包裝。此類試劑盒的實(shí)例是注射器和針等。本發(fā)明的試劑盒特別適合施用不同的劑型，例如經(jīng)口或腸胃外劑型，適合在不同的劑量間隔施用單獨(dú)的組合物，或者相互間滴定不同的組合物。為幫助施用本發(fā)明所包括的組合物，所述試劑盒通常包括施用說(shuō)明。
本發(fā)明包括的另一試劑盒進(jìn)而保護(hù)一種或多種用于檢測(cè)感染動(dòng)物的試劑。所述試劑盒可包括用于分析樣品中是否存在完整微生物、多肽、表位或多核苷酸序列的試劑。病毒、細(xì)菌、多肽或多核苷酸序列的存在可利用抗體、pcr、雜交以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他檢測(cè)方法來(lái)測(cè)定。
本發(fā)明包括的另一試劑盒可提供用于檢測(cè)抗特定表位的抗體的試劑。此類試劑用于分析樣品中抗體的存在，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易知曉和可用的。抗體的存在可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法來(lái)測(cè)定。
在某些實(shí)施方式中，試劑盒可包括一組印刷說(shuō)明書或者標(biāo)明該試劑盒用于檢測(cè)感染動(dòng)物的標(biāo)簽。
抗體
抗體可以是單克隆的、多克隆的或重組的?？贵w可針對(duì)免疫原或其部分來(lái)制備。例如，基于所述免疫原的氨基酸序列的合成肽或通過(guò)克隆技術(shù)重組制備的合成肽，或者其天然基因產(chǎn)物和/或部分，可被分離并用作免疫原。通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)抗體生產(chǎn)技術(shù)可使用免疫原來(lái)產(chǎn)生抗體?？贵w片段也可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法自抗體制備，并且其包括fab、f(ab')2和fv片段。
在生產(chǎn)抗體時(shí)，篩選所需的抗體可通過(guò)本領(lǐng)域已知的免疫性中的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)完成。一般而言，elisas和免疫印記法優(yōu)選的免疫測(cè)定類型。兩種測(cè)定法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。多克隆和單克隆抗體均可用于測(cè)定?？贵w可以固體載體底物結(jié)合，與可檢測(cè)部分綴合，或者結(jié)合且綴合，如本領(lǐng)域熟知的?？贵w與固體的結(jié)合也是本領(lǐng)域熟知的。考慮用于本發(fā)明的可檢測(cè)部分可包括但不限于熒光、金屬、酶和放射性標(biāo)記物，諸如生物素、金、鐵蛋白、堿性磷酸酯酶、b-半乳糖苷酶、過(guò)氧化物酶、脲酶、熒光素、若丹明、氚、14c和碘化作用。
本發(fā)明進(jìn)一步通過(guò)下述實(shí)施例來(lái)說(shuō)明，但是其絕不限于所述實(shí)施例。
實(shí)施例
實(shí)施例1：支氣管炎博德特氏菌細(xì)菌提取物亞單位疫苗的免疫原性
在研究中涉及32只約8周齡的帶有低支氣管炎博德特氏菌(微量凝集抗體(mat)滴度<16)的吡咯獵犬。將幼犬隨機(jī)分成兩個(gè)處理組(t1和t2)，每組16只。在接種之前，從t2去掉一只幼犬，原因是腹股溝疝。
按照表1所示的研究設(shè)計(jì)，在第0日和第21日將犬皮下接種適當(dāng)?shù)囊呙?。第一次接種時(shí)將疫苗在右肩區(qū)域施用于每只犬，第二次接種時(shí)在左肩區(qū)域施用。
在第42日，通過(guò)在plexiglas室中霧化30分鐘，用支氣管炎博德特氏菌鼻內(nèi)攻擊來(lái)自所有處理組的犬。一次攻擊四只犬，2只來(lái)自t1，2只來(lái)自t2，一組除外，該組僅有3只動(dòng)物，2只來(lái)自t1，1只來(lái)自t2，因?yàn)橄惹耙恢粍?dòng)物已從研究中去除。
主要的效力變量是咳嗽。所有其他變量(鼻涕、眼黏分泌物、噴嚏、抑郁、干嘔、呼吸音)被認(rèn)為是支持性次級(jí)變量。一天兩次(“觀察期間”；上午和下午)臨床觀察呼吸性疾病的跡象(包括咳嗽)，每個(gè)期間每個(gè)房間約30分鐘，從第42日直到第70日(研究結(jié)尾)。無(wú)論動(dòng)物在兩個(gè)連續(xù)觀察期間咳嗽與否，計(jì)算各動(dòng)物的攻擊后(post-challenge)。計(jì)算各動(dòng)物在兩個(gè)連續(xù)觀察期間的咳嗽/不咳嗽的頻率分布。用cohran-armitage試驗(yàn)分析兩個(gè)連續(xù)觀察期間的咳嗽/不咳嗽，針對(duì)房間進(jìn)行調(diào)整，原因在于利用概括性線性混合模型來(lái)分析數(shù)據(jù)是不可能的。計(jì)算各處理和時(shí)間點(diǎn)的鼻細(xì)菌分離的頻率分布(+/-)。還要測(cè)定各動(dòng)物是否曾經(jīng)具有攻擊后分離的細(xì)菌(bacteriaisolatedpost-challenge)。
針對(duì)各處理組，計(jì)算動(dòng)物是否曾具有攻擊后分離的支氣管炎博德特氏菌的頻率分布，并且如果可能的話，利用概括性線性混合模型對(duì)其進(jìn)行分析。計(jì)算各動(dòng)物的攻擊后鼻腔流出物(nasalsheddingpost-challenge)的持續(xù)時(shí)間并利用概述性線性混合模型進(jìn)行分析。將抗體滴度進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化，并利用概括線性混合模型分析重復(fù)的測(cè)量。
結(jié)果：接種之后在任一犬中均無(wú)疼痛或發(fā)燒(>39.5℃)報(bào)告。兩個(gè)處理組中一些犬被報(bào)告在接種時(shí)有抓痕。在第一次接種觀察后的3-6小時(shí)期間內(nèi)僅t2中的兩只犬報(bào)告了小尺寸的注射腫脹(2×2×1cm)。該數(shù)據(jù)表明，接種是安全的并且犬的耐受良好。
所有鹽水對(duì)照都發(fā)展了咳嗽，表示攻擊足夠。對(duì)照組中咳嗽的持續(xù)期間的最小二乘法(ls)平均值為20.3。對(duì)比而言，在預(yù)防接種中，疫苗使咳嗽的持續(xù)期間顯著降低至5.2的ls平均值，且p-值<.0001。另外，當(dāng)與對(duì)照相比時(shí)，在預(yù)防接種中的其他呼吸道臨床跡象，諸如干嘔和呼吸音均降低。
攻擊后細(xì)菌分離數(shù)據(jù)顯示，試驗(yàn)疫苗與鹽水對(duì)照(ls平均值25.3)相比顯著降低了接種組中的攻擊生物體的鼻腔流出物的持續(xù)時(shí)間(ls平均值為20.5)，且p-值為0.0061。該數(shù)據(jù)表明，疫苗在降低感染水平上是有效的，如通過(guò)接種中流出(shedding)的持續(xù)期間降低所證實(shí)的。
在t2組中接種后產(chǎn)生的抗體應(yīng)答(第21日和42日)類似于t1，這可能是由于凝集抗體測(cè)定的性質(zhì)之故，而且不缺乏抗原性。相比鹽水對(duì)照(ls平均值13)，在第70日時(shí)，觀察到在大多數(shù)攻擊后接種中誘導(dǎo)了強(qiáng)烈的既往應(yīng)答(ls平均值426)，表明免疫有效。
總言之，來(lái)自該研究的數(shù)據(jù)清楚表明，支氣管炎博德特氏菌細(xì)菌提取物(bacterialextract)亞單位疫苗通過(guò)降低咳嗽及鼻腔流出物的持續(xù)期間而展示出效力。
實(shí)施例2：可注射支氣管炎博德特氏菌疫苗的效力和安全性評(píng)價(jià)
在研究中涉及50只約8周齡的比格獵犬。將犬隨機(jī)分成5個(gè)處理組，每組10只。所有的動(dòng)物健康情形良好而且沒(méi)有接受任何博德特氏菌屬接種。預(yù)篩血清樣本的支氣管炎博德特氏菌為陰性，且在首次接種前微量凝集試驗(yàn)(mat)的滴度<16。在首次接種前通過(guò)細(xì)菌鼻拭子分離試驗(yàn)測(cè)定所有動(dòng)物均不含支氣管炎博德特氏菌(第0日)。
按照表2所示的研究設(shè)計(jì)，在第0日和第21日將動(dòng)物接種適當(dāng)?shù)囊呙?。第一次接種將t01、t02、t03和t04組的疫苗在右肩區(qū)域皮下施用于每只犬，第二次接種在左肩區(qū)域施用。t05組在第0日接受商業(yè)可得的鼻內(nèi)疫苗的單次鼻內(nèi)接種。該組最后接種，以防止活疫苗在住所傳播，并該組中的犬分開居住在不同的房間中，以防止暴露于其他組。
在第42日，通過(guò)在plexiglas室中霧化總計(jì)30分鐘，用支氣管炎博德特氏菌鼻內(nèi)攻擊來(lái)自所有處理組的犬。一次攻擊來(lái)自同一圍欄的五只犬(各處理組一只)。
主要的效力變量是咳嗽。細(xì)菌分離為次級(jí)變量。一天兩次(“觀察期間”；上午和下午)臨床觀察呼吸性疾病的跡象包括咳嗽)，每個(gè)期間每個(gè)房間約30分鐘，從第42日直到第62日，以及在第63日一次(上午)(研究結(jié)尾)。在咳嗽分析之前，用平方根反正弦變換來(lái)變換咳嗽的觀察期間百分比。利用概括線性混合模型分析咳嗽觀察期間的變換百分比以及咳嗽的天數(shù)。針對(duì)各動(dòng)物，計(jì)算攻擊后動(dòng)物咳嗽的觀察期間的百分比和攻擊后出現(xiàn)咳嗽的天數(shù)。
結(jié)果：在處理組t02和t04的犬的注射部位處觀察到輕微至中等腫脹(數(shù)據(jù)未顯示)。反應(yīng)的嚴(yán)重程度和所涉及的犬的數(shù)目在第二次接種后增加。在處理組t03中的幾只犬中觀察到溫和的注射部位反應(yīng)。在鹽水組t01中未觀察到可測(cè)量的注射腫脹。未觀察到臨床發(fā)燒(>39.5℃)，只有t02組中的一只犬在接種后第4日除外。在任一接種犬中沒(méi)有疼痛報(bào)告。
支氣管炎博德特氏菌攻擊接種在全部未接種的對(duì)照中誘導(dǎo)了咳嗽(53.3％，咳嗽14.7天)，說(shuō)明攻擊適于評(píng)價(jià)試驗(yàn)疫苗。所得的t05組(其接受了商業(yè)鼻內(nèi)疫苗(陽(yáng)性對(duì)照))的結(jié)果，顯示出在攻擊后直至2日觀測(cè)咳嗽為4.6％，這表明攻擊水平是最佳的而且不是勢(shì)不可擋的。
在該研究中評(píng)價(jià)了三種試驗(yàn)制劑。t02在攻擊后直至6日具有16.1％的觀測(cè)咳嗽，t03在攻擊后直至10.5日具有34.7％的觀測(cè)咳嗽，而t04在攻擊后直至10.7日具有34.5％的觀測(cè)咳嗽。因此，相比未接種的對(duì)照，所有接種組顯示出降低的咳嗽得分。接種了添加有百日咳桿菌粘附素和佐劑qcdc的支氣管炎博德特氏菌細(xì)菌提取物的t02組，在咳嗽得分標(biāo)準(zhǔn)上顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的降低。因此，發(fā)現(xiàn)t02中所測(cè)試的制劑的效力是有效的。
實(shí)施例3.含支氣管炎博德特氏菌的疫苗在犬中的安全性和效力
選擇五十(50)只犬進(jìn)行研究，將其分成5個(gè)處理組?；诘?4日的體檢來(lái)確定動(dòng)物是否適合該研究。
在每次接種前，在研究的第-2日、第21日和第28日在sst試管中從所有動(dòng)物收集血樣(約8ml)，用于血清學(xué)。在第-2日收集的血清樣本用于確認(rèn)動(dòng)物不含支氣管炎博德特氏菌。在接種前第0日收集鼻拭子，并測(cè)試支氣管炎博德特氏菌的存在。在第-4日開始，收集鼓膜溫度，以便在接種前建立基線。
按照表3所示的研究設(shè)計(jì)，在第0日、第21日和第28日將犬接種適當(dāng)?shù)囊呙?。第一次接種時(shí)將疫苗在右肩區(qū)域皮下施用于每只犬，第二次接種時(shí)在左肩區(qū)域施用。
在接種第0、21和28日觀察所有動(dòng)物的接種后注射部位反應(yīng)。從1-7日和第22-35日每日觀察接種后所述動(dòng)物的注射反應(yīng)。在第0-7日和第21-35日收集鼓膜溫度。
在攻擊前一日，即第55日收集血樣(約6ml)，用于血清學(xué)。在攻擊前，于第54、55和56日收集鼓膜溫度。在攻擊前一日，即第55日收集鼻拭子，并測(cè)試支氣管炎博德特氏菌的存在。在第54和55日，每日兩次(上午和下午)，以及在第56日的上午，每次期間約30分鐘，觀察動(dòng)物的呼吸道疾病的臨床癥狀，以便建立基線值。
利用支氣管炎博德特氏菌攻擊菌株來(lái)制備109cfu/4ml/犬的目標(biāo)攻擊劑量。在第56日，通過(guò)在plexiglas室對(duì)被攻擊的各圍欄霧化總計(jì)30分鐘，用支氣管炎博德特氏菌鼻內(nèi)攻擊來(lái)自所有處理組的犬。一次攻擊來(lái)自同一圍欄的五只犬(各處理組一只)。
在攻擊后從第56-77日，每日一次記錄鼓膜溫度。一天兩次(“觀察期間”；上午和下午)臨床觀察呼吸性疾病的跡象(包括咳嗽)，每個(gè)期間每個(gè)房間約30分鐘，從第56日直到第76日，以及在第77日一次。簡(jiǎn)言之，利用下述計(jì)分系統(tǒng)觀察咳嗽、鼻涕、噴嚏、眼黏分泌物、干嘔和抑郁：無(wú)(0)、溫和(1)、中等(2)和嚴(yán)重(3)。在第59、62、66、69、74、76和77日收集鼻拭子，測(cè)定攻擊生物體的流出。
在第77日收集血樣(約6ml)，用于血清學(xué)。利用拭子和輸送介質(zhì)收集鼻拭子，用于分離支氣管炎博德特氏菌。
支氣管炎博德特氏菌的凝集抗體通過(guò)微量凝集試驗(yàn)(mat)來(lái)測(cè)定。從第0、28、55和77日，滴定來(lái)自處理組t04和t05的血清樣本，通過(guò)血清中和反應(yīng)和ifa測(cè)定crcov抗體，以及通過(guò)hai測(cè)定civ。按照標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行支氣管炎博德特氏菌從鼻拭子的分離。對(duì)各樣品定性測(cè)試細(xì)菌存在與否。
結(jié)果.在第0日，五十(50)只健康的約8周齡比格小獵犬經(jīng)鼻拭子培養(yǎng)物分離證實(shí)不含支氣管炎博德特氏菌生物體。通過(guò)mat來(lái)評(píng)價(jià)血清樣本的支氣管炎博德特氏菌凝集抗體可證實(shí)，所有小獵犬在第-2日均易感染，mat滴度為8。
在該研究中評(píng)價(jià)的所有實(shí)驗(yàn)疫苗在首次接種后產(chǎn)生輕微至無(wú)注射腫脹。對(duì)于大部分接種而言，注射腫脹限于研究的第0日。在第二次接種后也報(bào)告了輕微至無(wú)注射腫脹。在其發(fā)生時(shí)，注射部位腫脹在第二次接種后一至三天減退。主要在5-途徑聯(lián)合組(t04)中報(bào)告抓痕。接種后未報(bào)告臨床發(fā)燒。在鹽水組中未報(bào)告注射腫脹。所述數(shù)據(jù)證實(shí)了疫苗的安全性。
在攻擊接種之前和之后進(jìn)行的菌落計(jì)數(shù)證實(shí)，平均1.45x108cfu博德特氏菌屬/犬在室中被霧化。攻擊接種在全部鹽水對(duì)照犬(t02)中誘導(dǎo)咳嗽，其中平均觀察咳嗽百分比為43.5％，咳嗽天數(shù)為12.2天。類似于鹽水對(duì)照，僅接種4-途徑病毒(crcov/civ/cpiv/cav2)而沒(méi)有博德特氏菌屬抗原的處理組t05發(fā)展了咳嗽，其中平均觀察咳嗽百分比為43.4％，咳嗽天數(shù)為12.2天。這些發(fā)現(xiàn)表明，攻擊對(duì)評(píng)價(jià)試驗(yàn)疫苗適當(dāng)且一致。
當(dāng)與對(duì)照組相比時(shí)(咳嗽12.2天)，接種博德特氏菌屬疫苗的處理組t01中的犬顯著地免受攻擊(咳嗽3.6天，p<0.0001)。當(dāng)間隔3周施用時(shí)，相同的疫苗也顯著地保護(hù)t03中的犬(咳嗽5.8天，p＝0.0004)。該兩組(t01對(duì)t03)中的咳嗽得分上的降低并非顯著不同(p-值＝0.1883)，表明3周或4周間隔施用的疫苗的保護(hù)水平是類似的。
當(dāng)與對(duì)照組相比(咳嗽12.2天)，以及與接受4-途徑病毒(crcov/civ/cpiv/cav2)聯(lián)合的t05相比(咳嗽12.1天，p＝0.0019)，接受不加佐劑的5-途徑聯(lián)合疫苗的t04中的犬顯著(p＝0.0016)防御博德特氏菌屬攻擊(咳嗽6.6天)，這說(shuō)明了博德特氏菌屬部分在缺乏佐劑的聯(lián)合疫苗中的效力。
對(duì)5-途徑聯(lián)合疫苗中病毒部分的血清學(xué)評(píng)價(jià)僅對(duì)兩部分是可能的。civ和crcov，其中在研究第-2日證實(shí)犬是血清陰性的。在研究的第56日，在4-途徑疫苗組(t04)中的civhai應(yīng)答數(shù)字上類似于5-途徑疫苗組(t05)，說(shuō)明不存在博德特氏菌屬部分對(duì)civ抗原的干擾。在研究的第56日，在4-途徑疫苗組(t04)中的crcovsn應(yīng)答數(shù)字上高于5-途徑疫苗組(t05)，說(shuō)明博德特氏菌屬可能對(duì)crcov部分具有干擾。然而，這些發(fā)現(xiàn)并非決定性的，因?yàn)檫@些疫苗未加佐劑，而且制劑并非最佳化的，以及并未進(jìn)行crcov攻擊來(lái)測(cè)試效力。
單價(jià)博德特氏菌屬疫苗經(jīng)證實(shí)是安全且有效的。當(dāng)疫苗以21或28天間隔給予時(shí)，展示了單價(jià)疫苗的效力。當(dāng)以5-途徑不含佐劑的聯(lián)合疫苗給予時(shí)，博德特氏菌屬部分也顯示是有效的。
實(shí)施例4.多價(jià)血清學(xué)研究
通過(guò)微量凝集試驗(yàn)(mat)對(duì)約8周齡且健康情形良好的五十只犬預(yù)篩支氣管炎博德特氏菌，以及通過(guò)間接熒光抗體測(cè)定(ifa)對(duì)其預(yù)篩犬呼吸道冠狀病毒(crcov)。還利用血清中和反應(yīng)(sn)來(lái)評(píng)價(jià)抗體水平。在第0日，如通過(guò)mat(≤16)所測(cè)定，所有犬對(duì)支氣管炎博德特氏菌的抗體呈陰性，如通過(guò)ifa(<40)所測(cè)定，所有犬對(duì)crcov的抗體呈陰性。在首次接種前(第0日)，所有犬也不含支氣管炎博德特氏菌和crcov，如通過(guò)鼻拭子分離試驗(yàn)所測(cè)定。
犬分成5個(gè)處理組，每組8只犬，并按照表4所示的研究設(shè)計(jì)接種。第一次接種時(shí)將疫苗在右肩區(qū)域施用于每只犬，第二次接種時(shí)在左肩區(qū)域施用。
在第二次接種之后，由于并發(fā)癥，將t04和t05組從研究中去除。每日觀察剩余組(t01、t02和t03)中的犬的接種后反應(yīng)，并且在每次接種后監(jiān)控體溫(鼓膜)，連續(xù)7天。在第0、21、42和56日從犬中收集血樣，以測(cè)量抗體應(yīng)答。
對(duì)來(lái)自第0、21、42和56日的血清樣本通過(guò)mat測(cè)定測(cè)試針對(duì)支氣管炎博德特氏菌的凝集抗體。對(duì)來(lái)自同一天的血清樣本進(jìn)行滴定，以通過(guò)血清中和反應(yīng)測(cè)定crcov抗體，通過(guò)hai測(cè)定civ，研究通過(guò)血清中和反應(yīng)測(cè)定cav-2和cpi抗體。得到各處理組的幾何平均抗體滴度。
結(jié)果：
在第二劑量后，t02和t03組中的試驗(yàn)疫苗在全部(100％)接種犬中誘導(dǎo)抗體應(yīng)答，表明對(duì)病毒抗原自動(dòng)免疫接種。在大部分接種犬中，第二次接種后抗體應(yīng)答增加，表明第二次接種具有加強(qiáng)作用。重要的是注意到，在多種病毒和細(xì)菌(支氣管炎博德特氏菌)抗原存在下，在病毒部分之間實(shí)現(xiàn)了的抗體應(yīng)答，表明不存在免疫干擾。mat血清學(xué)與防御博德特氏菌屬無(wú)關(guān)，但是可作為引入合適的研究動(dòng)物的有價(jià)值的篩選工具。總言之，基于免疫接種犬中的免疫應(yīng)答，在5途徑多價(jià)疫苗中預(yù)測(cè)到病毒抗原的效力。
實(shí)施例5.免疫研究的持續(xù)時(shí)間
a.單價(jià)：
該研究的目的是證明支氣管炎博德特氏菌提取物-亞單位疫苗在8周齡犬中抗病毒性支氣管炎博德特氏菌攻擊的免疫持續(xù)時(shí)間。
所有動(dòng)物健康情形良好，并且沒(méi)有接受任何博德特氏菌屬接種。在首次接種前，動(dòng)物對(duì)支氣管炎博德特氏菌具有低抗體滴度(≤16)或者無(wú)抗體滴度，如通過(guò)微量凝集試驗(yàn)(mat)所測(cè)定的。在首次接種前，所有動(dòng)物也不含支氣管炎博德特氏菌，如通過(guò)細(xì)菌鼻拭子分離試驗(yàn)所測(cè)定的。
將犬分成2個(gè)處理組；一組接受安慰劑疫苗，而另一組接受補(bǔ)充有重組抗原的支氣管炎博德特氏菌提取物。該抗原為百日咳桿菌粘附素、bsp22，或者二者。對(duì)動(dòng)物接種兩次，間隔約3-4周。在每次接種后，觀察其注射部位反應(yīng)。
接種后約6-12個(gè)月，通過(guò)用支氣管炎博德特氏菌霧化來(lái)攻擊所有處理組的犬。在攻擊之前和之后測(cè)定攻擊劑量和攻擊接種物的純度。在攻擊之前和之后進(jìn)行臨床觀察。
收集鼻拭子，用于分離支氣管炎博德特氏菌。收集各動(dòng)物的血液，用于血清。通過(guò)mat測(cè)定對(duì)支氣管炎博德特氏菌的凝集抗體。利用elisa，滴定血清樣本的百日咳桿菌粘附素-特異性igg抗體反應(yīng)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序從鼻拭子進(jìn)行支氣管炎博德特氏菌的分離。
咳嗽、博德特氏菌屬分離(攻擊后)和接種后血清學(xué)反應(yīng)是用于評(píng)判研究中的疫苗效力的標(biāo)準(zhǔn)。
b.多價(jià)：
該研究的目的是證明多價(jià)呼吸道聯(lián)合疫苗在犬中的免疫持續(xù)時(shí)間。所述疫苗含下述抗原組分：修飾的-活cav-2、修飾的-活cpiv、滅活的civ、滅活的crcov，以及補(bǔ)充有重組抗原的支氣管炎博德特氏菌提取物，所述重組抗原為百日咳桿菌粘附素、bsp22，或者為兩者。
所有動(dòng)物健康情形良好，并且沒(méi)有接受所述疫苗旨在防護(hù)的任一種病原體的接種。將犬分成多組處理組。每組由兩個(gè)處理組組成。對(duì)照組接受安慰劑疫苗，接種疫苗組接受測(cè)試疫苗。對(duì)動(dòng)物接種兩次，間隔約2-4周。在每次接種后，觀察其注射部位反應(yīng)。
接種后約6-12個(gè)月，通過(guò)用疫苗旨在防護(hù)的病原體之一來(lái)攻擊各組兩個(gè)處理組(接種疫苗和對(duì)照)。在攻擊之前和之后進(jìn)行臨床觀察。在攻擊后期間，收集鼻拭子，用于分離攻擊病原體。收集各動(dòng)物的血液，用于獲取血清，其用于隨后的分析性分析。
呼吸道疾病的臨床癥狀、攻擊后病原體流出和血清學(xué)反應(yīng)是用于評(píng)判疫苗效力的標(biāo)準(zhǔn)。
因此已經(jīng)詳細(xì)描述了本發(fā)明的各實(shí)施方式，應(yīng)理解，所附權(quán)利要求定義的本發(fā)明并不局限于上面說(shuō)明書所述的特定細(xì)節(jié)，因?yàn)槠浜芏囡@而易見的變體在不背離本發(fā)明精神或范圍的情況下是可能的。
上述所有參考文獻(xiàn)因此通過(guò)參考引入，如同其在本文中被完整闡述。