本發(fā)明屬于骨髓炎治療藥物，具體涉及一種抗菌用人造納米細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、骨髓炎是一種主要影響兒童和老人的感染性骨病。近年來，其發(fā)病率和耐藥菌感染占比逐年上升。傳統(tǒng)療法為長(zhǎng)期高劑量應(yīng)用抗生素結(jié)合手術(shù)清創(chuàng)，主要存在以下兩個(gè)難題：①長(zhǎng)期大劑量使用抗生素帶來的副作用/不良反應(yīng)和誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥；②清創(chuàng)手術(shù)伴隨的麻醉/再感染/致殘等風(fēng)險(xiǎn)。從其他治療原理角度引入新型非抗生素治療策略對(duì)于進(jìn)一步提高骨髓炎的療效具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種抗菌用人造納米細(xì)胞，有效避免了傳統(tǒng)骨髓炎治療中長(zhǎng)期大劑量使用抗生素副作用大及清創(chuàng)手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)高這兩大臨床難題，從介導(dǎo)芬頓反應(yīng)和銅死亡兩種非抗生素原理角度，進(jìn)行殺菌，實(shí)現(xiàn)優(yōu)異的骨髓炎治療效果；此外，本發(fā)明還提供了抗菌用人造納米細(xì)胞的制備方法及其應(yīng)用。

2、本發(fā)明第一方面提供了一種抗菌用人造納米細(xì)胞的制備方法，所述抗菌用人造納米細(xì)胞用于制備治療骨髓炎的藥物，所述抗菌用人造納米細(xì)胞通過以下步驟制備而得：

3、將聚乙烯吡咯烷酮或其水溶液、cucl2·2h2o或其水溶液、fecl2·4h2o或其水溶液、伊利司莫或其dmso溶液、naoh或其水溶液、h2o2或其水溶液混合后，攪拌均勻，洗滌超濾離心，得到納米顆粒；

4、采用骨髓基質(zhì)干細(xì)胞制備細(xì)胞膜；

5、將所述納米顆粒與細(xì)胞膜混合均勻，超聲孵育擠出即得抗菌用人造納米細(xì)胞；其中，所述納米顆粒與細(xì)胞膜的蛋白質(zhì)質(zhì)量比為1:(0.9～1.1)。

6、本發(fā)明提供的抗菌用人造納米細(xì)胞，為骨髓炎的治療提供了一種新思路，本發(fā)明提供的抗菌用人造納米細(xì)胞作為骨髓炎治療的一種新型非抗生素策略，有效避免了傳統(tǒng)骨髓炎治療過程中存在的兩大痛點(diǎn)問題，一是長(zhǎng)期大劑量使用抗生素帶來的副作用/不良反應(yīng)和誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥，二是清創(chuàng)手術(shù)伴隨的麻醉/再感染/致殘等風(fēng)險(xiǎn)。

7、在本發(fā)明的一實(shí)施方式中，所述納米顆粒的制備包括以下步驟：

8、將聚乙烯吡咯烷酮水溶液、cucl2·2h2o水溶液、fecl2·4h2o水溶液混合后，攪拌均勻，然后加入含伊利司莫的dmso溶液，攪拌均勻，再依次加入naoh水溶液、h2o2水溶液，攪拌反應(yīng)30～35min后，用蒸餾水洗滌超濾離心至少3次，即得納米顆粒。

9、在本發(fā)明的一實(shí)施方式中，聚乙烯吡咯烷酮水溶液的濃度為202～247mg/ml，cucl2·2h2o水溶液的濃度為36～44mg/ml，fecl2·4h2o水溶液的濃度為18～22mg/ml，含伊利司莫的dmso溶液中伊利司莫的濃度為168～206mg/ml，naoh水溶液的濃度為0.018～0.022m，h2o2水溶液的濃度為9～10m。

10、在本發(fā)明的一實(shí)施方式中，聚乙烯吡咯烷酮水溶液、cucl2·2h2o水溶液、fecl2·4h2o水溶液、含伊利司莫的dmso溶液、naoh水溶液、h2o2的體積比為(1323～1617):(90～110):(90～110):(4.5～5.5):(2970～3630):(60～74)。

11、在本發(fā)明的一實(shí)施方式中，超濾膜的孔徑為9～11kda。

12、在本發(fā)明的一實(shí)施方式中，細(xì)胞膜的制備包括以下步驟：

13、培養(yǎng)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞至細(xì)胞密度達(dá)到80～90％時(shí)，用細(xì)胞刮刮掉細(xì)胞，pbs洗滌3次，加入細(xì)胞膜裂解液，在冰上裂解細(xì)胞13～15min，然后用液氮反復(fù)凍融3～5個(gè)循環(huán)，在4℃、13000～14000g的條件下離心30～35min后收集細(xì)胞膜，即得細(xì)胞膜。

14、在本發(fā)明的一實(shí)施方式中，將所述納米顆粒與細(xì)胞膜混合均勻，在35～37℃下超聲處理15～20min后，先通過孔徑為180～220nm的聚碳酸酯膜擠壓12～15次、再通過孔徑為90～110nm的聚碳酸酯膜擠壓12～15次，13000～14000g離心3～5min，純化收集獲得抗菌用人造納米細(xì)胞。

15、本發(fā)明第二方面提供了一種抗菌用人造納米細(xì)胞，所述抗菌用人造納米細(xì)胞采用上述制備方法制備所得。

16、本發(fā)明第三方面提供了上述抗菌用人造納米細(xì)胞在制備用于治療骨髓炎的藥物中的應(yīng)用。

17、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下：

18、1、本發(fā)明提供的抗菌用人造納米細(xì)胞作為骨髓炎治療的一種新型非抗生素策略，有效避免了傳統(tǒng)骨髓炎治療過程中存在的兩大痛點(diǎn)問題，一是長(zhǎng)期大劑量使用抗生素帶來的副作用/不良反應(yīng)和誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥，二是清創(chuàng)手術(shù)伴隨的麻醉/再感染/致殘等風(fēng)險(xiǎn)。

19、2、本發(fā)明實(shí)施例提供的抗菌用人造納米細(xì)胞，在骨髓炎感染部位的弱酸性條件下，解體釋放銅鐵離子、銅離子載體伊利司莫和過氧化氫，從介導(dǎo)芬頓反應(yīng)和銅死亡兩種非抗生素原理角度，進(jìn)行殺菌，實(shí)現(xiàn)優(yōu)異的骨髓炎治療效果，為骨髓炎的治療提供了一種新思路。具體地說，參照?qǐng)D4所示，本發(fā)明實(shí)施例提供的抗菌用人造納米細(xì)胞中，銅、鐵離子通過銅-鐵催化環(huán)路(cu+-to-cu2+和fe3+-to-fe2+)增強(qiáng)芬頓反應(yīng)殺菌，此外，銅離子載體伊利司莫將多余銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)細(xì)菌內(nèi)，誘導(dǎo)其銅死亡；進(jìn)一步地，采用骨髓基質(zhì)干細(xì)胞膜修飾提高納米體系的生物相容性和骨髓靶向性。

20、3、采用本發(fā)明實(shí)施例提供的抗菌用人造納米細(xì)胞制備所得治療骨髓炎的藥物，為兼具化學(xué)動(dòng)力治療和誘導(dǎo)銅死亡的復(fù)合藥物體系，實(shí)現(xiàn)了優(yōu)異的骨髓炎治療效果；采用本發(fā)明實(shí)施例提供的抗菌用人造納米細(xì)胞制備所得治療骨髓炎的藥物在使用時(shí)，通過靜脈注射的方式給藥，發(fā)揮抗菌治療骨髓炎的效果。

21、4、本發(fā)明實(shí)施例提供的抗菌用人造納米細(xì)胞的制備方法，原料來源廣泛，工藝簡(jiǎn)單、安全。

22、說明書附圖

23、圖1為本發(fā)明實(shí)施例中抗菌用人造納米細(xì)胞的制備流程示意圖；

24、圖2為實(shí)施例1中制備所得抗菌用人造納米細(xì)胞的透射電鏡照片(標(biāo)尺，100nm)；

25、圖3為實(shí)施例1中制備所得抗菌用人造納米細(xì)胞體外抗s.aureus和mrsa菌效果(**p＜0.01相對(duì)于cfe@cm組)；

26、圖4為本發(fā)明實(shí)施例中抗菌用人造納米細(xì)胞的殺菌機(jī)制示意圖。

技術(shù)特征：

1.一種抗菌用人造納米細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述抗菌用人造納米細(xì)胞用于制備治療骨髓炎的藥物，所述抗菌用人造納米細(xì)胞通過以下步驟制備而得：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗菌用人造納米細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述納米顆粒的制備包括以下步驟：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗菌用人造納米細(xì)胞的制備方法，其特征在于，聚乙烯吡咯烷酮水溶液的濃度為202～247mg/ml，cucl2·2h2o水溶液的濃度為36～44mg/ml，fecl2·4h2o水溶液的濃度為18～22mg/ml，含伊利司莫的dmso溶液中伊利司莫的濃度為168～206mg/ml，naoh水溶液的濃度為0.018～0.022m，h2o2水溶液的濃度為9～10m。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗菌用人造納米細(xì)胞的制備方法，其特征在于，聚乙烯吡咯烷酮水溶液、cucl2·2h2o水溶液、fecl2·4h2o水溶液、含伊利司莫的dmso溶液、naoh水溶液、h2o2的體積比為(1323～1617):(90～110):(90～110):(4.5～5.5):(2970～3630):(60～74)。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗菌用人造納米細(xì)胞的制備方法，其特征在于，超濾膜的孔徑為9～11kda。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗菌用人造納米細(xì)胞的制備方法，其特征在于，細(xì)胞膜的制備包括以下步驟：

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗菌用人造納米細(xì)胞的制備方法，其特征在于，將所述納米顆粒與細(xì)胞膜混合均勻，在35～37℃下超聲處理15～20min后，先通過孔徑為180～220nm的聚碳酸酯膜擠壓12～15次、再通過孔徑為90～110nm的聚碳酸酯膜擠壓12～15次，13000～14000g離心3～5min，純化收集獲得抗菌用人造納米細(xì)胞。

8.一種抗菌用人造納米細(xì)胞的制備方法，其特征在于，由權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)制備方法制備所得。

9.權(quán)利要求8所述的抗菌用人造納米細(xì)胞在制備用于治療骨髓炎的藥物中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種抗菌用人造納米細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用，所述抗菌用人造納米細(xì)胞用于制備治療骨髓炎的藥物，所述抗菌用人造納米細(xì)胞通過以下步驟制備而得：將聚乙烯吡咯烷酮或其水溶液、CuCl<subgt;2</subgt;·2H<subgt;2</subgt;O或其水溶液、FeCl<subgt;2</subgt;·4H<subgt;2</subgt;O或其水溶液、伊利司莫或其DMSO溶液、NaOH或其水溶液、H<subgt;2</subgt;O<subgt;2</subgt;或其水溶液混合后，攪拌均勻，洗滌超濾離心，得到納米顆粒；采用骨髓基質(zhì)干細(xì)胞制備細(xì)胞膜；將所述納米顆粒與細(xì)胞膜混合均勻，超聲孵育擠出即得抗菌用人造納米細(xì)胞；其中，所述納米顆粒與細(xì)胞膜的蛋白質(zhì)質(zhì)量比為1:(0.9～1.1)。本發(fā)明提供的抗菌用人造納米細(xì)胞，有效避免了傳統(tǒng)骨髓炎治療中長(zhǎng)期大劑量使用抗生素副作用大及清創(chuàng)手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)高這兩大臨床難題，從介導(dǎo)芬頓反應(yīng)和銅死亡兩種非抗生素原理角度，進(jìn)行殺菌，實(shí)現(xiàn)優(yōu)異的骨髓炎治療效果。

技術(shù)研發(fā)人員：李遠(yuǎn)輝,賀超,蔣宇航,李健,鐘雨軒,吳增暉,吳鈺純,黃錦鵬,龐鍇鋮,周元月,肖同
受保護(hù)的技術(shù)使用者：廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院（廣州重癥孕產(chǎn)婦救治中心、廣州柔濟(jì)醫(yī)院）
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/11/14