本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術領域，特別涉及氯化二亞苯基碘鎓用于制備細菌感染治療藥物的用途。

背景技術：

感染性疾病是指病原微生物入侵機體并在局部或全身大量繁殖所引發(fā)的器質(zhì)性或功能性損害，是導致臨床患者死亡的主要因素之一。細菌是最為常見的病原微生物，細菌進入機體中，一方面通過侵襲定植或釋放毒素等形式直接造成組織臟器損傷，另一方面細菌的菌體成分還可刺激機體炎癥細胞活化，誘導tnf-α、il-1、il-6和hmgb-1等炎癥介質(zhì)的大量釋放，進而引發(fā)失控性炎癥反應并導致機體多器官、多系統(tǒng)的損傷和功能紊亂。最終導致患者死亡。

抵御細菌感染主要依賴于外源性的抗菌藥物和機體自身的免疫防御功能?？股氐膽煤透掳l(fā)展曾一度使得細菌性疾病得到有效的控制，但由于細菌耐藥性的增加以及多重耐藥細菌的不斷出現(xiàn)，以抗生素為代表的抗菌藥物的研發(fā)和應用已陷入困境。在此情況下，從提高機體自身免疫防御的角度出發(fā)，積極尋找新型抗菌藥物，對于拓寬細菌感染、特別是耐藥菌感染的解決措施就具有重要的意義。

機體的天然免疫系統(tǒng)是應對病原體入侵的第一道免疫防線。天然免疫細胞的吞噬效應對其發(fā)揮抗菌防御功能至關重要。巨噬細胞因廣泛分布于皮膚以及各組織臟器中，因而在天然免疫細胞中最先感知和抵御病原體入侵。研究表明，巨噬細胞通過直接吞噬作用，經(jīng)內(nèi)體-溶酶體途徑介導對病原體的降解清除。吞噬作用也可與細胞自噬作用結合，加快巨噬細胞內(nèi)體的酸化成熟及其與溶酶體的結合，提高對酵母真菌等的處理能力。另一方面，巨噬細胞吞噬病原體后，也可經(jīng)抗原提呈作用活化特異性免疫反應，進一步加強對病原體的清除作用?；谏鲜稣J識，巨噬細胞的吞噬能力對于機體抗菌免疫防御非常重要，基于調(diào)節(jié)細胞吞噬能力的策略有望為尋找感染性疾病的新型藥物靶點提供新思路。

氯化二亞苯基碘鎓（diphenyleneiodoniumchloride,dpi）屬于聯(lián)苯碘類化合物，最早發(fā)現(xiàn)其具有抑制糖異生的效應，可導致血糖降低。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，該化合物的藥理作用主要與其抑制nadph氧化酶的活性，進而抑制呼吸鏈有關。研究表明，氯化二亞苯基碘鎓可能通過與nadph氧化酶的黃素基團發(fā)生相互作用而抑制相應電子轉運體，從而抑制電子傳遞和ros產(chǎn)生，上述作用機制也是目前該化合物的公認藥理機制。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種氯化二亞苯基碘鎓在制備治療細菌感染藥物中的用途，該藥物可上調(diào)天然免疫細胞對細菌的吞噬活性，抑制細菌感染所致的炎癥反應，增強機體對細菌的抵抗能力。其特點是通過增加機體天然免疫細胞的吞噬能力實現(xiàn)對細菌的吞噬和殺傷，是一種在預防及治療細菌感染性疾病的新型的抗菌藥物。

本發(fā)明的技術方案是：

氯化二亞苯基碘鎓在制備治療細菌感染藥物中的用途。

所述的細菌為革蘭陽性細菌或革蘭陰性細菌。

所述藥物用于增加機體天然免疫細胞的吞噬能力。

所述天然免疫細胞為單核巨噬細胞或中性粒細胞。

所述氯化二亞苯基碘鎓為碘鎓鹽類化合物，其分子量為314.55，化學結構式為c12h8cli。分子結構如下：

所述藥物按照每公斤體重0.1-1mg給藥，每天1次，給藥方式為靜脈注射。

申請人對氯化二亞苯基碘鎓的促吞噬和抗菌、抗炎活性進行了研究，發(fā)現(xiàn)氯化二亞苯基碘鎓可增強巨噬細胞對革蘭氏陰性和陽性細菌的吞噬作用，抑制細菌感染所致的炎癥反應損傷，提高細菌感染小鼠模型的存活率。因此，該化合物可通過增強機體自身細胞的吞噬能力從而實現(xiàn)抗感染作用，并為其可能作為抗感染藥物應用到臨床奠定基礎。

申請人對氯化二亞苯基碘鎓的體外促吞噬作用進行了藥理學研究，實驗表明，其可促進小鼠巨噬細胞吞噬革蘭陽性菌和革蘭陰性菌，且該作用與其促進鈣離子內(nèi)流、上調(diào)肌動蛋白的活性有關；同時，氯化二亞苯基碘鎓可在體內(nèi)外抑制細菌感染導致的炎癥反應，降低小鼠組織細菌計數(shù)，提高存活率。申請人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，氯化二亞苯基碘鎓介導巨噬細胞的吞噬和殺菌活性與其對nadph氧化酶和ros的抑制效應無關，因此是一種新穎的藥理作用。

本發(fā)明所述藥物并非直接針對細菌，而是通過誘導或增強機體的自噬效應而實現(xiàn)，故對細菌的殺傷效應具有廣譜性的特點，特別是對耐藥細菌也具有良好的殺菌活性，可用于預防、治療細菌感染性疾病相關藥物的開發(fā)。

附圖說明

圖1為氯化二亞苯基碘鎓對小鼠巨噬細胞吞噬大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌效應的影響，圖中，ec：大腸埃希菌；sa：金黃色葡萄球菌；dpi：氯化二亞苯基碘鎓，**：p<0.01；

圖2為氯化二亞苯基碘鎓促進小鼠巨噬細胞吞噬大腸埃希菌作用的時效和量效關系測定,圖中，ec：大腸埃希菌；dpi：氯化二亞苯基碘鎓；其中圖2a表示不同濃度的氯化二亞苯基碘鎓對小鼠巨噬細胞吞噬大腸埃希菌的影響。圖2b表示氯化二亞苯基碘鎓作用不同時間后對小鼠巨噬細胞吞噬大腸埃希菌的影響；

圖3為氯化二亞苯基碘鎓促進小鼠巨噬細胞吞噬大腸埃希菌作用的特異性檢測，圖中，ec：大腸埃希菌；dpi：氯化二亞苯基碘鎓，**：p<0.01。其中圖3a表示細胞色素d對氯化二亞苯基碘鎓促進小鼠巨噬細胞吞噬大腸埃希菌的影響，3b表示溫度對氯化二亞苯基碘鎓促進小鼠巨噬細胞吞噬大腸埃希菌的影響；

圖4為三種nadph氧化酶抑制劑對大腸埃希菌誘導巨噬細胞胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生以及對小鼠巨噬細胞吞噬大腸埃希菌的影響，圖中，nc：陰性對照；ec：大腸埃希菌；dpi：氯化二亞苯基碘鎓；va：vas2870；eb：ebselen，**：p<0.01。其中圖4a表示三種nadph氧化酶抑制劑氯化二亞苯基碘鎓，vas2870和ebselen對大腸埃希菌誘導巨噬細胞胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生的影響，4b表示氯化二亞苯基碘鎓，vas2870和ebselen對巨噬細胞吞噬大腸埃希菌的影響。

圖5為氯化二亞苯基碘鎓對大腸埃希菌刺激小鼠巨噬細胞釋放炎癥介質(zhì)的抑制活性檢測，圖中，nc：陰性對照，ec：大腸埃希菌；dpi：氯化二亞苯基碘鎓，**：p<0.01。其中圖5a表示氯化二亞苯基碘鎓對大腸埃希菌誘導的小鼠巨噬細胞tnf-a，il-6mrna表達的影響，5b表示氯化二亞苯基碘鎓對大腸埃希菌誘導的小鼠巨噬細胞隨時間變化釋放tnf-a，il-6的影響；

圖6為氯化二亞苯基碘鎓介導鈣離子內(nèi)流和肌動蛋白聚集，進而上調(diào)巨噬細胞吞噬活性的作用檢測。圖中，m：未處理對照組，ec：大腸埃希菌，dpi：氯化二亞苯基碘鎓，egta和bapta：鈣離子螯合劑，**：p<0.01。其中圖6a表示氯化二亞苯基碘鎓對巨噬細胞胞漿鈣離子水平的影響，圖6b表示鈣離子螯合劑對氯化二亞苯基碘鎓介導的巨噬細胞吞噬能力的影響，圖6c表示氯化二亞苯基碘鎓對肌動蛋白聚合能力的影響。

圖7為氯化二亞苯基碘鎓對大腸埃希菌感染小鼠組織菌計數(shù)、炎癥介質(zhì)水平和生存率的影響，圖中，ns：生理鹽水；ec：大腸埃希菌；dpi：氯化二亞苯基碘鎓，*：p<0.05，**：p<0.01。其中圖7a表示氯化二亞苯基碘鎓對大腸埃希菌感染小鼠存活率的影響，7b表示氯化二亞苯基碘鎓對大腸埃希菌感染小鼠后肺組織（左）以及腹腔液和腹腔巨噬細胞胞內(nèi)細菌加載量（右）的影響，圖7c和7d表示氯化二亞苯基碘鎓對大腸埃希菌感染小鼠后肺、脾、肝組織以及血清中tnf-α和il-6產(chǎn)生的影響。

具體實施方式

本發(fā)明所述試劑和儀器如下：

試劑：氯化二亞苯基碘鎓、vas2870、ebselen、皂苷、egta、bapta、dcfh-da購于sigm-aldrich公司；

細胞色素d購于selleck公司；

f-actin染色試劑盒購于abcam公司；

大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌購于美國標準生物制品收藏中心（atcc）；

細胞培養(yǎng)基dmem購于lifetechnologies公司；

用于配制lb液體培養(yǎng)基的酵母提取物和胰蛋白胨購于oxoid公司；

氯化鈉購于成都科隆化學品有限公司；

dmso購于biosharp公司；

抗生素頭孢美唑鈉購于重慶藥友制藥有限公司；

tnf-α和il-6檢測試劑盒購于ebioscience公司；

rna提取試劑盒購于天根生化科技有限公司；

反轉錄試劑盒和rt-pcr試劑盒購于toyobo公司；

tnf-α和il-6引物由上海生工生物工程有限公司合成。

儀器：多功能讀數(shù)儀器（thermovarioskanflash），酶標儀（伯樂smartspecplus），細菌菌落計數(shù)儀（迅數(shù)菌落計數(shù)儀），實時熒光定量pcr儀（伯樂cfx96real-timesystem），二氧化碳培養(yǎng)箱（thermo3111型），恒溫孵箱（上海精宏實驗設備有限公司dnp-9162型），超凈工作臺（蘇凈vs-1300l-u型）。

實施例1：氯化二亞苯基碘鎓對小鼠巨噬細胞吞噬大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌效應的影響

1.1實驗方法：將體外培養(yǎng)的小鼠巨噬細胞接種至24孔無菌細胞培養(yǎng)板中，細胞密度為5×10⁵/ml，1ml/孔。挑取種植于營養(yǎng)瓊脂平板上的大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌菌株的單個菌落，轉入lb培養(yǎng)基中增菌至對數(shù)生長期（od600約為0.5-0.8），調(diào)整菌液濃度為5×10⁷cfu/ml，取10μl加入預先接種小鼠巨噬細胞的24孔板中，同時加入氯化二亞苯基碘鎓10μm，以加入同等體積dmso作為對照組，37℃，5%co2培養(yǎng)1h，加入抗生素殺滅胞外細菌后移除培養(yǎng)上清，細胞用200μl0.3%皂苷裂解，裂解液稀釋10倍后取100μl涂布營養(yǎng)瓊脂板上，37℃孵育12h，菌落計數(shù)儀計數(shù)細菌菌落數(shù)。吞噬指數(shù)=胞內(nèi)細菌數(shù)/加樣總細菌數(shù)。

1.2實驗結果：由圖1結果可知，氯化二亞苯基碘鎓處理細胞后其吞噬指數(shù)顯著增加，表明氯化二亞苯基碘鎓可有效促進小鼠巨噬細胞對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的吞噬作用。

實施例2：氯化二亞苯基碘鎓促進小鼠巨噬細胞吞噬大腸埃希菌作用的時效和量效關系測定

2.1實驗方法：采用不同濃度（0.625，1.25，2.5，5，10μm）的氯化二亞苯基碘鎓處理小鼠巨噬細胞，或采用同一濃度（10μm）氯化二亞苯基碘鎓分別作用不同時間（0.5，1，1.5，2，2.5h）后，檢測氯化二亞苯基碘鎓對細胞吞噬大腸埃希菌的吞噬指數(shù)，具體操作方法同1.1。

2.2實驗結果：由圖2a結果可知，隨著氯化二亞苯基碘鎓濃度的增加，其吞噬指數(shù)不斷升高。同時由圖2b結果可知，隨著氯化二亞苯基碘鎓作用時間的延長，其吞噬指數(shù)也不斷升高。以上結果表明氯化二亞苯基碘鎓成劑量依賴性和時間依賴性方式促進細胞對細菌的吞噬。

實施例3：氯化二亞苯基碘鎓促進小鼠巨噬細胞吞噬大腸埃希菌作用的特異性檢測

3.1實驗方法：巨噬細胞的接種和細菌培養(yǎng)方法同1.1，加入氯化二亞苯基碘鎓（10μm）或同時加入細胞色素d（2.5μm）處理，按照1.1方法檢測細胞對細菌的吞噬指數(shù)。同時將細胞分別置于4℃或37℃環(huán)境下，加入氯化二亞苯基碘鎓處理后，檢測細胞對細菌的吞噬指數(shù)。

3.2實驗結果：由圖3a結果可知，細胞色素d是公認的細胞吞噬抑制劑，氯化二亞苯基碘鎓處理細胞后可顯著增加細胞對細菌的攝取能力，同時加入細胞色素d處理后相對于單獨氯化二亞苯基碘鎓組其細胞對細菌的攝取能力顯著降低，表明氯化二亞苯基碘鎓促進細胞對細菌的攝取能力是通過促進其吞噬能力實現(xiàn)的。由圖3b結果可知，低溫可降低細胞的吞噬能力，正常未處理細胞置于4℃時比37℃時的吞噬能力顯著降低，加入氯化二亞苯基碘鎓處理后置于4℃時同樣比37℃時的細胞攝取細菌的能力顯著降低。以上結果表明氯化二亞苯基碘鎓可通過促進巨噬細胞吞噬能力增強對細菌的攝取和清除。

實施例4：三種nadph氧化酶抑制劑對大腸埃希菌誘導巨噬細胞胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生以及對小鼠巨噬細胞吞噬大腸埃希菌的影響

4.1實驗方法：將體外培養(yǎng)的小鼠巨噬細胞接種至24孔無菌細胞培養(yǎng)板中，細胞密度為5×10⁵/ml，1ml/孔。按照1.1方法加入大腸埃希菌，同時分別加入二亞苯基碘鎓、vas2870和ebselen三種nadph氧化酶抑制劑各10μm作用小鼠巨噬細胞，以加入同等體積dmso作為對照組，37℃，5%co2培養(yǎng)1h，加入活性氧熒光探針dcfh-da，37℃，5%co2繼續(xù)孵育20min，更換培養(yǎng)基，激光共聚焦顯微鏡檢測胞內(nèi)活性氧探針熒光強度。同時檢測二亞苯基碘鎓，vas2870和ebselen對細胞吞噬大腸埃希菌的吞噬指數(shù)，具體操作方法同1.1。

4.2實驗結果：由圖4a結果可知，大腸埃希菌可誘導小鼠巨噬細胞胞內(nèi)活性氧水平升高，加入三種nadph氧化酶抑制劑后其活性氧水平均顯著降低，表明二亞苯基碘鎓，vas2870和ebselen可有效抑制大腸埃希菌誘導小鼠巨噬細胞活性氧的產(chǎn)生。由圖4b結果可知，二亞苯基碘鎓可顯著增強小鼠巨噬細胞對大腸埃希菌的吞噬作用，另兩種nadph氧化酶抑制劑vas2870和ebselen對小鼠巨噬細胞吞噬細菌無促進作用。以上結果表明，二亞苯基碘鎓促進小鼠巨噬細胞的吞噬作用與其對nadph氧化酶的抑制無關。

實施例5：氯化二亞苯基碘鎓對大腸埃希菌刺激小鼠巨噬細胞釋放炎癥介質(zhì)的抑制活性檢測

5.1實驗方法：將體外培養(yǎng)的小鼠巨噬細胞接種至96孔無菌細胞培養(yǎng)板中，細胞密度為5×10⁵/ml，200μl/孔。大腸埃希菌按照1.1方法培養(yǎng)后，調(diào)整菌液濃度為5×10⁷cfu/ml加樣。取氯化二亞苯基碘鎓（10μm）和細菌（5×10⁵cfu/ml）加入預先接種的細胞，37℃，5%co2孵育2-10h，分別取上清稀釋后檢測tnf-α和il-6。取培養(yǎng)4h細胞提取rna，反轉錄后進行rt-pcr，檢測tnf-α和il-6mrna水平的表達情況。

5.2實驗結果：由圖5a結果可知，大腸埃希菌感染后，小鼠巨噬細胞tnf-α和il-6mrna表達顯著上調(diào)，而加入氯化二亞苯基碘鎓處理可顯著降低tnf-α和il-6mrna水平。同時由圖5b結果可知，對上清tnf-α和il-6的檢測發(fā)現(xiàn)，大腸埃希菌加入后2-10h可觀察到tnf-α和il-6持續(xù)釋放，而氯化二亞苯基碘鎓處理組以時間依賴的方式明顯抑制tnf-α和il-6的釋放。

實施例6：氯化二亞苯基碘鎓對小鼠巨噬細胞胞漿鈣離子水平和肌動蛋白聚合的影響

6.1實驗方法：將體外培養(yǎng)的小鼠巨噬細胞接種至共聚焦培養(yǎng)皿或24孔孔無菌細胞培養(yǎng)板中，細胞密度為5×10⁵/ml。大腸埃希菌按照1.1方法培養(yǎng)后，調(diào)整菌液濃度為5×cfu/ml，取氯化二亞苯基碘鎓（10μm）和大腸埃希菌（5×10⁵cfu/ml）加入預先接種在共聚焦培養(yǎng)皿中的細胞，37℃，5%co2孵育30min，共聚焦培養(yǎng)皿中加入鈣離子探針fluo4-am，37℃，5%co2孵育20min，pbs洗滌后激光共聚焦顯微鏡檢測胞內(nèi)鈣離子情況。同時將共聚焦培養(yǎng)皿的細胞用多聚甲醛固定后，使用鬼筆環(huán)肽對肌動蛋白f-actin染色，用dapi對細胞核染色后進行激光共聚焦檢測，觀察f-actin聚合情況。24孔板加入大腸埃希菌（5×10⁵cfu/ml）和氯化二亞苯基碘鎓（10μm）或同時加入鈣離子螯合劑egta(5mm)或bapta(10μm)，按照1.1方法進行吞噬指數(shù)檢測。

6.2實驗結果：由圖6a結果可知，大腸埃希菌可誘導胞內(nèi)鈣離子較少的增加，加入二亞苯基碘鎓處理后，其胞內(nèi)鈣離子進一步增加。由圖6b對吞噬指數(shù)檢測結果顯示，氯化二亞苯基碘鎓可顯著增強細胞的吞噬作用，然而同時加入鈣離子螯合劑egta或bapta其吞噬作用受到顯著抑制。由圖6c中f-actin的熒光染色結果顯示，不加試劑對照組沒有觀察到f-actin的明顯聚集，然而二亞苯基碘鎓處理組可顯著促進f-actin在膜上的聚集。以上結果顯示，二亞苯基碘鎓可通過促進胞內(nèi)鈣離子增加誘導f-actin聚合，從而促進巨噬細胞對細菌的吞噬作用。

實施例7：氯化二亞苯基碘鎓對大腸埃希菌感染小鼠組織菌計數(shù)、炎癥介質(zhì)水平和生存率的影響

7.1實驗方法：6-8周的野生型balb/c小鼠腹腔注射生理鹽水或大腸埃希菌（1×10⁸cfu/kg)，同時注射氯化二亞苯基碘鎓(1mm/kg)或等體積生理鹽水，觀察72h的存活率（n=10）。注射6h后將小鼠麻醉，用生理鹽水對腹腔進行灌洗，收集灌洗液，1000rpm離心，取上清涂布營養(yǎng)瓊脂板上進行細菌培養(yǎng)，上清加入抗生素殺滅胞外細菌后，去除上清，細胞沉淀用0.3%saponin裂解，取裂解液涂布瓊脂板上進行細菌培養(yǎng)。同時解剖獲取肝，脾，肺和血液，臟器加入500μl生理鹽水勻漿后離心，檢測上清細胞因子和將上清涂板進行細菌培養(yǎng)檢測。血液離心后取血清檢測細胞因子。

7.2實驗結果：由圖7a結果可知，腹腔注射大腸埃希菌后，模型組小鼠72h存活率為40%，氯化二亞苯基碘鎓處理組72h存活率為80%，表明氯化二亞苯基碘鎓可提高大腸埃希菌感染小鼠的存活率。由圖7b結果可知，對組織細菌加載量的檢測發(fā)現(xiàn)，大腸埃希菌感染6h后肺組織細菌顯著增加，而氯化二亞苯基碘鎓處理組肺組織勻漿中細菌加載量顯著減少。同時對腹腔灌洗液上清及腹腔巨噬細胞胞內(nèi)的細菌量檢測發(fā)現(xiàn)，氯化二亞苯基碘鎓處理的小鼠其上清中的細菌量顯著減少，而胞內(nèi)的細菌量顯著增加，表明氯化二亞苯基碘鎓可通過促進腹腔巨噬細胞對細菌的吞噬作用而增強對細菌的清除能力。由圖7c和7d所示，注射大腸埃希菌顯著增加了肺，脾，肝勻漿和血液上清中的tnf-α和il-6水平，然而氯化二亞苯基碘鎓可顯著抑制各臟器tnf-α和il-6水平。以上實驗結果表明，氯化二亞苯基碘鎓可在體內(nèi)誘導細胞對細菌的吞噬，從而增強了對細菌的清除，改善炎癥反應進而提高大腸埃希菌感染小鼠的存活率。