本發(fā)明涉及生物醫(yī)用材料，具體涉及一種兼具成骨誘導(dǎo)與抗菌的多功能仿生涂層及其制備方法。

背景技術(shù)：

1、在骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松、骨腫瘤等綜合并發(fā)癥下的骨折、創(chuàng)傷等骨缺損修復(fù)與治療，目前仍是臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域面臨的主要難題。鈦及其合金因具有較高的比強度、優(yōu)異的耐蝕性、可靠的生物相容性，已成為骨科與矯形外科理想的植入替代材料之一。然而，鈦基合金的彈性模量較高，與天然骨組織極不匹配，易導(dǎo)致應(yīng)力屏蔽效應(yīng)，從而加劇骨吸收過程，造成植入失效；且表面自發(fā)形成的天然鈍化致密氧化層，不具備生物活性，不利于成骨分化、成骨細(xì)胞的粘附、增殖與功能表達(dá)等生理過程，植入后與周圍人體組織的交互作用差，導(dǎo)致骨整合不足；此外，較弱的抗菌性能，也加速了植入手術(shù)的早期感染，引起炎癥。因此，迫切需要對生物醫(yī)用鈦合金進(jìn)行表面改性處理，以應(yīng)對復(fù)雜的臨床環(huán)境，促進(jìn)植入物與骨組織界面的早期骨整合并避免細(xì)菌感染。

2、人體骨骼是一種具有微納多級多孔結(jié)構(gòu)的組織，可用于儲存大量的營養(yǎng)素、生長因子、細(xì)胞，也可用于物質(zhì)交換和運輸。在植入鈦合金表面構(gòu)建納米管狀結(jié)構(gòu)的仿骨多孔材料，可顯著降低鈦合金的彈性模量，也可實現(xiàn)植入周圍組織營養(yǎng)物質(zhì)的儲存與運輸，促進(jìn)骨內(nèi)快速血管化；納米結(jié)構(gòu)，也為細(xì)胞粘附提供較多的黏著位點，有利于細(xì)胞的快速鋪展。此外，中空結(jié)構(gòu)也為生物活性物質(zhì)的搭載與控釋提供大量存儲空間。骨骼包含大量多種金屬元素，在維持骨骼組織的穩(wěn)態(tài)平衡、加速血管生成、調(diào)節(jié)骨代謝、維持骨細(xì)胞正常功能表達(dá)中發(fā)揮著重要作用。在納米管內(nèi)搭載金屬活性離子，可有效地實現(xiàn)植入部位周圍成骨分化、抑制破骨，實現(xiàn)骨組織的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)。但金屬離子可隨周圍組織液快速擴散，形成突釋，對細(xì)胞和組織造成毒性。因此，對金屬離子釋放必須有效地控制。

3、然而，現(xiàn)有技術(shù)中在制備含金屬離子的功能涂層時，無法實現(xiàn)活性金屬離子的可控釋放，導(dǎo)致功能涂層快速失效，無法得到很好的應(yīng)用，并且，現(xiàn)有涂層還存在著抗菌性能差、細(xì)胞毒性大等不足之處。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的：本發(fā)明的第一目的在于提供一種兼具成骨誘導(dǎo)與抗菌的多功能仿生涂層；本發(fā)明的第二目的在于提供上述多功能仿生涂層的制備方法。

2、技術(shù)方案：本發(fā)明提供的兼具成骨誘導(dǎo)與抗菌的多功能仿生涂層，以生物醫(yī)用材料為基底，由內(nèi)向外依次包括仿骨多孔二氧化鈦納米管層、螯合活性金屬離子的相轉(zhuǎn)變?nèi)芫讣{米蛋白層以及骨靶向生物分子層。

3、進(jìn)一步地，所述仿骨多孔二氧化鈦納米管層中，多孔二氧化鈦納米管的管徑為10-200nm、管長為0.1-20μm，為非晶態(tài)或銳鈦礦型結(jié)構(gòu)。

4、進(jìn)一步地，所述活性金屬為鍶、鈣、鋅、鎂、鈰、鎵中的一種或多種；所述溶菌酶為蛋清溶菌酶、人溶菌酶中的一種多種。

5、進(jìn)一步地，所述骨靶向生物分子為含氨基的四環(huán)素類親骨抗生素；所述含氨基的四環(huán)素類親骨抗生素為鹽酸四環(huán)素、多西環(huán)素、米諾環(huán)素、替加環(huán)素中的一種，優(yōu)選為鹽酸四環(huán)素。

6、進(jìn)一步地，所述生物醫(yī)用材料為鈦及其合金，包括ti13nb13zr、ti12mo6zr、ti6al7nb、ta2合金，可用于制造植入人體的人工關(guān)節(jié)、固定橋、牙科整形器件等假體或人工器官，可在骨修復(fù)材料領(lǐng)域中應(yīng)用。

7、本發(fā)明提供的兼具成骨誘導(dǎo)與抗菌的多功能仿生涂層的制備方法，包括以下步驟：

8、(1)利用陽極氧化法在預(yù)處理后的基體表面制備仿骨多孔二氧化鈦納米管層，制得具有仿骨多孔二氧化鈦納米管層的基體；

9、(2)將步驟(1)制得的材料置于由相轉(zhuǎn)變還原劑溶液和包含活性金屬鹽、溶菌酶、溶劑的混合液混合而成的反應(yīng)液中，進(jìn)行原位自組裝，制得具有仿骨多孔二氧化鈦納米管層和螯合活性金屬離子的相轉(zhuǎn)變?nèi)芫讣{米蛋白層的基體；

10、(3)先將步驟(2)制得的材料置于羧基活化溶液中進(jìn)行羧基活化，再向羧基活化溶液中添加骨靶向分子溶液，通過酰胺反應(yīng)將骨靶向分子接肢到材料表面形成骨靶向生物分子層，最終制得兼具成骨誘導(dǎo)與抗菌的多功能仿生涂層。

11、進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述預(yù)處理包括砂紙打磨、拋光、清洗和干燥，所述拋光包括機械拋光和電化學(xué)拋光。

12、進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述陽極氧化法的工藝參數(shù)包括：電解液的組成包括：可溶性氟化物、水和有機醇類溶劑，以基體為陽極，以高純石墨棒為陰極，電壓為10-130v，優(yōu)選為40-60v，更優(yōu)選為40-50v，陽極氧化時間為1-180min，優(yōu)選為50-80min，更優(yōu)選為45-60min，反應(yīng)溫度為0-50℃，優(yōu)選為20-30℃，更優(yōu)選為25±2℃，陰極與陽極的距離為30-60mm，優(yōu)選為40-50mm，更優(yōu)選為40-45mm；所述電解液中，可溶性氟化物的質(zhì)量百分比濃度為0.1-10wt.％，優(yōu)選為0.5wt.％，水的體積百分比濃度為2-3vol.％，優(yōu)選為2vol.％，可溶性氟化物為氟化銨或氫氟酸，優(yōu)選為氟化銨，有機醇類溶劑為乙二醇、丙三醇或異丙醇，優(yōu)選為乙二醇。

13、進(jìn)一步地，步驟(2)中，所述相轉(zhuǎn)變還原劑溶液由相轉(zhuǎn)變還原劑和溶劑組成，相轉(zhuǎn)變還原劑為三(2-羧乙基)膦，溶劑為4-羥乙基哌嗪乙磺酸，相轉(zhuǎn)變還原劑在相轉(zhuǎn)變還原劑溶液中的摩爾濃度為10-100mm，優(yōu)選為40-60mm，更優(yōu)選為50-60mm，相轉(zhuǎn)變還原劑溶液的ph為6.5-7.5，優(yōu)選為7±0.2，在此ph范圍內(nèi)有利于溶菌酶快速相轉(zhuǎn)變，而其他ph值下會導(dǎo)致相轉(zhuǎn)變?nèi)芫笩o法進(jìn)行形成；所述混合液中，溶劑為4-羥乙基哌嗪乙磺酸，濃度為5-30mm，優(yōu)選為10-20mm，ph為6.9-7.3，優(yōu)選為7.2±0.1，溶菌酶在混合液中的質(zhì)量濃度為1-5mg/ml，優(yōu)選為2-3mg/ml，活性金屬鹽在混合液中的摩爾濃度為0.5-6mm，優(yōu)選為1.8-3.5mm；所述相轉(zhuǎn)變還原劑溶液與混合液的體積比為1:1-2，優(yōu)選為1:1；所述原位自組裝的時間為1-3h，優(yōu)選為2±0.5h。

14、進(jìn)一步地，步驟(3)中，所述羧基活化溶液中的活化組分包括1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和n-羥基琥珀酰亞胺，其中，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽在羧基活化溶液中的摩爾濃度為10-50mm，優(yōu)選為20-40mm，n-羥基琥珀酰亞胺在羧基活化溶液中的摩爾濃度為5-30mm，優(yōu)選為10-20mm；所述羧基活化的時間為1-5h，優(yōu)選為2-4h；所述骨靶向分子溶液的摩爾濃度為2-10mm，優(yōu)選為4-6mm；所述酰胺反應(yīng)的時間為10-24h，優(yōu)選為12-16h。

15、發(fā)明原理：本發(fā)明通過陽極氧化技術(shù)在基體表面制備仿骨多孔二氧化鈦中空納米管陣列，可降低醫(yī)用鈦合金的應(yīng)力屏蔽效應(yīng)，增加表面粗糙度，為活性物質(zhì)的搭載、營養(yǎng)物質(zhì)的儲存、細(xì)胞的粘附等提供空間和位點；活性金屬離子，可有效地促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化，調(diào)節(jié)相關(guān)功能表達(dá)和骨穩(wěn)態(tài)平衡。

16、溶菌酶由大量氨基酸所構(gòu)成，包含大量的化學(xué)活性官能團，其二硫鍵經(jīng)過還原劑三(2-羧乙基)膦裂解后發(fā)生相轉(zhuǎn)變，自組裝形成類淀粉樣產(chǎn)物，該產(chǎn)物不僅可以黏附在任意形態(tài)的基體表面(包括納米管)，還可以為界面賦予更多的氨基、羧基、羥基等化學(xué)活性基團，進(jìn)一步螯合活性金屬離子，延長離子釋放周期，減緩周圍細(xì)胞和組織毒性，并為后續(xù)生物功能分子的化學(xué)接枝提供活性反應(yīng)位點；并且，溶菌酶還具有一定的抗菌作用。

17、骨靶向活性分子可在體內(nèi)環(huán)境下誘導(dǎo)植入周圍快速膠原和礦物沉積、成骨分化、成骨細(xì)胞粘附歸巢，主要包括雙膦酸鹽類、寡肽類、四環(huán)素類、適體類等。其中，四環(huán)素類骨靶向活性分子，既具有抑制基質(zhì)金屬蛋白酶活性、抑制骨吸收、恢復(fù)成骨細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，改善病理狀態(tài)下的骨組織生長活性，恢復(fù)成骨細(xì)胞的正常功能，又作為一種廣譜抗生素，對細(xì)菌、真菌均有抑制作用，從而降低植入手術(shù)的感染風(fēng)險。四環(huán)素結(jié)構(gòu)上的β二酮、烯醇及甲酰胺基團等可與骨組織羥基磷灰石上的鈣離子之間形成螯合鍵，四環(huán)素上的羥基也可與羥基磷灰石之間形成范德華力和氫鍵，因而具有極強的骨親活性，從而實現(xiàn)骨靶向。四環(huán)素分子另一端含有活性氨基，可通過酰胺反應(yīng)，將四環(huán)素類分子與相轉(zhuǎn)變?nèi)芫干系慕?jīng)1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和n-羥基琥珀酰亞胺活化的羧基共價結(jié)合，實現(xiàn)骨靶向分子的進(jìn)一步接肢，從而促進(jìn)生理環(huán)境下羥基磷灰石的誘導(dǎo)結(jié)晶沉積、膠原形成以及成骨細(xì)胞粘附與功能表達(dá)，促進(jìn)早期骨整合。

18、有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下顯著優(yōu)點：(1)本發(fā)明所利用的相轉(zhuǎn)變?nèi)芫讣{米蛋白顆粒涂層，不受基體材料、形狀限制，可快速地原位自主裝在各種材料表面；(2)本發(fā)明所用到的金屬離子和骨靶向活性分子，協(xié)同成骨和抗菌雙重效果，并可以通過溶菌酶的螯合或共價作用，有效延緩釋放周期，避免突釋帶來的細(xì)胞和組織毒性；(3)本發(fā)明制備的二氧化鈦納米管仿骨多孔結(jié)構(gòu)，可為細(xì)胞粘附提供大量的黏著位點，并為骨細(xì)胞生長儲存大量營養(yǎng)物質(zhì)，有利于物質(zhì)交換和運輸；(4)本發(fā)明制備方案所需的條件溫和，不需要特殊的設(shè)備，工藝簡單，成本低廉。